ES2914629B2 - Procedimiento para la obtencion de biomasa y/o sustancias de valor utilizables como aditivos para piensos a partir de cultivos embriogenicos de encina o alcornoque y producto obtenido. - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para la obtención de biomasa y/o sustancias de valor utilizables como aditivos para piensos a partir de cultivos embriogénicos de encina o alcornoque y producto obtenido

SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención se encuentra dentro de la biotecnología y se refiere a un procedimiento para obtener biomasa y/o sustancias de valor utilizables como aditivos para piensos, a partir de bellotas u hojas de encina o alcornoque.

El objeto de la invención es un método para producir a gran escala embriones somáticos de encina o alcornoque, también aplicable a otras especies del género Quercus, de gran calidad nutritiva. La producción puede realizarse durante todo el año, y el producto ser aprovechado para alimentación de forma casi directa o para la extracción de sustancias de interés farmacéutico y alimentario. La invención afecta igualmente al producto obtenido.

En definitiva, el objeto de la invención es múltiple, pudiendo resumirse en los siguientes logros:

• Producción de bellotas en laboratorio.

• Producción secundaria de biomasa para pienso enriquecida en proteínas y aminoácidos de interés.

• Producción de polifenoles o sustancias de interés.

• Producción en biorreactores a gran escala de cada uno de estos productos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La Embriogénesis Somática es una técnica de micropropagación vegetativa por la que se forman embriones a partir de células somáticas, por vía asexual. Este método está extendido en la regeneración de todo tipo de plantas; herbáceas, arbustivas y leñosas. En el propio centro de investigación solicitante se ha desarrollado durante años un protocolo para la obtención de embriones somáticos a partir de células de hoja del alcornoque y de tegumentos de bellota inmadura para la encina. Con ambos tejidos de inicio, se captura directamente el potencial genético del árbol madre por lo que el objetivo siempre se dirigió a la clonación u obtención de planta de idénticas características genéticas (Toribio et al., 2005).

El material de partida más susceptible y, por tanto, más usado como explante para iniciar esta técnica es la semilla, aunque se pueden usar otros tejidos como flores, polen, yemas, ápices y hojas. En la encina, el documento “Holm Oak Somatic Embryogenesis: Current Status and Future Perspectives” (Martinez, T. y col. 2019) hace una revisión de los protocolos para la propagación de la encina por embriogénesis somática. Se analizan los factores que afectan a la inducción (edad de la planta donante, tipo de explante, reguladores del crecimiento) y los que afectan al mantenimiento y proliferación de los cultivos. Los embriones somáticos se inician a partir de diferentes tipos de explantes, incluidos embriones cigóticos, tegumentos de óvulos, hojas y ápices de brotes. El objetivo es la propagación y regeneración de las plantas.

El documento “Somatic Embryogenesis of Quercus suber L. From Immature Zygotic Embryos”; Testillano, P. y col. 2018, describe un protocolo eficiente para la inducción de embriogénesis somática de alcornoque a partir de embriones cigóticos inmaduros, así como a métodos para la proliferación y maduración de embriones somáticos, germinación, regeneración de plántulas y aclimatación. Utilizan medios de cultivo MS ((Murashige y Skoog’s, 1962) y Sommer y añaden auxinas, y sacarosa (15-30 g/l) según las distintas etapas. Dado que el desarrollo es asíncrono, las placas del medio de proliferación generalmente exhiben un amplio repertorio de masas de diferentes tamaños y embriones somáticos en diversas etapas de desarrollo, desde globular temprano, al torpedo y el cotiledonario inmaduro. Los cultivos de embriogénesis somática en el medio de proliferación mantienen su capacidad embriogénica durante muchos meses y se utilizan como fuente continua de nuevos embriones somáticos.

La patente de invención EP0608716 B1 promueve la formación de masa proembriogénica (PEM) en un medio de cultivo líquido que contiene una auxina. Los PEM obtenidos se recolectan y se ponen en contacto con un líquido libre de auxina y finalmente se recolectan los embriones somáticos derivados. El material explante dicotiledóneo o monocotiledóneo deriva de protoplastos, tallos, hojas, pétalo, sección de hipocótilo, embrión cigótico, tubérculo, etc. Si bien en dicha patente se describe un método en el que se emplean biorreactores para producir en medio líquido, este método prevé el uso de auxinas o fitoreguladores de crecimiento durante las etapas de proliferación, estando exclusivamente previsto para la generación de plantas. Además, no se hace ninguna referencia al uso de esta técnica para el género Quercus y no es aplicada a la obtención de una biomasa rica en proteínas y polifenoles.

