CN115530005A - 一种组织培养快速繁殖甜灵芝的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种组织培养快速繁殖甜灵芝的方法，包括以下步骤：在母种培养基中培养起甜灵芝母种后，将甜灵芝母种接种至原种培养基培养，得到甜灵芝原种；将甜灵芝原种接种至栽培种培养基中培养，获得甜灵芝栽培种；将所述甜灵芝栽培种进行代料栽培，获得甜灵芝。本发明利用茶蒲屑和茶籽壳屑来配制原种培养基，减少木屑使用量，经过栽培种培养基的培养后，利用代料栽培培养基进行代料栽培，在不同培养阶段控制不同的CO₂浓度，使产出的甜灵芝的生长速度更快，产出稳定性高，质量好。

Description

一种组织培养快速繁殖甜灵芝的方法

技术领域

本发明涉及灵芝培养技术领域，尤其涉及一种组织培养快速繁殖甜灵芝的方法。

背景技术

灵芝是著名的食药用真菌，在我国已超2000多年的历史。灵芝具有较好的补中益气、扶正固本等药用功效，具有养心安神、止咳平喘的功效，被列入了传统中医药的“上药”。现代药理学研究表明，灵芝具有多糖、三萜类、核苷酸、氨基酸等多种生物活性成分，具有抗肿瘤、抗癌、抗氧化、调节免疫、降血脂、降血糖、保护肝脏等药理活性。

在民间使用最多的灵芝为赤芝，但赤芝苦味重，大众接受度差，这对灵芝子实体的推广利用产生了一定影响。甜灵芝为1989年从日本引入的新品种，其苦味较淡，味偏甜，口感优于赤芝，大众接受度较佳，食用评价高于赤芝，具有很高的市场开发价值。

但是甜灵芝比赤芝在组织培养上具有更大的难度，甜灵芝所需的培养液与赤芝存在很大差别，而且生长周期、产出效率不如赤芝高效，多糖、三萜类等物质含量偏低，目前的组织培养技术存在生长不稳定、功能性能单一、原料配比不合理等缺陷。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种组织培养快速繁殖甜灵芝的方法，以解决现有技术中甜灵芝组织培养存在的生长不稳定、功能性能单一、原料配比不合理等问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

本申请实施例提供一种组织培养快速繁殖甜灵芝的方法，包括以下步骤：

1)制备甜灵芝原种；

母种培养基包括以下成分：土豆400g/L、葡萄糖40g/L、琼脂25g/L、蛋白胨12g/L、硫酸镁1.5g/L、磷酸二氢钾3g/L、VB11 mg/L，pH自然；在28～30℃下恒温黑暗培养；在母种培养基中培养起甜灵芝母种后，将甜灵芝母种接种至原种培养基培养，得到甜灵芝原种；

所述原种培养基包括以下重量份的成分：茶蒲屑30～45％、茶籽壳屑15～20％、麦麸10～15％，玉米粉10％、石膏1％、石灰粉1％、蔗渣10～18％、过磷酸钙2％；在25～28℃、相对湿度85～95％下恒温黑暗培养；

2)将甜灵芝原种接种至栽培种培养基中培养，获得甜灵芝栽培种；

所述栽培种培养基包括以下重量份的原料：杂木屑70～80份、麸皮10～15份、米糖4～7份、黄豆粉1～3份、石膏粉2份，PH5-6，含水量50-60％，之后置27℃室内培养，培养时间约30～60天，可长满全瓶，得到甜灵芝栽培种；

3)将所述甜灵芝栽培种进行代料栽培，获得甜灵芝；

所述代料栽培的培养基与所述栽培种培养基相同，所述代料栽培条件为在26～27℃、相对湿度80～90％下恒温培养，保持CO₂体积分数在0.3％，待菌柄长至4cm～5cm时修枝，修枝后CO₂体积分数降低至0.08％～0.1％，继续培养，得到甜灵芝。

