CN105941392A - 一种适用于组培快繁的白芨蒴果保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种白芨种子的保藏方法，包括白芨蒴果采摘时机选择及前处理，白芨蒴果消毒处理，种子无菌保藏条件等几个方面结合进行改进，获得适用于组培快繁的白芨蒴果保存方法。本发明的保藏装置结构设计合理，保藏方法科学可靠，保藏时间长，成活率高，可满足白芨常年组培生产白芨苗的要求，适用于同类种子的采集及保存。

Description

一种适用于组培快繁的白芨蒴果保存方法
技术领域
本发明属于种子保藏技术领域，具体涉及一种白芨种子的保藏方法。
背景技术
种质资源是人类极其珍贵的财富。随着经济发展，地球不断开发及生态环境破坏，每年都有多个物种消失或濒临灭绝。各种植物，包括栽培种、野生种甚至杂草，都具有各自独特的优良基因，是植物品种改良乃至农业可持续发展的基础。它们是经过长期进化而来，一旦失去不会再生。因此，世界各国都很重视植物种质资源的收集与保存的研究。
白芨种子都在秋初成熟，而组培快繁幼苗的工作却全年都可进行，由于种子不能实现长久无菌保存造成白芨幼苗组培快繁工作不可全年进行。新鲜完好的蒴果内部基本无菌，感染率很低，而采收后存放的蒴果会因为失水和干裂，内部种子则被污染，导致接种后污染率奇高（超过八成），这大大制约了白芨的组培快繁工作。
现有白芨种子保藏方式有：
1.石蜡包裹
取下新鲜饱满硕果后外层裹上一层石蜡（参见图4），防止果裂而造成果荚内部微生物感染。此方法可在一定程度上防止内部种子受到环境中微生物污染，但在用其作为组培用白芨种子时，外层石蜡表面还是有大量微生物。而石蜡具有疏水性，很难消毒干净，播种时石蜡易破碎并随种子一起飘入培养瓶中而造成培养物被大量污染。此外，该方法处理种子会在一定程度上降低了果荚的透气性，导致果荚内部种子呼吸作用降低，这会直接降低组培过程中的种子萌发率。
2.风干保存
直接把完整硕果放置在阴凉处自然风干说过果荚水分再存放在4℃环境，这也是当前常用保存方式。该方法保藏的种子污染率低，种子萌发率高，但是此种子保存方法有效期很短，一般保存时效约2~3个月。在阴干果荚水分和放置在冰柜保鲜过程中，果荚会因不断失去水分而慢慢干裂，导致种子裸露而造成微生物感染（参见图5，保藏3、4个月后大量果荚开裂，种子裸露出来）。组培接种前消毒时如果消毒液通过果荚裂缝接触到种子，则会大大影响种子活力，造成种子萌发率底下。若在果荚上长期喷水保湿防止种子干裂又会引起果荚霉变，不利于种子保藏。
发明内容
为解决现有技术白芨种子保藏时间不长，成活率不高等不足，本发明的白芨种子的保藏方法，包括白芨蒴果采摘时机选择及前处理，白芨蒴果消毒处理，种子无菌保藏条件等几个方面结合进行改进，获得适用于组培快繁的白芨蒴果保存方法。本发明的保藏方法科学可靠，保藏时间长，成活率高，可满足白芨常年组培生产白芨苗的要求，适用于同类种子的采集及保存。
本发明提供的技术方案是：一种适用于组培快繁的白芨蒴果保存方法，其包括下述步骤：
(1) 蒴果采收：采收无破损的白及蒴果。
(2) 蒴果消毒分装：对选好的蒴果进行消毒分装。
(3) 蒴果风干：将消毒后的蒴果风干。
(4) 种子长期保存：将风干的蒴果放入带透气孔的无菌培养瓶中，于2-6℃冰箱长期保存。
