CN111802380B - 一种桃休眠芽茎尖超低温离体保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种桃休眠芽茎尖超低温离体保存方法，包括以下步骤：预培养：取桃休眠芽茎尖，置于预培养基中进行预培养；玻璃化脱水处理：采用PVS3溶液进行80～120min的脱水处理；液氮冻存；解冻、卸载；恢复培养：卸载后的桃休眠芽茎尖置于恢复培养基中进行恢复培养；预培养基和恢复培养基中均添加一定量的活性炭和抗坏血酸。本发明以桃休眠芽茎尖为材料，减少了低温驯化步骤，简化了加载液处理、玻璃化液脱水处理步骤，改良了预培养基和恢复培养基，各步骤处理过程中对茎尖造成的损伤小，经保存后的茎尖再生率高，为桃种质资源长期稳定保存提供了一种新途径。
Description
【技术领域】
本发明属于植物种质低温保存技术领域，具体涉及了一种利用玻璃化法的桃休眠芽茎尖超低温离体保存方法。
【背景技术】
桃属于落叶木本多年生植物，原产于中国，然后传播到世界各地。食用桃是我国桃产业发展的主体，类型丰富，品种繁多，随着育种方法的发展，到2019年我国已经形成了上千种桃商品化品种，桃种质丰富的遗传资源也为今后的育种提供了更大的可能，因此对于桃种质资源进行合理的收集保存尤为重要。植物种质资源超低温保存是指在液氮(-196℃)的超低温条件下长期保存植物细胞、组织或器官并采取一定的方法使之回归正常生长的一整套生物技术，材料储存所需的空间小，维护成本低，并且低温环境能很大程度地减少污染的可能。植物材料冻存于液氮中时，只需要定期的补充液氮维持低温环境，就能够得以长期保存，因此超低温保存被认为是长期保存生物样品的理想方法。
种子、茎尖、愈伤等材料都可用于植物低温保存中，其中茎尖分生组织分化程度低，具有较好的遗传稳定性，因此在实际操作中通常被选择为超低温保存材料。休眠芽为冬季体外材料，易获取并且在收集时就具有一定程度的冷驯化，自1960年起就已经被应用于植物种植超低温保存技术中。玻璃化超低温保存法一般包括低温驯化、预培养、加载液处理、玻璃化溶液脱水处理、快速冷冻、水浴解冻、卸载洗涤和恢复培养等步骤。超低温保存是否成功的关键在于降温冰冻过程中避免细胞内结冰，其中低温驯化可以提前使植物暴露于低温环境中，增强其耐冻性，提高其冻后再生率；预培养可以增加细胞分裂与分化的同步化，减少细胞内自由水的含量，使细胞能接受低温胁迫，提高冻后再生率；玻璃化液溶液处理可使细胞在-196℃形成玻璃化，而没有冰的形成，但是玻璃化液对植物的毒害较大，严重影响植物的冻后再生率。经研究证明，玻璃化溶液处理前，装载处理(低浓度的玻璃化液处理)可以减轻玻璃化液毒性，而提高植物的冻存率。植物的超低温保存影响因素很多，如何获得高的冻后再生率是超低温成功保存的基础，也是众多学者研究的主要目的。
桃富含酚类物质，实际操作中休眠芽上的切割，处理过程中高渗溶液所造成的应激压力、低温环境等的物理损伤，都会使其表现出强烈的酚类分泌，这些酚类化合物可能会引起组织褐变，从而抑制液氮储存后的芽繁殖和恢复，因此，想获得高的冻后再生率更加困难。现有技术中还未有关于以桃休眠芽茎尖为材料进行超低温离体保存的研究报道。
【发明内容】
本发明的目的就在于为解决现有技术的不足而提供一种可以获得较高的冻后再生率的桃休眠芽茎尖超低温离体保存方法，。
