CN101492645A - 一种促进灵芝酸和灵芝多糖生物合成的灵芝细胞培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促进灵芝酸和灵芝多糖生物合成的灵芝细胞培养方法，该方法包括将灵芝菌种接种到斜面培养基进行培养，再依次进行一级液体种子培养、二级液体种子培养和液体深层发酵，其中，在液体深层发酵过程中用可见光进行光照培养。经测定，本发明方法可有效促进灵芝细胞的生长，相比于现有的细胞培养方法，本发明方法所制备的细胞培养产物中，其灵芝酸、灵芝多糖的含量或产量都有了不同程度地提升。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物细胞培养方法，尤其涉及一种通过在灵芝液体深层发酵过程中采用可见光照射以促进灵芝细胞生长、灵芝多糖和灵芝酸生物合成的灵芝细胞培养方法，属于微生物发酵领域。
背景技术
灵芝(Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Krast)属于担子菌纲、多孔菌科、灵芝属高等真菌。传统中医认为，灵芝具味甘、性温、无毒，可补心、肝、脾、肺、肾五脏之气，具滋补强身、扶正固本之功效。现代医学研究发现灵芝中所含有效成分主要为灵芝多糖和灵芝酸。灵芝酸和灵芝多糖具有抗癌和抗艾滋病病毒等疗效(RussellR，Paterson M.Ganoderma-A therapeutic fungal biofactory.Phytochemistry 2006，67：1985-2001；Tang W，Liu JW，Zhao WM，Wei DZ，Zhong JJ.Ganoderic acid T fromGanoderma lucidum mycelia induces mitochondria mediated apoptosis in lung cancercells.Life Sci 2006，80：205-211；El-Mekkawy S，Meselhy MR，Nakamura N，Tezuka Y，Hattori M，Kakiuchi N，Shimotohno K，Kawahata T，Otake T.Anti-HIV-1 andanti-HIV-1-protease substances from Ganoderma lucidum.Phytochemistry 1998，49：1651-1657)。
在灵芝酸和灵芝多糖的药用价值被广泛揭示的同时，灵芝产量和质量成为限制其应用的瓶颈，因为在自然界中野生灵芝十分稀少，且其中灵芝酸含量仅为1毫克/100毫克细胞，远不能满足人们的需要；而灵芝人工栽培周期长、产品质量易受环境气候及虫害的影响；因此发酵法生产灵芝酸和灵芝多糖将是一种非常有前景的方法。目前，通过灵芝细胞液体深层发酵所获得的灵芝酸和灵芝多糖的产量仍然较低。李平作等(李平作，徐柔，章克昌.灵芝胞外多糖深层发酵培养基的优化.无锡轻工大学学报1998，17(4)：26-30.)报道了灵芝分批培养中培养基的优化，但该方法只报道了胞外多糖的生产情况，最大生物量与胞外多糖的产量分别是14.8克/升和2.91克/升(在该文献中，胞外多糖的测定方法为乙醇沉淀-干重法)。
日本特许公报(特开平4-304890，5pp)公开了一种灵芝酸的发酵生产工艺，但未提及灵芝多糖的生产，且所得产物中灵芝酸的含量仅为0.46-1.0毫克/100毫克细胞。还有一些专利和文献也公开报道了各种方法，公开号为CN1264743A (发明名称：液体发酵法同时生产灵芝多糖和灵芝酸的工艺)、CN1375557A(发明名称：生物反应器中灵芝细胞两阶段培养生产灵芝酸的方法)，授权公开号为CN1141392C(发明名称：中间补料发酵生产灵芝多糖和灵芝酸的方法)等专利文献公开了一系列的通过发酵生产灵芝多糖和灵芝酸的细胞培养方法，这些细胞培养方法都是在黑暗环境下进行的，细胞培养产物中灵芝多糖和灵芝酸的含量尚有待提高。
光照作为一种物理影响因子，已广泛用于植物细胞、藻类细胞和光合细菌培养过程中，人们系统研究了光质(不同波长的光)、光照强度对细胞生长、产物合成、细胞形态和生理生化的影响。此外，已有学者通过对光质、光照强度的研究，建立了不同的光照控制策略高效生产代谢产物。然而，在药用真菌液体深层发酵过程中，未见光照对细胞生长、产物合成乃至细胞生理生化影响的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种促进灵芝细胞生长、灵芝酸和灵芝多糖生物合成的灵芝细胞培养方法，与现有方法相比，本发明灵芝细胞培养方法能够显著促进灵芝细胞生长和灵芝酸、灵芝多糖的生物合成。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种促进灵芝细胞生长、灵芝酸和灵芝多糖生物合成的灵芝细胞培养方法，包括将灵芝菌种接种到斜面培养基进行培养，再依次进行一级液体种子培养、二级液体种子培养和液体深层发酵，其中，在液体深层发酵过程中用可见光进行光照培养。
