CN108739068B - 一种冬虫夏草菌丝体和子实体的生产工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种冬虫夏草菌丝体和子实体的生产工艺，其生产步骤包括：1)培养被毛孢菌丝体；2)共生催芽；3)培养子实体；所述培养被毛孢菌丝体的步骤包括：配制固体培养基以及营养液；将所述固体培养基与营养液混合均匀后分装于培养容器中，灭菌处理后接入被毛孢固体种，并培养至培养基表面长满菌丝；所述共生催芽的步骤包括：配制液体培养基，并在无菌条件下将其加入到步骤1)的培养容器中；接入拟青霉液体种，培养至两种菌丝长满培养基并在表面长出子实体芽；所述培养子实体的步骤包括：将步骤2)中得到的培养物置于培养室中培养至菌丝转为灰褐色，子实体生长至即将要散发孢子时采收。

Description

一种冬虫夏草菌丝体和子实体的生产工艺

技术领域

本发明涉及一种冬虫夏草菌丝体和子实体的生产工艺，具体涉及一种利用拟青霉作为伴生菌，伴生被毛孢来生产冬虫夏草菌丝体和子实体的生产工艺，属于冬虫夏草生产技术领域。

背景技术

自20世纪80年代以来，科技人员从天然冬虫夏草上分离到20多种真菌，除被毛孢是冬虫夏草真菌外，其余均为伴生菌。这些伴生菌在不同外界条件下，以各自的身份或先或后地进入寄主，与被毛孢共存于寄主并竞争生长，在共存竞争生长过程中，两种或两种以上的真菌以复合的形式，动态共存而促使冬虫夏草有性世代的生殖。如果没有伴生菌的共存竞争促进，单纯的被毛孢在寄主上生长，只能无性增殖菌丝体而不能形成子实体。该理论论点，诸多真菌工作者在近年的实践中已达成共识，特别是在2015年全国菌物协会的“金湖宣言”中得到了充分的肯定。

CN101695255中公开了原生料配制培养基，以此激发被毛孢向有性型转化，然而，其所采用的原生料一般需取自于虫草生长的原生态环境，其实质上就含有伴生菌存在。但该方法成功率低、产品质量不稳定，无法形成规模化生产。此外，CN101843196中公开了利用头孢霉与头棒束孢霉伴生来完成冬虫夏草的有性型。但是，将两种液体种混合接种于同一培养基上共生，有着难以克服的缺陷：由于头孢霉为低温菌而头棒束孢为常温菌，因而很难有效把握二者的共生温度，从而导致生物转化率极低，极易感染杂菌，因而必须使用抗生素，导致产品的质量差、成本高、风险大。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用拟青霉作为伴生菌，伴生被毛孢来生产冬虫夏草菌丝体和子实体的生产工艺，具有生物转化率稳定、成本低、适合于工厂化生产的特点。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种冬虫夏草菌丝体和子实体的生产工艺，其生产步骤包括：1)培养被毛孢菌丝体；2)共生催芽；3)培养子实体；其中：

所述培养被毛孢菌丝体的步骤包括：a、配制固体培养基以及营养液；b、将所述固体培养基与营养液混合均匀后分装于培养容器中，于115℃-120℃、0.15MPa下灭菌处理60分钟-90分钟，待其冷却到20℃时按固体培养基重量的2-6％接入被毛孢固体种，并在0℃-16℃下培养35天-40天至培养基表面长满菌丝；

所述共生催芽的步骤包括：a、配制液体培养基，并在无菌条件下按固体培养基用量的10-12％将其加入到步骤1)的培养容器中；b、按步骤1)中的被毛孢固体种量的3％接入拟青霉液体种，并于5℃-18℃的共生温度下培养30天-35天至两种菌丝长满培养基并在表面长出子实体芽；

所述培养子实体的步骤包括：将步骤2)中得到的培养物置于培养室中培养至菌丝转为灰褐色，子实体生长至即将要散发孢子时采收；培养过程中，培养室的白天温度为18℃-21℃，夜间温度为5℃-18℃，同时，培养过程中每天以照度为200LX-1000LX的光照射不少于16小时，每日早晚通风两次，每次半小时。