本发明的目的是以下述技术方案实现的：
一种桃休眠芽茎尖超低温离体保存方法，包括以下步骤：
S1.预培养：取桃休眠芽茎尖，置于预培养基中进行预培养，所述预培养基为基础培养基+1.5～2.5gL-1活性炭+1.5～2.5gL-1抗坏血酸；
S2.玻璃化脱水处理：采用PVS3溶液对预培养后的桃休眠芽茎尖进行80～120min的脱水处理；
S3.液氮冻存：对脱水处理后的桃休眠芽茎尖进行液氮冻存处理；
S4.解冻、卸载：对液氮冻存后的桃休眠芽茎尖解冻、卸载处理；
S5.恢复培养：卸载后的桃休眠芽茎尖置于恢复培养基中进行恢复培养，所述恢复培养基为基础培养基+1.5～2.5gL-1活性炭+1.5～2.5gL-1抗坏血酸。
优选的，步骤S1桃休眠芽茎尖经以下步骤获得：取带芽的桃休眠枝条，首先经酒精消毒后，再用次氯酸钠消毒，然后用无菌水洗涤后，剥取得到茎尖。
优选的，所述酒精消毒时间为30s～1min，所述次氯酸钠浓度为8～10％，消毒时间为4～7min。
优选的，步骤S1预培养温度为4～5℃，预培养时间为2～6d，且避光培养。
优选的，所述预培养基的基础培养基为：MS+4.5～7gL-1琼脂+0.2～0.6ML-1蔗糖。
优选的，步骤S3所述液氮冻存时间大于24h。
优选的，步骤S4所述解冻方法为37～40℃水浴解冻。
优选的，步骤S4所述卸载采用卸载液处理20～40min，卸载过程中卸载液更换2～4次。
优选的，步骤S5所述恢复培养温度为23～27℃，且首先避光培养1～2周后再进行光培养。
优选的，所述恢复培养基的基础培养基为：MS+0.3～0.75mgL-16-BA+0.05～0.25mgL-1IBA+4.5～7gL-1琼脂+20～30gL-1蔗糖。
本发明提供的桃休眠芽茎尖超低温离体保存方法，首次以桃休眠芽茎尖为材料，进行超低温保存，且优化了超低温保存步骤，首先减少了低温驯化步骤，简化了加载液处理、玻璃化液脱水处理步骤，改良了预培养基和恢复培养基，各步骤处理过程中对茎尖造成的损伤小，经保存后的茎尖再生率高达85％，为桃种质资源长期稳定保存提供了一种新途径。
【附图说明】
图1是死亡的冻后桃休眠芽茎尖TTC染色后的效果图；
图2是存活的冻后桃休眠芽茎尖TTC染色后的效果图；
图3是采用恢复培养基础培养基，桃休眠芽茎尖超低温保存成活再生效果图；
图4是实验例一中，采用编号4恢复培养基，桃休眠芽茎尖超低温保存成活再生效果图；
图5是实验例一中，编号1～7不同恢复培养基组成对桃休眠芽茎尖超低温保存再生率的影响统计图，图中不同小写字母表示不同玻璃化溶液处理时间对桃休眠芽茎尖超低温保存成活率差异显著性(P<0.05)，字母不同表示差异显著；
图6是实验例二中不同玻璃化溶液PVS3处理时间对桃休眠芽茎尖超低温保存再生率的影响统计图；
图7是实验例二中PVS3处理100min后桃休眠芽茎尖冻后恢复再生图；
图8是实验例三中不同活性炭添加量对桃休眠芽茎尖超低温保存再生率的影响统计图。
【具体实施方式】
本发明提供的桃休眠芽茎尖超低温离体保存方法，包括以下步骤：
S1.预培养：取桃休眠芽茎尖，置于预培养基中进行预培养，预培养基为基础培养基+1.5～2.5gL-1活性炭+1.5～2.5gL-1抗坏血酸；经研究，预培养基与现有技术的基础培养基相比，添加了活性炭和抗坏血酸，具有抗氧化作用，可以减少存活的冻后茎尖在恢复过程中出现的褐化死亡现象，提高冻后茎尖的存活率；
