CN112616657A - 一种白芨种子的无菌保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明主要涉及中药种植技术领域，公开了一种白芨种子的无菌保存方法，包括果荚的采集、果荚表面处理及灭菌、种子取出和分装、种子的保存、组培育苗几个步骤。本发明方法保存白芨种子成本低，操作简便，方法简单，可进行批量处理和保存，白芨种子保存半年后，发芽率能够达到73％。本发明方法保存的种子，组培育苗成本低，可以快速获得无菌繁殖体系，不受季节限制，在短期内获得大量种苗；本发明方法保存的种子设置几道防线，在保持种子萌发率的同时，将种子播种污染率降到最低。

Description

一种白芨种子的无菌保存方法

技术领域

本发明属于中药材组织培养技术领域，具体涉及一种白芨种子无菌低温保存方法。

背景技术

白芨(Bletilla striata(Thunb))Reich.f)为兰科白芨属多年生草本植物，全球白芨属植物约有6种，均分布于亚洲，我国有4种，主要分布于冀、京、陕、甘、滇、苏、皖、浙、赣、闽、湘、黔等省。白芨以其干燥块茎入药，具有收敛止血，消肿生肌等功效，是我国重要的传统中药材之一。主要用于咳血、吐血、外伤出血、疮疡肿痛、皮肤皲裂等症；白芨具有延缓衰老、增稠、悬浮、保湿等持性，被广泛用于食品，医药以及化妆品行业中。另外，白芨因其花色艳丽，有较高的观赏价值，也是一种很多的景观植物。近年来，受药用和花卉市场需求的影响，白芨用量逐年加大，因人工无节制挖掘，生态环境遭到严重破坏等因素，导致野生白芨自然资源急剧减少，濒临灭绝，被国家列为重点保护的野生药用植物之一。保护野生白芨自然资源，推广应用植物组织培养育苗技术和人工规范化、规模化、集约化种植势在必行，对白芨资源的保护具有重要的意义。

近年来，在白芨组织培养技术方面的研究报导较多，白芨组织培养技术己经较为成熟。以种子为外植体的无菌播种方式，因其操作简单、污染率低、种子量大、周期短，可在短时期内建立起无菌繁殖体系，已被大家广泛采用，成为白芨最主要的组培育苗方法。白芨种子主要集中于每年9-10月成熟，种子成熟后果荚表皮极易失水裂开，长时间保存较难，果荚表皮裂开后，大大增加播种污染率，需在果荚裂开前及时播种。一旦果荚破裂，一方面种子容易染菌，另一方面种子与灭菌药液接触，影响出苗率。另外果荚的果柄和果蒂由于带有褶皱，灭菌不彻底，极易带菌。即使将果荚经灭菌后保存在3-5度的低温环境中，保存时间也最多20天左右，时间过长易滋生霉菌，明显增加播种污染率，影响播种效果。

专利号为CN201711244877.5“一种白及种子超低温保存方法”是在室温下将未损坏的白及果荚打开，用镊子使白及种子转入冻存管中，再加入抗冻液进行室温温育30～60min，再将其放入梯度降温盒中放入低温冰箱中，使其降温盒的温度在-35℃～-60℃，再将降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存备用。该发明方法在转入冻存管时，未对白及果荚进行消毒，容易带入病菌，污染种子，另外此方法采用液氮保存，较为繁琐，不易操作，且成本高。专利号为CN201210296768.9的“一种白及种子的保存方法”是将经过洗涤的白及蒴果置于超净工作台上，用酒精灯明火外焰进行烘烤，烘烤的温度为400～500℃，烘烤时间为3～6秒；再放入低温冰箱保存。该方法使用酒精灯明火外焰进行烘烤，烘烤的温度为400～500℃，烘烤时间为3～6秒，不容易控制，会导致蒴果烘烤过度或者有些没有烘烤到而消毒不全，造成污染。CN201410230993.1的“一种白及种子的包埋玻璃化超低温保存方法”，是将消毒剖开的种子投入藻酸钠包埋液，搅拌均匀后滴入钙离子包埋液中，置于室温下凝固成包埋珠；将包埋珠置于PVS2溶液中脱水处理20-160min；放入冷冻管中，并加入PVS2溶液，然后将冷冻管置于液氮中冷冻保存。本方法一方面使用了液氮成本高；另一方面使用PVS2溶液，并且发明人也指出PVS2溶液对材料也存在一定的毒性，需要严格控制脱水的时间。这些因素也可能导致白及种子萌发率低。专利号为CN201610285243.3的“一种适用于组培快繁的白芨蒴果保存方法”的专利，在采收及保存时保留蒴果的果柄，会造成消毒不完全，从而造成播种污染率高。