在一些实施例中，所述原种培养基中还包括20～30％的花生根，在制备所述原种培养基时，包括以下步骤：

将茶蒲屑、茶籽壳屑经过自然堆积发酵，堆高2.5m，保持推料湿润，每1个月翻堆依次，堆制6个月，使其中的单宁、油脂等对甜灵芝生长有害的物质消除，堆制结束后，将茶蒲屑、茶籽壳屑晒干，将茶蒲屑、茶籽壳屑充分软化后备用；

将收集的花生根晒干，粉碎成花生根屑，备用；

将晒干后的茶蒲屑、茶籽壳屑与粉碎后的花生根屑搅拌均匀，然后将石膏、过磷酸钙、石灰粉、玉米粉、麦麸溶解于水，再加入拌匀后的茶蒲屑、茶籽壳屑和花生根屑，配置好的料堆闷5小时，使原种培养基的含水量保持在63％～65％，PH5～6.5。

在一些实施例中，在将甜灵芝母种接种至原种培养基培养时：

按原种培养基质量5％～10％接种量接种到斜面的原种培养基上，在25～28℃、相对湿度85～95％下恒温黑暗培养20～35D，至菌丝长满斜面，挑取长势旺盛、粗壮均一的作为甜灵芝原种于4℃保藏备用或进一步培养。

在一些实施例中，在将甜灵芝原种接种至栽培种培养基中培养时：

按栽培种培养基质量5～10％接种量接种到栽培种培养基上，在27℃、相对湿度85～95％下恒温黑暗培养30～60D，至菌丝充满栽培生产用的瓶子，得到甜灵芝栽培种。

在一些实施例中，在将甜灵芝母种接种至母种培养基之前，还包括制备甜灵芝母种，包括以下步骤：

取甜灵芝子实体，浸泡于超净台上的生物消毒液中进行消毒，浸泡时间为3分钟，然后取出；

用无菌手术刀切开消毒后的子实体，在菌柄和菌盖之间显露出的菌肉中切取米粒大小作为外植体，然后取外植体喷洒保鲜液，再密封以保持无菌状态，接着置于8℃下冷藏8～10小时，取出后再置于30～32℃下活化10～12小时，重复进行冷藏和活化5次，得激活外植体；

将激活外植体接种于母种培养基上，在28～30℃培养10～20天，使培养基长满菌丝体，得母种；培养期间为恒温黑暗培养。

在一些实施例中，在进行代料栽培时，包括以下步骤：

在代料栽培初期，CO₂体积分数在0.3％的阶段，避光培养；

当修枝后且CO₂体积分数降低至0.08％～0.1％时，每天采用波长为670～720nm的红光和波长为512～520nm的绿光交替照射，设置光照强度为300～500lx，先利用红光照射60分钟，再切换至黑暗无光照条件，替换至利用绿光照射60分钟，再切换至黑暗无光照条件，控制红光和绿光在一天内的总光照时间为480～600分钟，红光和绿光之间的间隔时间为30分钟。

在一些实施例中，所述栽培种培养基还包括重量份为12～15份的蜜环菌发酵液，所述蜜环菌发酵液中有效活菌数为1.0～5.0×106/mL。

在一些实施例中，所述栽培种培养基还包括重量份为1～5份的漆酶液，所述漆酶液的漆酶活力为500～800U/g。

相比现有技术，本发明至少包括以下有益效果：

本申请实施例提供的组织培养快速繁殖甜灵芝的方法，利用茶蒲屑和茶籽壳屑来配制原种培养基，减少木屑使用量，经过栽培种培养基的培养后，利用代料栽培培养基进行代料栽培，在不同培养阶段控制不同的CO₂浓度，使产出的甜灵芝的生长速度更快，产出稳定性高，质量好。