S2.玻璃化脱水处理：采用PVS3溶液对预培养后的桃休眠芽茎尖进行80～120min的脱水处理；桃休眠芽茎尖组织脆弱，相比其他组织，受到的玻璃化液毒性影响更大，对玻璃化处理时间、浓度要求更加严格，经研究，采用PVS3溶液直接脱水处理80～120min，不需加载处理，即可获得较高的冻后再生率；
S3.液氮冻存：脱水处理后的桃休眠芽茎尖更换新的PVS3溶液，然后于液氮中冻存；
S4.解冻、卸载：对液氮冻存后的桃休眠芽茎尖解冻、卸载处理；
S5.恢复培养：卸载后的桃休眠芽茎尖置于恢复培养基中进行恢复培养，恢复培养基为基础培养基+1.5～2.5gL-1活性炭+1.5～2.5gL-1抗坏血酸。与预培养基相同，本发明恢复培养基与现有技术的基础培养基相比，主要添加了活性炭和抗坏血酸，可以减少存活的冻后茎尖在恢复过程中出现的褐化死亡现象，提高冻后茎尖的存活率。
休眠芽又称潜伏芽，即长期保持休眠状态而不萌发的芽，如一般木本植物，枝条上靠下部的腋芽在生长季节不生长，呈休眠状态，属于休眠芽。本发明采用的休眠芽采样时间是郑州地区的12月中旬到次年1月，在温度上休眠芽以休眠状态一般已经历了相当长时期的(4℃以下)低温大环境，相当于在室外已经经历了低温驯化这一过程，之后不需要人工再次驯化，因此，相对于其他试验材料节省了低温驯化的时间。-
本发明首次以桃休眠芽茎尖为材料，进行超低温保存，且优化了超低温保存步骤，减少了低温驯化步骤，简化了加载液处理、玻璃化液脱水处理步骤，改良了预培养基和恢复培养基，各步骤处理过程中对茎尖造成的损伤小，经保存后的茎尖再生率高达85％，为桃种质资源长期稳定保存提供了一种新途径。
优选的，步骤S1桃休眠芽茎尖经以下步骤获得：取带芽的桃休眠枝条，首先经酒精消毒后，再用次氯酸钠消毒，然后用无菌水洗涤后，在解剖镜下剥取得到茎尖。
优选的，酒精消毒时间为30s～1min，次氯酸钠浓度为8～10％，消毒时间为4～7min。
优选的，步骤S1预培养温度为4～5℃，预培养时间为2～6d，且避光培养。适宜的培养温度和时间可以获得最优的预培养效果，提高冻后再生率。
优选的，预培养基的基础培养基可以采用现有技术常规的预培养基，本发明给出一个优选的基础培养基为：MS+4.5～7gL-1琼脂+0.2～0.6ML-1蔗糖，但不限于上述基础培养基。
本发明步骤S3液氮冻存、步骤S4解冻、卸载可采用常规方法，以下给出一个现有技术使用较多的方法，但不限于以下方法：
步骤S3液氮冻存时间大于24h。
步骤S4解冻方法为37～40℃水浴解冻。
步骤S4卸载采用卸载液处理20～30min，卸载过程中更换2～4次卸载液，卸载液组成为：1.2ML-1蔗糖+pH 5.8MS溶液。
优选的，步骤S5恢复培养温度为23～27℃，且首先避光培养1～2周后再进行光培养。适宜的培养温度和时间可以获得最优的恢复培养效果，提高冻后再生率。
优选的，恢复培养基的基础培养基可以采用现有技术常规的恢复培养基，本发明给出一个优选的基础培养基为：MS+0.3～0.75mgL-16-BA+0.05～0.25mgL-1IBA+4.5～7gL-1琼脂+20～30gL-1蔗糖，但不限于上述培养基。
如本领域技术人员可以理解的，可根据选取的桃品种而相应改动本发明预培养基的基础培养基、恢复培养基的基础培养基配方等，以及其他相应参数(如恢复培养温度等)，尤其是恢复培养基中激素(6-BA、IBA)的添加量，激素的含量及比例都会影响冻后桃休眠芽茎尖的正常生长。
