KR100218897B1 - 상황균사체 배양용 배지조성물 및 이를 이용한 상황균사체의 배양방법 - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 상황 (Phellinus linteus)균사체 배양용 배지조성물 및 이를 이용한 상황균사체의 배양방법에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 현미, 볶은현미, 보리, 보리분 또는 볶은 통보리중 적어도 1종 4060wt와 지하수 4060wt로 구성되어지되 종균배양용 병에 병입한 후 고압멸균기를 이용하여 15 1b/의 증기압(120121)에서 5060분간 가열하여 멸균하고 냉각한 배지에 자연산 상황의 자실체에서 조직을 분리하고 뽕나무추출 배지에서 계대배양한 후 상기 배지와 같은 배지에서 종배양한 종배양액을 접종하여 25 1의 온도에서 2530일간 배양함을 특징으로 하는 상황균사체 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 상황균사체의 배양방법에 관한 것이다.
상황(Phellinus linteus; 목질진흙버섯)은 뽕나무의 고목에 드물게 자생하는 말똥진흙버섯으로서 버섯류중에서 가장 강한 항종양성이 있는 것으로 보고 되고 있다.
현재 암의 치료에는 화학요법, 방사선 요법 및 외과적 수술법등이 있으나 치료의 범위가 정도의 한계 및 부작용의 발현으로 그 사용이 제한적이다. 이러한 관점에서 직접적인 세포독성을 갖는 기존의 화학요법 치료를 대체하거나 병행하여 숙주의 암세포에 대한 면역활성을 부활시킴으로써 인체에 무해하며 보다 효율적으로 치료하려는 시도가 오래전부터 있어왔다. 이미BCG 등의 세균제제와 사카로마이세스 세르비시아(Saccaromyces cerevisiae)의 세포벽다당인 자이모산(Zymosan)이 숙주의 면역성을 자극하여 함암성 작용을 나타내는 것으로 알려져 있으며 또한 한방에서 이용되어 온 균류 생약, 지의류생약 및 각종 식물성 생약에서 분리한 리포폴리사카라이드(lipopolysaccaride), 프로테오글리칸(proteoglycan) 및 헤미셀룰로오즈(hemicellulose)가 숙주 매개성 항종양 작용을 갖는 것으로 보고되고 있다. 최근에는 표고버섯에서 렌티난(Lentinan), 구름버섯에서 PSK와 코포랑(copolang), 흰 비단털 버섯에서 프로테오글리칸등이 담자균류로부터 분리한 다당 또는 단백다당의 함양활성이 밝혀져 항종양 면역 요법제로 이용되거나 개발중이다.
한편, 이케가와(Ikekawa)등은 이와같은 담자균류의 항종양성 다당류에 대한 비교연구에서 상황이 가장 강력한 숙주매개성 항종양 효과를 갖는 것으로 보고한 바 있으나 상황은 뽕나무 고목에 기생하는 버섯으로서 자연에 자생하는 것이 지극히 적고 뽕나무의 감소와 더블어 상황 자실체의 채취가 곤란하여 자원성이 없으며, 인공배양도 지극히 곤란하여 오늘날까지 거의 실용화되지 못하고 있는 실정이다.
상황균사체의 배양과 추출방법으로는 산명배양법에 의해 상황의 자실체를 채취하여 균사체를 한천배지에서 분리배양한 다음, 톱밥 1000g, 대두분 250g, 펩톤 3.0g, KNO35.0g, CaCO37.5g, 증류수 1.82.0!로 구성되는 고형배지에 균사체를 접종하고 인큐베이터(incubator)에서 25로 3개월간 배양한 후 건조시킨 균사괴 100g을 1000의 열수로 1시간동안 환류추출하고 추출액을 100이하의 저온에서 100까지 감압농축한 다음, 농축액을 동결건조하여 분말을 얻는 방법으로 행하여지고 있다.
그러나, 종래의 상황균사체 배양방법은 균사체를 의약용으로 사용하기 위한 방법이므로 균사체의 배양 및 추출방법이 까다로우며, 추출시 수율이 높지 않고 배양시 배지조성 성분으로서 식용이 불가능한 것을 사용하므로 별도의 배지를 제조하여야 할 뿐만아니라 배지성분을 이용할 수 없어 균사체의 배양 및 추출에 많은 비용이 소요되는 문제점이 있었다.
따라서, 본발명의 목적은 상황균사체의 배양이 용이하며 별도의 균사체 추출공정이 필요없는 상황균사체 배양용 배지 조성물을 제공하는데 있다.
