PT608716E - Aperfeicoamentos em ou relacionados com compostos organicos - Google Patents

Description

^efiô ^ (ÀAA^mma. - 1 -

DESCRIÇÃO "APERFEIÇOAMENTOS EM OU RELACIONADOS COM COMPOSTOS ORGÂNICOS" O presente invento relaciona-se com métodos aperfeiçoados de embriogénese somática apropriados para a regeneração da totalidade das plantas a partir de cultura tecidular e mais específicamente com métodos aperfeiçoados para a obtenção de embriões somáticos por meio de embriogénese somática usando meios líquidos per se.

Fundamentos A comercialização de um processo para utilizar de um modo eficaz a embriogénese somática é considerada desejável em relação a e economicamente mais atractiva do que, por exemplo, clonagem organogénica devido ao potencial para rendimentos mais elevados de plantas em intervalos de tempo comparativamente curtos. É sabido que certas células de plantas têm o potencial para se diferenciarem em plantas totais quando cultivadas em meios de cultura de tecidos de plantas apropriados. Esses meio compreendem, tipicamente, sais inorgânicos, uma fonte de carbono tal como sacarose, inositol, tiamina, etc. Exemplos de meios de cultura tecidulares de plantas habitualmente usados são os de Murashige and Skoog (meio MS), Lindsmaier and Skoog, por Gamborg (meio B5), etc. A composição desses meios de cultura de tecidos de plantas pode -2- ^ Cvw»—*- ser modificada a fim de optimizar o crescimento das células particulares de plantas utilizadas. Quase todas as células de plantas requerem hormonas de plantas, por exemplo auxinas ou compostos afins de auxina tais como ácido índole acético, ácido indole butírico, ácido naftaleno acético, ou 2,4-D, e/ou uma citocinina tal como benziladenina, zeatina, cinetina, etc. A fim de assegurar um crescimento óptimo pode também ser vantajoso adicionar vitaminas tais como ácido nicotínico, piridoxina ou outros componentes tais como leite de côco, hidrolisados de caseína, etc.

No passado, a formação de verdadeiros embriões somáticos requeria a utilização de material caloso (cicatricial) que compreende conglomerados não diferenciados de células tendo vacúolos muito grandes, células redondas tendo vacúolos muito pequenos, tal como o material primário de fase de crescimento a partir do qual embriões somáticos podem então ser derivados. Contudo, a utilização desse material como material de partida em embriogénese somática apresenta muitas desvantagens e provou ser de utilização limitada para a obtenção de grandes números de plantas tendo um fenotipo substancialmente semelhante e/ou sendo substancialmente uniformes no que se refere a nível de ploidia (grau de repetição do número básico de cromossomas). Plantas originadas a partir de tecido caloso têm tendencia a apresentar variação somaclonal e/ou não uniformidade no que se refere ao nível de ploidia. (Chaleff R. S. (1983) Science 219: 676-682; Larkin P. J. (1987) Iowa State Journal of Research 61 (4): 393-434; De Klerk G-J (1990) Acta Bot. Neerl. 39 (2): 129-144; Karp A. & Bright S.W.J. (1985) Oxford Surveys of Plant Molecular & Cell Biology 2: 199-234; Custers J.B.M. et al (1990) Acta Bot. Neerl. 39 (2): 153-161 (cucumis sativus L.); Kysely W. et al (1987) Plant cell Reports 6:305-308 (pisum sativum L.); Ezura H. (1992) Plant Science 85: 209-213 (cucumis melo); e Kivihaqu E. et al (1992) Plant Cell, Tissue, e Organ Culture 28: 187-194 (Ciclame persicum Mill)]. -3-

Exemplos conhecidos de pedidos de patentes utilizam material caloso na embriogénese somática. Um exemplo, WO 90/01058 para Plant Genetics Inc. descreve a utilização de material caloso para adquirir embriões somáticos ao investigar o efeito da utilização de uma ampla gama de auxinas sintéticas. Material caloso é formado ou feito crescer a partir de material de explante apropriado durante muitas semanas de cultura e/ou de subcultura em meios sólidos. A embriogénese somática é então iniciada transferindo tecido caloso para um meio contendo uma hormaona de planta tal como 2,4-D ou um seu análogo. Não é feita qualquer menção ao nível de ploidia de embriões somáticos, ou ao nível de ploidia de plantas obtidas. Embora a utilização de material caloso em embriogénese somártica possa ser útil para a obtenção de plantas em que a obtenção de variantes somaclonais possa ser interessante para o enriquecimento de uma reunião de genes disponíveis, é de pouca ajuda para comerciantes ou produtores de sementes que desejem simplesmente obter números comerciais de plantas que tenham todas substancialmente o mesmo genótipo.

Durzan and Gupta (in: "Biotechnology in agriculture", ed. A. Mizrahi, 1988, Alan R. Lies Inc, New York, pp 53-81) referem embriogénese somática e poliembriogénese em coníferas, envolvendo massas suspensoras de embriões (ESMs). É admitido que linhagens celulares de cenouras tenham sido clonadas a partir de microgrupos compostos por células meristemáticâs e estudadas quanto à sua capacidade para produzir embriões. (P. Coutos - Thevenot et al, Plant Cell Reports (1990) 8: 605-608).

Os autores referem a utilização de uma suspensão inicial de células a partir de hipocótilos de cenoura doméstica (estirpes Sl) num meio de cultura de -4- tecido compreendendo a auxina, 2,4-D, isolando grupos de células por filtração, resuspendendo dos grupos de células em meio de cultura de tecido de planta compreendendo 2,4-D a fim de aumentar a densidade da população do grupo, transferindo colónias de células de grupos isolados para uma placa de Petri compreendendo meio sólido de cultura de tecido de planta contendo 2,4-D e 1% de bacto-agar a fim de induzir a formação de colónia celular e seu depósito num segundo meio sólido contendo 2,4-D e 1% de bacto-agar em redor de um tecido caloso de estirpe progenitora Sl, dissociando cada colónia de células em meio de cultura de tecido de planta contendo 2,4-D e sub-cultivando as culturas assim obtidas em meio de cultura de tecido de cultura contendo 2,4-D. A análise subsequente das linhagens celulares obtidas de acordo com este processo revelaram que 13 de entre 40 linhagens celulares eram embriogénicas, mas a maior parte destas linhagens tinham perdido o seu potencial embriogénico com o passar do tempo. Apenas uma linhagem celular apresentou um potencial embriogénico bastante constante durante um período de tempo mais longo. De acordo com análise citométrica de fluxo a última linhagem foi diplóide. O presente invento proporciona um método para a obtenção de embriões somáticos em cultura em suspensão que é tecnicamente simples. Não requere i.a. a deposição de linhagens celulares em redor do calo progenitor. O método do invento permite, consequentemente, a produção de embriões somáticos numa escala comercial. Os embriões somáticos de acordo com o invento são capazes de ser usados para proporcionar quantidades comerciais de plantas tendo subatancialmente o mesmo genótipo.

Até agora, a embriogénese somática tem sido indicada como um instrumento potencialmente poderoso na obtenção de plantas, contudo, as impraticabilidades da utilização de embriogénese somática a partir de material caloso impediram a exploração com sucesso da tecnologia. -5-

Verifícou-se actualmente, de um modo surpreendente, que quantidades comerciais de embriões somáticos verdadeiros podem ser obtidas através da utilização de técnicas de cultura líquida per se e sem a necessidade de utilizar meios sólidos e/ou tecido caloso. Verificou-se também que é possível aumentar a biomassa de PEMs em meios líquidos e assim a capacidade para produzir a partir delas embriões somáticos em quantidades comerciais. A utilização dessas técnicas de cultura líquida evita a necessidade de utilizar passos de cultura de calo/sub-cultura de calo e proporciona pela primeira vez um meio para a obtenção de populações de embriões somáticos que são uniformes no que se refere a nível de ploidia. O presente invento proporciona um método para a obtenção de embriões somáticos por meio de embriogénese somática a qual reduz substancialmente ou elimina o risco da obtenção de variantes somaclonais. O presente invento proporciona culturas em suspensão de embriões somáticos não-Daucus em que o nível de ploidia de embriões somáticos nelas contidos é substancialmente uniforme.

Numa apresentação, o método do invento proporciona ainda plantas tendo uma ploidia substancialmente uniforme (por exemplo plantas diplóides ou plantas tetraplóides) derivadas a partir de culturas em suspensão de embriões somáticos tendo substancialmente o nível de ploidia desejado. O invento proporciona um meio mais confiável para a obtenção de embriões somáticos verdadeiros em quantidades comerciais a partir de material de explante que não se baseia na utilização de tecido caloso e/ou utiliza meios sólidos como elementos essenciais dos referidos meios. -6-

Estes e outros objectivos do invento tomar-se-ão aparentes a partir da leitura da descrição e exemplos que se seguem.

Descrição Detalhada O invento proporciona um método para a promoção de formação de massa embriogénica (PEMs) a partir de material de explante em que as PEMs são capazes de dar origem a embriões somáticos viáveis, caracterizados pelo facto de tecido de planta não caloso ser posto em contacto com um meio de cultura líquido de tecido de planta incluindo uma quantidade eficaz de uma auxina ou mistura de auxinas.