实施例1
本实施例提供的桃休眠芽茎尖超低温离体保存方法，具体步骤如下：
(1)室外采得桃冬季休眠枝条(品种：中桃红玉)，去除长枝条上的花芽，将枝条处理成每段只含一个休眠芽的2～3cm小段；
(2)剥鳞片：用镊子剥去每个休眠芽表层的4～5层鳞片，直至得到浅绿色包裹的芽体；
(3)在超净工作台中，首先用75％酒精(v/v)消毒1min，再用10％(w/w)次氯酸钠消毒6min，无菌水冲洗5次，在解剖镜下剥取茎尖；
(4)茎尖置于含预培养基的平皿上，封口膜包裹后4℃下黑暗预培养4d，预培养基的组成为：MS+2gL-1活性炭+2gL-1抗坏血酸+6gL-1琼脂+0.4ML-1蔗糖，pH5.8；本发明所用MS培养基为市售商品，浓度为4.42gL-1；
(5)加载、玻璃化脱水处理过程中，略去加载处理，预培养后的茎尖直接用PVS3溶液进100min的脱水处理，PVS3溶液组成：50％(w/v)蔗糖+50％(w/v)甘油+pH 5.8MS溶液；
(6)将脱水后的桃茎尖装入含有1.8mLPVS3溶液的冷冻管中，迅速投入液氮中冻存24h；
(7)液氮中取出冻存后的冷冻管缓缓放入40℃水浴锅中解冻5min；无菌常温条件下进行常规卸载处理30min，每10min更换一次，卸载液组成：1.2ML-1蔗糖+pH 5.8MS溶液；
桃休眠芽茎尖经解冻后通过TTC染色法测试其活力，TTC可以将活细胞染为红色，而死细胞不着色。将解冻后的桃休眠芽茎尖放入0.6％的TTC溶液中，28±2℃条件下对冻后茎尖进行6h左右染色，取出茎尖洗净后显微镜下观察茎尖染色情况，染色结果见图一和图2所示(图1：未存活茎尖；图2：存活茎尖)；
实施例2
本实施例提供的桃休眠芽茎尖超低温离体保存方法，具体步骤如下：
(1)室外采得桃冬季休眠枝条(品种：中桃红玉)，去除长枝条上的花芽，将枝条处理成每段只含一个休眠芽的2～3cm小段；
(2)剥鳞片：用镊子剥去每个休眠芽表层的4～5层鳞片，直至得到浅绿色包裹的芽体；
(3)在超净工作台中，首先用75％酒精(v/v)消毒1min，再用10％(w/w)次氯酸钠消毒6min，无菌水冲洗5次，在解剖镜下剥取茎尖；
(4)茎尖置于含预培养基的平皿上，封口膜包裹后4℃下黑暗预培养6d，预培养基的组成为：MS+2gL-1活性炭+2gL-1抗坏血酸+6gL-1琼脂+0.4ML-1蔗糖，pH5.8；
(5)加载、玻璃化脱水处理过程中，略去加载处理，预培养后的茎尖直接用PVS3溶液进100min的脱水处理，PVS3溶液组成：50％(w/v)蔗糖+50％(w/v)甘油+pH 5.8MS溶液；
(6)将脱水后的桃茎尖装入含有1.8mLPVS3溶液的冷冻管中，迅速投入液氮中冻存24h；
(7)液氮中取出冻存后的冷冻管缓缓放入40℃水浴锅中解冻5min；无菌常温条件下进行常规卸载处理30min，每10min更换一次，卸载液组成：1.2ML-1蔗糖+pH 5.8MS溶液；
(8)卸载处理后将茎尖移入恢复培养基中25±2℃暗培养7d后再进行光培养，每隔30d更换一次培养基；
恢复培养基的组成为：4.42gL-1MS+0.5mgL-1 6-BA+0.1mgL-1IBA+2gL-1活性炭+2gL-1抗坏血酸+6gL-1琼脂+30gL-1蔗糖，pH5.8；中桃红玉对6-BA含量要求较为严格，含量过多或过少均会影响桃冻后茎尖的正常生长。
