CN111149617A - 一种灵芝的组培方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种灵芝的组培方法,具体涉及食用菌组织培养技术领域。本发明突破性地以灵芝子实体组织中的多酚氧化酶为关注对象，在切取外植体前先用生物消毒液降低子实体中多酚氧化酶活性，防止其产生褐变，再于获取外植体后采用保鲜液冷藏和活化激活外植体中的纤维素酶和多酚酶，促进外植体接种后迅速生长出菌丝，并在培养期间采用特定波长的红光和绿光交替、间歇照射，之后用微波照射试炼，刺激菌丝体的生长和其中有效成分的富集。本发明的外植体成活率为72％以上，获得的菌丝体生长速度为8mm/d，总氨基酸含量为16％以上、多糖含量4％以上。

Description

一种灵芝的组培方法
【技术领域】
本发明涉及食用菌组织培养技术领域，具体涉及一种灵芝的组培方法。
【背景技术】
灵芝在中国向来被视为草木菁英，有“瑞草”、“仙草”等美誉，在日本被称为万年茸，是一种珍贵的药(食)用菌。《神农本草经》指出：赤芝(即灵芝)“苦，平，无毒”，主治“胸中结、益心气，补中、增智慧、不忘”，“久食轻身不老，延年神仙”。《本草纲目》记载灵芝有“滋补强壮、延年益寿、利关节、治耳聋”等神奇功效，将其列为药中上品。
在自然界中，灵芝通过子实体产生孢子进行有性繁殖。当人们将灵芝进行引种驯化后，发现采用孢子进行育种的萌发率极低，由此人们发展出了用孢子或子实体组织细胞作为外植体经培养萌发形成的纯菌丝体的育种方法。目前，在灵芝的实体组织细胞培养时，极少关注其中酶的活性情况，只是按常规的组培方法进行组织分离和培养操作，如中国专利公开号为CN107750814A、名为一种野生灵芝菌种的培育方法的专利文献，公开了将灵芝菌肉组织依次从原种培育到栽培种培育的过程，该方法虽然能够获得菌丝作为菌种，但外植体成活率低、各阶段菌丝的生长速度也较低，且氨基酸和多糖成分含量低，直接造成子实体发育缓慢和有效成分含量低。
因此，为使人工繁育灵芝获得更大的成功、促进灵芝产业持续发展，有必要开发一种菌丝生长迅速、有效成分含量高的灵芝组培方法。
【发明内容】
本发明的发明目的在于：针对灵芝现有组培方法中外植体成活率低、菌丝的生长速度较低，且氨基酸和多糖成分含量低的问题，提供一种灵芝的组培方法。本发明的外植体成活率为72％以上，获得的菌丝体生长速度为8mm/d，总氨基酸含量为16％以上、多糖含量4％以上。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种灵芝的组培方法，包括以下步骤：
a.取灵芝子实体，浸泡于超净台上的生物消毒液中进行消毒，浸泡时间为60-120秒，然后取出；
b.用无菌手术刀切开消毒后的子实体，在菌柄和菌盖之间显露出的菌肉中切取米粒大小作为外植体，然后取外植体喷洒保鲜液，再密封以保持无菌状态，接着置于1-5℃下冷藏2-6小时，取出后再置于15-25℃下活化4-8小时，重复进行冷藏和活化2-4次，得激活外植体；
c.将激活外植体接种于母种培养基上，在20-30℃培养10-20天，使培养基长满菌丝体，得母种；培养期间每天采用波长为670-720nm的红光和波长为512-520nm的绿光交替照射，设置光照强度为5-25lx，光照时间为140-200分钟，其余时间为黑暗无光照条件，红光与绿光的交替时间为20-40分钟；
d.将母种置于微波照射下试炼12-24小时，设置照射波长为4-10cm、照射功率密度为15-25mW/cm2、微波源与母种的距离为1-2m，得试炼种；
e.取试炼种接种至MS培养基上，在20-30℃下进行培养，使MS培养基上长满菌丝体，得栽培种，将栽培种接种于菌袋或段木上，按常规方法进行栽培出菇，即可采收。
优化的，步骤a中所述生物消毒液包括以下重量份比的原料：谷维素5-15份、壳聚糖12-24份、花生四烯酸10-20份、解淀粉芽孢杆菌0.01-0.05份、异硫氰酸酯0.03-0.07份、青蒿素0.01-0.04份、春雷霉素0.02-0.07份、虾青素0.08-0.14份和水100-200份。
