CN111972210A - 一种高效转化葡萄蔓中白黎芦醇的灵芝栽培方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高效转化葡萄蔓中白黎芦醇的灵芝栽培方法，利用葡萄蔓枝袋料栽培菌种经处理过的（韩芝8号）灵芝，使收获的灵芝中含有白藜芦醇。包括葡萄蔓枝晒干粉碎、拌料、装袋、灭菌、接种、菌丝培养、采收等步骤。本发明培养方法收获的灵芝中检出白黎芦醇（0.76‑2.31mg/kg），其他采用同样方法和配方的灵芝菌种（韩芝5号、日芝1号和武芝2号以及未经处理的韩芝8号灵芝菌种）中均未有白黎芦醇检出。

Description

一种高效转化葡萄蔓中白黎芦醇的灵芝栽培方法

技术领域

本发明涉及一种高效转化葡萄蔓中白黎芦醇的灵芝栽培方法，属农副产品综合利用领域。

背景技术

白藜芦醇(resveratrol，简称Res)是非黄酮类的多酚化合物，在植物体内主要以白藜芦醇苷(PDT)形式存在，能降低血小板聚集，预防和治疗动脉粥样硬化，是肿瘤的化学预防剂、心脑血管疾病的化学预防剂。白藜芦醇具有优良药理活性和保健功能其市场需求很大且与日剧增，已有大部分国家和地区都开发了白藜芦醇及其制品。美国已把白藜芦醇作为膳食补充剂，日本已将从植物提取的白藜芦醇作为食品添加剂，中国已将含白藜芦醇的植物提取物制成降脂美容的天然保健食品。

现在白藜芦醇主要从虎杖、桑葚、买麻藤、野鲜槐、葡萄等植物中分离提取，但是含量低。分离提取主要采用柱层析、大孔树脂吸附法等方法，柱层析分离白藜芦醇虽然分离效果好，但成本高、处理量小且使用有机溶剂；大孔树脂吸附虽然成本低、处理量大，但白藜芦醇损失大且不能连续生产。相关研究显示葡萄蔓、花生根等植物种植副产品中也含有白藜芦醇，并对从中提取白藜芦醇技术进行了研究。本项目发现采用葡萄蔓为原料袋料接入灵芝（经处理过的韩芝8号）菌株，原先并不含有白藜芦醇的灵芝实体中有白藜芦醇检出，表明采用含有白藜芦醇植物副产品（葡萄蔓）进行灵芝（经处理过的韩芝8号）袋料栽培具有转化其中的白藜芦醇能力，因此开发一种用灵芝转化白藜芦醇的方法具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的通过采用含有白藜芦醇的植物副产品（葡萄蔓枝）为原料进行灵芝（DH8）袋料栽培从而获得含有白藜芦醇的灵芝实体，具体是通过以下技术方案来实现的：

1、灵芝菌种（韩芝8号）制备

1.1、试管斜面培养基的制备

1.1.1.马铃薯培养基：马铃薯200g，蛋白胨2 g，酵母粉3 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁0.6g，琼脂20 g，葡萄蔓枝浸泡液1000ml。

１.1.2、培养基（葡萄蔓浸泡液处理）配制

1.1.2.1葡萄蔓浸泡液制备

取蒸馏水按料液比1:5，浸泡葡萄蔓枝屑24h得葡萄蔓枝浸泡液备用。

1.1.2.2培养基制备

先将马铃薯切片，煮沸20mim，过滤，取汁，加入其他配料，进行煮沸，待琼脂完成溶化后，补1.1.2.1葡萄蔓枝浸泡液至1000ml，趁热分装到试管中，每根试管装5-7ml，塞好塞子或棉花塞。

１.1.3、灭菌 将装好培养基的试管竖着放入灭菌锅内，1.5兆帕高压下灭菌15-20mim。

１.1.4、试管摆放 灭菌后，打开灭菌锅，趁热将试管按一定的斜度（10℃左右）摆放，放冷，即成试管斜面。

１.2、子实体菌丝分离法 子实体菌丝分离法操作简单，且能保持原有菌株的特性，在大规模生产时多采用此种分离法。

１.2.1、（韩芝8号）种芝选择 选择形态发育正常，无病虫害，菌盖边缘尚未变色，未弹射孢子的灵芝子实体。

１.2.2、消毒处理 在无菌条件下用75%酒精进行表面擦拭杀菌消毒。

１.2.3、分离 在无菌条件下或无菌箱内，切去菌柄基部，用刀片切开菌盖，用单面刀片或解剖刀切取米粒大菌肉一块移入试管斜面培养基中央。可多分离一些试管，以供选择。

１.2.4、培养 试管放置在26-28℃恒温箱内，培养2-3天可在斜面上切取的灵芝子实体上有少量白色絮状菌丝出现，7-8天后菌丝长满斜面，此即为第一代母种试管，可保存冰箱中供转管使用。