冻后茎尖于恢复培养基培养十周后统计茎尖的成活率，达85％。
实施例3
本实施例提供的桃休眠芽茎尖超低温离体保存方法，具体步骤如下：
(1)室外采得桃冬季休眠枝条(品种：中桃红玉)，去除长枝条上的花芽，将枝条处理成每段只含一个休眠芽的2～3cm小段；
(2)剥鳞片：用镊子剥去每个休眠芽表层的4～5层鳞片，直至得到浅绿色包裹的芽体；
(3)在超净工作台中，首先用75％酒精(v/v)消毒30s，再用8％(w/w)次氯酸钠消毒7min，无菌水冲洗5次，在解剖镜下剥取茎尖；
(4)茎尖置于含预培养基的平皿上，封口膜包裹后2℃下黑暗预培养2d，预培养基的组成为：4.42gL-1MS+2gL-1活性炭+2.5gL-1抗坏血酸+6gL-1琼脂+0.4ML-1蔗糖，pH5.8；
(5)加载、玻璃化脱水处理过程中，略去加载处理，预培养后的茎尖直接用PVS3溶液进100min的脱水处理，PVS3溶液组成：50％(w/v)蔗糖+50％(w/v)甘油+pH 5.8MS溶液；
(6)将脱水后的桃茎尖装入含有1.8mLPVS3溶液的冷冻管中，迅速投入液氮中冻存30h；
(7)液氮中取出冻存后的冷冻管缓缓放入38℃水浴锅中解冻5min；无菌常温条件下进行常规卸载处理20min，每10min更换一次，卸载液组成：1.2ML-1蔗糖+pH 5.8MS溶液；
(8)卸载处理后将茎尖移入恢复培养基中25±2℃暗培养2周后再进行光培养，每隔30d更换一次培养基；
恢复培养基的组成为：4.42gL-1MS+0.5mgL-1 6-BA+0.1mgL-1IBA+2gL-1活性炭+2.5gL-1抗坏血酸+6gL-1琼脂+30gL-1蔗糖，pH5.8。
实施例4
本实施例提供的桃休眠芽茎尖超低温离体保存方法，具体步骤如下：
(1)室外采得桃冬季休眠枝条(品种：中农金辉)，去除长枝条上的花芽，将枝条处理成每段只含一个休眠芽的2～3cm小段；
(2)剥鳞片：用镊子剥去每个休眠芽表层的4～5层鳞片，直至得到浅绿色包裹的芽体；
(3)在超净工作台中，首先用75％酒精(v/v)消毒1min，再用9％(w/w)次氯酸钠消毒4min，无菌水冲洗5次，在解剖镜下剥取茎尖；
(4)茎尖置于含预培养基的平皿上，封口膜包裹后4℃下黑暗预培养4d，预培养基的组成为：4.42gL-1MS+2gL-1活性炭+1.5gL-1抗坏血酸+7gL-1琼脂+0.6ML-1蔗糖，pH5.8；
(5)加载、玻璃化脱水处理过程中，略去加载处理，预培养后的茎尖直接用PVS3溶液进100min的脱水处理；
(6)将脱水后的桃茎尖装入含有1.8mLPVS3溶液的冷冻管中，迅速投入液氮中冻存24h；
(7)液氮中取出冻存后的冷冻管缓缓放入39℃水浴锅中解冻5min；无菌常温条件下进行常规卸载处理30min，每10min更换一次；卸载液组成：1.2ML-1蔗糖+pH 5.8MS溶液；
(8)卸载处理后将茎尖移入恢复培养基中25±2℃暗培养7d后再进行光培养，每隔30d更换一次培养基；
恢复培养基的组成为：4.42gL-1MS+0.75mgL-1 6-BA+0.25mgL-1IBA+2gL-1活性炭+1.5gL-1抗坏血酸+5gL-1琼脂+25gL-1蔗糖，pH5.8。
实施例5
