CN107646702A - 一种马铃薯组织培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种马铃薯组织培养基，包括MS基础培养基和添加在所述培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：吲哚乙酸0.05~0.5mg/L，蔗糖10~40g/L，6‑苄氨基腺嘌呤0.5~1.0 mg/L，萘乙酸0.3~1.0 mg/L，椰汁20~30ml/L，ABT生根粉1~3 mg/L，N‑二甲氨基琥珀酰胺酸10~20 mg/L，多效唑1.0~2.0 mg/L；所述添加剂还包括活性炭和琼脂，所述活性炭质量分数为0.05~0.2%，所述琼脂质量分数为0.1~1%。与现有技术相比，本发明的技术优势在于：本培养基为一步培养培养基，满足马铃薯在芽段诱导、继代增值、试管微型薯诱导以及生根壮苗等阶段对培养基的要求，对马铃薯芽外植体的诱导率和愈伤组织的分化率、出芽率以及生根效果都有显著的促进作用。

Description

一种马铃薯组织培养基

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的说涉及一种马铃薯组织培养基。

背景技术

马铃薯是一种分布广泛，适应性强、产量高、营养丰富的宜粮、宜菜、宜饲、宜做工业原料的高产经济作物，也是世界十大营养食品之一。马铃薯中含有蛋白质、碳水化合物、脂肪、钙、磷、锌、铁、硫胺素、核苷酸、维生素等。马铃薯内含物质量与动物蛋白相近，可与鸡蛋媲美，可消化成分高，能很好地为人体所吸收。而且其含有丰富的氨基酸，备受当代营养食品发展的重视。此外，马铃薯还含有碳水化合物、脂肪、糖类、粗纤维、灰分和各种维生素等营养素，这些营养素对人体是不可缺少的物质。

马铃薯不但营养价值高，而且还有一定的医疗保健作用。它能够供给人体大量的粘体蛋白质。粘体蛋白质是一种多糖蛋白的混合物，能预防心血管系统的脂肪沉积，保持动脉血管的弹性，防止动脉粥样硬化过早发生，并可预防肝脏、肾脏中结缔组织的萎缩，保持呼吸道、消化道的滑润。马铃薯还有和胃、健脾、益气的疗效，可以预防治疗胃、十二指肠溃疡、慢性胃炎、习惯性便秘和皮肤湿疹等疾病，并有解毒、消炎的功效。此外，马铃薯所含的半纤维素成分，能增加肠道的蠕动次数，具有保健抗癌作用。还含有糖普生物碱，具有平喘、强心、抗过敏、调节代谢内分泌的作用。

植物组织培养是以植物细胞培养技术为前提的一项生物技术。茎尖培养是通过试管培养植株茎尖的一小部分无病毒感染的分生组织细胞，进行大批量繁殖。目前以马铃薯叶片、茎段、叶柄、根等多种外植体进行的再生植株培养，均采用多步成苗培养。具体技术实施方案为：将马铃薯试管苗的叶片、茎段、叶柄、根等的外植体进行愈伤组织培养，诱导30天左右后进行愈伤组织培养的继代培养，再将愈伤组织转接分化培养基中再生植株，多步培养途径繁琐，再生率普遍较低且诱导时间长；一步成苗法具有再生周期短、繁殖系数和再生频率高，易操作等优点，而针对马铃薯一步培养的培养基要求较高，为提高培养基的培育效果，急需研究马铃薯组织离体培养基，使其能够满足马铃薯组织培养的各个阶段的需求。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术中的缺陷，提供了一种马铃薯组织培养基。

一种马铃薯组织培养基，包括基础培养基和添加在所述培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：吲哚乙酸0.05~0.5mg/L，蔗糖10~40g/L，6-苄氨基腺嘌呤0.5~1.0 mg/L，萘乙酸0.3~1.0 mg/L，椰汁20~30ml/L，ABT生根粉1~3 mg/L，N-二甲氨基琥珀酰胺酸10~20 mg/L，多效唑1.0~2.0 mg/L；所述添加剂还包括活性炭和琼脂，所述活性炭质量分数为0.05~0.2%，所述琼脂质量分数为0.1~1%。

作为优化的，所述的马铃薯组织培养基，包括基础培养基和添加在所述培养基中的添加剂，包括吲哚乙酸0.3mg/L，蔗糖30g/L，6-苄氨基腺嘌呤0.8mg/L，萘乙酸0.5mg/L，椰汁25ml/L，ABT生根粉2mg/L，N-二甲氨基琥珀酰胺酸15mg/L，多效唑1.5 mg/L；还包括质量分数为0.1%的活性炭和质量分数为0.5%的琼脂。

本发明还公开了一种马铃薯组织培养基的制备方法，包括以下步骤：称取相应质量的吲哚乙酸、蔗糖、6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、椰汁、ABT生根粉、N-二甲氨基琥珀酰胺酸、多效唑、活性炭、琼脂依次加入到基础培养基中，搅拌均匀，将pH调整至5.8，120℃灭菌20min即得。

