CN101353639B

CN101353639B - 一种橡胶树花药愈伤组织玻璃化超低温保存方法

Info

Publication number: CN101353639B
Application number: CN2008101198635A
Authority: CN
Inventors: 李哲; 周权男; 孙爱花; 黄天带; 黄华孙; 林位夫
Original assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2008-09-12
Filing date: 2008-09-12
Publication date: 2010-12-15
Anticipated expiration: 2028-09-12
Also published as: CN101353639A

Abstract

本发明提供了一种橡胶树花药愈伤组织玻璃化超低温保存方法，包括如下步骤：将花药愈伤组织接种到预培养基中，暗培养2～3天，培养温度为25～28℃；然后在室温下用60％的PVS₂处理花药愈伤组织10～30分钟；脱水处理后，在0℃下用PVS₂处理20～40分钟，移去PVS₂原液，再加入新的PVS₂，在液氮中保存。花药愈伤组织复苏后，进行继代培养，进一步诱导胚状体及诱导成熟胚状体分化后可获得再生植株。本发明所涉及的液氮玻璃化超低温保存方法具有设备简便、实验程序简化、效果和重复性好等优点，可长期保存橡胶树花药愈伤组织，解冻后经培养得到再生植株，为橡胶树遗传转化创造条件。

Description

一种橡胶树花药愈伤组织玻璃化超低温保存方法

技术领域

本发明属于植物细胞工程技术领域，涉及一种橡胶树花药愈伤组织玻璃化超低温保存方法。

背景技术

橡胶树是多年生高大乔木，异花授粉，在遗传上高度杂合，使得橡胶树的育种难度加大。生产上橡胶树种植材料一般有两种，一是实生树，二是芽接树。芽接树个体间产量变异小、产量高、性状一致，但抗逆性较弱。实生树个体间产量变异大、产量低、性状不一致，但抗逆性较强。目前生产上橡胶树种植基本上是用芽接树。橡胶树选育种按照常规育种程序，采用多代自交的办法，时间长且难以得到纯合的植株。

通过橡胶树花药组织培养，诱导胚状体发生、植株再生和进行扩繁，获得自根无性系，为培育橡胶树产量高、抗逆性强而生长快的优良品种，提供了新的技术手段和方法。

采用推广品种花药培养获得的再生植株，起源于花药壁体细胞，具有与母体无性系同样的遗传信息，带有无性繁殖的芽接树的优良性状；同时，它们又是经过脱分化和再分化过程，经过和合子胚十分相似的途径发育，回复到幼态，因而又带有实生树的优良性状。经过多年的橡胶树田间栽培实验表明，花药体细胞植株的表现型与母本植株一致。因此，花药体细胞植株是一种幼态自根无性系，能够集芽接树和实生树的优点于一体，而且不受砧木对接穗的不良影响，能表现出产量高、生长快、抗逆性强、适应性广、经济寿命长等优点，是一种很有发展前途的新一代种植材料，具有广阔的应用前景。

在植物组织培养过程中，培养时间较长时，会出现胚性材料胚性降低、体细胞无性系变异机率增加等问题；而且在实验室中进行较大规模组织培养时，材料较多，管理难度加大。目前，花药培养植株再生频率还不高，一般为1～3％，即100个花药出苗仅1～3株。

至今，橡胶树进行超低温冷冻保存的研究还很少。1997年Enge1mann等研究了胚性愈伤组织的超低温保存，保存后的胚性愈伤组织解冻后可获得体细胞胚，但未能获得再生植株。2007年，法国农业研究国际合作中心(CIRAD)的Lardet等对从橡胶树幼嫩种子内株被来源的愈伤组织成功地进行了液氮超低温冷冻保存，并获得再生植株，但他们采用了程序降温的处理过程。他们使胚性愈伤组织及其环境温度每分钟下降0.2℃，当温度降至-40℃，再投入液氮中保存，操作不便。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用液氮玻璃化超低温方法保存巴西橡胶树花药愈伤组织方法，该方法可长期保存巴西橡胶树优良材料遗传资源，实现橡胶树优良种质资源长期保存，为生物技术育种提供新途径。

为了实现本发明目的，本发明所述橡胶树花药愈伤组织玻璃化超低温保存方法，包括如下步骤：

1)预培养：将花药愈伤组织接种到预培养基中，暗培养2～3天，培养温度为25～28℃；

2)装载：然后在室温下用60％的PVS₂(玻璃化溶液)处理花药愈伤组织10～30分钟；

3)脱水及冻存：脱水处理后，在0℃下用PVS₂(玻璃化溶液)处理20～40分钟，并去除玻璃化溶液，最后再重新加入玻璃化溶液，于液氮中保存。

本发明所述的花药愈伤组织为胚性愈伤组织，是在橡胶树处于盛花期的春、夏两个花季，选取高产和性状优良的橡胶树的花，选用花粉发育状态为单核期、少数为双核期的花药，在胚性愈伤组织诱导培养基上培养，诱导出胚性愈伤组织。