Promoção de formação de massa pro-embriogénica (PEMs) significa que a formação de PEMs pode ser induzida e/ou a biomassa de PEMs pode ser aumentada. O material de explante utilizado pode ser de espécies de plantas dicotilédoneas ou monocotilédoneas. De preferência, o material de explante é derivado de uma espécie de planta dicotiledónea. De um modo típico, os embriões somáticos são derivados de massas pro-embriogénicas (PEMs), estruturas que são morfologicamente distintas do material caloso e que são também conhecidas como grupos meristematicos. As PEMs apresentam o mesmo nível de ploidia ou mesmos níveis de ploidia que o material de explante a partir do qual derivam. Assim, quando material de explante compreendendo células diplóides e tetraplóides é retirado de uma planta diplóide, PEMs diplóides e tetraplóides dela resultante poderão ter que ser separados por passagem por crivo, separação de células, etc., antes de posterior cultura em meio líquido. PEMs compreendem tecido de planta em crescimento substancial- -7-

mente diferenciado e podem ser encaradas como precursores de embriões somáticos, verdadeiros. Em microscopia óptica (ampliação de x 40 a x 100) as PEMs aparecem como conglomerados de células ricas em citoplasma, redondas, pequenas, compreendendo pequenos vacúolos. Como tal as PEMs do presente invento podem ser encaradas como sendo substancialmente idênticas em termos genéticos às células de plantas antepassadas a partir das quais são derivadas e por último dão origem a verdadeiros embriões somáticos, embriões esses que são reconhecíveis como sendo bipolares, isto é, tendo a capacidade de dar origem a raizes e a rebentos a partir de tecidos meristematicos de raizes e de rebentos. Assim, um verdadeiro embrião somático viável é também um que possa dar origem a pelo menos uma planta pequena que seja substancialmente idêntica, do ponto de vista genético, ao material celular progenitor do explante a partir do qual derive, quando submetido a posteriores tratamentos apropriados tal como os que são habitualmente utilizados nesta técnica.

Material de tecido de planta apropriado para utilização no método do invento é material de explante que pode ser obtido a partir de qualquer orgão da planta ou de uma sua parte ou de outro tecido de planta apropriadamente diferenciado por exemplo protoplastos. Esse tecido pode ser seleccionado a partir do grupo compreendendo caule, folha, pétala, corte de hipocótilo, meristema apical, ovários, embrião zigótico per se, tubérculo, feixe vascular, periciclo, filamento de antera, etc. De um modo alternativo, um material de explante apropriado pode ser o embrião somático per se. O tecido da planta pode ser recolhido a partir de qualquer espécie de planta de interesse e inclui tecido de planta seleccionada de entre plantas monocotiledóneas e de plantas dicotile-dóneas. Uma selecção de tipos de plantas de interesse pode ser encontrada no Handbook for Seedling Evaluation, J. Bekendam and R. Grob, ISTA, Zurich, Switzerland 1979 nas páginas 28 - 29 e ainda exemplificada nas páginas do índice 122 - 126, aqui incorporados como referência. Tipos de plantas preferidas -8- incluem as seleccionadas a partir do grupo compreendendo Ciclames, Cucúrbitas, Licopérsicos, de preferência Licopérsicos de mesa ou comestíveis, Alios, Begónias, Betas, Prímulas, Brássicas, Cápsicos, Cicórios, Gerberas, Impaciens, Lactucas, Orizas, Pelargónios, Petúnias, Violas, e Zeas. Mais preferidos são tipos de plantas seleccionadas de entre o grupo compreendendo Ceclames, Cucúrbitas, Betas tais como Beta vulgaris (beterrabas sacarinas), Brássicas tais como B. oleracea ou B. napus, Violas, Pelargónios, e Cápsicos. O meio de cultura líquido de tecido de planta apropriado para utilização no método do invento pode ser qualquer meio de cultura líquido de tecido de planta que seja apropriado para a indução e/ou promoção de embriogénese. Exemplos de meios básicos habitualmente utilizados nesta técnica incluem meio B5 Gamborg's (B5), meio Murashige and Skoog (MS), e suas variantes. O presente invento contempla que uma quantidade suficiente de auxina capaz de induxir formação de PEMs seja adicionada a um meio de cultura líquido apropriado contendo explante ou outro material de partida apropriado numa fase de indução inicial, e que após essa fase de indução inicial, um outro meio de cultura líquido apropriado capaz de promover crescimento de PEMs e multiplicação é utilizado em que concentração(ões) de auxina(s) sejam reabastecida(s) com intervalos apropriados. É consequentemente vantajoso monitorizar a concentração de auxina ao longo do tempo, usando por exemplo técnicas de HPLC padronizadas conhecidas nesta técnica a fim de assegurar que o estádio de desenvolvimento da suspensão seja fixada no intervalo de PEMs. É também importante não adicionar demasiada quantidade de auxina(s) ao meio de cultura de tecido de planta a fim de evitar possíveis efeitos secundários tóxicos da(s) auxina(s) e manter ainda as PEMs num estado viável. -9- O meio de cultura líquido de tecido de planta para crescimento e multiplicação de PEMs pode ser a fase inicial de indução de meio de cultura de tecido de planta em que a concentração de auxina e/ou de outros componentes essenciais seja simplesmente reabastecida com intervalos apropriados de modo a que as fases de indução e de promoção de embriogénese sejam capazes de ter lugar; o meio da fase de indução inicial pode também ser substituído por meio de cultura recente de cultura de tecido contendo concentrações apropriadas de auxina em intervalos apropriados, pelo que o meio de cultura líquido de tecido de planta pode ser o mesmo ou diferente do apropriado mas diferente do meio de cultura líquido de tecido de cultura inicialmente utilizado. Assim, pode ser apreciado que os actuais tipos de meio ou de meios de cultura de tecido de planta utilizados não são de importância crítica para o invento contanto que sejam líquidos e capazes de serem utilizados na indução e/ou promoção de formação de PEMs na presença de concentração apropriada de auxina.

Poderá também ser rapidamente apreciado que a concentração necessária de auxina irá variar de espécie de planta para espécie de planta e que poderá variar de variedade de planta para variedade de planta. O tipo e concentração de auxina que origina os resultados optimos para uma dada variedade, podem ser determinados por meio de testes padrão. Dependendo da variedade de planta poderá ser vantajoso utilizar uma mistura de auxinas. Exemplos de auxinas e de compostos afins de auxina apropriados para utilização no método do invento incluem ácido indole acético, ácido índole butírico, ácido naftaleno acético e suas misturas. O nível de auxina é mantido a uma concentração tal que promova o crescimento e formação de PEMs. A concentração de auxina é de preferência mantida a uma concentração variando entre cerca de 0,1 mg/1 e cerca de 30 mg/1 dependendo dos números ou biomassa de PEMs e da espécie de planta em questão. Uma mistura - 10- apropriada de auxinas pode incluir NAA e 2,4-D em concentrações apropriadas. A concentração eficaz de auxina de ácido naftaleno acético (NAA) situar-se-á, em geral, entre cerca de 0 - 20 mg/1 e a de 2,4-D situar-se-á entre cerca de 0,1 mg/1 e cerca de 10 mg/1, dependendo da espécie de planta em questão. Por exemplo, PEMs de ciclame não requerem a presença de NAA mas requerem a presença de 2,4-D numa concentração inicial de cerca de 5-10 mg/1; verificou-se que PEMs de licopérsico requerem NAA numa concentração inicial de 20 mg/1 e 2,4-D numa concentração inicial de 1 mg/1.

Dependendo da variedade de planta e do meio de cultura de tecido de planta utilizado, poderá ser vantajoso adicionar uma quantidade não-fitotóxica de citocinina ao meio contendo auxina a fim de facilitar a fixação de auxina. O invento também proporciona um método para a obtenção de embriões somáticos com um nível de ploidia substancialmente igual em cultura em suspensão que compreende: i) Cultura de material de explante em contacto com um meio de cultura líquido de tecido compreendendo uma quantidade eficaz de auxina ou mistura de auxinas suficiente para promover a indução de formação de massa pro-embriogénica (PEMs); ii) Multiplicação do número de PEMs obtidas em i) em contacto com um meio de cultura líquido de tecido de planta contendo auxina apropriada; iii) Colheita de PEMs obtidas em ii) e colocando-as em contacto com um meio líquido substancialmente sem auxina; iv) Colheita de embriões derivados das PEMs produzidas em iii). - 11 -

Passos i) e ii) deste método foram discutidos aqui anteriormente. Podem por exemplo ser realizados como se segue:

Material de explante é colocado num meio líquido apropriado, tal como meio B5 ou meio MS, contendo uma auxina ou uma mistura de auxinas numa concentração de cerca de 0,1 mg/1 a cerca de 30 mg/1 dependendo da espécie em questão, e que é eficaz para a indução da formação de PEMs. O material de explante é cultivado a uma densidade apropriada variando entre cerca de 0,01 gramas em peso recente/1 e cerca de 100 gramas em peso recente/1 de cultura, de preferência entre cerca de 1,0 grama em peso recente/1 e cerca de 10 gramas em peso recente/1 durante um período de tempo medido em semanas, e durante esse período de tempo aparecem as PEMs. O período de tempo pode situar-se entre cerca de 2 semanas e cerca de 14 semanas ou mais, tipicamente entre cerca de 4 semanas e cerca de 8 semanas, dependendo da espécie de planta em questão. De um modo típico, PMEs obtidas são separadas da cultura inicial do material de explante, por exemplo, através de diluição do meio ou substituição do meio e posteriormente cultura num meio líquido recente igual ou semelhante.