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

具体实施方式

实施例1：

本实施例1提供一种组织培养快速繁殖甜灵芝的方法，包括以下步骤：

1)制备甜灵芝原种；

将甜灵芝母种接种到母种培养基中，母种培养基包括以下成分：土豆400g/L、葡萄糖40g/L、琼脂25g/L、蛋白胨12g/L、硫酸镁1.5g/L、磷酸二氢钾3g/L、VB11 mg/L，pH自然；在28～30℃下恒温黑暗培养8天；

在母种培养基中培养起甜灵芝母种后，将甜灵芝母种接种至原种培养基培养，得到甜灵芝原种；

所述原种培养基包括以下重量份的成分：茶蒲屑30～45％、茶籽壳屑15～20％、麦麸10～15％，玉米粉10％、石膏1％、石灰粉1％、蔗渣10～18％、过磷酸钙2％；在25～28℃、相对湿度85～95％下恒温黑暗培养25天；

母种培养、原种培养条件均在暗室避光培养。

2)将甜灵芝原种接种至栽培种培养基中培养，获得甜灵芝栽培种；

所述栽培种培养基包括以下重量份的原料：杂木屑70～80份、麸皮10～15份、米糖4～7份、黄豆粉1～3份、石膏粉2份，PH5-6，含水量50-60％，之后置27℃室内培养，培养时间约30～60天，可长满全瓶，得到甜灵芝栽培种；

3)将所述甜灵芝栽培种进行代料栽培，获得甜灵芝；

所述代料栽培的培养基与所述栽培种培养基相同，所述代料栽培条件为在26～27℃、相对湿度80～90％下恒温培养，保持CO₂体积分数在0.3％，待菌柄长至4cm～5cm时修枝，修枝后CO₂体积分数降低至0.08％～0.1％，继续培养，一般培养时间为35～65天，得到甜灵芝。

通过以上方式培养的甜灵芝，生物效率(二次采收灵芝子实体的总鲜重量占培养基干重的百分率)最高可达到57％，即每100g栽培用培养料最高可得57g新鲜的甜灵芝实体。

实施例2：

本实施例2为了使甜灵芝具有更好的药效，提高其食用功效，本实施例的所述原种培养基中还包括20～30％的花生根，在制备所述原种培养基时，包括以下步骤：

将茶蒲屑、茶籽壳屑经过自然堆积发酵，堆高2.5m，保持推料湿润，每1个月翻堆依次，堆制6个月，经过自然堆积发酵处理后，消除茶蒲屑、茶籽壳屑中的单宁、油脂等对甜灵芝生长有害的物质，既去除了有毒抑菌物，又使大分子物质降解，有利于灵芝菌丝的吸收，使菌丝长势旺盛；在堆制结束后，将茶蒲屑、茶籽壳屑晒干，将茶蒲屑、茶籽壳屑充分软化后备用；

将收集的花生根晒干，粉碎成花生根屑，备用；

将晒干后的茶蒲屑、茶籽壳屑与粉碎后的花生根屑搅拌均匀，然后将石膏、过磷酸钙、石灰粉、玉米粉、麦麸溶解于水，再加入拌匀后的茶蒲屑、茶籽壳屑和花生根屑，配置好的料堆闷5小时，使原种培养基的含水量保持在63％～65％，PH5～6.5。

需要说明的是，由于花生根中含有白黎芦醇，白黎芦醇具有优良药理活性和保健功能，花生根这种植物种植副产品又极容易获得，数量大，成本低，通过将花生根晒干粉碎，再与其他原料一起制备原种培养基，使得花生根中的白黎芦醇转化至甜灵芝原种上，通过以上方式，能使甜灵芝原种上转化得到白黎芦醇0.58～2.14mg/kg。

实施例3：

本实施例3为了更好地进行培养过程控制，使生长更稳定，周期更可控，在将甜灵芝母种接种至原种培养基培养时：

按原种培养基质量5％～10％接种量接种到斜面的原种培养基上，在25～28℃、相对湿度85～95％下恒温黑暗培养20～35D，至菌丝长满斜面，挑取长势旺盛、粗壮均一的作为甜灵芝原种于4℃保藏备用或进一步培养。