２、灵芝栽培种的制备

２.1、培养基配方 葡萄蔓枝屑65%，木屑25%，麦麸8%、红糖1%、石膏粉0.9%、过磷酸钙0.1%。

２.2、培养基材料准备 葡萄蔓枝屑和木屑要选用干燥、新鲜、无霉变、无虫蛀，使用前最好曝晒1-2天，然后粉碎过20目，去掉细粉，称好量后加水浸泡2-3天，捞起沥干，备用。

２.3、配料 按配方称好其他料，将木屑、麦麸和石膏先与已经过浸泡处理的葡萄蔓枝屑拌匀，再将溶于水的红糖和过磷酸钙加入，充分拌匀。培养料含量控制为65%左右，判断标准为抓起一把培养料，用手攥紧时指缝有水渗出，似滴不滴水成团，若水为流出，则太湿，若无水渗出，则太干。培养料pH为5.5左右，用石膏和过磷酸钙进行pH的调节。

２.4、装瓶或装袋 使用500 ml的菌种瓶或长×宽×厚为35㎝×17㎝×0.04㎝的聚乙烯或聚丙烯菌袋，把拌匀的培养料装入瓶或袋中，边装边压实。用菌种瓶装料时，装至瓶肩处后，在中心位置用尖头木棒从顶到底打一洞，然后用棉塞塞紧或用聚丙烯薄膜封口；用菌袋装时，在装至22-25㎝时，在中心位置用尖头木棒从顶到底打一洞，然后用菌环和菌扣扣紧或用绳子绑紧袋口。

２.5、灭菌 在0.15兆帕高压下灭菌2小时或采用常压灭菌12-15小时。

２.6、接种 待灭菌后的瓶子或袋子温度降到30℃以下时，移入接种室或接种箱内，在无菌条件下，从灵芝母种试管中，用接种钩挑取蚕豆粒大小菌种块移入瓶中，1支试管母种接原种4-5瓶或袋，1瓶或袋原种接栽培种40-50瓶或袋。

２.7、培养 接种后置28℃左右条件下避光培养。

２.8、接种后的前几天应每天或隔天对瓶子或袋子进行检查，挑出污染及菌丝未萌发的瓶子或袋子一般条件下，30天左右即右长满瓶或袋。合格的原种、栽培种的标准为：灵芝菌丝浓密，白色，上下分布均匀，成为栽培种。

３、葡萄蔓枝袋料栽培（韩芝8号）灵芝

３.１葡萄蔓枝晒干粉碎：收集葡萄修剪下来的新鲜葡萄蔓枝，晒干，粉碎成葡萄蔓枝屑，备用；

３.２拌料：先选取杂木屑、玉米芯颗粒、甘蔗渣三种主料中的一种，与葡萄蔓枝屑、五节芒粉和麸皮三种主料拌匀，然后将红糖、石膏粉和过磷酸钙溶解于水中，再加入主料，充分拌匀，配制好的料堆闷1-3小时，培养料含水量为65wt%-70wt%，pH5-6.5；

３.３装袋：将拌好并经过堆闷的培养料及时按常规代料袋栽法进行装袋，选厚0.03-0.04厘米聚乙烯或厚0.04-0.05厘米聚丙烯袋，袋宽为15厘米，长35厘米，每袋装干料300-500克，用棉花线或菌环与菌扣扎紧袋口，装好袋后，立即进行灭菌；

３.４灭菌：当天拌好的培养料必须当天灭菌，以免培养料变质，采用常压或高压灭菌，常压灭菌，在3-4小时内达到100℃，然后在100℃条件下持续灭菌8-12小时；高压灭菌时要求压力0.12-0.16兆帕保持2-3小时持续灭菌；