进一步优化的，所述生物消毒液的制备方法为：取谷维素、壳聚糖、花生四烯酸和解淀粉芽孢杆菌，加水搅拌均匀，在20-30℃下培养80-100小时，然后取出，加入异硫氰酸酯、青蒿素、春雷霉素、虾青素，搅拌均匀，接着采用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌，得生物消毒液。
更进一步优化的，步骤b中所述保鲜液包括以下重量份比的原料：玉米朊20-30份、叶绿素0.1-0.7份、虾青素0.5-1.7份、碧萝芷3-9份、谷维素2-8份、辣木籽提取物15-25份、玉米赤霉烯酮0.2-0.6份、5-羟基色胺0.04-0.1份、甘露低聚糖1-3份和甘油110-180份。
再更进一步优化的，所述保鲜液的喷洒量为每克外植体喷洒5-15ml。
再更进一步优化的，所述辣木籽提取物的制备方法为：取辣木籽粉碎后，加水湿润，使水分含量为21％-31％，然后置于闪爆器中进行高压蒸汽闪爆处理，设置闪爆器温度为70-90℃、压力为1-3MPa、保压时间为140-160秒、卸压时间为0.03-0.08秒、闪爆次数为2-4次，得闪爆粉，接着取闪爆粉按料液比g/ml为1:7-15加入水微波萃取65-95分钟，设置微波萃取的功率为700-1100w，随后过滤，收集滤液浓缩干燥，得辣木籽提取物。
再更进一步优化的，所述保鲜液的制备方法为：取玉米朊、叶绿素、虾青素、碧萝芷混合均匀，然后加入20％-30％重量的甘油，置于高压均质机中进行均质，设置高压均质机温度为5-15℃、压力为30-50Mpa、循环次数为2-4次，得均质包合物，备用；取剩余甘油加热至55-75℃，加入谷维素、辣木籽提取物、玉米赤霉烯酮、5-羟基色胺和甘露低聚糖，搅拌均匀，然后冷却至室温，加入所述均质包合物，搅拌均匀，得保鲜液。
再更进一步优化的，步骤c中所述母种培养基的制备方法为：取MS培养基加热使溶解，然后在每升培养基中加入青蒿精油10-20mg、15-25mg玉米素、4-10mg萘乙酸、5-15g纳豆，搅拌均匀后冷却，在20-30℃下培养72-94小时，接着加热使再次溶解，继续在每升培养基中加入亚硒硫酸钠0.1-0.5g、褪黑素4-10mg、玉米赤霉烯酮3-9mg，搅拌均匀后进行灭菌、冷却，得母种培养基。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1.本发明突破性地以灵芝子实体组织中的多酚氧化酶为关注对象，在切取外植体前先用生物消毒液降低子实体中多酚氧化酶活性，防止其产生褐变，再于获取外植体后采用保鲜液冷藏和活化激活外植体中的纤维素酶和多酚酶，促进外植体接种后迅速生长出菌丝，并在培养期间采用特定波长的红光和绿光交替、间歇照射，之后用微波照射试炼，刺激菌丝体的生长和其中有效成分的富集。本发明的外植体成活率为72％以上，获得的菌丝体生长速度为8mm/d，总氨基酸含量为16％以上、多糖含量4％以上。
2.本发明关注到在子实体的完整细胞中，多酚类物质(包括酚类和酚酸类等)作为呼吸传递介质，在醌-酚之间保持动态平衡，当外植体切取下来后，由于离开了子实体，其营养来源被切断、平衡被打破，其中的酚类物质在多酚氧化酶的作用下会不可逆转地氧化成醌，醌再聚合生成黑素，特别是在外植体的切取断面，多酚氧化酶容易聚集迅速产生黑素，黑素的生成会抑制多种酶的活性，最终导致外植体死亡，严重降低组织培养的质量。
本发明中在切取外植体前以生物消毒液浸泡灵芝子实体，既可以杀菌消毒，又能有效防止外植体切下来后切面暴露发生褐变，能够提高外植体接种的成活率。其中，解淀粉芽孢杆菌以分解小部分的谷维素、花生四烯酸、壳聚糖作为营养源进行培养后可产生多种抑菌代谢物，与异硫氰酸酯、青蒿素、春雷霉素共同配合能够杀菌消毒，相比于常规采用升汞、酒精、次氯酸钠等化学物质消毒对子实体组织的损伤，本发明中的消毒成分为纯天然的植物成分和生物代谢成分，不会对子实体组织造成伤害。谷维素、花生四烯酸、壳聚糖和虾青素分别为植物体和动物体中的代谢成分，能够与外植体中的酚类和酚酸类以氢键结合，由于酚类和酚酸类为多酚氧化酶的褐变反应底物，故通过氢键结合后能间接性地降低多酚氧化酶与多酚的反应活性，防止褐变产生。