优选的是：按重量比计，所述固体培养基由以下组分配制而成：燕麦30-50％、玉米渣：10-25％、蚕蛹粉：10-25％、全鸡蛋：10-25％。

优选的是：按重量比计，所述营养液由以下组分配制而成：白糖：10％、磷酸二氢钾：0.005％、硫酸镁：0.025％、维生素B1：0.001％以及水：其余量。

优选的是：所述培养被毛孢菌丝体的步骤还包括：c、在培养基表面长满菌丝后，再于16℃-18℃下生长15天-20天，至菌丝长满容器达到生理成熟后采收菌丝体。

优选的是：按重量比计，所述液体培养基由以下组分制成：全鸡蛋87-90％、牛奶：1-2％、马铃薯汁：5-6％、白糖水(浓度20wt％)：4-5％。

优选的是：被毛孢Hirsutella sinensis保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.14551，保藏时间2017年9月11日。

优选的是：所述拟青霉液体种为伴生菌。

优选的是：所述共生催芽的步骤中，当培养至25天-35天时，以照度为100LX-500LX的光每天光照12小时。

优选的是：所述拟青霉可替换为蝙蝠蛾拟青霉及其变种、头棒束孢、头孢菌。

本发明的有益效果在于，本发明以拟青霉作为伴生菌，伴生被毛孢来生产冬虫夏草菌丝体和子实体，应用多菌共存理论，在同一培养容器中，先后用固体和液体两种培养基，分别接入被毛孢固体种和拟青霉液体种，并在合适的条件下进行培养，完成冬虫夏草从无性世代向有性世代的转化。通过本发明的工艺收取的被毛孢菌丝体和子实体，总体测试基因相似度≥97％，急毒长毒实验均无毒副作用，可作为天然冬虫夏草的替代品。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做进一步说明。

本发明的冬虫夏草菌丝体和子实体的生产工艺，其工艺步骤包括：1)培养被毛孢菌丝体；2)共生催芽；以及3)培养子实体。

具体地，所述培养被毛孢菌丝体的步骤包括：a、配制固体培养基，其中，按重量比计，所述固体培养基由以下组分配制而成：燕麦30-50％、玉米渣：10-25％、蚕蛹粉：10-25％、全鸡蛋：10-25％，将各组分搅拌混合均匀后即得所述固体培养基；b、配制营养液，按重量比计，其由以下组分配制而成：白糖10％、磷酸二氢钾0.005％、硫酸镁0.025％、维生素B₁0.001％以及水：其余量，将各组分搅拌混合均匀后即得；c、将所述固体培养基与营养液混合均匀至营养液被固体培养基全部吸收后，将混有营养液的培养基分装于培养容器中，装量为培养容器体积的1/5-3/5；d、将步骤c中分装后的培养基于115℃-120℃、0.15MPa下灭菌处理60分钟-90分钟，待其冷却到20℃时按固体培养基重量的2-6wt％接入被毛孢固体种，并在0℃-16℃下培养35天-40天至培养基表面长满菌丝即可转入下一步处理；其中，培养过程中所采用的被毛孢Hirsutella sinensis保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.14551，保藏日2017年9月11日。

所述培养被毛孢菌丝体的步骤还可用于独立生产被毛孢菌丝体，其过程为：在培养过程中，当在培养基表面长满菌丝后向瓶中补充固体培养基用量的10-12％的营养液再于16-18℃下生长15天-20天，至菌丝长满容器达到生理成熟后及时采收、烘干并粉碎包装即可。在该步骤中，被毛孢菌丝体的得率≥50％，腺苷含量≥0.2％。

