CN113854283A

CN113854283A - 一种油橄榄胚性愈伤组织超低温冷冻保存方法

Info

Publication number: CN113854283A
Application number: CN202111037735.8A
Authority: CN
Inventors: 龙伟; 姚小华; 任华东
Original assignee: Research Institute of Subtropical Forestry of Chinese Academy of Forestry
Current assignee: Research Institute of Subtropical Forestry of Chinese Academy of Forestry
Priority date: 2021-09-06
Filing date: 2021-09-06
Publication date: 2021-12-31

Abstract

本发明公开了一种油橄榄胚性愈伤组织超低温冷冻保存方法，首先将胚性愈伤组织置于附加高浓度蔗糖增殖培养基进行预培养；在0℃下，将经预培养的胚性愈伤组织转入到40％～80％液体冷冻保护剂处理；再把经过渡脱水处理的胚性愈伤组织转入到100％液体冷冻保护剂处理，经换液后迅速地直接投入到液氮冷冻保存；复苏时将冻存管从液氮取出后经2级水温完成解冻，将经过解冻清洗的胚性愈伤组织经过2步过渡培养，最后然后转到正常培养基。本发明是前期的技术体系的深入和改进，无需昂贵的仪器设备，操作简单，成本低廉，易于推广。

Description

一种油橄榄胚性愈伤组织超低温冷冻保存方法

技术领域

本发明属于林业生物技术领域，涉及一种林木种质资源长期保存和利用方法，具体地说，涉及一种油橄榄胚性愈伤组织超低温冷冻保存方法。

背景技术

随着人口的急剧增长、现代工业污染和环境生态平衡遭到严重破坏,一些珍贵、稀有物种以及具有抗虫、抗病、抗毒、抗不良环境潜能的地方栽培品种已经灭绝或濒于绝种。此外，随着植物育种技术的发展,高产品种单一化现象日益明显，植物遗传基础也越来越狭窄，因此扩大和保存优良植物种质资源越来越收到全球的关注，但如何长期、稳定地保存这些植物种质资源成为需要解决的问题。据报道，目前大约有全球的植物物种中有1/3，大约100，000种以上，在野外面临着灭绝的危险。不论古时和现代(遗传育种)植物的育种程序，植物多样性的保存时很重要的。而且，植物多样性为医药行业，食品行业和农作物保护提供资源。自从70年代以来，大量农作物栽培种的野生种被保存野外基因库里。据估计，大约有6百万多种植物遗传资源被保存在一些私人地区，国家和国际性的基因库内。目前常用的保存方法为组织培养保存、低温保存和异地保存。低温保存方法对植物种质资源干燥的种子的储存大多数采用的方式，但这种方法不适合农作物的种质资源(如香蕉)或者顽拗型种子的保存(如热带树种的种子)；异地保存方法采用原地保存和异地野外保存两种方法，但随着环境和人为因素压力的加大，无论原地和异地野外保存，均易受到各种自然灾害和人为的破坏而丧失。20世纪60年代到80年代之间，科学家尝试将引来的品种进行保护地栽培或者利用组培快繁的方法进行保存，但这些方法存在着低效和高代价等不可避免的局限；首先，大量的种质资源保存或栽培需占用大面积的土地，管理费用高；其次，在保存过程中由于长期施加外界因素的影响，引发变异和造成种质退化，从而影响种质的遗传品质稳定，特别是器官组织培养的长期继代会引起细胞染色体倍数的变化，导致再生能力和出苗率下降。最后，由于昆虫，病害和不利的天气条件等因素，野外保存有可能造成种质资源的灭绝。