３.５接种：灭菌后，待菌棒袋冷却到30℃以下时在接种室或接种箱内进行接种；接种时，2人配合操作，一人负责打开和扎紧筒口，一人负责接入菌种；

３.６菌丝培养：接种后的菌棒袋，移入消毒好的培养室内，分层排放，接种口朝外，每排放6-8层高，排架间留人行道；在菌丝封满料面之前，培养室温度保持21-23℃，菌丝封满料面后温度控制在22-25℃，空气相对湿度为65-70%；前期注意避光培养，30-40天后，菌丝满袋后适当进行弱散射光光照培养，光照强度200-500Lx，同时隔天进行通风换气，3-7天后菌棒开始转为黄色、结皮并吐黄水后，进行出芝管理；

３.７采收：当灵芝菌盖边缘不再生长，菌盖下面子实层内弹射出棕红色孢子时，按常规方法进行孢子粉收集和子实体采收；

所述步骤３.２中培养料按照重量百分比的配方为：葡萄蔓枝屑40-60%，杂木屑10-20%，五节芒粉10-20%，麸皮10-20%，红糖0.5-1.5%，石膏粉1-3%，过磷酸钙1-3%，各组分的质量百分数之和为100%。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明在培养基配制中采用葡萄蔓浸提液替代传统的蒸馏水制备灵芝（韩芝8号）原种，使后期栽培收获的灵芝中检出的白黎芦醇含量增高；

（2）利用本发明方法制备（韩芝8号）灵芝菌种用含葡萄蔓的代料配方栽培灵芝，收获的灵芝中检出白黎芦醇（ 0.76-2.31mg/kg），其他采用同样方法和配方的灵芝菌种（韩芝5号、日芝1号和武芝2号以及未经处理的韩芝8号灵芝菌种）中均未有白黎芦醇检出。

具体实施方式

实施例1灵芝菌种（韩芝8号）制备

1.1、试管斜面培养基的制备

1.1.1.马铃薯培养基：马铃薯200g，蛋白胨2 g，酵母粉3 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁0.6g，琼脂20 g，葡萄蔓枝浸泡液1000ml。

1.1.1.1葡萄蔓浸泡液制备

取蒸馏水按料液比1:5，浸泡葡萄蔓枝屑24h得葡萄蔓枝浸泡液备用

１.1.2、培养基配制 先将马铃薯切片，煮沸20mim，过滤，取汁，加入其他配料，进行煮沸，待琼脂完成溶化后，补葡萄蔓枝浸泡液至1000ml，趁热分装到试管中，每根试管装5-7ml，塞好塞子或棉花塞。

１.1.3、灭菌 将装好培养基的试管竖着放入灭菌锅内，1.5兆帕高压下灭菌15-20mim。

１.1.4、试管摆放 灭菌后，打开灭菌锅，趁热将试管按一定的斜度（10℃左右）摆放，放冷，即成试管斜面。

１.2、子实体菌丝分离法 子实体菌丝分离法操作简单，且能保持原有菌株的特性，在大规模生产时多采用此种分离法。

１.2.1、（韩芝8号）种芝选择 选择形态发育正常，无病虫害，菌盖边缘尚未变色，未弹射孢子的灵芝子实体。

１.2.2、消毒处理 在无菌条件下用75%酒精进行表面擦拭杀菌消毒。

１.2.3、分离 在无菌条件下或无菌箱内，切去菌柄基部，用刀片切开菌盖，用单面刀片或解剖刀切取米粒大菌肉一块移入试管斜面培养基中央。可多分离一些试管，以供选择。

１.2.4、培养 试管放置在26-28℃恒温箱内，培养2-3天可在斜面上切取的灵芝子实体上有少量白色絮状菌丝出现，7-8天后菌丝长满斜面，此即为第一代母种试管，可保存冰箱中供转管使用。

实施例2灵芝栽培种的制备

２.1、培养基配方 葡萄蔓枝屑65%，木屑25%，麦麸8%、红糖1%、石膏粉0.9%、过磷酸钙0.1%。

２.2、培养基材料准备 葡萄蔓枝屑和木屑要选用干燥、新鲜、无霉变、无虫蛀，使用前最好曝晒1-2天，然后粉碎过20目，去掉细粉，称好量后加水浸泡2-3天，捞起沥干，备用。

２.3、配料 按配方称好其他料，将木屑、麦麸和石膏先与已经过浸泡处理的葡萄蔓枝屑拌匀，再将溶于水的红糖和过磷酸钙加入，充分拌匀。培养料含量控制为65%左右，判断标准为抓起一把培养料，用手攥紧时指缝有水渗出，似滴不滴水成团，若水为流出，则太湿，若无水渗出，则太干。培养料pH为5.5左右，用石膏和过磷酸钙进行pH的调节。