在将甜灵芝原种接种至栽培种培养基中培养时：

按栽培种培养基质量5～10％接种量接种到栽培种培养基上，在27℃、相对湿度85～95％下恒温黑暗培养30～60D，至菌丝充满栽培生产用的瓶子，得到甜灵芝栽培种。

实施例4：

本实施例4在将甜灵芝母种接种至母种培养基之前，还包括制备甜灵芝母种，包括以下步骤：

取甜灵芝子实体，浸泡于超净台上的生物消毒液中进行消毒，浸泡时间为3分钟，然后取出；

用无菌手术刀切开消毒后的子实体，在菌柄和菌盖之间显露出的菌肉中切取米粒大小作为外植体，然后取外植体喷洒保鲜液，再密封以保持无菌状态，接着置于8℃下冷藏8～10小时，取出后再置于30～32℃下活化10～12小时，重复进行冷藏和活化5次，得激活外植体；

将激活外植体接种于母种培养基上，在28～30℃培养10～20天，使培养基长满菌丝体，得母种；培养期间为恒温黑暗培养。

需要说明的是，本实施例以以灵芝子实体组织中的多酚氧化酶为关注对象，在切取外植体前先用生物消毒液降低子实体中多酚氧化酶活性，防止其产生褐变，再于获取外植体后采用保鲜液冷藏和活化激活外植体中的纤维素酶和多酚酶，促进外植体接种后迅速生长出菌丝，经过恒温黑暗培养后，能使甜灵芝中的多糖、三萜类等物质含量得到较好的生成，外植体成活率高。

实施例5：

本实施例5在进行代料栽培时，为了使甜灵芝在不同的培养阶段能得到对应的营养补给，适应不同的生长速率，包括以下步骤：

在代料栽培初期，CO₂体积分数在0.3％的阶段，避光培养；

当修枝后且CO₂体积分数降低至0.08％～0.1％时，每天采用波长为670～720nm的红光和波长为512～520nm的绿光交替照射，设置光照强度为300～500lx，先利用红光照射60分钟，再切换至黑暗无光照条件，替换至利用绿光照射60分钟，再切换至黑暗无光照条件，控制红光和绿光在一天内的总光照时间为480～600分钟，红光和绿光之间的间隔时间为30分钟。

通过进行红光和绿光的交替照射，配合相应的CO₂体积分数浓度，在甜灵芝的代料栽培后期，能很好地提高这阶段的生物效率至62％，并有利于降低其内的灵芝酸A，降低灵芝的苦味，突显甜味。

实施例6：

本实施例6所述栽培种培养基还包括重量份为12～15份的蜜环菌发酵液、重量份为1～5份的漆酶液，所述蜜环菌发酵液中有效活菌数为1.0～5.0×106/mL，漆酶液的漆酶活力为500～800U/g。

其中，所述蜜环菌发酵液制备方法包括取蜜环菌母种，接种于培养液，摇床140rpm培养9d，培养温度27℃，用纱布滤掉蜜环菌菌球，即得蜜环菌发酵液。

需要说明的是，将蜜环菌应用在灵芝栽培种培养基堆腐发酵中，所制得的栽培种培养基具备抑菌功能，可以显著降低杂菌污染率，提高灵芝质量。

而且漆酶作为木质素降解酶系的一种，是一种糖基化、含铜的多酚氧化酶，能够降解酚类及其衍生物，对甜灵芝的组织培养生长发育过程起到重要作用，因此通过在栽培种培养基中加入漆酶活力为500～800U/g的漆酶液，能同步兼顾甜灵芝的生长质量和生长效率。