En este sentido, el cultivo in vitro de células vegetales ha abierto nuevos caminos como fuente renovable de compuestos bioactivos de gran valor añadido debido a las ventajas que presenta su utilización:

• Son independientes de factores geográficos, estacionales y ambientales.

• Constituyen sistemas de producción estables ya que aseguran la obtención continua de compuestos con calidad y productividad uniformes.

• Los requerimientos de espacio para el desarrollo de la producción son reducidos. • El proceso de producción se optimiza cuando éste se libera al medio de cultivo y se puede realizar a gran escala.

• Permite obtener nuevos compuestos que no son sintetizados por las plantas de forma natural.

Hasta la fecha, no existen estudios previos donde se utilicen los cultivos embriogénicos de Quercus para la producción de biomasa utilizable como aditivo para pienso o extracción de sustancias de interés.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

Las bellotas de encina y alcornoque tienen un reconocido valor como alimento para el ganado, especialmente porcino ibérico, pero actualmente se le reconocen otras propiedades nutricionales que se han relacionado con la presencia de sustancias de interés, especialmente aminoácidos y polifenoles de interés funcional o farmacéutico (Vinha A, Joáo C, Barreira M, Costa A & Oliveira B. (2016). A New Age for Quercus spp. Fruits: Review on Nutritional and Phytochemical Composition and Related Biological Activities of Acorns. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, Institute of Food Technologists, 00, 1-35).

Las autoras de la presente invención han observado que se puede utilizar la gran capacidad productiva de los cultivos embriogénicos de alcornoque y encina, aprovechando la variabilidad genética, modificando la composición del medio y los sistemas y condiciones de cultivo, con el fin de obtener productos similares a las bellotas en su composición, en las que se puede optimizar los niveles de esas sustancias de interés.

El procedimiento propuesto permite seleccionar los individuos o genotipos dentro de cada especie que dan mayor cantidad de embriones somáticos y de mejor calidad nutritiva, variar las condiciones de cultivo y la composición del medio para favorecer la producción de sustancias de interés y producirlo durante todo el año a gran escala para su aprovechamiento como complemento de piensos o para la extracción de sustancias de interés.

Para ello, y de forma más concreta, en el proceso de la invención se establecen las siguientes fases operativas:

1. Obtención de líneas embriogénicas.

2. Conservación de las líneas embriogénicas.

3. Proliferación en medio líquido sin auxinas.

4. Escalado en agitación.

5. Diferenciación y maduración de embriones sin auxinas.

6. Variación de la composición nutritiva.

En la primera fase u obtención de líneas embriogénicas, hay dos variantes de realización o sub-métodos en función de la especie de que se trate.

En la variante 1, aplicable a todos los Quercus (alcornoque, encina, roble...) se utiliza como material de partida los embriones cigóticos inmaduros, o bellotas inmaduras, de un tamaño comprendido entre 5 y 10 mm de diámetro, que se desinfectan y colocan en un medio de cultivo tipo MS o SH (Schenk y Hildebrandt’s, 1972) con un rango en torno a 30 g/L de sacarosa y 0,6 % de agar u otro gelificante, pero sin auxinas, ajustando el pH alrededor de 6 y esterilizando en condiciones estándar. Tras tres meses de cultivo en cámara a temperatura controlada, el primero de ellos en oscuridad, y con renovación mensual del medio, se obtienen los primeros embriones somáticos (ES) o masas embriogénicas (S) (Cloning mature holm oak trees by somatic embryogenesis. A Barra-Jiménez y col. 2014. Trees 28 (3), 657-667)