本发明所述预培养基为改良MS培养基中添加2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)1.0～3.0mg/L、KT(6-糠氨基嘌呤，又名激动素)1.0～3.0mg/L、NAA(萘乙酸)1.0～3.0mg/L、Phytagel(植物凝胶)2.0～3.0g/L、蔗糖50.0～90.0g/L、二甲基亚砜(DMSO)5～10％(体积百分含量)。

本发明中用改良MS培养基是以MS培养基为基本培养基，并将MS培养基中的无水氯化钙、磷酸二氢钾、四水硫酸锰、七水硫酸镁的含量调整为无水氯化钙150～400mg/L、磷酸二氢钾300～450mg/L、四水硫酸锰15～40mg/L、七水硫酸镁400～600mg/L。

所述PVS₂溶液由28～32％的甘油(Gly)、12～18％己二醇(EG)、12～18％的二甲基亚砜(DMSO)和136.9g/L(0.4mol/L)的蔗糖所组成。其中含量为体积百分含量。

60％PVS₂溶液为：含34.2～68.4g/L(0.1～0.2mol/L)蔗糖的愈伤组织继代液体培养基(不加Phytagel)与PVS₂溶液按体积比40:60配制而成，所述继代液体培养基为改良MS培养基中添加2，4-D1.0～3.0mg/L、KT1.0～3.0mg/L、NAA1.0～3.0mg/L、蔗糖34.2～68.4g/L(0.1～0.2mol/L)、椰子水40～90ml/L。

本发明的脱水处理可采用本领域常用的方法进行。

采用本发明所述橡胶树花药愈伤组织的液氮玻璃化超低温保存方法，可长期保存橡胶树花药愈伤组织，保存时间可达一天至几年。一般将橡胶树花药愈伤组织存放在冻存管中(聚丙烯材料，PP，polypropylene)，常用量为0.2g/管。

采用本发明的超低温保存方法保存的橡胶树花药愈伤组织，化冻复苏后可以经过胚状体发生途径得到再生植株。

所述复苏及植株再生方法，包括如下步骤：

花药愈伤组织经过超低温保存后，愈伤组织再培养时，须先进行化冻处理，即复苏处理。将液氮中保存的橡胶树花药愈伤组织于40℃水浴中浸泡2～3分钟，然后用洗涤液洗2次，每次10～12分钟；洗涤后，转移到愈伤组织继代培养基上，在25～28℃进行暗培养2～3天；再继代培养一次，培养20～30天后存活的花药愈伤组织开始生长；再继代一次，相同条件下培养40～60天。

所述洗涤液为改良MS培养基中附加2，4-D1.0～3.0mg/L、KT1.0～3.0mg/L、NAA1.0～3.0mg/L、蔗糖342.3～410.8g/L(1.0～1.2mol/L)。

所述继代培养基为改良MS培养基中添加2，4-D1.0～3.0mg/L、KT1.0～3.0mg/L、NAA1.0～3.0mg/L、Phytagel2.0～3.0g/L、蔗糖50.0～90.0g/L、椰子水40～90ml/L。

继代后的愈伤组织便可进行胚状体的诱导，其过程为：将继代后的愈伤组织接种于胚状体诱导培养基，在25～28℃之间暗培养20～50天。20～50天后，紧实的愈伤组织表面出现了长势旺盛的乳白色小胚状体，一个愈伤组织可分化一至数十个胚状体，胚状体可进一步发育。胚状体诱导培养基是以改良MS培养基中添加6-BA(6-苄氨基嘌呤)0.5～2.0mg/L、KT0.5～3.0mg/L、NAA0.1～1.0mg/L、GA₃(赤霉素)0.1～1.0mg/L、Phytagel2.0～3.0g/L、蔗糖50.0～90.0g/L、活性碳1.0～2.0g/L、椰子水40～90ml/L。

植株再生是将成熟子叶型胚状体转移到分化培养基上进行培养，每只培养皿(9厘米直径)放6个胚状体，每天光照12小时，温度为25～28℃，培养20～60天后开始出苗。分化培养基为改良MS培养基中添加KT0.5～4.0mg/L、NAA0.1～1.0mg/L、GA₃0.1～1.0mg/L、Phytagel2.0～3.0g/L、蔗糖50.0～90.0g/L、活性碳1.0～2.0g/L、椰子水40～90ml/L。