As PMEs obtidas são capazes de entrar numa fase de crescimento ou de multiplicação imediatamente em condições ambientais iguais ou semelhantes às requeridas para indução de formação de PEMs. Por razões de conveniência, esta fase é aqui referida como uma fase de multiplicação visto aumentos nos números de PEMs ou na massa de PEMs serem monitorizados e se verificar que crescem.

Após observação de indução de formação de PEMs o meio de cultura líquido de tecido de planta é monotorizado de modo a que a concentração de auxina seja mantida a um nível suficiente para promover crescimento e - 12-

multiplicação de PEMs sem desenvolvimento significativo de PEMs. A fase de multiplicação pode envolver sub-cultura em diluições regulares de meio de cultura líquido de tecido de planta de escolha de modo a que os níveis de auxina sejam controlados a um nível suficiente para promover multiplicação de PEMs durante um intervalo de tempo apropriado. De um modo alternativo, PEMs podem ser separadas a partir da cultura inicial do material de explante e colocadas num meio de cultura de tecido de planta contendo auxina sendo-lhes permitido multiplicarem-se até uma biomassa de PEMs desejada utilizando lotes de alimento ou um sistema de cultura contínuo. De um modo típico, isto envolve a manutenção da concentração de auxina acima de um nível de cerca de 0,1 mg/1 durante um certo período de tempo. O período de tempo para a fase de multiplicação pode ser medido em anos dependendo de quantas PEMS são necessárias para conversão em verdadeiros embriões somáticos, contudo, usualmente, a fase de multiplicação é medida em meses ou semanas, ou seja entre cerca de 2 e cerca de 30 semanas dependendo da quantidade de biomassa de PEMs requerida. Uma vez na fase de multiplicação PEMs podem ser recolhidas em qualquer altura para colocação em meio de cultura de tecido de planta substancialmente sem auxina onde podem continuar a desenvolver-se até à obtenção de embriões somáticos verdadeiros. Isto pode envolver passagem por crivo tal como é aqui descrito, isto é, seleccionando fracções de PEMs de um certo tamanho que possam passar através de crivos com tamanhos apropriados, (por exemplo um crivo com um tamanho de poros de 150 pm) mas que sejam retidas num crivo com poros mais pequenos (por exemplo um crivo com um tamanho de poros de 100 Mm). A formação e multiplicação de PEMs é influenciada de um modo vantajoso por suplementação de uma fonte energética de carbono apropriada, convenientemente um hidrato de carbono solúvel tal como sacarose, glucose ou rafinase, ao meio de cultura líquido de tecido de planta. - 13- «***»

Concentrações típicas de hidrato de carbono situam-se entre 15 g/1 e 90 g/1, de preferência entre 20 g/1 e 60 g/1 de meio de cultura de tecido de planta. A fase de multiplicação pode ser realizada nos frascos ou num biorreactor. Biorreactores são conhecidos na técnica para cultura de suspensões de células para a produção de metabolitos celulares secundários, contudo, a utilização de biorreactores para a cultura de PEMs não foi, até agora, descrita. Verificamos que biorreactores podem ser úteis na produção de grande número de PEMs em intervalos de tempo relativamente curtos.

Por razões de conveniência, volumes de células embaladas a partir de culturas em suspensão são inoculados num meio apropriado contendo uma quantidade suficiente de uma fonte de energia de carbono apropriada, tal como, por exemplo, sacarose, glucose e rafinose a entre cerca de 15 g/1 e até cerca de 90 g/1 ou mais, de preferência entre cerca de 20 g/1 e cerca de 60 g/1, dependendo da espécie de PEMs em questão, num biorreactor apropriado. Preil W. and Beck A. [(1991) Acta Horticulturae 289, Plant Technology: 179-192] descrevem embriogénese somática em biorreactores usando vibromisturadores, contudo, não existe qualquer indicação nesse estudo da formação e multiplicação de PEMs serem realizadas antes do desenvolvimento de PEMs em embriões somáticos. Verificou-se que a utilização de vibromisturadores em biorreactores em culturas em suspensão de PEMs aumenta de um modo significativo a duração da vida de PEMs ao longo do tempo, ajuda a aumentar a biomassa de PEMs, reduz a perda de biomassa de PEMs e evita o amontoamento de PEMs. Um vibromisturador equipado com uma placa de mistura perforada ou com disco de agitação (fornecido por Applikon BV, The Netherlands and Chemap AG, Switzerland, respectivamente) colocado num plano fixo num biorreactor e deixado a vibrar de um modo substancial nesse plano fixo originou culturas em suspensão de PEMs sendo misturadas ou agitadas sem perda significativa de biomassa de PEMs. - 14-

De preferência, o vibromisturador é feito vibrar no plano substancialmente vertical. Uma frequência típica de operação de um vibromisturador para utilização no método do invento é de 50 Hz; a amplitude situa-se, convenientemente na ordem de ± 6 mm ou menos. Uma vez atingida uma biomassa de PEMs que seja capaz de dar origem a um número desejado de embriões somáticos,as PEMs podem ser postas em contacto com um meio líquido de cultura de tecido de planta substancialmente livre de auxina em que sejam capazes de se desenvolver em embriões somáticos. A suspensão de PEMs é vantajosamente arejada. Isto pode ser efectuado de um modo conhecido per se. Quando é utilizado um vibromisturador, o ar pode, por exemplo, ser aspergido para o vibromisturador do reactor utilizando um dispositivo de aspersão poroso.

Conclui-se a partir do que foi acima referido e a partir dos exemplos que as condições óptimas para os vários parâmetros tais como o tipo e concentração de auxinas, a presença de uma citocinina, a fonte de energia (hidrato de carbono), a frequência de agitação ou de vibração, o fornecimento de oxigénio, a intensidade e o comprimeto de onda da luz irão variar dependendo do material de planta utilizado. Essas condições óptimas podem ser determinadas utilizando testes padrão (tal como é ilustrado nos exemplos).

Os passos subsequentes iii) e iv) do método de obtenção de embriões somáticos de acordo com o invento, podem ser realizados como se segue: A promoção de desenvolvimento de PEMs em embriões somáticos pode ser conseguida colocando as PEMs num meio de cultura de tecido de planta sem auxina. As PEMs viáveis são capazes de desenvolver-se em embriões somáticos. Antes da transferência para um meio sem auxina, as PEMs são - 15- vantajosamente feitas passar por um crivo, por exemplo através de uma malha de nylon, a fim de seleccionar o tamanho da fracção de PEMs que origina, do modo mais eficiente, os embriões somáticos desejados. Um conteúdo demasiadamente elevado de PEMs não viáveis irá inibir a formação de embriões somáticos. Em geral é desejável utilizar PEMs compreendendo pelo menos 5%, de preferência pelo menos 10%, com maior preferência pelo menos 15% de PEMs viáveis. O tamanho óptimo da fracção pode ser determinado por meio de testes de avaliação padrão.

As PEMs de um tamanho seleccionado podem ser recolhidas, por exemplo, por meio de passagem por crivo ou por qualquer outro meio de separação nesta técnica. O destinatário especializado irá apreciar que o tamanho de PEMs com um tamanho desejável (isto é a fracção de PEMs tendo um elevado^ conteúdo de PEMs viáveis) irá variar de espécie para espécie tal como é aqui descrito detalhadamente.

Uma fracção de PEMS feita passar por crivo é uma fracção que é obtida fazendo passar as PEMs através de meios de filtração tais como malhas de rede com um tamanho de poros conhecido, por exemplo uma malha de nylon para que se obtenham PEMs com uma determinada variação de tamanho. As PEMs podem ter qualquer tamanho até cerca de 1 mm de diâmetro dependendo da espécie da planta, contudo agregados de PEMs podem ter um diâmetro indo até 5 mm. Falando de um modo geral, o tamanho desejável de PEMs individuais situa-se na ordem dos pm. Verificou-se que o tamanho das PEMs é de importância crítica para a obtenção de embriões somáticos simples delas derivados. De preferência, uma fracção de PEMs recolhida é uma fracção em que cada PEMs é capaz de dar origem a um embrião somático em condições apropriadas. Naturalmente, o tamanho da fracção particular, viável, de PEMs feita passar por crivo, varia de espécie de planta para espécie de planta. Por - 16- exemplo a fracção de PEMs mais útil para pepino é a fracção em que o tamanho das PEMs se situa entre cerca de 100 μτη e cerca de 150 μτη; a fracção de PEMs para cíclame entre cerca de 150 pm e cerca de 300 pm. De preferência, a fracção de PEMs é uma fracção em que cada PEMs é capaz de dar origem a pelo menos um embrião somático, de preferência a um embrião somático simples. O meio de cultura de tecido de planta substancialmente livre de auxina é um meio que seja capaz de permitir que PEMs se desenvolvam em embriões somáticos. Assim é tomado em consideração que o meio de cultura de tecido de planta líquido substancialmente livre de auxina poderá ser um meio de cultura de tecido de planta esvaziada de auxina em que níveis residuais de auxina podem estar presentes embora esses níveis de auxina, no caso de existirem, não interferirem de um modo substancial com o desenvolvimento de PEMs dando origem a embriões somáticos, ou poderá ser um meio de cultura de tecido de planta sem auxina. Naturalmente, o destinatário especializado irá tomar em consideração que o meio de cultura de tecido de planta substancialmente livre de auxina poderá ser colocado quer num frasco quer num biorreactor apropriado, por exemplo um que esteja equipado com um vibromisturador dependendo de quantos embriões somáticos são desejados. Embriões somáticos obtidos podem então ser convertidos em plantas usando métodos conhecidos nesta técnica. Assim, monitorizando a biomassa de PEMs é possível atingir grandes números de embriões somáticos em quantidades comerciais. O meio sem auxina compreende, de um modo conveniente, uma fonte de energia de hidratos de carbono solúveis numa concentração variando entre 15 g/1 e 90 g/1, de preferência entre 20 g/1 e 60 g/1. Fontes de energia de hidratos de carbono apropriadas incluem sacarose, glucose e rafmose.