综上所述，目前缺少一种简单、实用、有效、成本低、播种污染率低，可长时间无菌保存白芨种子的方法。若解决好白芨种子的无菌保存问题，可根据生产需求，适时播种，减少浪费，降低生产成本，提高生产效率。

发明内容

本发明提供一种简单、实用、有效、易于操作的白芨种子无菌低温保存方法，对白芨种子的无菌保存具有明显优势，解决了白芨种子保存成本高，保存时间短，保存过程中，易发生再次污染，造成播种污染率高等问题。

本发明为解决上述问题所采取的技术方案如下：

一种白芨种子的无菌保存方法，其包括以下步骤：

S1果荚的采集9-10月份，选择生长健壮、长势良好、产量高、无病虫害植株的成熟果荚，果荚未裂开、饱满、表面无斑点无虫眼。

S2果荚表面处理及灭菌用肥皂水刷洗果荚表面，自来水下冲洗干净，然后在无菌工作台上，先用75％酒精浸泡30-60秒钟，再用0.1％的氯化汞溶液浸泡25-30分钟，无菌水冲洗4-5次，再用无菌滤纸吸干表面水份；

S3种子取出和分装用无菌手术刀剖开上述消毒后的果荚，用镊子取出种子，放入无菌的2-2.5mlPCR离心管中,盖上盖子,并用封口胶密封盖子四周；

S4种子的保存将上述装有种子的离心管放入干燥器中，用封口胶密封盖子，放置于温度为3-5度的冰箱中保存；

S5无菌播种将上述保存的种子均匀播种到1/2Ms+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L的培养基中萌芽培养。。

优选地，为了避免污染，降低污染率，减少易发生霉变部位污染源，所述的S2中剖开果荚时，须切除果荚两端的果柄和果蒂，从中部纵向剖开果荚。

优选地，为了避免操作过程中个别果荚灭菌不彻底，放在一起造成交叉感染，所述的S3种子取出和分装时，每只离心管仅装一个果荚的种子。

优选地，为了降低湿度，防止离心管四周滋生病菌，减少播种污染率，所述的S4种子的保存时，还在干燥器中放入吸湿变色硅胶。

由于白芨种子每年9月、10月就可以采收，种子保存半年，完全可以满足组织培养育苗用种的的需求，为了保证种子出苗率，所述的S5播种步骤中，种子的保存时间不超过6个月。

本发明相对现有技术有以下有益效果：

1)本发明方法无菌保存白芨种子成本低，操作简便，方法简单，可进行批量处理和保存，白芨种子保存半年后，发芽率能够达到73％。

2)本发明方法保存的种子，组培育苗成本低，可快速获得无菌繁殖体系，不受季节限制，据生产需求，适时播种，在短期内获得大量种苗；无菌播种和生根壮苗两步完成整个组培育苗过程，这样能减少接种次数和培养时间；简化了组织培养操作环节，提高了工作效率，降低了组织培养育苗成本，投资成本低，容易推广，能够显著提高经济效益。

3)本发明方法保存的种子设置几道防线，减少播种污染源，将种子无菌播种污染率降到几乎为零。一是选择未开裂的果荚，充分消毒；二是消毒后将滋生病菌多的部位果蒂与果柄去除，减少污染源，避免剖开果荚时带入病菌，造成污染；三是在种子取出和分装时，每只离心管只装一个果荚的种子，避免操作过程中个别果荚灭菌不彻底，放在一起造成交叉感染；四是种子保存时，为了降低湿度，防止离心管四周滋生病菌，在干燥器中放入吸湿变色硅胶，预防滋生病菌，达到降低污染的效果。