所述的可见光可以是波长为400-740纳米的任意一种电磁波，例如可以是波长为560-700纳米的红光、波长为592-620纳米的橙光、波长为578-592纳米的黄光、波长为430-610纳米的绿光、波长为464-500纳米的青光、波长为390-500纳米的蓝光或波长为400-464纳米的紫光；所述的可见光也可是由上述7种可见光混合在一起所组成的波长为400-740纳米的白光；
优选的，所述的可见光选自蓝光(波长390-500纳米)、红光(波长560-700纳米)或白光(波长400-740纳米)，更优选为白光。
所述蓝光、红光或白光的光照强度优选为50-1200勒克斯，更优选为80-1050勒克斯，特别优选为80-320勒克斯，最特别优选为280-320勒克斯。
一种更优选的技术方案：在光照照射培养之前，先按照常规条件进行暗培养2-6天，再用白光进行光照照射培养；更优选的，在黑暗条件下进行液体深层发酵2天，再用光照强度为500勒克斯的白光进行光照培养。
一种特别优选的技术方案：在光照照射培养之前，先按照常规条件进行暗培养1-7天，再用白光进行光照照射培养；其中，用白光进行光照照射培养时，分为两个阶段：第一个阶段先用100勒克斯的白光照射培养1-7天，第二个阶段于液体深层发酵的第7-9天转用500勒克斯的白光进行光照照射培养。
一种最特别优选的技术方案：在光照照射培养之前，先按照常规条件进行暗培养2天，再用白光进行光照照射培养，其中，用白光进行光照照射培养时，分为两个阶段：第一个阶段先用100勒克斯的白光光照培养6天，再于液体深层发酵的第8天转用500勒克斯的白光进行光照培养。
本发明中所述的可见光可以是自然光，也可是采用各种人工设备所提供的上述可见光，只要波长符合上述要求，都可满足本发明的要求或实现本发明所述的效果。
本发明中，所述的灵芝细胞斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养和液体深层发酵所用到的培养基和培养条件均为灵芝细胞培养中的常规培养基和常规培养条件，这些都是本领域技术人员所公知的，作为参考，所述的培养基和有关的培养条件可按照有关文献所公开的内容进行(Tang YJ，Zhong JJ.Fed-batchfermentation of Ganoderma lucidum for hyperproduction of polysaccharide andganoderic acid.Enzyme Microb.Technol.2002，31：20-28)。
作为参考：
所述的斜面培养基是PDA琼脂培养基(1.5克/升的七水硫酸镁，3.0克/升的磷酸二氢钾，20克/升的葡萄糖，0.05克/升的维生素B1和200克土豆/升的提取液)。灵芝细胞斜面菌种培养条件是：培养温度28℃，暗培养，培养时间为7天。
所述的一级液体种子培养基为：葡萄糖35克/升，蛋白胨5克/升，酵母粉2.5克/升，七水硫酸镁0.5克/升，磷酸二氢钾1克/升，维生素B10.05克/升。一级液体种子培养条件：温度30℃，旋转式摇床，转速为120转/分。
所述的二级液体种子培养基为：葡萄糖35克/升，蛋白胨5克/升，酵母粉2.5克/升，七水硫酸镁0.5克/升，磷酸二氢钾1克/升，维生素B10.05克/升。二级液体种子培养条件：温度30℃，旋转式摇床，转速为120转/分。
所述的液体深层发酵培养基为：乳糖35克/升，蛋白胨5克/升，酵母粉5克/升，七水硫酸镁0.5克/升，磷酸二氢钾1克/升，维生素B10.05克/升。液体深层发酵条件：温度30℃，旋转式摇床，转速为120转/分。
所述的灵芝菌种可以通过各种商业途径购买得到，例如，可以购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，其菌种的编号为CGMCC 5.616。