油橄榄作为重要的木本油料树种，具备广泛的适应性和稳定性，被世界各地陆续引种，使得美国、阿根廷、澳大利亚等国成为继地中海外的橄榄油供应地。我国随着健康饮食、营养安全成为广大人民群众的消费理念，橄榄油也因其符合上述特点，受到消费者的欢迎，进口量逐年增加，2020年度达5.2万吨，也由此推动国内种植面积的不断扩大，但由于油橄榄属于外来树种，原生环境与国内环境存在较大差异，迫切需要培育出适合我国气候环境的品种；良种的培育来源于丰富的遗传资源基础，才能支撑起各类特殊目的的良种培育，但现实常常因环境气候的剧烈变化导致引进的特异种质资源易死亡，这对于扩大遗传资源基础来源产生不利影响。与此同时，随着国内各研究单位对良种培育的加大，选育过程中产生大量优质的种质资源，有限的土地资源限制了种植范围的无限制扩大，且受到环境、管理、自然灾害和病虫害等因素的影响，极易导致油橄榄种质资源萎缩，乃至死亡。为充分保存优良种质资源，扩大遗传基础，维持遗传稳定性，降低环境、土壤和人为干扰对种质资源的影响，有必要对种质资源进行合理、安全的保存。

液氮超低温保存技术从开始成功储存植物材料发展至今，已被公认为种质长期保存的最佳方法之一。植物材料在液氮超低温环境中会停止细胞新陈代谢，因而细胞活力和形态理论上可获得稳定保存。若能利用液氮超低温保存技术实现其种质资源的长期保存，可大大延长种质资源寿命，大幅降低活体种质保存成本。冷冻保存允许保存组织的发育潜能，且用最少的数量和最低的风险维持细胞的完整性。与前面保存方法比较，显示较高的安全性和稳定性。因此，具备稳定、高效、低廉和存储量大等特点的超低温保存技术可用于油橄榄种质资源的长期保存。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种油橄榄胚性愈伤组织超低温冷冻保存方法，该方法用于胚性愈伤组织的超低温保存以及利用该技术进行优良植物品种和种质的保存和利用，利用新开发的冷冻保护液为基础，通过调整处理的时间，冷冻保护剂浓度、材料处理方式和流程，获得的胚性愈伤组织具备较高的细胞存活率。该方法具有简单，成本低，易于推广的特点。可以长时间地保存胚性愈伤组织。目前由于体细胞胚胎的诱导受基因型差别，环境因素影响较大。因此如何长时间保存诱导出的胚性细胞，延长保存时间用于研究和扩大生产是需要迫切解决的难题。本试验通过建立一种油橄榄胚性愈伤组织的长期冷冻保存方法，来较长时间地保存胚性愈伤组织，且并不影响胚性愈伤组织复苏后的生活力。

其具体技术方案为：

一种油橄榄胚性愈伤组织超低温冷冻保存方法，包括以下步骤：

选取生长正常的淡黄色胚性细胞组织，放入高渗培养基进行预培养，之后将预培养细胞放入0℃预冷的冷冻保护剂缓速脱水，然后放入高浓度冷冻保护剂内完全脱水，最后快速置于液氮，需要时取出解冻复苏，恢复培养。

步骤1、预培养，将胚性愈伤组织置于MS培养基附加2,4D 1.5～3mg/L+6,BA 0.1～0.2mg/L+蔗糖0.3～1.0mol/L+琼脂7～9g/L+pH 5.8～6.5，24～27℃暗培养7～14d。

步骤2、在0℃下，将胚性愈伤组织转入到40％～80％冷冻保护剂进行过渡脱水，冷冻保护剂配制方法为：MS培养基附加2,4D 1.5～3mg/L+6,BA 0.1～0.2mg/L+pH 5.8～6.5内加入甘油9％～13％(v/v)+乙二醇11～14％(v/v)+DMSO 14～17％(v/v)+PEG4000 3～5g/L+蔗糖0.2～0.4mol/L，培养10～30min；把经过过渡脱水处理的胚性愈伤转入到0℃预冷的100％的冷冻保护剂中处理35～70min，然后迅速地直接投入到液氮中冷冻保存。

步骤3、将冷冻保存的冻存管从液氮中取出后直接浸入35～42℃水浴中，约80～110s完成解冻，然后再浸入到25～30℃水浴25～30s，解冻后的胚性愈伤组织以用MS培养基附加2,4D 1.5～3mg/L+6,BA 0.1～0.2mg/L+蔗糖0.3～0.5mol/L+pH 5.8～6.5，在室温清洗3次，每次3min。