以下举多个实施例进行试验数据说明：

实施例10：

本实施例10中提供一种组织培养快速繁殖甜灵芝的方法，具体为：取甜灵芝子实体，浸泡于超净台上的生物消毒液中进行消毒，浸泡时间为3分钟，然后取出；

用无菌手术刀切开消毒后的子实体，在菌柄和菌盖之间显露出的菌肉中切取米粒大小作为外植体，然后取外植体喷洒保鲜液，再密封以保持无菌状态，接着置于8℃下冷藏8小时，取出后再置于32℃下活化10小时，重复进行冷藏和活化5次，得激活外植体；

将激活外植体接种于母种培养基上，在28℃培养15天，使培养基长满菌丝体，得母种；培养期间为恒温黑暗培养。

母种培养基包括以下成分：土豆400g/L、葡萄糖40g/L、琼脂25g/L、蛋白胨12g/L、硫酸镁1.5g/L、磷酸二氢钾3g/L、VB11 mg/L，pH自然；在28℃下恒温黑暗培养8天；在母种培养基中培养起甜灵芝母种后，将甜灵芝母种接种至原种培养基培养，得到甜灵芝原种；

所述原种培养基包括以下重量份的成分：20％的花生根、茶蒲屑30％、茶籽壳屑15％、麦麸10％，玉米粉10％、石膏1％、石灰粉1％、蔗渣11％、过磷酸钙2％；在28℃、相对湿度95％下恒温黑暗培养25天；

在制备所述原种培养基时，将茶蒲屑、茶籽壳屑经过自然堆积发酵，堆高2.5m，保持推料湿润，每1个月翻堆依次，堆制6个月，使其中的单宁、油脂等对甜灵芝生长有害的物质消除，堆制结束后，将茶蒲屑、茶籽壳屑晒干，将茶蒲屑、茶籽壳屑充分软化后备用；

将收集的花生根晒干，粉碎成花生根屑，备用；

将晒干后的茶蒲屑、茶籽壳屑与粉碎后的花生根屑搅拌均匀，然后将石膏、过磷酸钙、石灰粉、玉米粉、麦麸溶解于水，再加入拌匀后的茶蒲屑、茶籽壳屑和花生根屑，配置好的料堆闷5小时，使原种培养基的含水量保持在65％，PH6。

在将甜灵芝母种接种至原种培养基培养时：

按原种培养基质量5％接种量接种到斜面的原种培养基上，在28℃、相对湿度85％下恒温黑暗培养20D，至菌丝长满斜面，挑取长势旺盛、粗壮均一的作为甜灵芝原种于4℃保藏备用或进一步培养。

将甜灵芝原种接种至栽培种培养基中培养，获得甜灵芝栽培种；

所述栽培种培养基包括以下重量份的原料：蜜环菌发酵液12份、漆酶液1份、杂木屑70份、麸皮10份、米糖4份、黄豆粉1份、石膏粉2份，PH6，含水量60％，之后置27℃室内培养，培养时间约30天，可长满全瓶，得到甜灵芝栽培种；

蜜环菌发酵液中有效活菌数为5.0×10⁶/mL，漆酶液的漆酶活力为800U/g；

在将甜灵芝原种接种至栽培种培养基中培养时：

按栽培种培养基质量5％接种量接种到栽培种培养基上，在27℃、相对湿度95％下恒温黑暗培养30D，至菌丝充满栽培生产用的瓶子，得到甜灵芝栽培种。

将所述甜灵芝栽培种进行代料栽培，获得甜灵芝；

所述代料栽培的培养基与所述栽培种培养基相同，所述代料栽培条件为在27℃、相对湿度90％下恒温培养，保持CO₂体积分数在0.3％，待菌柄长至4cm～5cm时修枝，修枝后CO₂体积分数降低至0.1％，继续培养，得到甜灵芝。