본발명의 또 다른 목적은 상기 목적의 상황균사체 배양용 배지 조성물을 이용한 상황균사체의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적 뿐만아니라 용이하게 표출될 수 있는 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본발명에서는 현미, 볶은현미, 보리, 보리분 또는 볶은 통보리 중 적어도 1종 4060wt와 지하수 4060wt로 구성되어 지되 종균배양용 병에 병입한 후 고압멸균기를 이용하여 151b/의 증기압(120121)에서 5060분간 가열하여 멸균하고 냉각한 배지에 자연산 상황의 자실체에서 조직을 분리하고 뽕나무 추출 배지에서 계대배양한 후 상기 배지와 같은 배지에서 종배양한 종배양액을 접종하되 25 1의 온도에서 25일간 배양하므로서 상황균사체를 빠른 시간내에 고수율로 용이하게 배양할 수 있을 뿐만아니라 단순히 건조방법으로 분말화하여 배지성분과 함게 2차로 사용할 수 있게 되므로 경제적이며 기타 영양분이 많이 함유된 상황균사체를 얻을 수 있었다.
이하, 본발명을 좀 더 상세히 설명하면 다음과 같다.
본발명의 상황(Phellinus linteus)균사체 배양용 배지 조성물은 4060wt의 현미, 볶은현미, 보리, 보리분 또는 볶은 통보리중 적어도 1종과 4060wt의 지하수로 구성되어 지되 종균배양용 병에 병입한 후 고압멸균법으로 멸균하고 냉각한 것으로 특징지워진다.
또한, 본발명에 따른 상황균사체 배양용 배지 조성물을 이용한 상황균사체의 배양방법은 자연산상황의 자실체에서 조직을 분리하고 뽕나무 추출배지에서 계대배양한 후, 상술한 상황균사체 배양용 배지에서 종배양한 다음, 상기 상황균사체 배양용 배지에 종배양액을 접종하여 인큐베이터(incubator)내에서 251의 온도로 2530일간 배양하는 것으로 특징지워진다.
현미는 벼를 도정하되 왕겨만 벗기고 속겨는 그대로 남겨 놓은 쌀을 의미하는 것으로 도정도가 20미만인 것을 사용하는 것이 바람직하며, 도정도가 20이상인 것을 사용할 때에는 상황균사체의 배양이 않되거나 배양이 충실하게 이루어지지 않는 문제점이 있으며, 일반적으로 시중에서 유통되고 있는 현미를 상업적으로 이용할 수 있다.
볶은 현미는 현미를 100의 온도에서 510분간 충분히 뒤집으면서 가열하거나 배조실에서 온도를 서서히 올려 최고 8385에서 34시간 유지하여 배조시킨 것을 사용하며, 상대적으로 현미보다 수분함유량이 낮으므로 배지조성시 수분의 양이 많도록 하여야 한다.
볶은 보리 역시 볶은 현미와 동일한 방법으로 배소한 것이고, 통보리는 통상의 보리보다 도정도가 낮은 것으로 왕겨만 벗긴 것을 사용한다.
현미, 볶은현미, 보리, 보리분 또는 볶은 통보리가 상황균사체 배양용 배지성분으로 적당한 이유는 속겨 또는 보리심내의 영양성분 중 일부 성분이 상황균사체 성장에 필수 성분으로 작용하는 것으로 판단되며, 이는 백미를 배지성분으로 사용할 때 상황균사체의 배양이 이루어지지 않거나 만족스럽지 못한 결과로부터 유추해석될 수 있는 것이다.
현미, 볶은현미, 보리, 보리분 또는 볶은 통보리의 사용비율이 40wt미만이거나 지하수의 사용비율이 60wt를 초과할 경우에는 상황균사체의 배양기간이 과다하게 소요되거나 상황균사체의 배양이 만족스럽지 못하며, 현미, 볶은현미, 보리, 보리분 또는 볶은 통보리의 사용비율이 60wt를 초과하거나 지하수의 사용비율이 40wt미만일 경우에는 배지상태가 건조해져 상황균사체의 배양이 잘 이루어지지 않거나 균사밀도가 저하되어 수득되는 균사체양이 감소되는 문제점이 있다.
현미, 볶은현미, 보리, 볶은 보리, 통보리와 지하수를 종균배양용 병에 병입한 후 고압멸균법으로 멸균함으로써 멸균효과 뿐만아니라 현미, 볶은현미, 보리, 볶은 통보리의 증숙이 함께 이루어져 상황균사체의 성장이 용이하게 이루어지게 된다.
멸균은 공지의 고압멸균법 즉, 고압멸균기(autoclave)를 이용하여 15lb/의 증기압(약120)에서 1520분간 가열하므로서 멸균을 행하는 고압멸균법에 있어서 가열시간을 5060분간으로 연장하여 현미, 볶은현미, 보리, 볶은 보리, 통보리의 내부에서 성장할 수도 있는 각종 미생물을 멸균시킨다.