所述共生催芽的步骤包括：a、配制液体培养基，按重量比计，所述液体培养基由以下组分制成：全鸡蛋87-90％、牛奶：1-2％、马铃薯汁：5-6％、白糖水(浓度20wt％)：4-5％，将上述各组分混匀后于115-120℃、0.15MPa下灭菌60分钟后冷却至16℃以下即得所述液体培养基，备用；b、在无菌条件下，向步骤1)的培养容器中加入所述液体培养基，其加入量为步骤1)中固体培养基用量的10-12％；c、按步骤1)中的被毛孢固体种量的3％接入拟青霉液体种，并于5℃-18℃的共生温度下培养30天-35天至两种菌丝长满培养基并在表面长出子实体芽即可转入下一步处理，优选的是，当培养至25天-35天时，可以照度为100LX-500LX的光，如日光每天光照12小时；其中，所述拟青霉液体种为本领域已知的PDA培养基去掉琼脂接拟青霉种(即，马铃薯：200克、葡萄糖：20克、拟青霉种：15～20克、自来水：1000毫升)，并由摇瓶机摇瓶制得。

该共生催芽步骤还可用于实施收取混合品。当子实体生长至1cm左右，正值旺盛生长时，立即将其连同菌丝体一并取出，烘干粉碎包装即可，此时，混合品中虫草素含量≥0.1％，腺苷含量≥0.02％。

所述培养子实体的步骤包括：将步骤2)共生催芽步骤中得到的培养物置于培养室中培养至白色菌丝转为灰褐色，子实体生长至3cm-4cm高即将要散发孢子而未散发时采收，干燥包装即可；培养过程中，培养室的白天温度为18℃-21℃，夜间温度为5℃-18℃，湿度为70-90％，以形成两菌复合共生的最佳空间，以及昼夜温差各自快慢生长的空间，同时，培养过程中每天以200LX-1000LX照度的光按每一光段4小时交替进行照射不少于16小时，每日早晚通风两次，每次半小时。

在培养子实体步骤中收取的子实体，其生物转化率＞70％，腺苷含量不低于0.055％，虫草素含量不低于0.1％。

本发明如上所述的生产工艺，也适用于虫草属的其它伴生菌，包括但不限于蝙蝠蛾拟青霉及其变种，如：头棒束孢、头孢菌、棒束孢等。生产过程中所使用的容器可以根据实际情况使用透明的专用玻璃瓶、罐头瓶、透明聚丙烯瓶或专用盒等，生产过程中所使用的各原料均为无工业污染、无农药化肥污染的纯天然农产品，生产得到的产品中，总体测试基因相似度≥97％，急毒长毒试验均无毒副作用，可作为天然虫草的替代品。

实施例1菌丝体的单独采收

在本实施例中，所述菌丝体的采收步骤包括：1)将360g燕麦、200g玉米渣、200g蚕蛹粉、200g全鸡蛋于常温下搅拌混合均匀后得固体培养基；2)将90g白糖、0.045g磷酸二氢钾、0.0225g硫酸镁、0.009gV_B1混合后加水至900ml并于常温下搅拌混合均匀得营养液；3)将所述固体培养基与所述营养液混合使得营养液被所述固体培养基全部吸收后，按每瓶装干料30g分装入30个罐头瓶中，随后于120℃、0.15MPa下灭菌处理1小时，当经灭菌处理后的主料冷却至20℃时，按1.5g/瓶向瓶中接入被毛孢固体种；4)将接种后的罐头瓶于0℃-16℃下避光培养35天待培养基表面长满菌丝向下延伸时，向瓶中补充营养液3.5ml并继续培养15天-20天，同时将培养温度提高至16℃-18℃，至瓶中长满菌丝且全部菌丝转化为灰褐色时即可采收，烘干粉碎并包装，以防潮防污染。在该实施例中，收获干品总量为504g，生物转化率为56％，经检测得，收获的干品中腺苷含量为0.22％。

实施例2采收混合品(子实体与菌丝体不分离)

在本实施例中，所述采收混合品的前期步骤同实施例1中的步骤1)至步骤3)，不同之处在于，当接种后的罐头瓶于0℃-16℃下避光培养35天待培养基表面长满菌丝向下延伸时，向每瓶中加入液体培养基3ml，接入拟青霉菌液体种0.045g，并置于15℃的共生温度下培养35天至子实体长至1cm左右且瓶中长满菌丝体且全部菌丝体转换为灰褐色时即可采收、烘干粉碎并包装，以防潮防污染。在该实施例中，收获产品总量为450g，生物转化率为50％，经检测得，收获的产品中腺苷含量为0.11％，虫草素含量为0.1％。