Quantidades comerciais de embriões somáticos podem variar de

valor desde algumas centenas (por exemplo 500), até vários milhões (por exemplo 3.000.000) ou mais dependendo das necessidades do cliente. Por exemplo, se forem necessárias cerca de 200.000 plantas, a multiplicação de PEMs será continuada até se atingir uma biomassa de PEMs que seja substancialmente capaz de dar origem a cerca de 200.000 embriões somáticos. Essas PEMs são então colocadas em contacto com meio de cultura líquidode tecido de planta sem auxina onde se podem desenvolver até embriões somáticos.

Quando verdadeiros embriões somáticos se desenvolvem no meio de cultura de tecido de planta substancialmente livre de auxina, eles poderão ser separados da meio de cultura de tecido de planta sem auxina e convertidos em plantas usando técnicas habitualmente utilizadas nesta técnica.

Os embriões somáticos são convenientemente separados das PEMs não viáveis antes da utilização comercial. Isto pode ser realizado de um modo conhecido per se. As PEMs não viáveis são em geral mais pequenas que os embriões somáticos. Os embriões somáticos podem, por exemplo, ser isolados manualmente, por passagem por crivo ou por separação de células. O método do invento proporciona lotes de embriões somáticos compreendendo embriões somáticos que apresentam substancialmente, todos eles, o mesmo nível de ploidia. Lotes de embriões somáticos podem compreender entre várias centenas e dezenas de milhares ou mais dependendo das necessidades comerciais. De preferência, lotes de embriões somáticos compreendem embriões somáticos substancialmente diplóides ou embriões somáticos substancialmente tetraplóides. Um lote de embriões somáticos pode ser simplesmente uma suspensão de embriões somáticos a partir da qual meios líquidos tenham sido drenados em que os embriões somáticos são colocados num recipiente apropriado. O meio ambiente do recipiente pode ter uma humidade relativamente elevada - 18- por exemplo 100%, e pode ser mantido a uma temperatura apropriadamente baixa acima de 0o C, até cerca de 15° C. Embriões somáticos armazenados deste modo podem ser mantidos durante até cerca de 4 dias. De um modo alternativo, os embriões somáticos podem ser submetidos a um processo de secagem, congelados, transformados em pílulas, encapsulados num gel, etc. O método do invento proporciona ainda culturas em suspensão de embriões somáticos diferentes de Daucus, compreendendo embriões somáticos tendo substancialmente todos o mesmo nível de ploidia. Embriões somáticos preferidos são diplóides ou tetraplóides. Os embriões somáticos são derivados de material de explante dicotiledóneo ou monocotiledóneo.

Seguem-se agora exemplos ilustrativos do invento. Deve ser tomado em consideração que os exemplos não devem, de modo algum, ser considerados como sendo limitativos do âmbito do invento.

Exemplo 1; Início de Culturas de Células de Ciclame Embriogénicas e de Embriões Somáticos a partir delas

Sementes da variedade de Ciclame " Concerto Scarlet ” (Sluis and Groot) são esterilizadas à superfície com etanol a 70% (durante 2 minutos) e com uma solução a 1,5% de hipoclorito de sódio (durante 45 minutos), sendo em seguida lavadas minuciosamente com água esterilizada (3 x). As sementes são germinadas em papel húmido durante entre 2-4 semanas a 23° C, e o tubérculo que emerge é usado como material de explante. Três tubérculos são cultivados em 10 ml de meio B5 básico (comercialmente disponível a partir de Duchefa Biochemie BV, Haarlem, The Netherlands), suplementado com 20 g/1 de sacarose, 10 mg/1 2,4-D, 100 mg/1 de myo-inositol, 1,0 mg/1 de ácido nicotínico, 1,0 mg/1 de HC1 de piridoxina, 10 mg/1 de HC1 de tiamina num agitador rotativo (agitador giro-rotativo G10, New Brunswick Scientific, Edison, N.J. USA) a 100 - 19- MOVn k. rpm no escuro, a 23° C. Após 7 dias o meio é substituído com meio recente. Após mais 7 dias, a cultura é diluída (5 x) até um volume de 50 ml com meio recente. Após mais 7 dias as medulas centrais compreendendo feixes vasculares e periciclo do material de explante de tubérculo a partir da cultura diluída são separadas do material de explante do tubérculo e são sub-cultivadas à parte do resto dos tubérculos em 25 ml de meio B5 básico suplementado com 20 g/1 de sacarose, 100 mg/1 de myo-inositol, 1,0 mg/1 de ácido nicotínico, 1,0 mg/1 de HC1 de piridoxina, 10 mg/1 de HC1 de tiamina, 5 mg/1 de 2,4-D, e 1 mg/1 de cinetina. As sub-culturas são diluídas semanalmente duas vezes, durante 4 semanas. Massas pro-embriogénicas aparecem mais ou menos às 4 semanas. PEMs são multiplicadas por meio de sub-cultura posterior tal como foi acima descrito durante um período de 2 semanas. As PEMs são capazes de se desenvolver dando origem a verdadeiros embriões somáticos por posterior cultura em meio B5 sem auxina e sem citokinin, suplementado com 20 g/1 de sacarose, 100 mg/1 de myo-inositol, 1,0 mg/1 de ácido nicotínico, 1,0 mg/1 de HC1 de piridoxina, 10 mg/1 de HC1 de tiamina.

Exemplo 2 : Início de Culturas em Suspensão de Células de Ciclame Embriogénicas e Embriões Somáticos a partir delas.

Sementes de Ciclame (cv Concerto Scharlaken Othello, de Zaadunie BV) são esterilizadas à superfície com etanol a 70% (durante 2 minutos) e solução de hipoclorito de sódio a 1% (durante 45 minutos) e lavadas minuciosamente com água esterilizada (3 x). As sementes são germinadas em papel húmido durante entre duas e cinco semanas no escuro a 23° C. Tubérculos emergidos são usados como material de explante e cortados em entre duas e oito porções. O nível de ploidia do material de explante é medido de acordo com os ensinamentos de De Laat A.A.M. et al (1987) Plant Breeding 99: 303-307, e verifica-se ser diplóide. -20- O material de explante a partir de três tubérculos é cultivado em 10 ml de meio B5 básico (Duchefa Biochemie BV, Haarlem, The Netherlands) suplementado com sacarose a 20 g/1, ácido 2,4-diclorofenoxiacético a 5 mg/1, e cinetina a 1 mg/1 num frasco de 50 ml num agitador rotativo (100 rpm) no escuro e a uma temperatura de 23° C. Todos os frascos são cobertos com folha de alumínio. Após uma semana a cultura é diluída cinco vezes com meio B5 básico suplementado com 20 g/1 de sacarose, 5 mg/1 de 2,4-D, 100 mg/1 de mjyo-inositol, 1,0 mg/1 de ácido nicotínico, 1,0 mg/1 de HC1 de piridoxina, 10 mg/1 de HC1 de tiamina e 1 mg/1 de cinetina até um volume de 50 ml num frasco de 250 ml. Após mais duas semanas a cultura contem PEMs que são separadas do resto da cultura com uma pipeta tendo um bocal amplo, e cultivadas separadamente. As PEMs são identificadas visualmente como aglomerados de células consistindo essencialmente em células citoplásmicas, redondas, pequenas. Neste estádio as PEMs são identificadas como simples aglomerados de células ou como um certo número de aglomerados de células ligadas umas às outras. As culturas são subcultivadas de duas em duas semanas por inoculação de 1 ml de células embaladas em meio B5 básico suplementado com 20 g/1 de sacarose, 5 mg/1 de 2,4-D, 100 mg/1 de /wyo-inositol, 1,0 mg/1 de ácido nicotínico, 1,0 mg/1 de HC1 de piridoxina, 10 mg/1 de HC1 de tiamina e 1 mg/1 de cinetina até se obter um volume final de 50 ml, num frasco de 250 ml usando uma pipeta tendo um bocal amplo. O volume de células embaladas (PCV), isto é a massa celular total após centrifugação para PCVinjcjai e PCVfinai é determinada centrifugando amostras a partir de culturas durante 2 minutos, a 700 x g. A linhagem de células embrionárias cresce geralmente com um tempo duplicado de entre 4 a 6 dias tal como é calculado a partir de medições de PCViniciai G PCV^i usando a fórmula de Schlegel, H.G. (1981) Allgemeine Microbiologie, Thieme, Stuttgart, página 190. A linhagem de células embriogénicas obtida deste modo é mantida durante pelo menos 45 semans e é geneticamente estável, isto é o nível de ploidia é diplóide, igual ao do material de explante original. -21 -

ãátawaw-j «h

As PEMs são seleccionadas fazendo passar por crivo a cultura de PEMs através de malhas de nylon tendo um tamanho de poro de 250 pm e de 100 pm respectivamente. Oito dias após a subcultura é atingido o número mais elevado de PEMs/ml. Esta fracção dá origem a desenvolvimento embrionário óptimo e ao número mais elevado de embriões por PCV da cultura de PEMs. O número de PEMs feitas passar por crivo varia geralmente entre 1.000 e 5.000 PEMs/ml PCV.