本实施例提供的桃休眠芽茎尖超低温离体保存方法，具体步骤如下：
(1)室外采得桃冬季休眠枝条(品种：中蟠11号)，去除长枝条上的花芽，将枝条处理成每段只含一个休眠芽的2～3cm小段；
(2)剥鳞片：用镊子剥去每个休眠芽表层的4～5层鳞片，直至得到浅绿色包裹的芽体；
(3)在超净工作台中，首先用75％酒精(v/v)消毒1min，再用10％(w/w)次氯酸钠消毒6min，无菌水冲洗5次，在解剖镜下剥取茎尖；
(4)茎尖置于含预培养基的平皿上，封口膜包裹后4℃下黑暗预培养4d，预培养基的组成为：4.42gL-1MS+2gL-1活性炭+2gL-1抗坏血酸+4.5gL-1琼脂+0.4ML-1蔗糖，pH5.8；
(5)加载、玻璃化脱水处理过程中，略去加载处理，预培养后的茎尖直接用PVS3溶液进100min的脱水处理；
(6)将脱水后的桃茎尖装入含有1.8mLPVS3溶液的冷冻管中，迅速投入液氮中冻存24h；
(7)液氮中取出冻存后的冷冻管缓缓放入37℃水浴锅中解冻5min；无菌常温条件下进行常规卸载处理30min，每10min更换一次；
(8)卸载处理后将茎尖移入恢复培养基中25±2℃暗培养14d后再进行光培养，每隔30d更换一次培养基；
恢复培养基的组成为：4.42gL-1MS+0.3mgL-1 6-BA+0.05mgL-1IBA+2gL-1活性炭+2gL-1抗坏血酸+6gL-1琼脂+20gL-1蔗糖，pH5.8。
实验例一：恢复培养基的组成对桃休眠芽茎尖超低温保存成活率的影响试验
除了预培养基和恢复培养培养基采用基础培养基，脱水处理80min，其他操作步骤同实施例一。由于受前期处理过程的影响，发现部分存活的冻后茎尖在恢复过程中会出现褐化死亡现象，导致后续保存失败，经研究，添加一定量的抗氧化因子可以减少褐化死亡，并经初步筛选，选择了活性炭、抗坏血酸Vc、脯氨酸三种抗氧化因子，为确保存活茎尖进一步生长成苗，提高冻后茎尖的成活率，针对桃品种特性，对恢复培养基础恢复培养基中添加活性炭、抗坏血酸Vc、脯氨酸三种抗氧化因子进行了进一步筛选调节，筛选用量(g/L)如表1所示。
表1
注：恢复培养基的基础培养基组成为：4.42gL-1MS+0.5mgL-1 6-BA+0.1mgL-1IBA+6gL-1琼脂+30gL-1蔗糖，pH5.8。
结果表明在每L基础恢复培养基中加入2g活性炭及2g抗坏血酸Vc能够获得该处理条件下最高的成苗率66％。具体结果如图3、图4和图5所示。
实验例二：玻璃化溶液处理时间对桃休眠芽茎尖超低温保存成活率的影响试验
除了玻璃化脱水处理时间分别采用0min、20min、40min、60min、80min、100min和120min，其他操作步骤同实施例一，冻后茎尖培养十周后统计茎尖的成活率，根据再生茎尖数占实验所用茎尖数的百分比得出冻后茎尖的再生率。结果如图6、图7所示。
结果表明，玻璃化溶液处理时，0min的对白处理无茎尖存活，说明细胞内含水量大，影响茎尖的超低温保存；随着处理时间的逐渐延长，当玻璃化溶液处理时间为100min时，桃休眠芽茎尖获得了85％的最大再生率，处理时间超过100min时，细胞脱水过度，影响桃休眠芽茎尖的冻后存活率。
实验例三：活性炭添加量对桃休眠芽茎尖超低温保存成活率的影响试验