其中：

MS培养基具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速组织生长。

活性炭：可以降低组织培养物的有害代谢浓度，对细胞生长有利。活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉末结构，它结构疏松，孔隙大，吸水能力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力，粒度越小其吸附能力越大。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糖醛及激素等。添加的活性炭能够促进根的生长和植株的发育，出根时间早，根条数多。

吲哚乙酸：一种植物体内普遍存在的内源生长素，属吲哚类化合物，又名茁长素、生长素、异生长素，是一种有机物，对可见光稳定，对植物生长具有两重性，植物不同部位对其敏感度不同，一般根大于茎，不同植物对其敏感程度也不同。

琼脂：琼脂的最有用特性是它的凝点和熔点之间的温度相差很大。它在水中需加热至95℃时才开始熔化，熔化后的溶液温度需降到40℃时才开始凝固，所以它是配制固体培养基的最好凝固剂。用琼脂配制的固体培养基，可用以进行高温培养而不熔化，在凝固之前接种时，也不致将培养物烫死。因此，琼脂是制备各种生物培养基中应用最广泛的一种凝固剂。

蔗糖：蔗糖除供能之外，还能诱导愈伤组织组织的再分化； 培养基高温灭菌时，蔗糖更稳定且不容易碳化；植物细胞中含有蔗糖转化酶，蔗糖能更好地维持培养基内的低渗环境，蔗糖形成的渗透压可较长时间地保持相对稳定，可在一定程度上减少微生物的污染。

6-苄氨基腺嘌呤：属广谱性植物生长调节剂，可促进植物细胞生长，抑制植物叶绿素的降解，提高氨基酸的含量，延缓叶片衰老等。诱导芽的分化，促进侧芽生长，促进细胞分裂，还能减少植物体内叶绿素的分解，具有抑制衰老、保绿作用。

萘乙酸：是促进植物根系生长的植物生长调节剂，也是萘乙酰胺的中间体。萘乙酸用作植物生长调节剂，具有促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根，增加坐果，防止落果等，可随营养流输导到作用部位。

椰汁：含有丰富的钾、镁等矿物质，另含糖类、脂肪、蛋白质、生长激素、维生素和大量的微量元素，对马铃薯自身生长有益。

ABT生根粉：绿色植物生长调节剂，它通过强化、调控植物内源激素的含量、重要酶的活性，促进生物分子的合成，诱导植物不定根或不定芽的形态建成，调节植物代谢作用强度，达到提高育苗造林成活率及林木生长量的目的。

N—二甲氨基琥珀酰胺酸：多效应的外源植物激素，用于生长调节剂，具有良好的内吸、传导性能，能控制作物徒长，调节营养分配，使作物健壮高产。

多效唑：植物生长调节剂，具有延缓植物生长，抑制茎秆伸长，缩短节间、促进植物分蘖、增加植物抗逆性能，提高产量等效果。

与现有技术相比，本发明的技术优势在于：本培养基为一步培养培养基，满足马铃薯在芽段诱导、继代增值、试管微型薯诱导以及生根壮苗等阶段对培养基的要求，对马铃薯芽外植体的诱导率和愈伤组织的分化率、出芽率以及生根效果都有显著的促进作用。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件，除非特别说明，比例和百分比基于重量。

本发明实施例所用原料均为市售。

实施例1、一种马铃薯组织培养基

在MS培养基中加入如下成分：吲哚乙酸0.05mg/L，蔗糖20g/L，6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/L，萘乙酸0.5mg/L，椰汁20ml/L，ABT生根粉2 mg/L，N-二甲氨基琥珀酰胺酸10mg/L，多效唑1.5 mg/L；质量分数为0.05%的活性炭，质量分数为0.1%的琼脂，。

制备方法：称取相应质量的吲哚乙酸、蔗糖、6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、椰汁、ABT生根粉、N-二甲氨基琥珀酰胺酸、多效唑、活性炭、琼脂依次加入到基础培养基中，搅拌均匀，将pH调整至5.8，120℃灭菌20min即得。

将相同品种马铃薯用软毛刷在自来水下刷洗干净，然后用多菌灵稀释液泡数十分钟，无菌水冲洗3~5遍，再放入干净的培养箱里，用干净的纸张将马铃薯盖好，置于室温约25~28℃，光照为1500~2000Lux的培养室中培养，每隔5天左右给马铃薯浇少量水，并定期观察马铃薯出芽情况。

将供试品种放在室温下催芽萌发，待马铃薯芽长到1~3cm时，选取强壮的芽用刀片切下，将其分离后置于杯中，用纱布封好杯口，流水冲洗30分钟。接着移置超净工作台，置于经消毒好的碟子上，用吸水纸吸干芽上的水，然后分装入消毒瓶里，按顺序进行酒精、次氯酸钠、氯化汞的消毒灭菌。在消毒灭菌过程中不断晃动消毒液。消毒完后用无菌水冲洗4~5次，最后用灭菌吸水纸吸干水，放入灭菌培养皿中待用。将芽段（1~3cm）接种到培养基中，为了每瓶接种2~3块，观察培养基对芽外植体诱导情况，实验结果见表1.