步骤4、恢复培养，将清洗好的胚性愈伤转入到MS培养基附加2,4D 1.5～3mg/L+6,BA 0.1～0.2mg/L+蔗糖0.3～0.5mol/L+琼脂7～9g/L+pH 5.8～6.5上，24～27℃暗培养3～5d；再转到MS培养基附加2,4D 1.5～3mg/L+6,BA 0.1～0.2mg/L+0.1～0.3mol/L蔗糖+琼脂7～10g/L+pH 5.8～6.5上，24～27℃暗培养1～3d；最后转入到MS培养基附加2,4D 1.5～3mg/L+6,BA 0.1～0.2mg/L+蔗糖30～40g/L+琼脂7～9g/L+pH 5.8～6.5上，24～27℃暗培养。

进一步，步骤1中，在正常培养基，MS培养基附加2,4D 1.5～3mg/L+6,BA0.1～0.2mg/L+蔗糖30～40g/L+琼脂7～9g/L+pH 5.8～6.5上继代15～20d的淡黄色胚性愈伤组织上挑出0.5～0.8g规格细胞团，置于正常培养基附加蔗糖0.3～1.0mol/L上预培养7～14d，然后将胚性愈伤组织放置在无菌滤纸上滚动翻转5～10s，去除表层水份。

进一步，步骤2中，迅速去除水分的胚性愈伤组织转入到0℃预冷的40％～80％的冷冻保护剂溶液中，培养10～30min，期间轻微晃动放入胚性愈伤组织的冷冻保护剂溶液。然后将过渡脱水的胚性愈伤组织取出，随后取出置于0℃预冷的无菌滤纸上滚动翻转5～10s，再将胚性愈伤组织转入到0℃预冷的100％的冷冻保护剂的冻存管中，培养35～70min；最后将冷冻保护剂吸出，重新加入0℃预冷的100％冷冻保护剂，迅速封盖投入到液氮中。

进一步，步骤3中，将装有胚性愈伤组织的冻存管迅速从液氮取出后置于35～42℃的循环水浴锅中，80～110s取出后迅速再浸入25～30℃水浴锅25～30s，然后将胚性愈伤组织从冻存管取出，置于室温无菌滤纸滚动翻转5～10s，再次用室温的液体预培养基清洗3次，每次3min，清洗完成后用无菌滤纸滚动翻转5～10s。

进一步，步骤4中，将去除冷冻保护剂的胚性愈伤组织置于垫有无菌滤纸的MS培养基附加2,4D 1.5～3mg/L+6,BA 0.1～0.2mg/L+蔗糖0.3～0.5mol/L+琼脂7～9g/L+pH 5.8～6.5的恢复培养基上，培养基需要经过滤纸先期吸取表层冷凝水，培养基凝固剂须为琼脂，24～27℃暗培养3～5d，然后将载有胚性愈伤组织的滤纸整体转入到MS培养基附加2,4D1.5～3mg/L+6,BA 0.1～0.2mg/L+蔗糖0.1～0.3mol/L+琼脂7～9g/L+pH 5.8～6.5上，培养基需要经过滤纸先期吸取表层冷凝水，24～27℃暗培养1～3d。最后将经恢复培养的胚性愈伤组织转入到正常培养基，24～27℃暗培养。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明解决了长期继代保存引起的遗传变异问题，同时也解决了远距离运输的难题，可以在较小的面积上保存较多的种质资源，提高了效率；胚性愈伤在超低温(-196)℃状态下代谢完全停止，生命以静止的形式可以在这种状态下长期保存，解冻后又可恢复其原有的生物活性和遗传特性。该方法简单易行，有效地解决了种质资源保存中的污染，混杂、变异的问题而保持遗传稳定，二是简单易行，三是可以大量保存种质材料。

附图说明

图1是实施例1中的胚性愈伤冷冻前活力变化趋势图；

图2是实施例2中的胚性愈伤冷冻前活力变化趋势图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1

取A1基因型胚性愈伤组织，置于MS培养基附加2,4D 2.0mg/L+6,BA 0.15mg/L+蔗糖0.4mol/L+琼脂7.0g/L+pH 6.0的预培养上，24～27℃暗培养7～14d；将预培养后的胚性愈伤组织转入到0℃预冷的50％的冷冻保护剂中，培养15min；随后取出置于0℃预冷的无菌滤纸上滚动翻转5～10s后，然后将胚性愈伤组织转入到0℃预冷的100％的冷冻保护剂中处理50min，更换新鲜0℃预冷的100％冷冻保护剂后迅速地投入到液氮中速冻保存。