Após passagem por crivo, as PEMs são lavadas e inoculadas para meio de desenvolvimento, isto é meio MS ou B5 suplementado com sacarose ou glucose até uma concentração de 174 mM. 25 a 50 PEMs são cultivadas num frasco selado com folha de alumínio e nescofilm (Bando Chemicals Ind. LTD, Japan). Após três a quatro semanas são formados embriões com o formato de torpedo que se assemelham a embriões zigóticos. Usando este método são produzidos 250.000 embriões. Utilizando técnicas de análise citométricas de fluxo tal como é descrito por De Laat A.M.M. supra numa amostra aleatória da cultura de embriões, é avaliado o conteúdo de DNA de 500 embriões somáticos. Verificou-se que todos os embriões eram diplóides. A conversão (isto é a germinação) de embriões de cíclame compreende formação de tubérculos seguida por formação adventícia de raízes e é induzida cultivando os embriões num meio líquido isto é meio MS ou B5 tendo um conteúdo de glucose ou de sacarose de cerca de 116 mM ou de 59 mM respectivamente. A formação de tubérculos é definida como o desenvolvimento a partir do hipocótilo de um tubérculo ou de uma estrutura afim do tubérculo. Posterior desenvolvimento do cotilédone formando a primeira folha pode ocorrer quer em meio líquido quer em meio sólido tal como perlite, solo esterilizado, etc.

Embriões convertidos são semeados directamente em perlite ou em -22- "eãbta solo para vasos, em condições de esterilidade (na presença de uma fonte de carbono) ou em condições de não esterilidade (sem adição de fonte de carbono) e apresentam formação de cotilédone após duas a quatro semanas no escuro a de 18° a 20° C. É utilizada uma humidade relativa elevada de cerca de 90%. Mais de 90% dos embriões convertem-se no estádio de cotilédone em condições de esterilidade. Uma vez aparecido o cotilédone pequenas plantas resultantes são colocadas à luz e endurecidas antes de serem transferidas para a estufa.

Exemplo 3 : Iniciação de Culturas de Células de Tomate Embriogénicas

Sementes da variedade de tomate " Manhattan " (Sluis and Groot) são esterilizadas à superfície com etanol a 70% (durante 2 minutos) e com uma solução a 1,5% de hipoclorito de sódio durante 15 minutos sendo em seguida lavadas minuciosamente com água esterilizada (3 x). As sementes são germinadas em papel humidificado durante 3 dias a uma temperatura de 23° C. Plantas pequenas completas são recolhidas, e cada pequena planta é cortada em 4 porções as quais são então usadas como material de explante. 10 pequenas plantas são cortadas deste modo e são incubadas em 15 ml de meio B5 básico líquido (comercialmente disponível a partir de Duchefa Biochemie BV, Haarlem, The netherlands) suplementado com sacarose a 20 g/1, 20 mg/1 de NAA, 1 mg/1 2,4-D, 1 mg/1 de cinetina, 100 mg/1 de «ryo-inositol, 1 mg/1 de ácido nicotínico, 1 mg/1 de HC1 de piridoxina, e 10 mg/1 de HC1 de tiamina num agitador rotativo a 100 rpm a 23° C durante um período cíclico de 16 horas de luz e de 8 horas de escuridão. O meio de cultura é monitorizado quanto a concentração de auxina usando técnicas HPLC conhecidas nesta técnica. Quando a concentração de auxina cai para menos de 0.1 mg/1, após cerca de 7 dias, 15 ml de meio B5 básico recente (comercialmente disponível a partir de Duchefa Biochemie BV, Haarlem, The Netherlands) suplementado com sacarose a 20 g/1, 20 mg/1 de NAA, 1 mg/1 de 2,4-D, 1 mg/1 de cinetina, 100 mg/1 de m^o-inositol, 1 mg/1 de ácido nicotínico, 1 mg/1 de HC1 de piridoxina, e 10 mg/1 de HC1 de tiamina são -23 -

adicionados para levar o volume até 30 ml de cultura. Esta cultura é sub-cultivada de 4-7 em 4-7 dias permitindo que o material de explante e as células sedimentem (assentem) durante 15 minutos e refrescando a cultura retirando 15 mis de meio usado e enchendo novamente com 15 mis de meio recente. Após cerca de 4-7 semanas após a cultura inicial de material de explante são observadas massas pro-embriogénicas (PEMs). As PEMs são multiplicadas sub-cultivando posteriormente tal como foi acima descrito durante um período de 2 semanas. As PEMs são em seguida sub-cultivadas em meio básico B5 sem auxina suplementado tal como foi acima referido excluindo NAA, 2,4-D e cinetina sendo observados verdadeiros embriões somáticos.

Exemplo 4 : Iniciação de Culturas de Células de Tomate Embriogénicas

Sementes da variedade de tomate " Majorca " (Sluis and Groot) são esterilizadas à superfície com etanol a 70% (durante 2 minutos) e com uma solução a 1,5% de hipoclorito de sódio durante 15 minutos sendo em seguida lavadas minuciosamente com água esterilizada (3 x). As sementes são germinadas em papel humedecido durante 7 dias a uma temperatura de 23° C no escuro. Cotilédones são colhidos e cortados em porções que são usadas com material de explante. 6 cotilédones de 3 pequenas plantas são cortados deste modo e são incubados em 15 ml de meio A líquido (ver Quadro 1) suplementado com 4 mg/1 de 2,4-D e 0,5 mg/1 de cinetina num agitador rotativo a 100 rpm a 23° C no escuro. Após 14 dias, são adicionados 35 ml de meio A recente (ver Quadro 1) incluindo hormonas tal como foi acima descrito. A cultura é sub-cultivada de 14 em 14 dias diluindo 2 x em meio A recente (ver Quadro 1), suplementado com hormonas tal como foi acima referido. Cerca de 4 semanas após a cultura inicial de material de explante são observadas PEMs. As PEMs são multiplicadas por meio de posterior sub-cultura tal como foi acima referido. -24-

Ouadro 1: Composição de meio A Macro elementos NH4NO3 (NH4)S04 kh2po4 kno3 MgCl2.6H20 CaCl2 Ácido Cítrico Sacarose g/i 1,20 0,66 0,55 1,01 0,30 0,22 0,5 20

Micro elementos 2 ml de solução de caldo/1 Vitaminas Gamborg (1 mg/1) 1 ml de solução de caldo/1 pH ajustado para 5,8 usando KOH (1 M).

Micro elementos (Solução de caldo) g/»

FeS04.7H20 CuS04.5H20 CoC12.6H20 MnCl2.4H20 NaMo04.2H20 Kl HB03 ZnS04.7H20 NiS04.6H20 ácido cítrico 6,9 0,65 0,12 2,97 0,24 0,041 1,5 4,3 0,39 2 pH = 2,3

Vitaminas Gamborg B5 (Duchefa); solução de caldo suplementado com: mjw-Inositol Ácido nicotínico Tia.mina-HCl 100 g/1 1 g/i 1 g/i -25-

Exemplo 5 : Início de Culturas em Suspensão de Células de Pepino Embriogénicas e Embriões Somáticos a partir delas

Sementes de pepino da variedade " Pandorex " (Sluis and Groot) são esterilizadas à superfície com solução a 70% de etanol (durante 2 minutos) e com uma solução a 1,5% de hipoclorito de sódio (durante 45 minutos), sendo então lavadas minuciosamente com água esterilizada (3 x). As sementes de pepino são germinadas em papel humedecido durante 2 dias a 23° C. A radícula que emerge a partir da semente é usada como material de explante. 15 radículas são cultivadas em 10 ml de meio MS líquido básico mais vitaminas (comercialmente disponíveis a partir de Duchefa Biochemie BV, Haarlem, The Netherlands) suplementado com sacarose a 20 g/1, 2 mg/1 de 2,4-D e 1 mg/1 de cinetina num agitador rotativo a 100 rpm no escuro a uma temperatura de 23° C. O meio de cultura é monitorizado quanto à concentração de auxina usando técnicas de HPLC conhecidas nesta técnica. Depois da concentração de auxina descer para <0.1 mg/1, após cerca de 5 dias, a cultura é diluída 5 x até 50 ml de meio MS líquido básico mais vitaminas (comercialmente disponíveis a partir de Duchefa Biochemie BV, Haarlem, The Netherlands) suplementado com sacarose a 20 g/1, 2 mg/1 de 2,4-D e 1 mg/1 de cinetina. Culturas são sub-cultivadas quinzenalmente diluindo a cultura 2 x com meio MS líquido básico mais vitaminas (comercialmente disponíveis a partir de Duchefa Biochemie BV, Haarlem, The Netherlands) suplementado com sacarose a 20 g/1, 2 mg/1 de 2,4-D e 1 mg/1 de cinetina. 8 semanas mais tarde aparecem massas pro-embriogénicas.