任选地，还包括第(5)步保存种子的取用：取出培养瓶放置至室温再在超净工作台中用75%酒精消毒1-2min便可直接用于组培接种。
优选地，第（2）步中，具体是用1%Tween20溶液1mL和0.1%的升汞溶液300mL进行消毒。
本发明一种适用于组培快繁的白芨蒴果保存方法，其中一个具体的方法步骤如下：
(1) 蒴果采收：在八月底白芨蒴果成熟时节，选择大而饱满，皮色青绿且无明显破损的蒴果，保留果柄，用剪刀单个采收蒴果，选择晴天午后天气干爽时采收较为适宜。
(2) 蒴果消毒分装：将采收蒴果用滤纸包裹放入冰柜保鲜，放置时间不宜过长，在超净台中把选好的蒴果分装于已灭菌过的480mL带透气孔的培养瓶中，每瓶分装蒴果不宜超过半瓶；加入1%Tween20溶液1mL和300mL的75%酒精溶液，轻轻晃动1-2min；倒去溶液并用无菌水涮洗2-3次后将蒴果转入一个新的无菌培养瓶中；加入1%Tween20溶液1mL和0.1%的升汞溶液300mL，并轻轻摇晃10min；蒴果会在溶液中上浮，期间可用镊子轻轻搅动，但不可刺破果荚。倒去升汞溶液后立即用无菌水清洗6-8次。
(3) 蒴果风干：将用无菌水洗净的蒴果放入已灭菌的不锈钢接种碟中，底层垫上多层无菌滤纸吸干多余水汽；将蒴果留在超净工作台中并把风力调制最大，风干12-15h；时间不宜过长，可能导致果荚风干破裂，太短则不可去除蒴果外多余水分而导致保存过程中引起种子坏死。
(4) 种子长期保存：将已风干水汽的蒴果放入带透气孔的无菌培养瓶中，并在瓶口周围缠绕两圈保鲜膜以防染菌。再将培养瓶放置于4℃冰箱长期保存。
本发明的优势与好处在于：本发明的白芨蒴果保存方法可以实现白芨种子无菌保藏1年以上，并不显著影响种子萌发率和组培接种后的污染率。本发明可以实现白芨果荚长期无菌保藏，打破种子采收时节的局限性，可实现白芨全年组培育苗。应用此方法可使保藏时间一年以上的硕果播种后的种子活力和组培接种后污染率达到新鲜硕果组培育苗种子活力和污染率。让白芨组培育苗工厂实现全年生产，大大提高组培育苗生产效率和全年生产力，有助于短期内快速扩大濒危中药材白芨资源种群数量。
附图说明
图1 本发明方法保藏15个月后的白芨蒴果。
图2 本发明方法保藏15个月后的白芨蒴果的萌芽效果。
图3 本发明方法保藏15个月后的白芨蒴果播种50天后幼苗长势。
图4石蜡包裹保藏效果图。
图5风干保鲜保藏效果图。
具体实施方式
下面为理解本发明提供具体实施例，但仅为了理解本发明，并不对本发明作出限制。
(1) 蒴果采收：在八月底白芨蒴果成熟时节，选择大而饱满，皮色青绿且无明显破损的蒴果。保留果柄，用剪刀单个采收蒴果。选择晴天午后天气干爽时采收较为适宜。
(2) 蒴果消毒分装：将采收蒴果用滤纸包裹放入冰柜保鲜，放置时间不宜过长。在超净台中把选好的蒴果分装于已灭菌过的480mL带透气孔的培养瓶中，每瓶分装蒴果不宜超过半瓶。加入1%Tween20溶液1mL和300mL的75%酒精溶液，轻轻晃动1-2min。倒去溶液并用无菌水涮洗2-3次后将蒴果转入一个新的无菌培养瓶中。加入1%Tween20溶液1mL和0.1%的升汞溶液300mL，并轻轻摇晃10min。蒴果会在溶液中上浮，期间可用镊子轻轻搅动，但不可刺破果荚。倒去升汞溶液后立即用无菌水清洗6-8次。
(3) 蒴果风干：将用无菌水洗净的蒴果放入已灭菌的不锈钢接种碟中，底层垫上多层无菌滤纸吸干多余水汽。将蒴果留在超净工作台中并把风力调制最大，风干12-15h。时间不宜过长，可能导致果荚风干破裂，太短则不可去除蒴果外多余水分而导致保存过程中引起种子坏死。