En la variante 2, aplicada específicamente al alcornoque, se cortan estacas de madera (fragmentos de las ramas) de unos 25 cm de longitud y alrededor de 1 cm de diámetro. Se colocan en perlita húmeda y condiciones controladas de temperatura y humedad para forzar su brotación. De las hojas brotadas, se recogen las de un tamaño de entre 5 y 10 mm, se desinfectan e introducen en un medio de cultivo tipo MS o SH con 30 g/L de sacarosa y 6 % de gelificante, pero con auxinas añadidas, ajustando el pH alrededor de 6 y esterilizando en condiciones estándar. Tras tres meses de cultivo en cámara a temperatura controlada, el primero de ellos en oscuridad, y con renovación mensual del medio, se obtienen los primeros embriones somáticos (Application of plant regeneration of selected cork oak trees by somatic embryogenesis to implement multivarietal forestry for cork production. I.Hernández 2011.Tree For Sci Biotechnol 5 (Special issue 1):19-26

En cualquiera de las dos variantes y de acuerdo con la segunda fase del procedimiento, los cultivos pueden mantenerse durante años (más de 10) con repicados periódicos en medio fresco tipo MS o SH con entre 30- 120 g/L de sacarosa y 0,6 % de gelificante, pero sin auxinas añadidas, ajustando el pH alrededor de 6 y esterilizando en condiciones estándar, conservándose en cámara a temperaturas de entre 4-23°C, con renovación periódica del medio.

Seguidamente se procede, de acuerdo con la tercera fase del procedimiento a introducir el material embriogénico en el mismo medio líquido anterior, tipo MS o SH, sin gelificante ni auxinas añadidas. La combinación de una determinada densidad inicial, el tamaño de la fracción del inóculo y la velocidad de agitación entre 60 y 120 rpm, permiten obtener la máxima producción de biomasa de un material homogéneo tipo sémola rico en proteína cultivando entre 30 y 45 días en cámara con temperatura 23 C y fotoperiodo de 16 horas luz.

En la cuarta etapa, se escala el cultivo hasta 1 L, usando las mismas condiciones y medios de la fase anterior, pero usando envases de mayor tamaño. Se multiplica la producción proporcionalmente a la cantidad de medio y tamaño de envase usado.

Durante la quinta etapa, se va separando la fracción de mayor tamaño (alrededor de 3 mm de diámetro o más), y se deja al resto del cultivo que continúe en proliferación. Esta fracción pasa a un sistema de cultivo de inmersión transitoria con el mismo medio de cultivo tipo MS de la fase anterior. Durante el primer mes, se utilizan frecuencias de riego (inmersión transitoria) de 2 minutos cada 4 horas, que favorecen la diferenciación de los embriones.

En la última etapa, se reduce el tiempo de riego y la frecuencia en torno a 1 minuto cada 8 horas y se varía la composición del medio añadiendo entre 15g/l y 90 g/l de sacarosa o una fuente de nitrógeno (ej. glutamina) para conseguir el engorde y maduración de los embriones con una determinada composición nutritiva.

Se combinan así en un proceso específico varias técnicas de cultivo en medio líquido (sistemas de agitación y biorreactores de inmersión temporal) en condiciones concretas de medio, densidad, tamaño de inóculo inicial, tiempo y velocidad, que permiten la obtención de dos productos de diferente composición y características morfológicas, según la fase del proceso.

El procedimiento descrito presenta las siguientes novedades:

1. El protocolo desarrollado en medio líquido se adapta a varias especies de Quercus:

alcornoque, encina, o roble, siendo aplicable probablemente a todas las fagáceas. 2. Se puede obtener embriones somáticos maduros a partir de bellotas inmaduras de encina y/o alcornoque sin utilizar auxinas o fitoreguladores de crecimiento en ninguna de las fases del proceso o a partir de hojas sin utilizar auxinas en las fases posteriores incluida la proliferación y maduración.

3. Obtención tras las etapas de proliferación y escalado de gran cantidad de biomasa de un cultivo embriogénico sincrónico, granular o tipo sémola, homogéneo y rico en proteínas: PRODUCTO1.

4. Generación y engorde de embriones somáticos maduros: PRODUCTO 2, al utilizar determinados medios y frecuencias de cultivo en un sistema de inmersión transitoria.

5. Obtención de un porcentaje superior a la bellota en proteínas, aminoácidos y polifenoles.

6. Los cultivos embriogénicos no pierden su capacidad productiva durante años.

7. El proceso permite variar la composición nutritiva del producto con la selección del genotipo, el estado de desarrollo y la modificación de la concentración de azúcares y la fuente de nitrógeno en el medio de cultivo.