２.4、装瓶 使用500 ml的菌种瓶，把拌匀的培养料装入瓶中，边装边压实。用菌种瓶装料时，装至瓶肩处后，在中心位置用尖头木棒从顶到底打一洞，然后用棉塞塞紧或用聚丙烯薄膜封口；

２.5、灭菌 在0.15兆帕高压下灭菌2小时。

２.6、接种 待灭菌后的瓶子温度降到30℃以下时，移入接种室或接种箱内，在无菌条件下，从灵芝母种试管中，用接种钩挑取蚕豆粒大小菌种块移入瓶中，1支试管母种接原种4-5瓶，1瓶原种接栽培种40-50袋。

２.7、培养 接种后置28℃左右条件下避光培养。

２.8、接种后的前几天应每天或隔天对瓶子进行检查，挑出污染及菌丝未萌发的瓶子一般条件下，30天左右即右长满瓶。合格的原种、栽培种的标准为：灵芝菌丝浓密，白色，上下分布均匀，成为栽培种。

实施例3葡萄蔓枝袋料栽培（韩芝8号）灵芝

３.１葡萄蔓枝晒干粉碎：收集葡萄修剪下来的新鲜葡萄蔓枝，晒干，粉碎成葡萄蔓枝屑，备用；

３.２拌料：先选取杂木屑为主料，与葡萄蔓枝屑、五节芒粉和麸皮三种主料拌匀，然后将红糖、石膏粉和过磷酸钙溶解于水中，再加入主料，充分拌匀，配制好的料堆闷1-3小时，培养料含水量为65wt%-70wt%，pH5-6.5；

培养料按照重量百分比的配方为：葡萄蔓枝屑60%，杂木屑15%，五节芒粉10%，麸皮10%，红糖1%，石膏粉1%，过磷酸钙3%，各组分的质量百分数之和为100%。

３.３装袋：将拌好并经过堆闷的培养料及时按常规代料袋栽法进行装袋，选厚0.03-0.04厘米聚乙烯，袋宽为15厘米，长35厘米，每袋装干料500克，用菌环与菌扣扎紧袋口，装好袋后，立即进行灭菌；

３.４灭菌：当天拌好的培养料必须当天灭菌，以免培养料变质，采用高压灭菌，高压灭菌时要求压力0.16兆帕保持3小时持续灭菌；

３.５接种：灭菌后，待菌棒袋冷却到30℃以下时在接种室或接种箱内接种灵芝菌种（韩芝8号）；接种时，2人配合操作，一人负责打开和扎紧筒口，一人负责接入菌种；

３.６菌丝培养：接种后的菌棒袋，移入消毒好的培养室内，分层排放，接种口朝外，每排放6-8层高，排架间留人行道；在菌丝封满料面之前，培养室温度保持21-23℃，菌丝封满料面后温度控制在22-25℃，空气相对湿度为65-70%；前期注意避光培养，30-40天后，菌丝满袋后适当进行弱散射光光照培养，光照强度200-500Lx，同时隔天进行通风换气，3-7天后菌棒开始转为黄色、结皮并吐黄水后，进行出芝管理；

３.７采收：当灵芝菌盖边缘不再生长，菌盖下面子实层内弹射出棕红色孢子时，按常规方法进行孢子粉收集和子实体采收。

实施例4

实验方法与实施例3相同，仅培养料不同，培养料按照重量百分比的配方为：葡萄蔓枝屑60%，杂木屑10%，五节芒粉10%，麸皮15%，红糖1%，石膏粉3%，过磷酸钙1%，各组分的质量百分数之和为100%。

实施例5

实验方法与实施例3相同，仅培养料不同，培养料按照重量百分比的配方为：葡萄蔓枝屑50%，杂木屑20%，五节芒粉10%，麸皮15%，红糖1%，石膏粉3%，过磷酸钙1%，各组分的质量百分数之和为100%。

实施例6

实验方法与实施例3相同，仅培养料不同，培养料按照重量百分比的配方为：葡萄蔓枝屑40%，杂木屑20%，五节芒粉20%，麸皮15%，红糖1%，石膏粉3%，过磷酸钙1%，各组分的质量百分数之和为100%。