3.本发明中在外植体接种于母种培养基前，先采用保鲜液将外植体进行激活，能有效提高外植体的成活率和菌丝的生长速度。之后，再结合低温和高温循环冷藏和活化，使外植体产生应激性防御，能够有效激活多酚氧化酶、纤维素酶等相关酶类，为外植体细胞的分化增殖提供动力和能量。其中，叶绿素、碧萝芷能够清除外植体呼吸代谢产生的自由基，防止细胞衰老而停止分化；虾青素和谷维素能够与外植体内的多酚类物质结合，防止褐变发生；玉米赤霉烯酮、5-羟色胺为生长促进剂，能够促进外植体分化出菌丝；甘露低聚糖具有激活细胞免疫应答的作用，可以增强外植体的抗逆性，并且能吸附代谢过程中的毒素，消除有害影响；甘油作为保鲜液的溶剂，可以将各种成分进行均匀分散，并促进保鲜液中成分在外植体的浸润与吸收；辣木籽含有多糖、多酚、黄酮成分，为外植体的存活提供营养物质，本发明采用高压蒸汽闪爆处理完，再用微波萃取制得辣木籽提取物，可以利用闪爆处理有效破坏辣木籽坚硬的细胞壁，利于微波萃取将上述营养成分充分提取出来；同时由于叶绿素、虾青素、碧萝芷中成分不易稳定，故采用了玉米朊作为保护剂，以低温高压均质的方法将上述三种成分包裹于玉米朊中形成包合物微粒，既能促进三种成分的吸收，又能保证它们的化学性质稳定。
4.本发明采用交替红光和绿光照射配合黑暗环境共同作用，有力促进了外植体发展成菌丝的繁殖和有效成分的积累。通过控制红光、蓝光的波长、光照时间、光照强度，与黑暗环境交织作用，获得了最佳的培养条件。
5.本发明中将母种置于一定波长的低功率密度微波下进行照射，是通过微波对母种菌丝体细胞进行干扰，对细胞中的平衡造成一定影响，以这种简单的方式模拟自然界中温度、水分、空气对菌丝体的影响来对母种菌丝体进行试炼，刺激菌丝体产生应激防御，有效提高栽培种的抗逆性。本发明的这种方法，省略了试炼中对温度、水分、空气的繁琐控制，简化了灵芝组培的步骤。
6.本发明中的母种培养基能够为激活外植体提供分化增殖所需的营养成分，又能进一步抑制黑素的生成，同时还能抑制杂菌的产生。其中，萘乙酸、玉米素、亚硒硫酸钠、玉米赤霉烯酮能够促进外植体分化，同时激活外植体中的酶类，刺激生长；纳豆经过培养后，产生多种酶和氨基酸，更进一步促进外植体细胞的增殖；青蒿精油中含有多种抗菌抑菌成分，能有效抑制杂菌的产生；褪黑素能对抗酚类氧化，在激活外植体的生长初期能有效抑制黑素的产生，提高成活率。
【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种灵芝的组培方法，包括以下步骤：
a.取灵芝子实体，浸泡于超净台上的生物消毒液中进行消毒，浸泡时间为60秒，然后取出；
其中，生物消毒液包括以下重量份比的原料：谷维素5份、壳聚糖12份、花生四烯酸10份、解淀粉芽孢杆菌0.01份、异硫氰酸酯0.03份、青蒿素0.01份、春雷霉素0.02份、虾青素0.08份和水100份。
生物消毒液的制备方法为：取谷维素、壳聚糖、花生四烯酸和解淀粉芽孢杆菌，加水搅拌均匀，在20℃下培养80小时，然后取出，加入异硫氰酸酯、青蒿素、春雷霉素、虾青素，搅拌均匀，接着采用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌，得生物消毒液。
b.用无菌手术刀切开消毒后的子实体，在菌柄和菌盖之间显露出的菌肉中切取米粒大小作为外植体，然后取外植体喷洒保鲜液，再密封以保持无菌状态，接着置于1℃下冷藏2小时，取出后再置于15℃下活化4小时，重复进行冷藏和活化2次，得激活外植体；
其中，保鲜液包括以下重量份比的原料：玉米朊20份、叶绿素0.1份、虾青素0.5份、碧萝芷3份、谷维素2份、辣木籽提取物15份、玉米赤霉烯酮0.2份、5-羟基色胺0.04份、甘露低聚糖1份和甘油110份。
辣木籽提取物的制备方法为：取辣木籽粉碎后，加水湿润，使水分含量为21％，然后置于闪爆器中进行高压蒸汽闪爆处理，设置闪爆器温度为70℃、压力为1MPa、保压时间为140秒、卸压时间为0.03秒、闪爆次数为2次，得闪爆粉，接着取闪爆粉按料液比g/ml为1:7加入水微波萃取65分钟，设置微波萃取的功率为700w，随后过滤，收集滤液浓缩干燥，得辣木籽提取物。