8. Se obtiene embriogénesis somática de encina y/o alcornoque sin utilizar auxinas o fitoreguladores en las fases de inducción, proliferación y maduración y con el mismo medio de cultivo.

9. Seleccionando densidad inicial, tamaño de Inóculo y genotipo se obtiene en 6 semanas, una tasa de multiplicación de hasta x125.

10. La amplia variabilidad entre genotipos permite seleccionar genotipos que crecen en oscuridad, lo que permitiría usar tanques de agitación cerrados.

EL procedimiento supone por tanto un salto técnico cuantitativo y cualitativo con respecto a lo ya conocido en embriogénesis somáticas de especies de Quercus, porque combina varias técnicas existentes, habiéndose conseguido eliminar fitoreguladores, escalar y controlar el tipo de producto y su composición.

La invención afecta igualmente al producto obtenido. Así, en la fase de proliferación se obtiene un PRODUCTO 1; cultivo embriogénico granular tipo sémola, de color translúcido crema-amarillento, con un alto contenido proteico (una media de 33,6% de proteína sobre materia seca (MS)) y rico en aminoácidos de interés como el GABA.

Y, tras el cultivo en inmersión transitoria, un PRODUCTO 2 similar a las bellotas inmaduras de la especie Quercus, de color opaco blanco-amarillento-verdoso, con una media del 23,4% de proteína sobre MS, grasa de hasta el 8,7% sobre MS con determinada composición de ácidos grasos y rico en polifenoles.

Los productos que se obtienen mediante el procedimiento de la invención presentan las siguientes novedades:

1. Altos porcentajes de proteína que pueden llegar hasta el 48% MS según genotipo.

2. Alta concentración de aminoácidos en los cultivos que equivalen al 96% del total de proteína.

3. Se identifican dos aminoácidos no proteicos de gran interés, y en alta proporción: acido gamma-aminobutirico (GABA) y ornitina.

4. Las concentraciones medias de polifenoles totales (hasta 39,1 g/kg en embriones de alcornoques) son mucho mayores a las encontradas en bellotas.

Pudiendo justificarse la aplicación como sustancias de interés ya que:

1. El aminoácido GABA está en concentraciones significativas, lo que permitiría utilizar los cultivos como aditivos en piensos o en la elaboración de preparaciones farmacéuticas o alimentarias.

2. Los polifenoles (principalmente taninos hidrolizables) y tocoferoles (vitamina E) son de gran interés por su elevado poder antioxidante. Se podrían elaborar extractos para piensos, diseñar “nuevos alimentos” por la industria alimentaria o preparaciones farmacéuticas.

3. La variación de la composición química entre genotipos es muy grande, lo que permite seleccionar genotipos por la concentración de un compuesto de interés o diseñar mezclas de cultivos de distintos genotipos o en diferentes estados de desarrollo, para optimizar los niveles de más de un componente.

4. Los niveles de grasa, proteína y el perfil de aminoácidos esenciales de los cultivos pueden ser modificados utilizando diferentes medios de cultivo.

EJEMPLO DETALLADO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN

Se describe el interés del procedimiento con datos y tablas de los resultados obtenidos con determinados genotipos de alcornoque y encina. Los ejemplos tienen fines ilustrativos y no deben considerarse una limitación del alcance de la invención.

Realizando las etapas 1 y 2 descritas anteriormente, a partir del material obtenido por embriogénesis somática de bellotas inmaduras (variante 1) y hojas en el caso del alcornoque (variante 2), se obtienen líneas embriogénicas que se conservan en medio con agar con repicados periódicos a medio fresco (Hernández, I. 2011). Se realizan entonces las siguientes etapas.

Seguidamente se procede, de acuerdo con la tercera fase del procedimiento a introducir el material embriogénico en el mismo medio líquido anterior, tipo MS o SH, sin gelificante ni auxinas añadidas. La combinación de una determinada densidad inicial, el tamaño de la fracción del inóculo y la velocidad de agitación entre 60 y 120 rpm, permiten obtener la máxima producción de biomasa de un material homogéneo tipo sémola rico en proteína cultivando entre 30 y 45 días en cámara con temperatura 23 C y fotoperiodo de 16 horas luz.