将本发明细胞培养方法所得到的产物分别用浓硫酸-苯酚法测定灵芝多糖的含量，采用紫外分光光度法测定灵芝酸的含量，测定结果表明，本发明的方法可有效促进灵芝细胞生长，所得到的细胞培养产物中，灵芝酸、灵芝多糖的含量或产量也都有不同程度地提高，说明在灵芝液体深层发酵过程中用可见光进行光照培养可以有效促进灵芝细胞生长及灵芝酸或/和灵芝多糖生物合成。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
试验材料：
1、灵芝菌种(Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Krast)：购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，其编号为CGMCC 5.616。
2、高亮发光二极管(LED)：购自台湾汇福光电有限公司，其编号为GT-16，技术参数见表1：
表1高亮发光二极管(LED)技术参数
实施例1
分别按照以下培养基和培养条件进行灵芝斜面菌种培养，一级液体种子培养、二级液体种子培养和液体深层发酵：
所述的斜面培养基是PDA琼脂培养基(1.5克/升的七水硫酸镁，3.0克/升的磷酸二氢钾，20克/升的葡萄糖，0.05克/升的维生素B1和200克土豆/升的提取液)。灵芝斜面菌种培养条件是：培养温度28℃，暗培养，培养时间为7天。
所述的一级液体种子培养基为：葡萄糖35克/升，蛋白胨5克/升，酵母粉2.5克/升，七水硫酸镁0.5克/升，磷酸二氢钾1克/升，维生素B10.05克/升。一级液体种子培养条件：温度30℃，旋转式摇床，转速为120转/分。
所述的二级液体种子培养基为：葡萄糖35克/升，蛋白胨5克/升，酵母粉2.5克/升，七水硫酸镁0.5克/升，磷酸二氢钾1克/升，维生素B10.05克/升。二级液体种子培养条件：温度30℃，旋转式摇床，转速为120转/分。
所述的液体深层发酵培养基为：乳糖35克/升，蛋白胨5克/升，酵母粉5克/升，七水硫酸镁0.5克/升，磷酸二氢钾1克/升，维生素B10.05克/升。液体深层发酵条件：温度30℃，旋转式摇床，转速为120转/分。
在灵芝液体深层发酵过程中，使用高亮发光二极管(LED)提供光源，分别用蓝光，红光或白光从摇瓶上部直接照射发酵液表面，蓝光，红光或白光的光照强度固定在300±20勒克斯。
细胞在60℃烘干后称重，烘干的细胞按照Tang and Zhong(Enzyme Microb.Technol.2002，31：20-28)的方法萃取处理后，分别用浓硫酸-苯酚法和紫外分光光度法测定灵芝多糖和灵芝酸的含量，试验结果见表2。
表2三种可见光对灵芝酸、灵芝多糖含量和产量的影响
a所有数值都是三个数值的平均值加上标准误差.
b生物量达到最大值的时间.
从试验结果可以看出，相对于暗培养，在灵芝液体深层发酵过程中分别采用蓝光、红光或白光进行光照培养，灵芝细胞培养产物中，其生物量乃至灵芝酸、灵芝多糖的含量和产量均有了不同程度地提高。
实施例2
本试验进行了4组平行的灵芝细胞培养试验，每组的培养基和培养条件都同实施例1，所不同在于：在液体深层发酵中，各组分别采用光照强度为100±20勒克斯、300±20勒克斯、500±50勒克斯、1000±50勒克斯的白光进行光照培养；细胞在60℃烘干后称重，烘干的细胞按照Tang and Zhong(Enzyme Microb.Technol.2002，31：20-28)的方法萃取处理后，分别用浓硫酸-苯酚法和紫外分光光度法测定灵芝多糖和灵芝酸的含量，试验结果见表3。
表3不同光照强度的白光对灵芝酸、灵芝多糖含量和产量的影响
a所有数值都是三个数值的平均值加上标准误差.
b生物量达到最大值的时间.
试验结果表明，较低光照强度的白光进行光照培养有利于促进灵芝细胞生长和提高灵芝酸的含量和灵芝多糖的产量，采用较高光照强度的白光进行光照培养有助于提高灵芝酸的产量和灵芝多糖的含量。
实施例3
本试验是在实施例1和实施例2的基础上进行的。分为试验组和对照组，对照组在液体深层发酵过程中为黑暗培养，其它条件同试验组(培养基和各个阶段的培养条件同实施例1)；试验组分为3个平行组，第一阶段采用黑暗培养，第二阶段采用光照强度为500勒克斯的白光进行光照培养，从第一阶段转到第二阶段的时间点分别为开始液体深层发酵的第2天、第4天和第6天。细胞在60℃烘干后称重，烘干的细胞按照Tang and Zhong(Enzyme Microb.Technol.2002，31：20-28)的方法萃取处理后，分别用浓硫酸-苯酚法和紫外分光光度法测定灵芝多糖和灵芝酸的含量，试验结果见表4。
表4黑暗培养加光照培养对灵芝酸、灵芝多糖含量和产量的影响
a所有数值都是三个数值的平均值加上标准误差.
b生物量达到最大值的时间.