其中，在代料栽培初期，CO₂体积分数在0.3％的阶段，避光培养；

当修枝后且CO₂体积分数降低至0.1％时，每天采用波长为670～720nm的红光和波长为512～520nm的绿光交替照射，设置光照强度为300～500lx，先利用红光照射60分钟，再切换至黑暗无光照条件，替换至利用绿光照射60分钟，再切换至黑暗无光照条件，控制红光和绿光在一天内的总光照时间为600分钟，红光和绿光之间的间隔时间为30分钟，即红光照射一个钟后，间隔半个钟，再切换至绿灯照射一个钟，间隔半个钟，再红光照射一个钟，如此循环，在一天内，红光照射5个钟，绿光照射5个钟，共10个钟，600分钟，其余时间均为黑暗无光照条件。

实施例11：

在本实施例11中提供一种组织培养快速繁殖甜灵芝的方法，与实施例10的区别仅在于：原种培养基包括以下重量份的成分：茶蒲屑45％、茶籽壳屑20％、麦麸10％，玉米粉10％、石膏1％、石灰粉1％、蔗渣11％、过磷酸钙2％；在28℃、相对湿度95％下恒温黑暗培养25天。在原种培养基中不包括花生根。

实施例12：

在本实施例12中提供一种组织培养快速繁殖甜灵芝的方法，与实施例10的区别仅在于：在进行代料栽培时，在CO₂体积分数改变后，不进行红光、绿光的交替照射。

实施例13：

在本实施例13中提供一种组织培养快速繁殖甜灵芝的方法，与实施例10的区别仅在于：所述栽培种培养基包括以下重量份的原料：杂木屑73份、麸皮15份、米糖7份、黄豆粉3份、石膏粉2份，PH6，含水量60％，之后置27℃室内培养，培养时间约30天，可长满全瓶，得到甜灵芝栽培种。在栽培种培养基中不包括蜜环菌发酵液和漆酶液。

选取同一批甜灵芝子实体，按照实施例10至13的方法进行组织培养，得到实验样品10至13，统计实验样品10至13的生物学效率、白黎芦醇浓度、代料栽培菌丝生长速度、灵芝多糖含量和灵芝三萜类含量，检测出的结果汇总如下表。

表1不同实施例的组织培养方法对甜灵芝特性的影响

相对于现有技术，上述实施例提供一种组织培养快速繁殖甜灵芝的方法，利用茶蒲屑和茶籽壳屑来配制原种培养基，减少木屑使用量，经过栽培种培养基的培养后，利用代料栽培培养基进行代料栽培，在不同培养阶段控制不同的CO₂浓度，使产出的甜灵芝的生长速度更快，产出稳定性高，质量好。

以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种组织培养快速繁殖甜灵芝的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)制备甜灵芝原种；

母种培养基包括以下成分：土豆400g/L、葡萄糖40g/L、琼脂25g/L、蛋白胨12g/L、硫酸镁1.5g/L、磷酸二氢钾3g/L、VB11 mg/L，pH自然；在28～30℃下恒温黑暗培养；在母种培养基中培养起甜灵芝母种后，将甜灵芝母种接种至原种培养基培养，得到甜灵芝原种；

所述原种培养基包括以下重量份的成分：茶蒲屑30～45％、茶籽壳屑15～20％、麦麸10～15％，玉米粉10％、石膏1％、石灰粉1％、蔗渣10～18％、过磷酸钙2％；在25～28℃、相对湿度85～95％下恒温黑暗培养；

2)将甜灵芝原种接种至栽培种培养基中培养，获得甜灵芝栽培种；

所述栽培种培养基包括以下重量份的原料：杂木屑70～80份、麸皮10～15份、米糖4～7份、黄豆粉1～3份、石膏粉2份，PH5-6，含水量50-60％，之后置27℃室内培养，培养时间约30～60天，可长满全瓶，得到甜灵芝栽培种；

3)将所述甜灵芝栽培种进行代料栽培，获得甜灵芝；

所述代料栽培的培养基与所述栽培种培养基相同，所述代料栽培条件为在26～27℃、相对湿度80～90％下恒温培养，保持CO₂体积分数在0.3％，待菌柄长至4cm～5cm时修枝，修枝后CO₂体积分数降低至0.08％～0.1％，继续培养，得到甜灵芝。