Etapa 3. Fase de proliferación en medio líquido sin auxinas, con luz, o en oscuridad. El material embriogénico obtenido de la etapa 2 se recoge y cultiva en envases con medio líquido tipo MS o SH, sin utilizar auxinas o reguladores de crecimiento. Se usa alrededor de 30g/l de sacarosa, ajustando el pH en torno a 6 y esterilizando a 120°C durante 30 minutos. Se cultivan en agitación a 110 rpm, temperatura entorno a los 23°C y fotoperiodo de 8 horas luz. Se pueden seleccionar además genotipos con alta capacidad de producción en oscuridad.

Ejemplo 1. Se cultivan 150mg de la fracción 0,8-3mm de embriones somáticos de alcornoque y encina durante 28 días en 50ml de medio en envases de 250ml, y no existen diferencias significativas entre el cultivo en luz y oscuridad:

Etapa 4. Escalado desde envase de 250ml a 1000ml: tasas de multiplicación

Tras los 28 días de proliferación, se renueva y duplica el medio de cultivo y vuelve a cultivar

en agitación a 110rpm otros 15 días. Se consigue una tasa elevada de multiplicación >100

seleccionando el genotipo y la especie de un PRODUCTO 1.

Ejemplo 2. La tasa de multiplicación alcanza en alcornoque hasta 124, lográndose hasta

74,6 g/L seleccionando el genotipo adecuado y hasta 40 en encina, lográndose hasta

33,5g/L seleccionando el genotipo adecuado.

GENOTIPO ENVASE MEDIO n° 28días

re p. proliferación

ml. g/envase g/envase MULTIPL Alcornoque 1 50

4 6,012 15,000 100

A lcornoque 1 100 4 12,269 29,700 99

A lcornoque 1 200 3 17,684 48,980 82

A lcornoque 2

2,540 11,850 79

A lcornoque 2 100 4 6,195 27,773 93

A lcornoque 2 200 4 10,101 48,800 81

50 4 3,394 6,764 45

100

4 6,047 14,260 48

A lcornoque 3 200 4 10,782 21,581 36

A lcornoque 4 50 4 6,888 13,546 90

A lcornoque 4 100 4 11,923 29,442 98

A lcornoque 4 200 7 37,161 74,578 124 Encina 1 50 4 2,146 - -Encina 1 100 3 6,220 14,907 50 Encina 1 200 9 10,679 16,822 28 Encina 2 50 4 4,478 5,865

Encina 2 100 2 6,358 - -Encina 2 200 2 7,164 -

Encina 4 E200 50 3 2,971 5,065 34 Encina 4 E500 100

4 5,829 11,599 39 Encina 4 E1000 200 4 10,544 19,995 33 Encina 5 E200 50 4 3,255 8,632 58 Encina 5 E500 100 4 6,910 17,780

Encina 5

E1000 200

7 15,449 33,497 56

CARACTERISTICAS DE LA COMPOSICION DE LA BELLOTA DE REFERENCIA

Tabla 1. Composición de la bellota decorticada [g/100 g m ateria seca)

‘ P ro m e d io de va lo re s pub licados en 10 tra b a jo s

2 A nális is NIR

JSum a=Cen iz as+FND+ P ro te in a+Grasa

Tabla 1. Perfil de aminoácidos de la proteina de la bellota decortkada

CARACTERÍSTICAS DE PRODUCTO 1

El material embriogénico obtenido tiene un alto porcentaje de proteína expresado en materia seca (MS). La encina tiene de media más contenido en proteína (33% MS) que el alcornoque (26,3% MS) habiéndose alcanzado en algún genotipo estudiado que no seleccionado para este fin, hasta el 48% MS.

Ejemplo 3. El análisis de macronutrientes: Ceniza (CZ), Fibra Neutro Detergente (FND), Fibra Acido Detergente (FAD), Lignina Acido Detergente (LAD), Proteína Bruta (PB), Grasa Bruta (GB) de varias líneas de alcornoque y de encina, cultivadas en 50ml de medio SH en envases de 250ml, con 150mg de la fracción 0,8-3mm de inóculo inicial, a los 28 días, demuestra que hay diferencias entre especies y genotipos pudiéndose seleccionar los mejores (Gráfica 1).