保鲜液的制备方法为：取玉米朊、叶绿素、虾青素、碧萝芷混合均匀，然后加入20％重量的甘油，置于高压均质机中进行均质，设置高压均质机温度为5℃、压力为30Mpa、循环次数为2次，得均质包合物，备用；取剩余甘油加热至55℃，加入谷维素、辣木籽提取物、玉米赤霉烯酮、5-羟基色胺和甘露低聚糖，搅拌均匀，然后冷却至室温，加入所述均质包合物，搅拌均匀，得保鲜液。
c.将激活外植体接种于母种培养基上，在20℃培养10天，使培养基长满菌丝体，得母种；培养期间每天采用波长为670nm的红光和波长为512nm的绿光交替照射，设置光照强度为5lx，光照时间为140分钟，其余时间为黑暗无光照条件，红光与绿光的交替时间为20分钟；
其中，母种培养基的制备方法为：取MS培养基加热使溶解，然后在每升培养基中加入青蒿精油10mg、15mg玉米素、4mg萘乙酸、5g纳豆，搅拌均匀后冷却，在20℃下培养72小时，接着加热使再次溶解，继续在每升培养基中加入亚硒硫酸钠0.1g、褪黑素4mg、玉米赤霉烯酮3mg，搅拌均匀后进行灭菌、冷却，得母种培养基。
d.将母种置于微波照射下试炼12小时，设置照射波长为4cm、照射功率密度为15mW/cm2、微波源与母种的距离为1m，得试炼种；
e.取试炼种接种至MS培养基上，在20℃下进行培养，使MS培养基上长满菌丝体，得栽培种，将栽培种接种于菌袋或段木上，按常规方法进行栽培出菇，即可采收。
实施例2
一种灵芝的组培方法，包括以下步骤：
a.取灵芝子实体，浸泡于超净台上的生物消毒液中进行消毒，浸泡时间为120秒，然后取出；
其中，生物消毒液包括以下重量份比的原料：谷维素15份、壳聚糖24份、花生四烯酸20份、解淀粉芽孢杆菌0.05份、异硫氰酸酯0.07份、青蒿素0.04份、春雷霉素0.07份、虾青素0.14份和水200份。
生物消毒液的制备方法为：取谷维素、壳聚糖、花生四烯酸和解淀粉芽孢杆菌，加水搅拌均匀，在30℃下培养100小时，然后取出，加入异硫氰酸酯、青蒿素、春雷霉素、虾青素，搅拌均匀，接着采用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌，得生物消毒液。
b.用无菌手术刀切开消毒后的子实体，在菌柄和菌盖之间显露出的菌肉中切取米粒大小作为外植体，然后取外植体喷洒保鲜液，再密封以保持无菌状态，接着置于5℃下冷藏6小时，取出后再置于25℃下活化8小时，重复进行冷藏和活化4次，得激活外植体；
其中，保鲜液包括以下重量份比的原料：玉米朊30份、叶绿素0.7份、虾青素1.7份、碧萝芷9份、谷维素8份、辣木籽提取物25份、玉米赤霉烯酮0.6份、5-羟基色胺0.1份、甘露低聚糖3份和甘油180份。
辣木籽提取物的制备方法为：取辣木籽粉碎后，加水湿润，使水分含量为31％，然后置于闪爆器中进行高压蒸汽闪爆处理，设置闪爆器温度为90℃、压力为3MPa、保压时间为160秒、卸压时间为0.08秒、闪爆次数为4次，得闪爆粉，接着取闪爆粉按料液比g/ml为1:15加入水微波萃取95分钟，设置微波萃取的功率为1100w，随后过滤，收集滤液浓缩干燥，得辣木籽提取物。
保鲜液的制备方法为：取玉米朊、叶绿素、虾青素、碧萝芷混合均匀，然后加入30％重量的甘油，置于高压均质机中进行均质，设置高压均质机温度为15℃、压力为50Mpa、循环次数为4次，得均质包合物，备用；取剩余甘油加热至75℃，加入谷维素、辣木籽提取物、玉米赤霉烯酮、5-羟基色胺和甘露低聚糖，搅拌均匀，然后冷却至室温，加入所述均质包合物，搅拌均匀，得保鲜液。
c.将激活外植体接种于母种培养基上，在30℃培养20天，使培养基长满菌丝体，得母种；培养期间每天采用波长为720nm的红光和波长为520nm的绿光交替照射，设置光照强度为25lx，光照时间为200分钟，其余时间为黑暗无光照条件，红光与绿光的交替时间为40分钟；