表1 不同培养基对芽外植体诱导的影响

培养基	接种芽数	诱导出芽数	芽分化成苗率	苗素质
					实施例1培养基	30	27	90%	茎较粗，叶片浓绿，根系发达
MS培养基	30	15	50%	植株一般，叶片小

实施例2、一种马铃薯组织培养基

在MS培养基中加入如下成分：吲哚乙酸0.3mg/L，蔗糖10g/L，6-苄氨基腺嘌呤1.0 mg/L，萘乙酸1.0 mg/L，椰汁25ml/L，ABT生根粉1mg/L，N-二甲氨基琥珀酰胺酸15mg/L，多效唑2.0 mg/L；质量分数为0.1%的活性炭，质量分数为1%的琼脂。

制备方法：称取相应质量的吲哚乙酸、蔗糖、6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、椰汁、ABT生根粉、N-二甲氨基琥珀酰胺酸、多效唑、活性炭、琼脂依次加入到基础培养基中，搅拌均匀，将pH调整至5.8，120℃灭菌20min即得。

选取来源一致的马铃薯无菌试管苗，在无菌条件下，切取顶端完全展开的叶片，并切取约0.5cm*0.5cm大小叶片，以叶片背面贴于培养基上，每瓶接种8个外植体，每个组合接种8瓶，接种后培养基置于温度为22±2℃条件下，全黑暗培养，7-10天后进行16h/d光照培养，光照为1500~2000Lux，光照培养20d后，表2中显示出愈伤组织的诱导率，即产生愈伤的外植体数/接种外植体数×100%，及愈伤组织的形成情况。

表2 不同培养基对叶片愈伤组织诱导的影响

培养基	接种数	诱导率	愈伤量	颜色与质地
					实施例2培养基	64	98%	多	黄绿色，颗粒大，较疏松
MS培养基	64	63%	少	淡绿色，颗粒小，致密

实施例3、一种马铃薯组织培养基

在MS培养基中加入如下成分：吲哚乙酸0.5mg/L，蔗糖40g/L，6-苄氨基腺嘌呤0.8 mg/L，萘乙酸0.3mg/L，椰汁30ml/L，ABT生根粉3 mg/L，N-二甲氨基琥珀酰胺酸20 mg/L，多效唑1.0 mg/L；质量分数为0.2%的活性炭，质量分数为0.5%的琼脂。

制备方法：称取相应质量的吲哚乙酸、蔗糖、6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、椰汁、ABT生根粉、N-二甲氨基琥珀酰胺酸、多效唑、活性炭、琼脂依次加入到基础培养基中，搅拌均匀，将pH调整至5.8，120℃灭菌20min即得。

将顶芽或腋芽萌发伸长形成的多节茎段嫩枝，剪成带1~2枚叶片的单芽或多芽茎段，接种到培养基中进行培养，每瓶接种8个马铃薯苗单节茎段，培养30d分别观察记录苗增殖倍数及苗素质。

表3 不同培养基对马铃薯继代培养的影响

培养基	接种芽数	增殖苗	增值倍数	苗素质
					实施例3培养基	40	99	2.475	株粗、叶绿、枝多
MS培养基	40	55	1.375	株细、叶淡绿、分枝少

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种马铃薯组织培养基，其特征在于：包括MS基础培养基和添加在所述培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：吲哚乙酸0.05~0.5mg/L，蔗糖10~40g/L，6-苄氨基腺嘌呤0.5~1.0 mg/L，萘乙酸0.3~1.0 mg/L，椰汁20~30ml/L，ABT生根粉1~3 mg/L，N-二甲氨基琥珀酰胺酸10~20 mg/L，多效唑1.0~2.0 mg/L；所述添加剂还包括活性炭和琼脂，所述活性炭质量分数为0.05~0.2%，所述琼脂质量分数为0.1~1%。

2.根据权利要求1所述的一种马铃薯组织培养基，其特征在于：包括MS基础培养基和添加在所述培养基中的添加剂，包括吲哚乙酸0.3mg/L，蔗糖30g/L，6-苄氨基腺嘌呤0.8mg/L，萘乙酸0.5mg/L，椰汁25ml/L，ABT生根粉2mg/L，N-二甲氨基琥珀酰胺酸15mg/L，多效唑1.5mg/L；还包括质量分数为0.1%的活性炭和质量分数为0.5%的琼脂。

3.根据权利要求1和2所述的一种马铃薯组织培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：称取相应质量的吲哚乙酸、蔗糖、6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、椰汁、ABT生根粉、N-二甲氨基琥珀酰胺酸、多效唑、活性炭、琼脂依次加入到基础培养基中，搅拌均匀，将pH调整至5.8，120℃灭菌20min即得。