Gráfica 1. Variación de la composición de macronutrientes según genotipo y especie

Comparado con las composiciones de la bellota decorticada y la harina de soja como el mejor referente en contenido proteico vegetal, el producto obtenido supera a la bellota y, en algunos ácidos, a la soja (Tabla 3)

Tabla 3. Perfil en aminoácidos de la proteína de cultivos embriogénicos (alcornoqueT3 y encina PLT3) en un medio con 30g/l de sacarosa, en bellota decorticada y en harina de soja.

Etapa 5. Cultivo en sistema de inmersión transitoria.

Ejemplo 4. Se parte de agregados embriogénicos de fracción superior a 800 gm. En cada sistema de inmersión transitoria (TIS) se introduce aproximadamente 3 gr/ L. de medio SH fitohormonas ni reguladores. Se programa 2 minutos de inmersión cada 4 horas. Se cultiva en cámaras con fotoperiodo de 16 h luz y temperatura aproximada de 23°C entre 30 días y 45 días (Tabla 4).

Tabla 4. Producción (g/200ml) según genotipo y concentración de sacarosa en el medio

CARACTERÍSTICAS DE COMPOSICIÓN DEL PRODUCTO 2

Los embriones maduros obtenidos tras el cultivo en inmersión transitoria con 30g/l de sacarosa, se caracterizan por un mayor porcentaje de materia seca (10,6% de MS), y menor porcentaje de proteína (23,4%PB/MS) que el PRODUCTO1.

Tabla 5. Composición de macronutrientes de los cultivos embriogénicos según etapa del procedimiento

(SUSPENSIONES= PRODUCTO 1 Y EMBRIONES = PRODUCTO 2)

a a . omposc n e macronutrentes e os cutvos em rog ncos seg n

MODIFICACIÓN DEL VALOR NUTRICIONAL DE LOS CULTIVOS EMBRIOGENICOS

PROTEINAS Y AMINOÁCIDOS

La concentración de aminoácidos de los cultivos equivale al 96% del total de proteína. Los análisis por GC-MS de los cultivos embriogénicos en los dos estados de desarrollo (P1 y P2) han permitido identificar dos aminoácidos no proteicos, acido gamma-aminobutirico (GABA) en todos los genotipos y estados de crecimiento, y ornitina solo en embriones de encina (Tabla 7).

Tabla 7. Análisis de aminoácidos de la proteína de cultivos embriogénicos

El contenido en GABA varía para cada especie vegetal según el tipo de tejidos. La suplementación con GABA ha demostrado tener efectos favorables para la prevención de enfermedades crónicas (regulación de la presión sanguínea y ritmo cardiaco, estimulación de la secreción de insulina y prevención de la diabetes, alivio del dolor, la ansiedad y el insomnio, estimulante del aprendizaje y la memoria, reducción del riesgo de Alzheimer, etc). En alimentación animal, el GABA se ha utilizado como aditivo en piensos de animales en situaciones de estrés productivo (p. ej. lechones al destete, vacas al inicio de la lactación, gallinas ponedoras durante la puesta, etc) observándose también una mejora de ciertos indicadores relacionados con la salud intestinal y el bienestar de los animales, así como un aumento del consumo y los rendimientos productivos (Park y Kim, 2015; Wang et al., 2013; Yang et al, 2009).

En el documento de patente ES2542163 se describe un procedimiento de obtención de granos de arroz integral germinados para obtener composiciones alimentarias saludables con altos contenidos en GABA (superiores a 230 mg/kg de harina seca). Estos niveles de GABA son inferiores a los obtenidos en los cultivos embriogénicos de bellota: 3020 mg/kg MS en el PRODUCTO 1 obtenido de Quercus.

Al suplementar con 550mg/L de glutamina el medio de cultivo (Tabla 8), la proteína (% peso fresco) de los embriones aumento proporcionalmente más en encina (1,85 vs 2,17%) que en alcornoque (1,93 vs 2,11%) y el perfil de aminoácidos cambió, siendo los cambios más evidentes en alcornoque, donde aumentaron los aminoácidos esenciales (43,5 vs 48,3%), entre otros la lisina (5,7 vs 6,6% en %AA), leucina (6,7 vs 8,1 en %AA) y valina (5,7 vs 6,5 en %AA).