复苏，将冷冻保存的冻存管有液氮中取出后直接浸入37℃水浴中，约90s完成解冻，取出后迅速再浸入25℃水浴锅28s；解冻后的胚性愈伤用预培养溶液在室温清洗3次，每次3min。

恢复培养，将清洗好的胚性愈伤转入到MS培养基附加2,4D 2.0mg/L+6,BA0.15mg/L+0.3～1.0mol/L蔗糖+琼脂7.0g/L+pH 6.0的固体恢复培养基上，24～27℃暗培养3～5d；然后转到MS培养基附加2,4D 2.0mg/L+6,BA 0.15mg/L+蔗糖0.3mol/L+琼脂7.0g/L+pH 6.0的固体恢复培养基上，24～27℃暗培养1～3d；最后把处理后的胚性愈伤转入MS培养基附加2,4D 2.0mg/L+6,BA 0.15mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+pH 6.0。对冷冻前后细胞活力利用TTC染色，分光光度计测定，结果如图1所示，冷冻前胚性愈伤细胞活力随蔗糖浓度的提高而总体逐渐下降，冻存后胚性愈伤细胞活力呈现先升后降趋势，在0.4mol/L时虽然细胞活力有所下降，但冷冻后的活力最高，因此该基因型最佳预培养浓度为0.4mol/L，并如表1所示，冷冻复苏后的胚性愈伤细胞活力最高是冷冻前的50.09％。

表1.胚性细胞生长前后活力测定

实施例2

取A2基因型胚性愈伤组织，置于MS培养基附加2,4D2.5 mg/L+6,BA 0.2mg/L+0.3～1.0mol/L蔗糖+琼脂7.5g/L+pH 6.0上，24～27℃暗培养7～14d；将预培养后的胚性愈伤组织转入到0℃预冷的60％的冷冻保护剂中，培养20min；随后取出置于0℃预冷的无菌滤纸上滚动翻转5～10s后，然后将胚性愈伤组织转入到0℃预冷的100％的冷冻保护剂中处理40min，更换新鲜0℃预冷的100％冷冻保护剂后迅速地投入到液氮中速冻保存。

复苏，将冷冻保存的冻存管有液氮中取出后直接浸入37℃水浴中，约90s完成解冻，取出后迅速再浸入25℃水浴锅25s；解冻后的细胚性愈伤用预培养溶液在室温清洗3次，每次3min。

恢复培养，将清洗好的胚性愈伤转入到MS培养基附加2,4D 2.5mg/L+6,BA 0.2mg/L+0.5mol/L蔗糖+琼脂7.0g/L+pH 6.0上，24～27℃暗培养3～5d；然后转到MS培养基附加2,4D 2.5mg/L+6,BA 0.2mg/L+0.3mol/L蔗糖+琼脂7.0g/L+pH 5.8～6.0上，24～27℃暗培养1～3d；最后把处理后的细胞转入到MS培养基附加2,4D 2.5mg/L+6,BA 0.2mg/L+蔗糖35g/L+琼脂7.5g/L+pH 6.0。采用通过TTC法染色，并用分光光度计测定冷冻前后细胞活力，结果如图2所示，预培养时该基因型随蔗糖浓度的增加，胚性愈伤细胞活力随之上升，在0.6mol/L后，开始逐渐平稳；冷冻后随蔗糖浓度增加，胚性愈伤细胞活力同步上升，在0.7mol/L蔗糖浓度时的细胞活力最高；如表2所示，冷冻复苏后的胚性愈伤细胞活力最高是冷冻前的86.35％。

表2. A2胚性愈伤组织冷冻前后活力测定

本发明通过不同的预处理时间，不同浓度的抗冻剂的毒性效应等比较，筛选出适宜于油橄榄胚性愈伤组织的超低温长期保存方法；经过优化的超低温冷冻保存试验的胚性愈伤组织，细胞复苏后存活率最高可达75％。本发明是前期的技术体系的深入和改进，无需昂贵的仪器设备，操作简单，成本低廉，易于推广，可用于油橄榄的胚性愈伤组织超低温(-196℃)冷冻保存技术体系。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种油橄榄胚性愈伤组织超低温冷冻保存方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、预培养：特征在于：将胚性愈伤组织置于MS培养基附加2,4D 1.5～3mg/L+6,BA0.1～0.2mg/L+蔗糖0.3～1.0mol/L+琼脂7～9g/L+pH 5.8～6.5上，24～27℃暗培养7～14d；