本发明中用液氮玻璃化超低温(-196℃)方法保存橡胶树花药愈伤组织，具有设备简单、实验程序简化、操作方便、冻存效果和重复性好等优点。在液氮-196℃低温下，橡胶树花药愈伤组织中所有细胞的分裂和代谢活动停止，材料在此过程中不会产生遗传性状的改变。

液氮玻璃化超低温保存法是长期、稳定保存植物器官、组织和细胞的有效方法。用这一方法可以长期保存橡胶树花药愈伤组织，为生物技术育种提供材料，为橡胶树遗传转化创造条件。它能长期保持优良种质资源的遗传的稳定性，为基础研究和生产应用研究提供有价值的种质资源。采用液氮玻璃化超低温保存方法对橡胶树花药愈伤组织进行超低温冷冻保存，以期为长期保存橡胶树优良材料的遗传资源提供技术支持，具有广阔的应用前景。

玻璃化冻存法的基本原理是：生物材料经高浓度玻璃化保护剂处理后，快速投入液氮保存，使保护剂和细胞内水分来不及形成冰，或冰晶没有充分的时间生成，水由液相变为固相，进入一种人工的完全玻璃化状态。在玻璃化状态时，水分子没有发生重排，不产生结构和体积的变化，因而不会由于机械损伤或溶液效应，造成组织和细胞伤害，使得细胞在化冻后仍保持活性。而且在液氮低温下，细胞分裂和代谢活动停止，不会产生遗传性状的改变。在理论上，生物的组织或细胞用液氮超低温冷冻保存方法可保存无限长的时间。

液氮超低温保存是目前植物种质资源长期保存的理想方法。在此温度(-196℃)下，活细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，植物材料处于稳定的生物学状态，不会产生遗传性状的改变和形态发生潜能的丧失。近几年发展较快的玻璃化法显示出较传统的缓慢降温法和二步法设备简单、操作方便和重演性好等优点。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

预先按要求配制好各种培养基和所需溶液。在春、夏两个花季，橡胶树处于盛花期，选取高产和性状优良的橡胶树的花，选用花粉发育状态为单核期、少数为双核期的花药。花蕾用10％的漂白粉溶液或0.1％的升汞溶液消毒10分钟，经无菌水冲洗4～6次，在无菌条件下取出花药，放在胚性愈伤组织诱导培养基(MS培养基添加2，4-D1.0mg/L、KT0.6mg/L、NAA0.5mg/L、Phytagel2.5g/L、蔗糖70.0g/L、椰子水70ml/L。)上培养，诱导出胚性愈伤组织。将愈伤组织转至预先按要求配制好的预培养基上，培养温度在26±1℃，暗培养3天。愈伤组织预培养基为改良MS培养基添加2，4-D2.0mg/L、KT2.0mg/L、NAA2.0mg/L、Phytagel2.5g/L、蔗糖70.0g/L、DMSO8％(体积百分含量)。

把经过预培养后的花药愈伤组织0.2g放入冻存管中，室温下加入60％的玻璃化溶液(PVS₂)处理30分钟。60％PVS₂溶液的组成：含51.3g/L(0.15mol/L)蔗糖的愈伤组织继代液体培养基与PVS₂溶液按体积比40:60配制。继代液体培养基为改良MS培养基中添加2，4-D2.0mg/L、KT2.0mg/L、NAA1.0mg/L、蔗糖51.3g/L(0.15mol/L)、椰子水80ml/L。

再把经过上述处理的花药愈伤组织进行脱水处理，在0℃下加入PVS₂，处理40分钟。然后移去原液，在此冻存管中加入新的PVS₂保护剂，迅速将其投入液氮罐中，冷冻1～7天。PVS₂溶液由30％的甘油(Gly)、15％己二醇(EG)、15％的二甲基亚砜(DMSO)和136.9g/L(0.4mol/L)的蔗糖所组成。

对超低温保存后的花药愈伤组织进行再培养前必须经过化冻处理，把冻存管在40℃水浴中浸泡3分钟，进行化冻。然后把花药愈伤组织用洗涤液洗2次，每次12分钟。再培养时，将经化冻洗涤后的愈伤组织立即转移到继代培养基上，每只培养皿(9厘米直径)放6块愈伤组织，暗培养2天；然后再继代培养一次，培养温度27±1℃，培养30天后存活的花药愈伤组织开始生长；再继代一次，相同条件下培养40天。洗涤液为改良MS培养基添加2，4-D2.0mg/L、KT2.0mg/L、NAA2.0mg/L、蔗糖376.5g/L(1.1mol/L)。继代培养基是以MS培养基为基本培养基，且将MS培养基中的无水氯化钙、磷酸二氢钾、四水硫酸锰、七水硫酸镁的含量调整为无水氯化钙300mg/L、磷酸二氢钾350mg/L、四水硫酸锰30mg/L、七水硫酸镁500mg/L，同时添加2，4-D2.0mg/L、KT2.0mg/L、NAA2.0mg/L、Phytagel2.5g/L、蔗糖70.0g/L、椰子水70ml/L。