Tabla 8. Efecto de la adición de glutamina (GLU) sobre el perfil de aminoácidos de alcornoque T3 y encina PLT3

Cuando se varió la concentración de sacarosa 15, 30, 60 o 90 g/L en el medio de cultivo de la fase 5, estimando la concentración en proteína como suma de los aminoácidos proteicos de los cultivos, dosis crecientes de sacarosa en el medio aumentaron la proteína de 2,20 a 3,05% en encina y de 1,91 a 2,17% en alcornoque expresada en peso fresco. Se analizaron también los perfiles de aminoácidos (por HPLC, solo AA proteicos) de los cultivos (Tabla 9). Al aumentar las dosis de sacarosa, en el alcornoque T3 aumentaron los aminoácidos esenciales (lisina, leucina y valina) habiendo menos efecto en encina PLT3: Tabla 9. Efecto de la concentración de sacarosa (SAC) en el perfil de aminoácidos del producto2 de alcornoque T3 y encina PLT3

ACIDOS GRASOS:

Se analizó la composición en ácidos grasos de la grasa y se comparó con la bellota decorticada y el aceite de soja, dando valores altos en linoleico, linolénico, palmítico y behénico.

Tabla 10. Comparación de los ácidos grasos (% total AG) en comparación con aceite de bellota y soja

POLIFENOLES

Los taninos son compuestos polifenólicos presentes exclusivamente en tejidos vegetales (“fitoquimicos”). Se consideran los componentes de la bellota de mayor interés para desarrollar nuevos alimentos y/o preparaciones farmacéuticas por su elevado poder antioxidante y sus propiedades antibacterianas (Vinha et al., 2016). El único trabajo encontrado en la bibliografía que presenta resultados sobre bellota obtenidos con una metodología analítica similar a la aplicada por las autoras de esta invención (Tabla 11) es el de Cantos et al. (2003). Estos autores analizaron la concentración de polifenoles por HPLC-DAD-MS/MS, e identificaron y cuantificaron individualmente los compuestos polifenólicos de la pulpa en bellotas de tres especies de Quercus (Ilex, Rotundifolia y Suber). La mayor concentración de polifenoles totales se obtuvo para Q. ilex (2,18 g/kg), seguida de Q. rotundifolia (1,44 g/kg) y Q. suber (0,298 g/kg). Se identificaron dos tipos de polifenoles hidrolizables, los compuestos derivados del ácido gálico y los del ácido elágico, siendo los primeros los más abundantes (87% en Q. Rotundifolia, 84% en Q. Ilex, y 62% en Q. Suber) en la pulpa de las bellotas de las tres especies de Quercus. Las concentraciones medias de polifenoles totales reportadas aquí (Tabla11) en los cultivos embriogénicos son mucho mayores a las encontradas en bellotas (6,46 g/kg en P1 de encina, 12,31 g/kg en P1 de alcornoque y 39,1 g/kg en P2 o embriones maduros de alcornoque).

Tabla 11. Composición relativa de polifenoles en P1 de encina y alcornoque y P2 de alcornoque

EM BRIONES

Alcornoque Polifenoles

EOÜs P1T3 s Q8 s A B ls AB3s T3 s

T3 es glucogallin 273 3295 0 2647 1331 531 5721 glucogallin? 64 166 0 420 2044 1166 697 vescalagin orcastalagin 88 0 ao 1S6 60 0 2042

231 207 213 206 154 lia 0 310 3 IB 572 1550 503 136 1335 205 2S9 73 0 100 0 0 procyanidin B2 445 2443 236 4501 3007 1191 4024

430 94 247 0 133 0 0 catechin 120 1944 0 2231 S5S 193 2905

109 627 273 0 141 0 0 SOS 4S6 1036 0 117 0 376 l-Q-galloylpedunculagin 0 0 0 0 0 0 2S21

lis 422 104 0 60 0 0 0 0 0 0 0 0 6072 0 0 0 292 0 173 0 427 848 297 0 0 0 0 0 0 0 824 0 0 129 l-desgalloyleugeniiin 0 0 0 0 0 0 1100

0 0 0 507 0 35 236 eugeniin 0 0 0 0 0 0 6350 tetra-O-gall oy l-D-glucose 0 310 0 13S6 13SS 5S9 1431