实施例3子实体的单独采收

在本实施例中，采收子实体的前期步骤同实施例2，其不同之处在于：当实施例2中的培养物长出子实体时，将培养物置于培养室中，于70-90％的湿度以及21℃的白天温度和10℃的夜间温度下进行培养，培养过程中同时以照度为200LX-1000LX的散光按每一光段4小时交替进行光照，且每天早晚各通风一次，每次半小时，直至白色菌丝全部转为灰褐色，子实体生长至3cm-4cm高即将要散发孢子而实际未散发时采收，干燥并包装。在该实施例中，收获的子实体干品中腺苷含量为0.056％，虫草素含量为0.21％。

本发明所描述的具体实施例只用于对冬虫夏草的菌丝体和子实体的生产工艺的具体实现过程的详细描述，而不是用于对其生产工艺的具体限定。任何对此工艺进行的修饰与改良，在专利范围或范畴内同类或相近物质的替代与使用，均属于本发明专利保护范围。

Claims (10)

1.一种冬虫夏草菌丝体和子实体的生产工艺，其特征在于：所述生产工艺的生产步骤包括：1)培养被毛孢菌丝体；2)共生催芽；3)培养子实体；其中：

所述培养被毛孢菌丝体的步骤包括：a、配制固体培养基以及营养液；b、将所述固体培养基与营养液混合均匀后分装于培养容器中，于115℃-120℃、0.15MPa下灭菌处理60分钟-90分钟，待其冷却到20℃时按固体培养基重量的2-6％接入被毛孢固体种，并在0℃-16℃下避光培养35天-40天至培养基表面长满菌丝；

所述共生催芽的步骤包括：a、配制液体培养基，并在无菌条件下按固体培养基用量的10-12％将其加入到步骤1)的培养容器中；b、按步骤1)中的被毛孢固体种量的3％接入拟青霉液体种，并于5℃-18℃的共生温度下培养30天-35天至两种菌丝长满培养基并在表面长出子实体芽；

所述培养子实体的步骤包括：将步骤2)中得到的培养物置于培养室中培养至菌丝转为灰褐色，子实体生长至即将要散发孢子时采收；培养过程中，培养室的白天温度为18℃-21℃，夜间温度为5℃-18℃，同时，培养过程中每天以200LX-1000LX照度的光照射不少于16小时，每日通风两次，每次半小时。

2.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于：按重量百分比计，所述固体培养基由以下组分配制而成：燕麦30-50％、玉米渣：10-25％、蚕蛹粉：10-25％、全鸡蛋：10-25％。

3.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于：按重量百分比计，所述营养液由以下组分配制而成：白糖：10％、磷酸二氢钾：0.005％、硫酸镁：0.025％、维生素B1：0.001％以及水：其余量。

4.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于：所述培养被毛孢菌丝体的步骤还包括：c、在培养基表面长满菌丝后，再于16℃-18℃下生长15天-20天，至菌丝长满容器达到生理成熟后采收菌丝体。

5.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于：按重量百分比计，所述液体培养基由以下组分制成：全鸡蛋87-90％、牛奶：1-2％、马铃薯汁：5-6％、白糖水：4-5％；其中，所述白糖水的质量浓度为20％。

6.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于：所使用的菌种被毛孢Hirsutellasinensis保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNO.14551，保藏时间2017年9月11日。

7.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于：所述拟青霉液体种为伴生菌。

8.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于：所述共生催芽的步骤中，当培养至25天-35天时，以照度为100LX-500LX的光每天照射12小时。

9.根据权利要求1-8中任意一项所述的生产工艺，其特征在于：所述拟青霉可替换为头棒束孢或头孢菌。

10.根据权利要求1-8中任意一项所述的生产工艺，其特征在于：所述拟青霉为蝙蝠蛾拟青霉或蝙蝠蛾拟青霉变种。