(4) 种子长期保存：将已风干水汽的蒴果放入带透气孔的无菌培养瓶中，并在瓶口周围缠绕两圈保鲜膜以防染菌。再将培养瓶放置于4℃冰箱长期保存。
本发明方法保藏15个月后的白芨蒴果如图1所示。采用此种方式保藏一年以上的白芨硕果果荚会失绿，成为棕褐色，但种子活力不会有明显降低。
本发明方法保藏15个月后的白芨蒴果的萌芽效果如图2。把采用此法保藏15个月后的种子播入白芨萌芽培养基中，种子萌动效果如上图。播种7天后发现种子开始萌动转绿，15天后大面积转绿，萌发率超过五成，与新鲜硕果播种萌发率无明显差异，且因内生菌及硕果内部微生物污染率低于20%。说明种子保藏完好，种子活力和接种污染率达到应用要求。
本发明方法保藏15个月后的白芨蒴果播种50天后幼苗长势如图3。播种50天后白芨幼苗长势良好（图3左图），株高1cm左右，无发达根系，与采用新鲜硕果培养的幼苗长势（图3右图）无差异，适合转接增值培养基进入芽增殖培养。

Claims (8)

1.一种适用于组培快繁的白芨蒴果保存方法，其特征在于，包括下述步骤：
(1) 蒴果采收：采收无破损的白及蒴果；
(2) 蒴果消毒分装：对选好的蒴果进行消毒分装；
(3) 蒴果风干：将消毒后的蒴果风干；
(4) 种子长期保存：将风干的蒴果放入带透气孔的无菌培养瓶中，于2-6℃冰箱长期保存。
2.如权利要求1所述的适用于组培快繁的白芨蒴果保存方法，其特征在于，第(1)步是在八月底白芨蒴果成熟时节，选择大而饱满，皮色青绿且无明显破损的蒴果，保留果柄，用剪刀单个采收蒴果。
3.如权利要求2所述的适用于组培快繁的白芨蒴果保存方法，其特征在于，选择晴天午后天气干爽时采收。
4.如权利要求1所述的适用于组培快繁的白芨蒴果保存方法，其特征在于，第(2)步是先用75%酒精消毒，随后用1%Tween20溶液1mL和0.1%的升汞溶液300mL进行消毒。
5.如权利要求4所述的适用于组培快繁的白芨蒴果保存方法，其特征在于，第(2)步的具体做法是：将采收蒴果用滤纸包裹放入冰柜保鲜，在超净台中把选好的蒴果分装于已灭菌过的带透气孔的培养瓶中，加入1%Tween20溶液1mL和300mL的75%酒精溶液，轻轻晃动，倒去溶液并用无菌水涮洗2-3次后将蒴果转入一个新的无菌培养瓶中，再加入1%Tween20溶液1mL和0.1%的升汞溶液300mL，并轻轻摇晃，倒去升汞溶液后立即用无菌水清洗6-8次。
6.如权利要求1所述的适用于组培快繁的白芨蒴果保存方法，其特征在于，第(3)步是将用无菌水洗净的蒴果放入已灭菌的不锈钢接种碟中，底层垫上多层无菌滤纸吸干多余水汽，再将蒴果留在超净工作台中风干12-15h。
7.如权利要求1所述的适用于组培快繁的白芨蒴果保存方法，其特征在于，第(4)步具体做法是：将已风干水汽的蒴果放入带透气孔的无菌培养瓶中，并在瓶口周围缠绕两圈保鲜膜以防染菌，再将培养瓶放置于4℃冰箱长期保存。
8.如权利要求1所述的适用于组培快繁的白芨蒴果保存方法，其特征在于，还包括第(5)步种子的取用，具体做法是：取出培养瓶放置至室温再在超净工作台中用75%酒精消毒1-2min便可直接用于组培接种。
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