0 213 0 1339 263 1S7 913 0 35 0 15S 0 65 0 beta-p enta -Ü -ga Hoy l-D-gluco se 0 870 0 4484 1262 790 2741 beta-p enta -Ü -ga Hoy l-D-gluco se 0 0 0 437 324 0 164

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1§.- Procedimiento para la obtención de biomasa y/o sustancias de valor utilizables como aditivos para piensos a partir de cultivos embriogénicos de encina o alcornoque, caracterizado por que en el mismo se establecen las siguientes fases operativas:

a) Obtención de embriones somáticos a partir de un explante de cualquier especie de Quercus.

b) Conservación de dichos embriones en medio de cultivo semisólido que contiene sacarosa, sin auxinas añadidas.

c) Proliferación de los embriones somáticos por agitación en medio de cultivo líquido similar al anterior, sin presencia de sustancias gelificantes.

d) Escalado en iguales condiciones que en la fase anterior C) en envases de mayor tamaño.

e) Selección de la fracción sólida mayor de 800 pm de diámetro y cultivo en un sistema de cultivo de inmersión transitoria en el mismo medio de cultivo que en la fase c), para la maduración de los embriones.

2§.- Procedimiento para la obtención de biomasa y/o sustancias de valor utilizables como aditivos para piensos a partir de cultivos embriogénicos de encina o alcornoque, según reivindicación 1§, caracterizado por que en la fase a) de obtención de embriones somáticos, se parte de bellotas inmaduras, que se esterilizan y colocan sobre un medio de cultivo semisólido, con un rango de entre 30- 60 g/L de sacarosa, en donde el pH del medio se ajusta entre 5,6-7,5 sin adición de auxinas, obteniéndose tras tres meses de cultivo el primero de ellos en oscuridad y con renovación mensual del medio, los primeros embriones somáticos o masas preembriogénicas.

3§.- Procedimiento para la obtención de biomasa y/o sustancias de valor utilizables como aditivos para piensos a partir de cultivos embriogénicos de encina o alcornoque, según reivindicación 1§, caracterizado por que en la fase b) los embriones somáticos se mantienen durante años sin auxinas con repicados mensuales en medio fresco semisólido con un rango de entre 30- 60 g/L de sacarosa, en donde el pH del medio se ajusta entre 5,6-7,5 sin adición de auxinas.

4§.- Procedimiento para la obtención de biomasa y/o sustancias de valor utilizables como aditivos para piensos a partir de cultivos embriogénicos de encina o alcornoque, según reivindicación 1§, caracterizado por que la agitación se lleva a cabo a una velocidad de entre 60 y 120 rpm

5§.- Procedimiento para la obtención de biomasa y/o sustancias de valor utilizables como aditivos para piensos a partir de cultivos embriogénicos de encina o alcornoque, según reivindicación 1§, caracterizado por que la fase e) comprende un sistema de cultivo de inmersión transitoria de 2 minutos de inmersión cada 4 horas durante alrededor de un mes y cultivando otro mes con 1 min de inmersión cada 8 horas.

6§.- Procedimiento para la obtención de biomasa y/o sustancias de valor utilizables como aditivos para piensos a partir de cultivos embriogénicos de encina o alcornoque, según reivindicación 1§, caracterizado por que contempla una fase adicional final de variación de la composición nutritiva en función de la especie, genotipo o línea embriogénica y estado de desarrollo, así como de la concentración de azúcares y la fuente de nitrógeno en el medio de cultivo.

7§.- Procedimiento para la obtención de biomasa y/o sustancias de valor utilizables como aditivos para piensos a partir de cultivos embriogénicos de encina o alcornoque, según reivindicación 1§, caracterizado por que el procedimiento es susceptible de realizarse en oscuridad.

8§.- Producto obtenido en la etapa de proliferación y escalado del procedimiento de la reivindicación 1§, caracterizado porque se materializa en un cultivo embriogénico granular o tipo sémola color amarillento, opaco, con hasta el 48% de proteína sobre la materia seca, 3020 mg/kg MS del aminoácido de interés GABA y hasta 12,31 g/kg de polifenoles.

9§.- Producto obtenido en la etapa de inmersión transitoria del procedimiento de la reivindicación 1§, caracterizado porque se materializa en embriones maduros con hasta 31% de proteína sobre la materia seca, aminoácidos como GABA y ORNITINA, y hasta 39,1 g/kg de polifenoles.