其中，母种培养基的制备方法为：取MS培养基加热使溶解，然后在每升培养基中加入青蒿精油20mg、25mg玉米素、10mg萘乙酸、15g纳豆，搅拌均匀后冷却，在30℃下培养94小时，接着加热使再次溶解，继续在每升培养基中加入亚硒硫酸钠0.5g、褪黑素10mg、玉米赤霉烯酮9mg，搅拌均匀后进行灭菌、冷却，得母种培养基。
d.将母种置于微波照射下试炼24小时，设置照射波长为10cm、照射功率密度为25mW/cm2、微波源与母种的距离为2m，得试炼种；
e.取试炼种接种至MS培养基上，在30℃下进行培养，使MS培养基上长满菌丝体，得栽培种，将栽培种接种于菌袋或段木上，按常规方法进行栽培出菇，即可采收。
实施例3
一种灵芝的组培方法，包括以下步骤：
a.取灵芝子实体，浸泡于超净台上的生物消毒液中进行消毒，浸泡时间为75秒，然后取出；
其中，生物消毒液包括以下重量份比的原料：谷维素7份、壳聚糖15份、花生四烯酸12份、解淀粉芽孢杆菌0.02份、异硫氰酸酯0.04份、青蒿素0.02份、春雷霉素0.03份、虾青素0.01份和水125份。
生物消毒液的制备方法为：取谷维素、壳聚糖、花生四烯酸和解淀粉芽孢杆菌，加水搅拌均匀，在22℃下培养85小时，然后取出，加入异硫氰酸酯、青蒿素、春雷霉素、虾青素，搅拌均匀，接着采用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌，得生物消毒液。
b.用无菌手术刀切开消毒后的子实体，在菌柄和菌盖之间显露出的菌肉中切取米粒大小作为外植体，然后取外植体喷洒保鲜液，所述保鲜液的喷洒量为每克外植体喷洒5ml，再密封以保持无菌状态，接着置于2℃下冷藏3小时，取出后再置于17℃下活化5小时，重复进行冷藏和活化3次，得激活外植体；
其中，保鲜液包括以下重量份比的原料：玉米朊23份、叶绿素0.2份、虾青素0.8份、碧萝芷4.5份、谷维素3.5份、辣木籽提取物17.5份、玉米赤霉烯酮0.3份、5-羟基色胺0.05份、甘露低聚糖1.5份和甘油130份。
辣木籽提取物的制备方法为：取辣木籽粉碎后，加水湿润，使水分含量为23％，然后置于闪爆器中进行高压蒸汽闪爆处理，设置闪爆器温度为75℃、压力为1.5MPa、保压时间为145秒、卸压时间为0.04秒、闪爆次数为3次，得闪爆粉，接着取闪爆粉按料液比g/ml为1:9加入水微波萃取73分钟，设置微波萃取的功率为800w，随后过滤，收集滤液浓缩干燥，得辣木籽提取物。
保鲜液的制备方法为：取玉米朊、叶绿素、虾青素、碧萝芷混合均匀，然后加入23％重量的甘油，置于高压均质机中进行均质，设置高压均质机温度为7℃、压力为35Mpa、循环次数为3次，得均质包合物，备用；取剩余甘油加热至60℃，加入谷维素、辣木籽提取物、玉米赤霉烯酮、5-羟基色胺和甘露低聚糖，搅拌均匀，然后冷却至室温，加入所述均质包合物，搅拌均匀，得保鲜液。
c.将激活外植体接种于母种培养基上，在23℃培养12天，使培养基长满菌丝体，得母种；培养期间每天采用波长为683nm的红光和波长为514nm的绿光交替照射，设置光照强度为10lx，光照时间为155分钟，其余时间为黑暗无光照条件，红光与绿光的交替时间为25分钟；
其中，母种培养基的制备方法为：取MS培养基加热使溶解，然后在每升培养基中加入青蒿精油12mg、17mg玉米素、5.5mg萘乙酸、8g纳豆，搅拌均匀后冷却，在23℃下培养77小时，接着加热使再次溶解，继续在每升培养基中加入亚硒硫酸钠0.2g、褪黑素5mg、玉米赤霉烯酮4mg，搅拌均匀后进行灭菌、冷却，得母种培养基。
d.将母种置于微波照射下试炼15小时，设置照射波长为5cm、照射功率密度为18mW/cm2、微波源与母种的距离为1.2m，得试炼种；
e.取试炼种接种至MS培养基上，在22℃下进行培养，使MS培养基上长满菌丝体，得栽培种，将栽培种接种于菌袋或段木上，按常规方法进行栽培出菇，即可采收。
实施例4
一种灵芝的组培方法，包括以下步骤：
a.取灵芝子实体，浸泡于超净台上的生物消毒液中进行消毒，浸泡时间为105秒，然后取出；
其中，生物消毒液包括以下重量份比的原料：谷维素12份、壳聚糖21份、花生四烯酸17份、解淀粉芽孢杆菌0.04份、异硫氰酸酯0.06份、青蒿素0.03份、春雷霉素0.05份、虾青素0.12份和水175份。