实施例7

实验方法与实施例3相同，仅培养料不同，培养料按照重量百分比的配方为：葡萄蔓枝屑40%，杂木屑20%，五节芒粉15%，麸皮20%，红糖1%，石膏粉2%，过磷酸钙2%，各组分的质量百分数之和为100%。

对比例1

采用与实施例3相同的栽培方法，将菌种更换为韩芝5号。

对比例2

采用与实施例3相同的栽培方法，将菌种更换为日芝1号。

对比例3

采用与实施例3相同的栽培方法，将菌种更换为武芝2号。

对比例4

采用与实施例3相同的栽培方法，将菌种更换为未经处理的（韩芝8号）灵芝菌种，即用不含葡萄蔓枝浸泡液的马铃薯培养基培养灵芝菌种（韩芝8号）。

试验结果：

1.设备基本信息

2.试剂、标品信息：

3.测试方法：

3.1前处理方法：

称取1g适量样品，加入20mL无水乙醇提取液超声提取20min，离心后取上清液，再加10mL提取残渣，合并提取液，定容30mL，过膜上机。

3.2仪器方法： 色谱柱：C18

流动相：0.1 mol/L 0.1M KH2PO4（ph6.8）；

流速：0.8 mL/min

柱温为25℃；

进样量10 μL

波长为245 nm。

计算公式：

X=（Cx-C0）*V/m

V-定容体积（30mL）

Cx-检测浓度

Co-空白

m-称样量

X-样品浓度

4、试验结果

。

Claims (6)

1.一种高效转化葡萄蔓中白黎芦醇的灵芝栽培方法，其特征在于，利用葡萄蔓枝袋料栽培经处理过的灵芝菌种，使收获的灵芝中含有白藜芦醇。

2.根据权利要求1所述的一种高效转化葡萄蔓中白黎芦醇的灵芝栽培方法，其特征在于，所述灵芝菌种为韩芝8号。

3.根据权利要求1所述的一种高效转化葡萄蔓中白黎芦醇的灵芝栽培方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

（1）葡萄蔓枝晒干粉碎：收集葡萄修剪下来的新鲜葡萄蔓枝，晒干，粉碎成葡萄蔓枝屑，备用；

（2）拌料：先选取杂木屑、玉米芯颗粒、甘蔗渣三种主料中的一种，与葡萄蔓枝屑、五节芒粉和麸皮三种主料拌匀，然后将红糖、石膏粉和过磷酸钙溶解于水中，再加入主料，充分拌匀，配制好的料堆闷1-3小时，培养料含水量为65wt%-70wt%，pH5-6.5；

（3）装袋：将拌好并经过堆闷的培养料及时按常规代料袋栽法进行装袋，选厚0.03-0.04厘米聚乙烯或厚0.04-0.05厘米聚丙烯袋作为菌棒袋，袋宽为15厘米，长35厘米，每袋装干料300-500克，用棉花线或菌环与菌扣扎紧袋口，装好袋后，立即进行灭菌；

（4）灭菌：当天拌好的培养料必须当天灭菌，采用常压或高压灭菌，常压灭菌，在3-4小时内达到100℃，然后在100℃条件下持续灭菌8-12小时；高压灭菌时要求压力0.12-0.16兆帕保持2-3小时持续灭菌；

（5）接种：灭菌后，待菌棒袋冷却到30℃以下时在接种室或接种箱内进行灵芝接种；

（6）菌丝培养：接种后的菌棒袋，移入消毒好的培养室内，分层排放，接种口朝外，每排放6-8层高，排架间留人行道；在菌丝封满料面之前，培养室温度保持21-23℃，菌丝封满料面后温度控制在22-25℃，空气相对湿度为65-70%；前期避光培养，30-40天后，菌丝满袋后进行弱散射光光照培养，光照强度200-500Lx，同时隔天进行通风换气，3-7天后菌棒开始转为黄色、结皮并吐黄水后，进行出芝管理；

（7）采收：当灵芝菌盖边缘不再生长，菌盖下面子实层内弹射出棕红色孢子时，按常规方法进行孢子粉收集和子实体采收。

4.根据权利要求3所述的一种高效转化葡萄蔓中白黎芦醇的灵芝栽培方法，其特征在于，步骤（2）中培养料按照重量百分比的配方为：葡萄蔓枝屑40-60%，主料 10-20%，五节芒粉10-20%，麸皮10-20%，红糖0.5-1.5%，石膏粉1-3%，过磷酸钙1-3%，各组分的质量百分数之和为100%。