As culturas de PEMs são então posteriormente sub-cultivadas por inoculação de 0,4 ml de volume de células embaladas em 50 ml de duas em duas semanas em meio A (do Quadro 1) suplementado com 10 mg/1 de 2,4-D e 0,5 mg/1 de cinetina. O tempo de duplicação da linhagem celular de pepino é de cerca de 2,7 dias tal como é determinado usando a fórmula de Schlegel (supra). As -26- Oâbw wiiwí PEMs são seleccionadas por passagem da cultura por crivo através de malhas de nylon com tamanhos de poros de 150 μτη e 100 μτη respectivamente, para PEMs com um tamanho variando entre 100 e 150 pm. A fracção 100-150 μτη produz o número mais elevado de embriões somáticos simples por PCV da cultura de PEMs. As PEMs a partir desta linhagem de células são diplóides ou tetraplóides. O racio entre células diplóides e tetraplóides permanece constante ao longo do tempo durante mais de dois anos em meio líquido A suplementado com 10 mg/1 de 2,4-D e 0.5 mg/1 de cinetina, tal como é medido pelo método de De Laat A.A.A. et al supra. As PEMs produzem plantas tanto dipolides como tetraplóides. O racio medido de diploidiaitetraploidia reflete-se tanto nas PEMs como nas plantas.

As PEMs desenvolvem-se em verdadeiros embriões somáticos cultivando as PEMs sobre meio MS sem auxina e citokinin suplementado com sacarose a 20 g e 5 μΜ de ABA.

Exemplo 6 : Manipulação de linhagens de células de Pepino Embriogénicas para se obterem culturas em suspensão 100% diplóides ou 100% tetraplóides. A suspensão do exemplo 5 consiste em PEMs diplóides e tetraplóides o que dá origem ao desenvolvimento de embriões com os mesmos níveis de ploidia. PEMs individuias com cerca de 2 mm de diâmetro são retiradas de uma suspensão de células com 13 semanas de idade iniciada de acordo com o método do exemplo 5. A medição das PEMs individuais para o nível de ploidia seguindo o método de De Laat et al. (1987) Plant Breeding 99, 303-307 revela que as PEMs são ou 100% diplóides ou 100% tetraplóides. Posterior cultura de PEMs individuais durante um período de quinze semanas (isto é sub-culturas realizadas quinzenalmente) em meio M5 líquido básico tal como é descrito no Exemplo 5 dá origem a linhagens celulares consistindo em 100% de células diplóides ou em 100% de células tetraplóides tal como é determinado usando o método de De Laat et al. acima referido. PEMs diplóides dão origem a embriões diplóides e a plantas diplóides. As PEMs tetraplóides dão origem a embriões tetraplóides e a plantas tetraplóides.

Exemplo 7 : Manipulação de linhagens celulares de Pepino Embriogénicas para se obter culturas em suspensão 100% diplóides ou 100% tetraplóides.

Plantas de pepino da variedade " Pandorex " (Sluis and Groot) são feitas crescer em condições de esterilidade usando o método do exemplo 3. Ovários com um tamanho de cerca de 1 cm são usados como material de explante. A medição do nível de ploidia seguindo o método de De Laat et al supra revela que o explante é completamente diplóide. Cerca de metade do fruto é dividido em cortes com uma espessura de cerca de 0,5 mm e é cultivado em 10 ml de meio MS líquido básico mais vitaminas (comercialmente disponíveis a partir de Duchefa Biochemie BV, Haarlem, The Netherlands) suplementado com sacarose 20 g/1, 2 mg/1 de 2,4-D e 1 mg/1 de cinetina num agitador rotativo a 100 rpm no escuro a uma temperatura de 23° C. O meio de cultura é monitorizado quanto à concentração de auxina utilizando técnicas de HPLC conhecidas nesta técnica. Depois da concentração de auxina cair para <0.1 mg/1, após cerca de 5 dias, a cultura é diluída 5 x até 50 ml com meio MS líquido básico mais vitaminas (comercialmente disponíveis a partir de Duchefa Biochemie BV, Haarlem, The Netherlands) suplementado com sacarose 20 g/1, 2 mg/1 de 2,4-D e 1 mg/1 de cinetina. Culturas são sub-cultivadas quinzenalmente por diluição da cultura 2 x com meio MS suplementado tal como foi acima referido. 8 semanas mais tarde aparecem massas pro-embriogénicas. As -28- -28-

ã&fe&wa&o culturas de PEMs são sub-cultivadas tal como é descrito no exemplo 5 em meio A (do Quadro 1) suplementado com 10 mg/1 de 2,4-D e 0,5 mg/1 de cinetina. 0,4 ml de volume de células embaladas é inoculado em 50 ml de meio A suplementado com 10 mg/1 de 2,4-D e 0,5 mg/1 de cinetina. O tempo de duplicação da linhagem de células de pepino é de cerca de 2,7 dias em meio A (Quadro 1) tal como é determinado usando a fórmula de Schlegel (supra). O nível de ploidia da suspensão de PEMs é determinado seguindo o método de De Laat et al supra e verifica-se ser diplóide. As PEMs são seleccionadas fazendo passar a cultura por crivo através de malha de nylon para PEMs com um tamanho variando entre 100 e 150 pm. As PEMs são desenvolvidas dando origem a embriões somáticos verdadeiros cultivando PEMs seleccionados em meio MS sem auxina e citocinina suplementado com 20 g/1 de sacarose. Usando este método 200.000 embriões são produzidos em quatro semanas a partir de cultura de PEMs. Verifica-se que o nível de ploidia de 500 embriões somáticos seleccionados de um modo aleatório é diplóide usando o método de De Laat et al supra.

Exemplo 8 : Manutenção de suspensões de PEMs estáveis no que se refere a nível de ploidia.

Suspensões de PEMs de pepino são feitas crescer em meio A (QUadro 1), suplementado com 10 mg/1 de 2,4-D e 0,5 mg/1 de cinetina. Durante a sub-cultura elementos macro e elementos micro são mantidos em excesso em cada passo de sub-cultura para as necessidades de PEMs de modo a que carências desses elementos não ocorram durante o intervalo de sub-cultura (isto é 2 semanas). Níveis de auxina (isto é 10 mg/1 de 2,4-D) são mantidos do mesmo modo. Cinetina (isto é 0,5 mg/1) é adicionada ao meio no início da sub-cultura e é deixada desaparecer do meio em quatro dias. A monitorização da concentração de auxina ao longo do tempo usando técnicas de HPLC conhecidas nesta técnica -29- assegura que o estádio de desenvolvimento da suspensão é fixada ao nível de PEMs. Suspensões de PEMs diplóide embriogénica são mantidas durante até 2 anos em meio A (Quadro 1) suplementado com 10 mg/1 de 2,4-D e 0,5 mg/1 de cinetina e revelam um nível de ploidia estável. Suspensões de PEMs tetraplóide embriogénica são mantidas durante 6 meses revelando um nível de ploidia estável. Este nível de ploidia é mantido até que o desenvolvimento do embrião seja iniciado.

Exemplo 9 : Início de Culturas em Suspensão de PEMs de Beterraba Embriogénicas e embriões somáticos a partir delas.

Sementes de beterraba (Hilleshog AB, Sweden) são esterilizadas à superfície com uma solução a 70% de etanol (durante 2 minutos) e uma solução a 1,5% de hipoclorito de sódio (durante 45 minutos), sendo em seguida lavadas minuciosamente com água esterilizada (3 x). As sementes de beterraba são germinadas em papel humedecido durante 7 a 14 dias a 23° C. Os cotilédones das sementes germinadas são usados como material de explante. 6 cotilédones são cultivados em 10 ml de meio A líquido (Quadro 10) suplementado com 10 mg/1 de 2,4-D e 0,5 mg/1 de cinetina num agitador rotativo a 100 rpm no escuro a uma temperatura de 23° C. A cultura é diluída 5 x com meio A líquido (Quadro 1) suplementado com 10 mg/1 de 2,4-D e 0,5 mg/1 de cinetina para 50 ml após uma ou duas semanas. As culturas são sub-cultivadas quinzenalmente diluindo a cultura 2 x com meio A (Quadro 1) suplementado tal como foi acima referido ou substituindo o meio com meio A recente suplementado tal como foi acima descrito. Após 4 a 6 semanas aparecem embriões somáticos no tecido de explante. Os embriões são retirados do explante e cultivados separadamente. 4 semanas mais tarde embriões cultivados produzem PEMs. As culturas de PEMs são posteriormente sub-cultivadas enchendo novamente com meio A do Quadro 1 suplementado com 10 mg de 2,4-D e 0,5 mg de cinetina. -30-

As PEMs são recolhidas por passagem por crivo da suspensão de PEMs primeiro em malha de nylon tendo um tamanho de poro de 500 pm e em seguida em malha de nylon tendo um tamanho de poro de 100 pm. A fracção de PEMs 100-500 pm geralmente dá origem a embriões somáticos predominantemente simples. As PEMs são cultivadas em meio A sem auxina e citocinina suplementado tal como foi acima referido e desenvolvem-se dando origem a embriões somáticos verdadeiros.