生物消毒液的制备方法为：取谷维素、壳聚糖、花生四烯酸和解淀粉芽孢杆菌，加水搅拌均匀，在27℃下培养95小时，然后取出，加入异硫氰酸酯、青蒿素、春雷霉素、虾青素，搅拌均匀，接着采用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌，得生物消毒液。
b.用无菌手术刀切开消毒后的子实体，在菌柄和菌盖之间显露出的菌肉中切取米粒大小作为外植体，然后取外植体喷洒保鲜液，所述保鲜液的喷洒量为每克外植体喷洒15ml，再密封以保持无菌状态，接着置于4℃下冷藏5小时，取出后再置于22℃下活化7小时，重复进行冷藏和活化3次，得激活外植体；
其中，保鲜液包括以下重量份比的原料：玉米朊28份、叶绿素0.6份、虾青素1.4份、碧萝芷7.5份、谷维素6.5份、辣木籽提取物22份、玉米赤霉烯酮0.5份、5-羟基色胺0.09份、甘露低聚糖2.5份和甘油163份。
辣木籽提取物的制备方法为：取辣木籽粉碎后，加水湿润，使水分含量为29％，然后置于闪爆器中进行高压蒸汽闪爆处理，设置闪爆器温度为85℃、压力为2.5MPa、保压时间为155秒、卸压时间为0.06秒、闪爆次数为3次，得闪爆粉，接着取闪爆粉按料液比g/ml为1:3加入水微波萃取88分钟，设置微波萃取的功率为1000w，随后过滤，收集滤液浓缩干燥，得辣木籽提取物。
保鲜液的制备方法为：取玉米朊、叶绿素、虾青素、碧萝芷混合均匀，然后加入27％重量的甘油，置于高压均质机中进行均质，设置高压均质机温度为13℃、压力为45Mpa、循环次数为3次，得均质包合物，备用；取剩余甘油加热至70℃，加入谷维素、辣木籽提取物、玉米赤霉烯酮、5-羟基色胺和甘露低聚糖，搅拌均匀，然后冷却至室温，加入所述均质包合物，搅拌均匀，得保鲜液。
c.将激活外植体接种于母种培养基上，在28℃培养17天，使培养基长满菌丝体，得母种；培养期间每天采用波长为707nm的红光和波长为518nm的绿光交替照射，设置光照强度为20lx，光照时间为185分钟，其余时间为黑暗无光照条件，红光与绿光的交替时间为35分钟；
其中，母种培养基的制备方法为：取MS培养基加热使溶解，然后在每升培养基中加入青蒿精油18mg、23mg玉米素、9mg萘乙酸、12g纳豆，搅拌均匀后冷却，在27℃下培养89小时，接着加热使再次溶解，继续在每升培养基中加入亚硒硫酸钠0.4g、褪黑素8mg、玉米赤霉烯酮8mg，搅拌均匀后进行灭菌、冷却，得母种培养基。
d.将母种置于微波照射下试炼21小时，设置照射波长为8cm、照射功率密度为22mW/cm2、微波源与母种的距离为1.8m，得试炼种；
e.取试炼种接种至MS培养基上，在28℃下进行培养，使MS培养基上长满菌丝体，得栽培种，将栽培种接种于菌袋或段木上，按常规方法进行栽培出菇，即可采收。
实施例5
一种灵芝的组培方法，包括以下步骤：
a.取灵芝子实体，浸泡于超净台上的生物消毒液中进行消毒，浸泡时间为90秒，然后取出；
其中，生物消毒液包括以下重量份比的原料：谷维素10份、壳聚糖18份、花生四烯酸15份、解淀粉芽孢杆菌0.03份、异硫氰酸酯0.05份、青蒿素0.02份、春雷霉素0.04份、虾青素0.011份和水150份。
生物消毒液的制备方法为：取谷维素、壳聚糖、花生四烯酸和解淀粉芽孢杆菌，加水搅拌均匀，在25℃下培养90小时，然后取出，加入异硫氰酸酯、青蒿素、春雷霉素、虾青素，搅拌均匀，接着采用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌，得生物消毒液。
b.用无菌手术刀切开消毒后的子实体，在菌柄和菌盖之间显露出的菌肉中切取米粒大小作为外植体，然后取外植体喷洒保鲜液，所述保鲜液的喷洒量为每克外植体喷洒10ml，再密封以保持无菌状态，接着置于3℃下冷藏4小时，取出后再置于20℃下活化6小时，重复进行冷藏和活化3次，得激活外植体；
其中，保鲜液包括以下重量份比的原料：玉米朊25份、叶绿素0.4份、虾青素1.1份、碧萝芷6份、谷维素5份、辣木籽提取物20份、玉米赤霉烯酮0.4份、5-羟基色胺0.07份、甘露低聚糖2份和甘油145份。