5.根据权利要求3所述的一种高效转化葡萄蔓中白黎芦醇的灵芝栽培方法，其特征在于，步骤（5）接种的菌种为灵芝栽培种，制备方法包括以下步骤：

（1）培养基配方按重量百分比为：葡萄蔓枝屑65%，木屑25%，麦麸8%、红糖1%、石膏粉0.9%、过磷酸钙0.1%；

（2）培养基材料准备：葡萄蔓枝屑和木屑要选用干燥、新鲜、无霉变、无虫蛀，使用前曝晒1-2天，然后粉碎过20目，去掉细粉，称好量后加水浸泡2-3天，捞起沥干，备用；

（3）配料：将木屑、麦麸和石膏先与已经过浸泡处理的葡萄蔓枝屑拌匀，再将溶于水的红糖和过磷酸钙加入，充分拌匀；培养料含量控制为65%，培养料pH为5.5，用石膏和过磷酸钙进行pH的调节；

（4）装瓶或装袋：使用500 ml的菌种瓶或长×宽×厚为35㎝×17㎝×0.04㎝的聚乙烯或聚丙烯菌袋，把拌匀的培养料装入瓶或袋中，边装边压实；用菌种瓶装料时，装至瓶肩处后，在中心位置用尖头木棒从顶到底打一洞，然后用棉塞塞紧或用聚丙烯薄膜封口；用菌袋装时，在装至22-25㎝时，在中心位置用尖头木棒从顶到底打一洞，然后用菌环和菌扣扣紧或用绳子绑紧袋口；

（5）灭菌：在0.15兆帕高压下灭菌2小时或采用常压灭菌12-15小时；

（6）接种：待灭菌后的瓶子或袋子温度降到30℃以下时，移入接种室或接种箱内，在无菌条件下，从灵芝母种试管中，用接种钩挑取蚕豆粒大小菌种块移入瓶中，1支试管母种接原种4-5瓶或袋，1瓶或袋原种接栽培种40-50瓶或袋；

（7）培养 ：接种后置28℃条件下避光培养；

（8）接种后的每天或隔天对瓶子或袋子进行检查，挑出污染及菌丝未萌发的瓶子或袋子；合格的原种、栽培种的标准为：灵芝菌丝浓密，白色，上下分布均匀，成为栽培种。

6.根据权利要求5所述的采用灵芝DH8转化葡萄蔓中白黎芦醇的方法，其特征在于，步骤（6）所述灵芝母种的培养方法包括以下步骤：

（1）马铃薯培养基：马铃薯200g，蛋白胨2 g，酵母粉3 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁0.6 g，琼脂20 g，葡萄蔓枝浸泡液1000ml；

所述葡萄蔓枝浸泡液的制备方法为：取蒸馏水按料液比1:5，浸泡葡萄蔓枝屑24h得葡萄蔓枝浸泡液备用；

（2）培养基配制：先将马铃薯切片，煮沸20mim，过滤，取汁，加入其他配料，进行煮沸，待琼脂完成溶化后，补葡萄蔓枝浸泡液至1000ml，趁热分装到试管中，每根试管装5-7ml，塞好塞子或棉花塞；

（3）灭菌：将装好培养基的试管竖着放入灭菌锅内，1.5兆帕高压下灭菌15-20 mim；

（4）试管摆放：灭菌后，打开灭菌锅，趁热将试管按倾斜摆放，放冷，即成试管斜面；

（5）种芝选择：选择形态发育正常，无病虫害，菌盖边缘尚未变色，未弹射孢子的灵芝子实体；

（6）消毒处理：在无菌条件下用75%酒精进行表面擦拭杀菌消毒；

（7）分离：在无菌条件下或无菌箱内，切去菌柄基部，用刀片切开菌盖，用单面刀片或解剖刀切取米粒大菌肉一块移入试管斜面培养基中央；

（8）培养：试管放置在26-28℃恒温箱内，培养2-3天后，斜面上切取的灵芝子实体上会有少量白色絮状菌丝出现，7-8天后菌丝长满斜面，此即为第一代母种试管；

（9）采收：当灵芝菌盖边缘不再生长，菌盖下面子实层内弹射出棕红色孢子时，按常规方法进行孢子粉收集和子实体采收。