Exemplo 10 : Início de Culturas em Suspensão de PEMs de Pimenteiro Embriogénicas.

Sementes de pimenteiro (cv Gedeon de Sluis and Groot) são esterilizadas à superfície com solução a 70% de etanol (durante 2 minutos) e uma solução a 1,5% de hipoclorito de sódio (durante 45 minutos), sendo em seguida lavadas minuciosamente com água esterilizada (3 x). As sementes de pimenteiro são germinadas em papel humedecido durante 7 a 14 dias a 23° C. Os cotilédones a partir das sementes germinadas são usados como material de explante. 6 cotilédones são cultivados em 10 ml de meio A líquido (Quadro 1) suplementado com 10 mg/1 de 2,4-D num agitador rotativo a 100 rpm no escuro a uma temperatura de 23° C. A cultura é diluída 5 x até 50 ml após duas semanas. As culturas são sub-cultivadas quinzenalmente diluindo a cultura 2 x tal como foi acima descrito ou substituindo o meio por meio A líquido recente (Quadro 1) suplementado com 10 mg/1 de 2,4-D. Após 2 a 4 semanas aparecem embriões nas arestas de corte do explante Os embriões são retirados do explante e são removidos da cultura e sub-cultivados no meio A líquido (Quadro 1) suplementado com 4 mg/1 de 2,4-D e 0,5 mg/1 de Zeatina. 4 semanas mais tarde aparecem massas pro-embriogénicas. PEMs são multiplicadas por meio de -31 - posterior sub-cultura tal como foi acima descrito. As PEMs são recolhidas por passagem por crivo da suspensão tal como foi descrito no exemplo 5. A fracção 100-500 pm dá origem a embriões somáticos predominantemente simples. As PEMs são cultivadas em meio A sem auxina e citocinina (Quadro 1).

Exemplo 11 : Início de Culturas em Suspensão de PEMs de Viola Embriogénicas e embriões somáticos a partir delas.

Sementes de Viola, (cv Delta violet de Sluis and Groot) são esterilizados à superfície com solução a 70% de etanol (durante 2 minutos) e uma solução a 1,5% de hipoclorito de sódio (durante 30 minutos), sendo em seguida lavadas minuciosamente com água esterilizada (3 x). Sementes Viola são germinadas em papel humedecido durante 7 a 14 dias a 23° C. Os cotilédones das sementes germinadas são usadas como material de explante. 6 cotilédones são cultivados em 10 ml de meio A líquido (Quadro 1) suplementado com 4 mg/1 de 2,4-D e 0,1 mg/1 de cinetina num agitador rotativo a 100 rpm no escuro a uma temperatura de 23° C. A cultura é diluída 5 x com meio A líquido (Quadro 1) suplementado com 4 mg/1 de 2,4-D e 0,1 mg/1 de cinetina para 50 ml após duas semanas. As culturas são sub-cultivadas quinzenalmente diluindo a cultura 2 x ou substituindo o meio por meio A líquido recente (Quadro 1) suplementado com 4 mg/'l de 2,4-D e 0,1 mg/1 de cinetina. Após 8 a 10 semanas aparecem massas pro-embriogénicas. PEMs são multiplicadas por meio de posterior sub-cultura tal como foi acima descrito. As PEMs são recolhidas fazendo passar por crivo a suspensão tal como foi descrito no exemplo 5 exceptuando o facto dos tamanhos dos poros da malha de nylon usada serem de 50 pm e de 250 pm. As PEMs são cultivadas em meio A sem auxina e citocinina (Quadro 1) suplementado tal como foi acima referido e desenvolvidas dando origem a embriões somáticos simples. -32-

Exemplo 12 : Início de Culturas em Suspensão de PEMs de Pelargónio Embriogénicas

Sementes de pelargónio (cv Pulsar red de Sluis and Groot) são esterilizadas à superfície com solução a 70% de etanol (durante 2 minutos) e uma solução a 1,5% de hipoclorito de sódio (durante 30 minutos), sendo em seguida lavadas cuidadosamente com água esterilizada (3 x). Sementes de pelargónio são germinadas em papel humedecido durante 7 a 14 dias a 23° C. Os cotilédones a partir das sementes germinadas são usados como material de explante. 6 cotilédones são cultivados em 10 ml de meio A líquido (Quadro 1) suplementado com 4 mg/l de 2,4-D e 0,1 mg/1 de cinetina num agitador rotativo a 100 rpm no escuro a uma temperatura de 23° C. A cultura é diluída 5 x com meio A líquido (Quadro 1) suplementado com 4 mg/1 de 2,4-D e 0,1 mg/1 de cinetina para 50 ml após uma semana. As culturas são sub-cultivadas quinzenalmente diluindo a cultura 2 x com meio A líquido (Quadro 1) suplementado com 4 mg/1 de 2,4-D e 0,1 mg/1 de cinetina ou substituindo o meio com meio A recente suplementado tal como foi acima descrito.

Após 4 a 6 semanas aparecem massas pró-embriogénicas. As PEMs são multiplicadas por meio de posterior sub-cultura tal como foi acima descrito. As PEMs são recolhidas fazendo passar por crivo a suspensão tal como foi descrito no exemplo 5 exceptuando o facto do tamanho dos poros da malha de nylon usada ser de 250 pm e de 50 pm. A fracção de PEMs de 50-250 pm dá origem a embriões somáticos predominantemente simples. As PEMs são cultivadas em meio A sem auxina e citocinina (Quadro 1) e desenvolvem-se dando origem a embriões somáticos simples. -33- Ofht&KafcO M (ÀM^amzrm.

Exemplo 13 ; Multiplicação de Biomassa de PEMs em Biorreactores 4 x 8 ml PCV é recolhido de culturas em suspensão de PEMs de pepino sub-cultivadas tal como foi descrito no exemplo 5 e inoculado em 4 biorreactores (Applikon Dependable Instruments B.V.) compreendendo dois biorreactores convencionais de 2 1 equipados com impulsores, e dois biorreactores equipados com vibromisturadores comercialmente disponíveis a partir de Chemap AG, contendo cada um deles 1 1 de meio A (Quadro 1) suplementado com 10 mg/1 de 2,4-D e 0,5 mg/1 de cinetina. É spargedcinetina ar nnos reactores com vibromisturadores por meio de um dispositivo de aspersão poroso de 15 pm localizado na extremidade da haste do vibrador localizada próximo do fundo da câmara do reator. A concentração de oxigénio dissolvido num dos reactores com vibromisturador é determinada a 40%, e no outro a 97% seguindo métodos padrão conhecidos nesta técnica. Vibromisturadores colocados verticalmente são operados a uma frequência de 50 Hz e com uma amplitude máxima de ± 6 mm. Os vibromisturadores estão colocados de modo a que o movimento vibratório se realize no plano vertical e que o movimento horizontal seja mantido a um mínimo. Discos de agitação são adaptados à extremidade da haste de vibração de modo a que fluido seja dirigido para uma curvatura corrente dirigindo a suspensão de células da periferia do recipiente do reactor para a base e em seguida para cima. É aspergido ar para os biorreactores convencionais no fundo do bioreator por meio de um tubo de aspersão equipado com um aspersor poroso de 15 um. A concentração de oxigénio dissolvido é determinada tal como foi acima -34-

referido em concentrações de 40% e 97% respectivamente. A velocidade de agitação do impulsor é mantida a cerca de 150 rpm ± 50 rpm. 6 dias após a inoculação é determinado o tempo de duplicação, PEMs são feitas passar por crivo a partir da suspensão de PEMs e PEMs/ml PCV são determinadas tal como foi descrito no exemplo 5. A utilização de vibromisturadores dá origem a números mais elevados de PEMs por unidade de volume (Quadro 2; Figura 1).

Quadro 2

Aparelho Tempo de Duplicação PEMs/ml PCV (Dias)

Impulsor 2,3 200 (40% D02)(,)

Impulsor 2,7 (97% D02) Vibromisturador 2,8 (40% D02) Vibromisturador 3,3 (97% D02) 620 2.284 3.710 (1) D02 = Oxigénio dissolvido -35- waJW»

Exemplo 14 : Multiplicação da Biomassa de PEMs em Biorreactores com V ibromisturadores 2 x 8 ml PCV é recolhido a partir de culturas em suspensão de pepino sub-cultivadas tal como foi descrito no exemplo 3 e inoculado em dois biorreactores com vibromisturadores (Applikon Dependable Instruments B.V.) compreendendo dois bioreatores de 2 1 equipados com vibromisturadores comercialmente disponíveis a partir de Chemap AG. Um biorreactor contem 1 1 de meio A (Quadro 1), suplementado com 10 mg/1 de 2,4-D e 0,5 mg/1 de cinetina, o outro contendo também 1 1 de meio A suplementado tal como foi acima referido exceptuando o facto da concentração de sacarose ser de 55 g/1. Ar é aspergido para os reactores com vibromisturador por meio de um dispositivo de aspersão poroso de 15 μτη localizado na extremidade da haste do vibrador próximo da base da câmara do reactor. A concentração de oxigénio dissolvido é determinada a 97% seguindo métodos padrão conhecidas nesta técnica. Os vivromisturadores são operados a uma frequência de 50Hz e com uma amplitude máxima de ± 6 mm. Os vibromisturadores são colocados de modo a que o movimento vibratório se efectue no plano vertical enquanto que o movimento lateral ou horizontal é mantido num mínimo. Discos de agitação são montados na extremidade da haste de vibração de modo a que o fluido flua numa curvatura corrente dirigindo a suspensão de células da periferia do recipiente do rector para a base e em seguida para cima. 6 dias após a inoculação é determinado o tempo de duplicação, PEMs são feitas passar por crivo a partir da suspensão de PEMs e PEMs/ml PCV são determinadas tal como no exemplo 5. Os resultados são apresentados mais abaixo no Quadro 3. -36-