辣木籽提取物的制备方法为：取辣木籽粉碎后，加水湿润，使水分含量为26％，然后置于闪爆器中进行高压蒸汽闪爆处理，设置闪爆器温度为80℃、压力为2MPa、保压时间为150秒、卸压时间为0.05秒、闪爆次数为3次，得闪爆粉，接着取闪爆粉按料液比g/ml为1:11加入水微波萃取80分钟，设置微波萃取的功率为900w，随后过滤，收集滤液浓缩干燥，得辣木籽提取物。
保鲜液的制备方法为：取玉米朊、叶绿素、虾青素、碧萝芷混合均匀，然后加入25％重量的甘油，置于高压均质机中进行均质，设置高压均质机温度为10℃、压力为40Mpa、循环次数为3次，得均质包合物，备用；取剩余甘油加热至65℃，加入谷维素、辣木籽提取物、玉米赤霉烯酮、5-羟基色胺和甘露低聚糖，搅拌均匀，然后冷却至室温，加入所述均质包合物，搅拌均匀，得保鲜液。
c.将激活外植体接种于母种培养基上，在25℃培养15天，使培养基长满菌丝体，得母种；培养期间每天采用波长为695nm的红光和波长为516nm的绿光交替照射，设置光照强度为15lx，光照时间为170分钟，其余时间为黑暗无光照条件，红光与绿光的交替时间为30分钟；
其中，母种培养基的制备方法为：取MS培养基加热使溶解，然后在每升培养基中加入青蒿精油15mg、20mg玉米素、7mg萘乙酸、10g纳豆，搅拌均匀后冷却，在25℃下培养83小时，接着加热使再次溶解，继续在每升培养基中加入亚硒硫酸钠0.3g、褪黑素7mg、玉米赤霉烯酮6mg，搅拌均匀后进行灭菌、冷却，得母种培养基。
d.将母种置于微波照射下试炼18小时，设置照射波长为7cm、照射功率密度为20mW/cm2、微波源与母种的距离为1.5m，得试炼种；
e.取试炼种接种至MS培养基上，在25℃下进行培养，使MS培养基上长满菌丝体，得栽培种，将栽培种接种于菌袋或段木上，按常规方法进行栽培出菇，即可采收。
实施例6
与实施例5的区别在于，不喷洒保鲜液。其余方法同实施例5。
实施例7
与实施例5的区别在于，不进行步骤b的冷藏和活化处理。其余方法同实施例5。
实施例8
与实施例5的区别在于，不进行红光和绿光的照射，而是一直处于黑暗无光照的条件。其余方法同实施例5。
实施例9
与实施例5的区别在于，不进行微波照射。其余方法同实施例5。
实施例10
与实施例5的区别在于，采用MS培养基代替母种培养基。其余方法同实施例5。
实施例11
按照中国专利公开号为CN107750814A、名为一种野生灵芝菌种的培育方法中实施例1的方法进行培养。
实施例12实施效果对比
选取同一批灵芝子实体，按照实施例1-11的方法进行培养，得实验样品1-11。统计实验样品1-10的激活外植体成活率、菌丝生长速度，试炼种菌丝生长速度，栽培种接种至菌袋后的菌丝生长速度。并同时统计培育种成活率、菌丝生长速度，栽培种接种至菌袋后的菌丝生长速度。最后，采用茚三酮显色法、蒽酮硫酸法分别测定栽培种中氨基酸含量和多糖含量。
表1成活率和菌丝生长速度统计结果
Figure BDA0002351690630000131
Figure BDA0002351690630000141
表2栽培种中有效成分含量测定结果
样品 氨基酸含量(％) 多糖含量(％)
实验样品1 16.3 3.95
实验样品2 17.8 4.11
实验样品3 18.2 4.32
实验样品4 19.1 4.88
实验样品5 20.7 5.04
实验样品6 13.4 2.11
实验样品7 12.2 2.01
实验样品8 10.2 1.77
实验样品9 14.2 2.45
实验样品10 12.4 2.04
实验样品11 11.2 1.68
从表1和表2可以看出，喷洒保鲜液、冷藏和活化处理、红光和绿光交替照射、微波照射、母种培养基均对成活率、菌丝生长速度、有效成分的积累有促进作用。与实施例11的现有技术相比，成活率高、菌丝生长速度快、有效成分含量高。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (7)