继代后的愈伤组织进行胚状体的诱导，将愈伤组织接种于诱导培养基，在27±1℃暗培养20～50天。20～50天后，紧实的愈伤组织表面出现了长势旺盛的乳白色小胚状体，一个愈伤组织可分化出一至数十个胚状体，胚状体可进一步发育成成熟子叶型胚状体。胚状体诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，且将MS培养基中的无水氯化钙、磷酸二氢钾、四水硫酸锰、七水硫酸镁的含量调整为无水氯化钙300mg/L、磷酸二氢钾350mg/L、四水硫酸锰30mg/L、七水硫酸镁500mg/L，同时添加6-BA1.5mg/L、KT1.5mg/L、NAA0.5mg/L、GA₃0.1mg/L、Phytagel2.5g/L、蔗糖70.0g/L、活性碳1.5g/L、椰子水70ml/L。

将成熟子叶型胚状体转移到分化培养基上进行培养，每天光照12小时，温度为27±1℃，培养20～60天后开始出苗，为再生植株。分化培养基是以MS培养基为基本培养基，且将MS培养基中的无水氯化钙、磷酸二氢钾、四水硫酸锰、七水硫酸镁的含量调整为无水氯化钙300mg/L、磷酸二氢钾350mg/L、四水硫酸锰30mg/L、七水硫酸镁500mg/L，同时添加KT2.0mg/L、NAA0.5mg/L、GA₃0.5mg/L、Phytagel2.5g/L、蔗糖70.0g/L、活性碳1.5g/L、椰子水70ml/L。

其中，MS培养基成分：

大量元素： NH₄NO₃ 1650mg/L

KNO₃ 1900mg/L

CaCl₂·2H₂O 440mg/L

MgSO₄·7H₂O 370mg/L

KH₂PO₄ 170mg/L

Na₂EDTA 37.3mg/L

FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L

微量元素： H₃BO₃ 6.2mg/L

MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L

ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L

KI 0.83mg/L

Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L

CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L

CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L

有机成分：肌醇 100mg/L

甘氨酸 2.0mg/L

烟酸 0.5mg/L

盐酸吡哆醇 0.5mg/L

盐酸硫胺素 0.1mg/L

蔗糖 30g/L

琼脂 10g/L

pH 5.8。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种橡胶树花药愈伤组织的玻璃化超低温保存方法，其特征在于，包括如下步骤：

2)装载：然后在室温下用60％的玻璃化溶液处理花药愈伤组织10～30分钟；

3)脱水及冻存：脱水处理后，在0℃下用玻璃化溶液处理20～40分钟，并去除玻璃化溶液，最后再重新加入玻璃化溶液，于液氮中保存；

所述预培养基为改良MS培养基中添加2，4-二氯苯氧乙酸1.0～3.0mg/L、6-糠氨基嘌呤1.0～3.0mg/L、萘乙酸1.0～3.0mg/L、植物凝胶2.0～3.0g/L、蔗糖50.0～90.0g/L、二甲基亚砜5～10％；所述60％的玻璃化溶液为：含34.2～68.4g/L蔗糖的愈伤组织继代液体培养基与玻璃化溶液按体积比40∶60配制而成，所述继代液体培养基为改良MS培养基中添加2，4-二氯苯氧乙酸1.0～3.0mg/L、6-糠氨基嘌呤1.0～3.0mg/L、萘乙酸1.0～3.0mg/L、蔗糖34.2～68.4g/L、椰子水40～90ml/L。

2.一种采用权利要求1所述方法保存的橡胶树花药愈伤组织的复苏及再培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

将液氮中保存的橡胶树花药愈伤组织于40℃水浴中浸泡2～3分钟，然后用洗涤液洗2次，每次10～12分钟；洗涤后，转移到愈伤组织继代培养基上，在25～28℃进行暗培养2～3天；再继代培养一次，培养20～30天后存活的花药愈伤组织开始生长；再继代一次，相同条件下培养40～60天；

所述洗涤液为改良MS培养基中附加2，4-二氯苯氧乙酸1.0～3.0mg/L、6-糠氨基嘌呤1.0～3.0mg/L、萘乙酸1.0～3.0mg/L、蔗糖342.3～410.8g/L；

所述继代培养基为改良MS培养基中添加2，4-二氯苯氧乙酸1.0～3.0mg/L、6-糠氨基嘌呤1.0～3.0mg/L、萘乙酸1.0～3.0mg/L、植物凝胶2～3g/L、蔗糖50.0～90.0g/L、椰子水40～90ml/L。