4)本发明方法保存的种子由于将种子保存过程的污染降到最低，从而大大节约了培育成本。

具体实施方式

实施例1一种白芨种子的无菌保存方法

一种白芨种子的无菌保存方法，其包括以下步骤：

S1果荚的采集9-10月份，选择生长健壮、长势良好、产量高、无病虫害植株的成熟果荚，果荚未裂开、饱满、表面无斑点、无虫眼；

S2果荚表面处理及灭菌用肥皂水刷洗果荚表面，自来水下冲洗干净，然后在无菌工作台上，先用75％酒精浸泡30-60秒钟，再用0.1％的氯化汞溶液浸泡25-30分钟，无菌水冲洗4-5次，再用无菌滤纸吸干表面水份；

S3种子取出和分装用无菌手术刀剖开上述消毒后的果荚，用镊子取出种子，放入无菌的2-2.5mlPCR离心管中,盖上盖子,并用封口胶密封盖子四周；

S4种子的保存将上述装有种子的离心管放入干燥器中，用封口胶密封盖子，放置于温度为3-5度的冰箱中保存；

S5无菌播种将上述保存的种子均匀播种到1/2Ms+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L的培养基中萌芽培养。

种子取出和分装时，剖开果荚时，须切除果荚两端的果柄和果蒂，从中部纵向剖开。每只离心管只装一个果荚的种子。S4种子的保存时，还在干燥器中放入吸湿变色硅胶。

由于白芨种子每年9月、10月就可以采收，而且种子非常多，种子保存半年，完全可以满足生产育苗的需要；为了保证种子萌发率保持在一定的水平，所述的S5育苗步骤中，种子的保存时间不超过6个月。

实施例2不同保存时间种子的出苗率和播种污染率：

用实施例1的方法，将新采种子和放置在温度为4度冰箱中保存了60天，120天，150天的种子分别均匀播种到1/2Ms+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L的培养基中,，培养30天，测定不同保养时间种子的出苗率和播种污染率。

表1不同保存时间种子出苗率和播种污染率

从表1可以看出：随着种子保存时间的增加，种子出苗天数相应延长，种子出苗率呈下降趋势。与新采种子相比，保存60天、120天、150天的种子出苗率分别下降5.7％、9.8％、13.5％，而种子播种污染率没有影响，说明本发明保存方法切实可行。

实施例3不同保存方法种子出苗率的影响

与实施例1不同之处在于：T1为果荚不灭菌，连同果荚一起保存的种子的保存方法；T2为用75％酒精浸泡60秒钟，再用0.1％的氯化汞(Hgcl₂)溶液浸泡25分钟，连同果荚一起保存的种子的保存方法；T3为干燥器中不放吸湿变色硅胶，每只离心管只放一个果荚种子的保存种子的方法。不同的保存方法下，将种子均保存30天，实验统计得到种子的出苗数如下表2：

表2不同保存方法保存种子60天后的出苗数比较表

从表2可以看出：T1和T2处理方法保存的种子全部都污染，没有出苗，保存方法失败。T3与本发明方法区别在于是否放入吸湿变色硅胶，说明随着环境的变化，保存的种子也可能因环境湿度大而霉变，而放入吸湿变色硅胶的效果更好。本发明在保存60天时，出苗数最多，说明本方法保存的种子活力好，方法有效，切实可行。

实施例4种子不同保存方法与播种污染率的影响

与实施例1不同之处在于：T1.果荚采集后，放密封容器中，在3-5℃的冰箱中保存，播种时用75％酒精灭菌30秒钟，0.1％氯化汞灭菌25分钟，每粒果荚播2瓶；T2.果荚采集后，用75％酒精灭菌30秒钟，0.1％氯化汞灭菌25分钟，装入无菌密封容器中，在3-5℃的冰箱中保存，每粒果荚播2瓶。

T3.果荚采集后，用75％酒精灭菌30秒钟，0.1％氯化汞灭菌25分钟，将果荚从中部纵向剖开，用镊子取出种子，装入无菌PCR离心管中，每只离心管装入5粒果荚的种子，播种时，每只离心管播2瓶。

T4同本发明实施例1，果荚采集后，用75％酒精灭菌30秒钟，0.1％氯化汞灭菌25分钟，去除果柄、果蒂，将果荚从中部纵向剖开，用镊子取出种子，装入无菌PCR离心管中，每只离心管装入1粒果荚的种子，播种时，每只离心管播2瓶。结果见表3