步骤2、将预培养的胚性愈伤组织转入到0℃预冷的40％～80％冷冻保护剂中，培养10～30min，冷冻保护剂的按照MS液体培养基，附加2,4D 1.5～3mg/L+6,BA 0.1～0.2mg/L+pH5.8～6.0+甘油9～13％+乙二醇11～14％+DMSO 14～17％+PEG 4000 3～5g/L+0.3～0.4mol/L蔗糖混匀配制；随后取出置于0℃预冷的无菌滤纸上滚动翻转5～10s后，再转入到0℃预冷的100％冷冻保护剂中处理35～70min，置于冻存管中，更换新鲜0℃预冷的100％冷冻保护剂后迅速地投入液氮中速冻保存；

步骤3、将装有胚性愈伤组织的冻存管迅速从液氮取出后置于35～42℃的循环水浴锅中，80～110s取出后迅速再浸入25～30℃水浴锅25-30s，然后将胚性愈伤组织从冻存管取出，置于室温无菌滤纸滚动翻转5～10s，再次用室温的预培养溶液清洗3次，每次3min，清洗完成后用无菌滤纸滚动翻转5～10s；

步骤4、将去除冷冻保护剂的胚性愈伤组织置于垫有无菌滤纸的MS培养基附加2,4D1.5～3.0mg/L+6,BA 0.1～0.2mg/L+蔗糖0.3～0.5mol/L+pH 5.8～6.5上，培养基需要经过滤纸先期吸取表层冷凝水，培养基凝固剂须为琼脂，24～27℃暗培养3～5d；之后将载有胚性愈伤组织的滤纸整体转入到MS培养基附加2,4D 1.5～3mg/L+6,BA 0.1～0.2mg/L+蔗糖0.1～0.3mol/L+琼脂7～9g/L+pH 5.8～6.5上，培养基如上去除冷凝水，24～27℃暗培养1～3d；最后将经恢复培养的胚性愈伤组织转入到正常培养基上。

2.根据权利要求1所述的油橄榄胚性愈伤组织超低温冷冻保存方法，其特征在于，步骤1中，将胚性愈伤组织置于MS培养基附加2,4D 1.5～3mg/L+6,BA 0.1～0.2mg/L+0.3～1.0mol/L蔗糖+琼脂7～9g/L+pH 5.8～6.5上。

3.根据权利要求1所述的油橄榄胚性愈伤组织超低温冷冻保存方法，其特征在于，步骤2中，将预培养的胚性愈伤组织转入到40％～80％冷冻保护剂中，冷冻保护剂按照MS培养基，附加2,4D 1.5～3mg/L+6,BA 0.1～0.2mg/L+pH 5.8～6.5，+甘油9～13％+乙二醇11～14％+DMSO 14～17％+PEG 4000 3～5g/L+0.3～0.4mol/L蔗糖混匀配制，胚性愈伤40～80％冷冻保护剂培养10～30min；随后取出置于0℃预冷的无菌滤纸上滚动翻转5～10s后，再转入到0℃预冷的100％冷冻保护剂中处理35～70min。

4.根据权利要求1所述的油橄榄胚性愈伤组织超低温冷冻保存方法，其特征在于，步骤3中，将装有胚性愈伤组织的冻存管迅速从液氮取出后置于35～42℃的循环水浴锅中，80～110s取出后迅速再浸入25～30℃水浴锅25-30s，置于室温无菌滤纸滚动翻转5～10s。

5.根据权利要求1所述的油橄榄胚性愈伤组织超低温冷冻保存方法，其特征在于，步骤4中，将去除冷冻保护剂的胚性愈伤组织置于垫有无菌滤纸增殖培养基上，培养基按照顺序附加0.3～0.5mol/L和0.1～0.3mol/L的不同蔗糖浓度。