2.如权利要求1所述的一种组织培养快速繁殖甜灵芝的方法，其特征在于，所述原种培养基中还包括20～30％的花生根，在制备所述原种培养基时，包括以下步骤：

将茶蒲屑、茶籽壳屑经过自然堆积发酵，堆高2.5m，保持推料湿润，每1个月翻堆依次，堆制6个月，使其中的单宁、油脂等对甜灵芝生长有害的物质消除，堆制结束后，将茶蒲屑、茶籽壳屑晒干，将茶蒲屑、茶籽壳屑充分软化后备用；

将收集的花生根晒干，粉碎成花生根屑，备用；

将晒干后的茶蒲屑、茶籽壳屑与粉碎后的花生根屑搅拌均匀，然后将石膏、过磷酸钙、石灰粉、玉米粉、麦麸溶解于水，再加入拌匀后的茶蒲屑、茶籽壳屑和花生根屑，配置好的料堆闷5小时，使原种培养基的含水量保持在63％～65％，PH5～6.5。

3.如权利要求2所述的一种组织培养快速繁殖甜灵芝的方法，其特征在于，在将甜灵芝母种接种至原种培养基培养时：

按原种培养基质量5％～10％接种量接种到斜面的原种培养基上，在25～28℃、相对湿度85～95％下恒温黑暗培养20～35D，至菌丝长满斜面，挑取长势旺盛、粗壮均一的作为甜灵芝原种于4℃保藏备用或进一步培养。

4.如权利要求3所述的一种组织培养快速繁殖甜灵芝的方法，其特征在于，在将甜灵芝原种接种至栽培种培养基中培养时：

按栽培种培养基质量5～10％接种量接种到栽培种培养基上，在27℃、相对湿度85～95％下恒温黑暗培养30～60D，至菌丝充满栽培生产用的瓶子，得到甜灵芝栽培种。

5.如权利要求4所述的一种组织培养快速繁殖甜灵芝的方法，其特征在于，在将甜灵芝母种接种至母种培养基之前，还包括制备甜灵芝母种，包括以下步骤：

取甜灵芝子实体，浸泡于超净台上的生物消毒液中进行消毒，浸泡时间为3分钟，然后取出；

用无菌手术刀切开消毒后的子实体，在菌柄和菌盖之间显露出的菌肉中切取米粒大小作为外植体，然后取外植体喷洒保鲜液，再密封以保持无菌状态，接着置于8℃下冷藏8～10小时，取出后再置于30～32℃下活化10～12小时，重复进行冷藏和活化5次，得激活外植体；

将激活外植体接种于母种培养基上，在28～30℃培养10～20天，使培养基长满菌丝体，得母种；培养期间为恒温黑暗培养。

6.如权利要求5所述的一种组织培养快速繁殖甜灵芝的方法，其特征在于，在进行代料栽培时，包括以下步骤：

在代料栽培初期，CO₂体积分数在0.3％的阶段，避光培养；

当修枝后且CO₂体积分数降低至0.08％～0.1％时，每天采用波长为670～720nm的红光和波长为512～520nm的绿光交替照射，设置光照强度为300～500lx，先利用红光照射60分钟，再切换至黑暗无光照条件，替换至利用绿光照射60分钟，再切换至黑暗无光照条件，控制红光和绿光在一天内的总光照时间为480～600分钟，红光和绿光之间的间隔时间为30分钟。

7.如权利要求6所述的一种组织培养快速繁殖甜灵芝的方法，其特征在于，所述栽培种培养基还包括重量份为12～15份的蜜环菌发酵液，所述蜜环菌发酵液中有效活菌数为1.0～5.0×10⁶/mL。

8.如权利要求7所述的一种组织培养快速繁殖甜灵芝的方法，其特征在于，所述栽培种培养基还包括重量份为1～5份的漆酶液，所述漆酶液的漆酶活力为500～800U/g。