본발명에서 사용되는 균주는 자연산상황(phellinus linteus)의 자실체에서 조직을 분리한 후, 뽕나무추출배지에서 계대배양을 하고 250의 삼각플라스크에 현미50g과 50㏄의 물을 주입후 고압살균(121/1.2/50분)을 실시하고 냉각시킨 다음 상기 계대배양액을 접종하여 배양한 후 본배양의 접종원으로 사용하였다.
본발명에서 자연산 상황은 강원도의 설악산에서 자생하는 것을 채취하여 사용하였으며, 통상의 방법으로 자실체에서 조직을 분리한 다음, 뽕나무 고목을 재료로하는 고형배지에서 정지배양의 방법으로 계대배양하고, 250의 삼각플라스크에 현미 50g과 50㏄의 물을 주입후 고압살균(121/1.2/50분)을 실시하고 냉각시킨 다음, 상기 계대배양액된 균사체를 무균상자 또는 무균실에서 접종하여 종배양한 후 접종원으로 사용하였다.
다음의 실시예 및 비교예는 본발명을 좀 더 구체적으로 설명하는 것이지만, 본발명의 범주를 한정하는 것은 아니다.
[실시예 1]
현미(농협제품) 300g과 지하수 250㏄를 1000의 종균배양용 병에 병입한 후 뚜껑을 닫고 고압멸균기를 이용하는 통상의 고압멸균법(15 lb/의 증기압(120121)에서 60분간)으로 멸균하여 냉각한 배지에 강원도의 설악산에서 자생하는 자연산 상황을 채취하여 통상의 방법으로 자실체에서 조직을 분리한 다음, 뽕나무 고목을 재료로하는 고형배지에서 정지배양의 방법으로 계대배양하고, 250의 삼각플라스크에 현미 50g과 50㏄의 물을 주입후 고압살균(121/1.2/50분)을 실시하고 냉각한 다음 상기 계대배양된 균사체를 무균실에서 접종하여 종배양한 종배양액 15g을 접종하여 251의 온도에서 배양하면서 균사체의 배양율을 측정하고 균사밀도를 육안으로 평가하여 표 1에 기재하였다.
배지 성분의 종류의 양을 표 1과 같이 변경한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 상황균사체를 배양하면서 균사체의 배양율과 균사밀도를 측정 및 평가하여 표 1에 기재하였다.
표 1로부터 알 수 있는 바와 같이 현미, 볶은현미, 보리, 볶은 보리, 통보리 중 적어도 1종과 지하수를 고압멸균법으로 멸균한 배지는 배지성분에 따른 균사생장 및 균사밀도는 큰 차이가 없으나 볶은 통보리에서는 공극율이 높아 균사밀도가 높으며 볶은 통옥수수는 살균시 종균병 내부의 물이 끓어올라 면전 뚜겅내부에 닿아 이로인해 배양중 오염이 됨을 알 수 있었다.
한편, 백미를 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 상황균사체를 배양한 결과, 배지의 영양성분 고갈로 인하여 상황균사체의 배양이 목적하는 정도로 이루어지지 않았으며, 멸균을 행하지 않은 경우에는 잡균의 성장으로 인하여 오염이 되고, 증류수를 사용할 때에는 무기물들이 부족하여 균사체의 배양이 잘 이루어지지 않았다.
종배양액의 접종량을 표 2와 같이 변경한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 상황균사체를 배양하면서 균사밀도를 스펙트로 포토메터를 이용하여 측정한 결과, 실시예의 경우에는 25일만에 배양이 완료되었으며, 실시예 1719의 경우에는 표 2와 같은 결과를 얻었다.
※ 1000㏄종균배양용병, 현미 300g기준
상술한 바와 같이 본발명의 상황균사체 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 상황균사체의 배양방법은 쉽게 얻을 수 있는 곡물류를 배지성분으로 사용하므로서 상황균사체를 고밀도로 용이하게 얻을 수 있을 뿐만아니라 배양완료 후 배지성분과 더블어 상황균사체를 모두 이용할 수 있으므로 상황균사체의 추출정제가 필요없어 경제적이며 균사체 배양공정이 간단한 효과가 있었다.
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KR20030032677A (ko) * | 2001-10-19 | 2003-04-26 | 김안식 | 액체종균을 이용한 인삼 상황버섯 재배방법 |
CN113755348A (zh) * | 2021-10-27 | 2021-12-07 | 重庆市蚕业科学技术研究院 | 一种野生桑树桑黄菌种分离纯化方法 |
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The Korean Journal of Microbiology Vol.25, No2, p133-142 , 이재성 외 7인 * |
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