1.一种灵芝的组培方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.取灵芝子实体，浸泡于超净台上的生物消毒液中进行消毒，浸泡时间为60-120秒，然后取出；
b.用无菌手术刀切开消毒后的子实体，在菌柄和菌盖之间显露出的菌肉中切取米粒大小作为外植体，然后取外植体喷洒保鲜液，再密封以保持无菌状态，接着置于1-5℃下冷藏2-6小时，取出后再置于15-25℃下活化4-8小时，重复进行冷藏和活化2-4次，得激活外植体；
c.将激活外植体接种于母种培养基上，在20-30℃培养10-20天，使培养基长满菌丝体，得母种；培养期间每天采用波长为670-720nm的红光和波长为512-520nm的绿光交替照射，设置光照强度为5-25lx，光照时间为140-200分钟，其余时间为黑暗无光照条件，红光与绿光的交替时间为20-40分钟；
d.将母种置于微波照射下试炼12-24小时，设置照射波长为4-10cm、照射功率密度为15-25mW/cm2、微波源与母种的距离为1-2m，得试炼种；
e.取试炼种接种至MS培养基上，在20-30℃下进行培养，使MS培养基上长满菌丝体，得栽培种，将栽培种接种于菌袋或段木上，按常规方法进行栽培出菇，即可采收。
2.根据权利要求1所述的一种灵芝的组培方法，其特征在于，步骤a中所述生物消毒液包括以下重量份比的原料：谷维素5-15份、壳聚糖12-24份、花生四烯酸10-20份、解淀粉芽孢杆菌0.01-0.05份、异硫氰酸酯0.03-0.07份、青蒿素0.01-0.04份、春雷霉素0.02-0.07份、虾青素0.08-0.14份和水100-200份。
3.根据权利要求2所述的一种灵芝的组培方法，其特征在于，所述生物消毒液的制备方法为：取谷维素、壳聚糖、花生四烯酸和解淀粉芽孢杆菌，加水搅拌均匀，在20-30℃下培养80-100小时，然后取出，加入异硫氰酸酯、青蒿素、春雷霉素、虾青素，搅拌均匀，接着采用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌，得生物消毒液。
4.根据权利要求1所述的一种灵芝的组培方法，其特征在于，步骤b中所述保鲜液包括以下重量份比的原料：玉米朊20-30份、叶绿素0.1-0.7份、虾青素0.5-1.7份、碧萝芷3-9份、谷维素2-8份、辣木籽提取物15-25份、玉米赤霉烯酮0.2-0.6份、5-羟基色胺0.04-0.1份、甘露低聚糖1-3份和甘油110-180份。
5.根据权利要求4所述的一种灵芝的组培方法，其特征在于，所述辣木籽提取物的制备方法为：取辣木籽粉碎后，加水湿润，使水分含量为21％-31％，然后置于闪爆器中进行高压蒸汽闪爆处理，设置闪爆器温度为70-90℃、压力为1-3MPa、保压时间为140-160秒、卸压时间为0.03-0.08秒、闪爆次数为2-4次，得闪爆粉，接着取闪爆粉按料液比g/ml为1:7-15加入水微波萃取65-95分钟，设置微波萃取的功率为700-1100w，随后过滤，收集滤液浓缩干燥，得辣木籽提取物。
6.根据权利要求4所述的一种灵芝的组培方法，其特征在于，所述保鲜液的制备方法为：取玉米朊、叶绿素、虾青素、碧萝芷混合均匀，然后加入20％-30％重量的甘油，置于高压均质机中进行均质，设置高压均质机温度为5-15℃、压力为30-50Mpa、循环次数为2-4次，得均质包合物，备用；取剩余甘油加热至55-75℃，加入谷维素、辣木籽提取物、玉米赤霉烯酮、5-羟基色胺和甘露低聚糖，搅拌均匀，然后冷却至室温，加入所述均质包合物，搅拌均匀，得保鲜液。
7.根据权利要求1所述的一种灵芝的组培方法，其特征在于，步骤c中所述母种培养基的制备方法为：取MS培养基加热使溶解，然后在每升培养基中加入青蒿精油10-20mg、15-25mg玉米素、4-10mg萘乙酸、5-15g纳豆，搅拌均匀后冷却，在20-30℃下培养72-94小时，接着加热使再次溶解，继续在每升培养基中加入亚硒硫酸钠0.1-0.5g、褪黑素4-10mg、玉米赤霉烯酮3-9mg，搅拌均匀后进行灭菌、冷却，得母种培养基。
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