表3种子不同保存方法与播种污染率的影响

处理方法	保存时间(天)	播种数(瓶)	污染数(瓶)	污染率(％)
					T1	30	20	20	100
T2	30	20	20	100
					T3	30	20	4	20
T4	30	20	0	0

从表3可以看出，T1和T2处理方法，播种污染率达到100％。说明这两种保存方法不可行。T3与T4相比，区别在于一个离心管中放入一粒果荚种子，还是放5粒果荚种子。T3污染率达到20％，说明还是会存在一定的交叉感染风险。而T4将风险降到零。这可能是多粒种子放在一个离心管中，如果一粒种子在消毒时没有完全或者保存过程中发霉，就可能造成整管种子都被污染。在种子播种接种到培养基时，由于一个离心管中多粒种子接种的培养瓶多，可能造成所有的培养瓶都被污染，全部浪费。而一个果夹种子放在一个离心管中，大大降低了交叉感染的风险，而且一粒种子能接种的培养瓶数少。即使污染了，造成的浪费也少。因此本发明的操作方法在种子保存过程中减少了交叉污染的几率，大大降低了污染风险，从而大大节约了种子培育成本。

本发明相对现有技术有以下有益效果：

1)本发明方法保存白芨种子成本低，操作简便，方法简单，可进行批量处理和保存，白芨种子保存半年，发芽率能够达到73％。

2)本发明方法保存的种子，组培育苗成本低，可快速获得无菌繁殖体系，不受季节限制，据生产需求，适时播种，在短期内获得大量种苗；通过无菌播种和生根壮苗两步完成整个组培育苗过程，这样能减少接种次数和培养时间；简化了组织培养操作环节，提高了工作效率，降低了组织培养育苗成本，投资成本低，容易推广，能够显著提高经济效益。

3)本发明方法保存的种子设置几道防线，将种子无菌播种污染率降到几乎为零。一是选择未开裂的果荚，充分消毒；二是消毒后将滋生病菌多的部位果蒂与果柄去除，减少污染源，避免剖开果荚时带入病菌，造成污染；三是在种子取出和分装时，每只离心管只装一个果荚的种子，避免操作过程中个别果荚灭菌不彻底，放在一起造成交叉感染；四是种子保存时，为了降低湿度，防止离心管四周滋生病菌，还在干燥器中放入吸湿变色硅胶，预防滋生病菌，达到降低污染的效果。

4)本发明方法保存的种子由于一只离心管只装一个果荚的种子，减少了交叉污染的几率，大大降低了污染风险，从而大大节约了种子培育成本。

Claims (5)

1.一种白芨种子的无菌保存方法，其包括以下步骤：

S1果荚的采集9-10月份，选择生长健壮、长势良好、产量高、无病虫害植株的成熟果荚，果荚未裂开、饱满、表面无斑点虫眼；

S2果荚表面处理及灭菌用肥皂水刷洗果荚表面，自来水下冲洗干净，然后在无菌工作台上，先用75％酒精浸泡30-60秒钟，再用0.1％的氯化汞溶液浸泡25-30分钟，无菌水冲洗4-5次，再用无菌滤纸吸干表面水份；

S3种子取出和分装用无菌手术刀剖开上述消毒后的果荚，用镊子取出种子，放入无菌的2-2.5mlPCR离心管中,盖上盖子,并用封口胶密封盖子四周；

S4种子的保存将上述装有种子的离心管放入干燥器中，用封口胶密封盖子，放置于温度为3-5度的冰箱中保存；

S5无菌播种将上述保存的种子均匀播种到1/2Ms+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L的培养基中萌芽培养。

2.根据权利要求1所述的白芨种子的无菌保存方法，其特征在于：所述的S2中剖开果荚时须切除果荚两端的果柄和果蒂，从中部纵向剖开。

3.根据权利要求1所述的白芨种子的无菌保存方法，其特征在于：所述的S3种子取出和分装时，每只离心管装一个果荚的种子。

4.根据权利要求1所述的白芨种子的无菌保存方法，其特征在于：所述的S4种子的保存时，还在干燥器中放入吸湿变色硅胶。

5.根据权利要求1所述的白芨种子的无菌保存方法，其特征在于：所述的S5组培育苗中，种子的保存时间不超过6个月。