除了活性炭(预培养基和恢复培养基中)添加量分别为0gL-1、0.5gL-1、1.0gL-1、1.5gL-1、2.0gL-1、2.5gL-1及3.0gL-1其他操作步骤同实施例一，冻后茎尖培养十周后统计茎尖的成活率，根据再生茎尖数占实验所用茎尖数的百分比得出冻后茎尖的再生率。结果如图8所示。
结果表明，当活性炭添加量为0gL-1时的对照处理茎尖再生率最低，组织出现褐化情况严重，影响茎尖的超低温保存；随着活性炭添加量的增加，桃冻后休眠芽茎尖的再生率逐渐提高，在1.5～2.5gL-1范围内获得了较高的再生率，当活性炭的添加量超过2.5gL-1时，桃休眠芽茎尖的冻后再生率下降，分析原因，可能是活性炭选择性吸附性较差，活性炭添加量过多时对培养基中激素含量分布产生影响，进而影响休眠芽茎尖的冻后再生情况。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (8)
1.一种桃休眠芽茎尖超低温离体保存方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.预培养：取桃休眠芽茎尖，置于预培养基中进行预培养，所述预培养基为基础培养基+1.5～2.5gL-1活性炭+1.5～2.5gL-1抗坏血酸；
S2.玻璃化脱水处理：采用PVS3溶液对预培养后的桃休眠芽茎尖进行80～120min的脱水处理；
S3.液氮冻存：对脱水处理后的桃休眠芽茎尖进行液氮冻存处理；
S4.解冻、卸载：对液氮冻存后的桃休眠芽茎尖解冻、卸载处理；
S5.恢复培养：卸载后的桃休眠芽茎尖置于恢复培养基中进行恢复培养，所述恢复培养基为基础培养基+1.5～2.5gL-1活性炭+1.5～2.5gL-1抗坏血酸；
所述预培养基的基础培养基为：MS+4.5～7gL-1琼脂+0.2～0.6ML-1蔗糖；
所述恢复培养基的基础培养基为：MS+0.3～0.75mgL-16-BA+0.05～0.25mgL-1IBA+4.5～7gL-1琼脂+20～30gL-1蔗糖。
2.如权利要求1所述的桃休眠芽茎尖超低温离体保存方法，其特征在于，
步骤S1桃休眠芽茎尖经以下步骤获得：取带芽的桃休眠枝条，首先经酒精消毒后，再用次氯酸钠消毒，然后用无菌水洗涤后，剥取得到茎尖。
3.如权利要求2所述的桃休眠芽茎尖超低温离体保存方法，其特征在于，
所述酒精消毒时间为30s～1min，所述次氯酸钠浓度为8～10％，消毒时间为4～7min。
4.如权利要求1所述的桃休眠芽茎尖超低温离体保存方法，其特征在于，
步骤S1预培养温度为4～5℃，预培养时间为2～6d，且避光培养。
5.如权利要求1所述的桃休眠芽茎尖超低温离体保存方法，其特征在于，
步骤S3所述液氮冻存时间大于24h。
6.如权利要求1所述的桃休眠芽茎尖超低温离体保存方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S4所述解冻方法为37～40℃水浴解冻。
7.如权利要求1所述的桃休眠芽茎尖超低温离体保存方法，其特征在于，
步骤S4所述卸载采用卸载液处理20～40min，卸载过程中卸载液更换2～4次。
8.如权利要求1所述的桃休眠芽茎尖超低温离体保存方法，其特征在于，
步骤S5所述恢复培养温度为23～27℃，且首先避光培养1～2周后再进行光培养。
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