从试验结果可以看出，从黑暗培养向采用光照强度为500勒克斯的白光进行光照培养的时间转移点在液体深层发酵的第2天时，所获得的细胞培养产物中，生物量、灵芝酸的产量和灵芝多糖的含量和产量在3个试验组中为最高；相比于对照组(黑暗培养)，3个试验组在生物量、灵芝酸的产量和灵芝多糖的含量和产量等方面均有显著的增长。
实施例4
本试验是在实施例3的基础上进行的，分为3个平行的试验组(培养基和各个阶段的培养条件同实施例1)；3个平行的试验组在液体深层发酵分为三个阶段，第一阶段为黑暗培养；第二阶段为100勒克斯白光照射培养，第三阶段用500勒克斯的白光照射培养；其中试验1组：由第一阶段转向第二阶段的时间点是开始液体深层发酵的第2天(即黑暗培养2天后转为用100勒克斯白光照射培养)；试验2组：由第一阶段转向第二阶段的时间点是开始液体深层发酵的第4天(即黑暗培养4天后转为用100勒克斯白光照射培养)；试验3组：由第一阶段转向第二阶段的时间点是开始液体深层发酵的第6天(即黑暗培养6天后转为用100勒克斯白光照射培养)；3个试验组均自液体深层发酵的第8天起转入第三阶段，即用500勒克斯的白光照射培养。
细胞在60℃烘干后称重，烘干的细胞按照Tang and Zhong(Enzyme Microb.Technol.2002，31：20-28)的方法萃取处理后，分别用浓硫酸-苯酚法和紫外分光光度法测定灵芝多糖和灵芝酸的含量，试验结果见表5。
表5黑暗培养加2个阶段的光照培养对灵芝酸、灵芝多糖含量和产量的影响
a所有数值都是三个数值的平均值加上标准误差.
b生物量达到最大值的时间.
与实施例3相比，采用黑暗培养加两个阶段的光照射培养，所得到的细胞培养产物，不论是在灵芝酸产量和含量上，还是在灵芝胞内多糖的含量和产量上，均有了明显的提升，尤其是试验1组，其灵芝酸产量和灵芝胞内多糖的产量更是有了大幅度地提高。
Claims (10)
1、一种促进灵芝细胞生长、灵芝酸和灵芝多糖生物合成的细胞培养方法，包括将灵芝菌种接种到斜面培养基进行培养，再依次进行一级液体种子培养、二级液体种子培养和液体深层发酵，其特征在于：在液体深层发酵过程中用可见光进行光照培养。
2、按照权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于：所述的可见光是7种可见光中的任意一种或多种，或者是由7种可见光所组成的白光。
3、按照权利要求2所述的细胞培养方法，其特征在于：所述的可见光是蓝光、红光或白光。
4、按照权利要求3所述的细胞培养方法，其特征在于：所述蓝光、红光或白光的光照强度为50-1200勒克斯。
5、按照权利要求4所述的细胞培养方法，其特征在于：所述蓝光、红光或白光的光照强度为80-320勒克斯。
6、按照权利要求5所述的细胞培养方法，其特征在于：所述蓝光、红光或白光的光照强度为280-320勒克斯。
7、按照权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于：在光照照射培养之前，先按照常规条件进行暗培养2-6天，再用白光进行光照照射培养。
8、按照权利要求7所述的细胞培养方法，其特征在于：在黑暗条件下进行液体深层发酵2天，再用光照强度为500勒克斯的白光进行光照照射培养。
9、按照权利要求7所述的细胞培养方法，其特征在于：在光照照射培养之前，先按照常规条件进行暗培养1-7天，再用白光进行光照照射培养；其中，用白光进行光照照射培养时，分为两个阶段，第一个阶段先用100勒克斯的白光光照培养1-7天，第二个阶段是在液体深层发酵的第7-9天转用500勒克斯的白光进行光照培养。
10、按照权利要求9所述的细胞培养方法，其特征在于：在光照培养之前，先按照常规条件进行暗培养2天后转用100勒克斯的白光光照培养6天，在液体深层发酵的第8天转用500勒克斯的白光进行光照培养。
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Granted publication date: 20101222 Termination date: 20180121 |