Uk

Quadro 3

Aparelho Tempo de Duplicação PEMs/ml PCV (Dias)

Vibromisturador 3,3 2.284 (97%, 20 g/1 sacarose)

Vibromisturador 2,9 6.000 (97%, 55 g/1 sacarose)

Exemplo 15 : Comparação de Viabilidade de PEMs ao longo do tempo a partir de Bioreatores Agitados versus Biorreactores com Vibromisturadores. 3 x 8 ml de PCV é recolhido a partir das culturas em suspensão de PEMs de pepino sub-cultivadas tal como foi descrito no exemplo 5 e inoculado em 3 biorreactores (Applikon Dependable Instruments B.V.) compreendendo um biorreactor de 2 1 convencional equipado com um impulsor contendo 1 1 de meio A (Quadro 1), suplementado com 10 mg/1 de 2,4-D e 0,5 mg/1 de cinetina, e dois biorreactores equipados com vibromisturadores comercialmente disponíveis a partir de Chemap AG, um contendo 1 1 de meio A suplementado tal como foi acima referido e o outro contendo também 1 1 de meio A suplementado tal como foi acima referido exceptuando o facto da concentração de sacarose ser de 55 g/1. É aspergido ar para o reactor com vibromisturador por meio de um -37 - ^--' dispositivo de aspersão poroso de 15 pm na extremidade da haste do vibrador em direcção ao fundo da câmara do reactor. A concentração de oxigénio dissolvido no reactor com vibromisturador é determinada a 97% seguindo métodos padrão conhecidos nesta técnica. O vibromisturador é operado a uma frequência de 50 Hz e com uma amplitude máxima de ± 6 mm. O vibromisturador é colocado de modo a que o movimento de vibração se realize no plano vertical e o movimento vibratório horizontal é mantido num mínimo. O disco de agitação é montado na extremidade da haste de vibração de modo a que o fluido flua numa curvatura corrente dirigindo a suspensão de células da periferia do recipiente do reactor para a base e em seguida para cima. É aspergido ar para o biorreactor convencional na extremidade do biorreactor por meio de um tubo de aspersão equipado com um aspersor poroso de 15 pm. A concentração de oxigénio dissolvido é determinada tal como foi acima referido a uma concentração de 97%. A velocidade de agitação do impulsor é mantida a cerca de 150 rpm ± 50 rpm. PEMs/ml PCV é determinado no início da cultura e o tempo de duplicação é determinado aos 6 e aos 14 dias tal como foi descrito no exemplo 5.

Os resultados mostram que o número de PEMs num biorreactor agitado diminui de um modo significativo ao longo do tempo, enquanto que o número de PEMs num vibromisturador permanece quase constante ao longo do tempo com uma concentração de sacarose de 20 g/1. Verifica-se que os números de PEMs aumentam até 3 x no espaço de 6 dias com uma concentração de sacarose de 55 g/1 (Quadro 4). -38-

Aparelho

Dia 0

Impulsor 2.300 (97%, 20 g/1 sacarose

Vibromisturador 2.300 (97%, 20 g/1 sacarose)

Vibromisturador 2.300 (97%, 55 g/1 sacarose

Quadro 4

PEMs/ml PCV

Dia 6 Dia 14 800 40 2.300 2.280 6.000 6.000

Exemplo 16 : Desenvolvimento de PEMs em Embriões Somáticos do Estádio Torpedo em Biorreactores 2 x 100.000 PEMs submetidas a passagem por crivo são recolhidas a partir de culturas em suspensão de PEMs de pepino sub-cultivadas tal como foi descrito no Exemplo 15 (55 g/1 de sacarose em vb /97% Do2) e inoculadas em 2 bioreatores (Applikon Dependable Instruments B.V.) compreendendo um bioreator de 2 1 convencional equipado com impulsor, e um bioreator equipado com um vibromisturador comercialmente disponível a partir de Chemap AG, contendo cada um deles 1 1 de meio MS contendo 20 g/1 de sacarose, e ABA numa concentração de 5,0 μΜ. Oxigénio é aspergido para o vibromisturador do reactor por meio de um dispositivo de aspersão poroso de 15pm localizado na -39

extremidade da haste do vibrador colocado próximo da base da câmara do reator. A concentração de oxigénio no vibromisturador do reactor é determinada a 97% seguindo métodos padrão conhecidos nesta técnica. O vibromisturador é operado a uma frequência de 50 Hz e com uma amplitude máxima de ± 6 mm. O vibromisturador é colocado de modo a que o movimento vibratório se realize no plano vertical e que o movimento horizontal seja mantido num mínimo. O disco de agitação é montado na extremidade da haste do vibrador de modo a que o fluido flua numa curvatura corrente dirigindo as PEMs da periferia do recipiente do reactor para a base e em seguida para cima.

Oxigénio é aspergido para o biorreactor convencional no fundo do bioreator por meio de um tubo de aspersão equipado com um aspersor poroso de 15 μτη.Α concentração de oxigénio dissolvido é determinada tal como foi acima referido com uma concentração de partida de 97% e deixada cair ao longo de 7 dias para 30% ± 5%. No dia 8 a concentração de oxigénio dissolvido é levada de novo para 97% e mantida a esse nível. A velocidade de agitação do impulsor é mantida a cerca de 190 rpm ± 5 rpm. O biorreactor convencional tem uma PEMs para uma eficiência entre 10-15% de desenvolvimento de embrião somático de estádio torpedo utilizável, completamente desenvolvida. O vibromisturador do bioreator tem uma PEMs para uma eficiência superior a 20% de desenvolvimento de embrião somático de estádio torpedo utilizável, completamente desenvolvida. Embriões somáticos de estádio torpedo utilizáveis são os embriões que dão origem a plantas com aspecto normal.

Exemplo 17 : Estabilidade morfológica de plantas cíclame derivadas de embriões somáticos

Embriões somáticos de cíclame derivados de híbridos F1 do exemplo 2 são convertidos em pequenas plantas colocando os embriões somáticos em solo para vasos. Após formação das primeiras folhas as pequenas plantas são transferidas para a estufa e são feitas crescer até à maturidade. As plantas são feitas crescer até ao estádio de floração. O exame morfológico das plantas em floração não revela anomalias nas plantas. Não é observada qualquer variação somaclonal devida a diferenças genéticas nas plantas.

Exemplo 18 : Variação somaclonal genética em plantas de pepino derivadas de embriões somáticos

Embriões somáticos de cíclame do exemplo 6 derivados de plantas híbridas F1 são convertidos em plantas em bujões Sorbarod (Baumgartner papier, Switzerland) e feitas crescer dando origem a plantas com frutos. O nível de ploidia é determinado pelo método de De Laat A.A. et al supra, em 80 plantas. Todas as plantas têm o mesmo nível de ploidia e não são observadas diferenças devidas a variação somaclonal genética.

Exemplo 19: Conversão de Embriões Somáticos de Pepino em Plantas PEMs de pepino são multiplicadas em biorreactores equipados com Vibromisturadores com baixas intensidades de luz, submetidas a passagem por crivo (100-150 pm) e inoculadas em frascos de Erlenmeyer a uma densidade de 5.000 PEMs/50 ml de meio MS, suplementado com 20 g/1 de sacarose e 5 pm de ABA. PEMs são divididas em dois (2) lotes os quais são posteriormente desenvolvidos com luz e no escuro até se obterem embriões somáticos. -41 -

Embriões somáticos de ambos os lotes são convertidos em plantas à luz. Os resultados revelam que a eficiência da conversão a partir de embriões somáticos em plantas para embriões somáticos derivados de PEMs cultivadas no escuro é mais elevada do que para embriões desenvolvidos com luz (Quadro 5).

Quadro 5 condição da luz conversão global de torpedo em planta taxa [%] luz 28,6 escuridão 62,7

Exemplo 20 : Tamanho de agregado de PEMs em relação à formação de torpedos simples apropriados para conversão em plantas.

Suspensão de PEMs com 9 dias de idade obtida tal como foi descrito no Exemplo 5 acima referido usando meio suplementado com 10 mg/1 de 2,4-D e 0,5 mg/1 de cinetina (com uma concentração de PEMs de 50 ml PCV/1) é feita passar por crivo em malhas de nylon em três eventos separados para se obter três fraeções de PEMs com diferentes tamanhos: 100-150 pm, 150-200 pm, e 200 pm-250 pm. O desenvolvimento do embrião é realizado com concentrações iniciais de PEMs de cerca de 25-50 PEMs/ml em meio MS contendo 3 pM de ABA. Após 9 dias de desenvolvimento da cultura o número de embriões de estádio torpedo é avaliado por microscopia óptica. O número torpedos simples é avaliado em relação ao número de multitorpedos. O racio torpedo/PEMs é de 5-15%. A fraeção com tamanho <100 pm não contem PEMs. Os resultados são apresentados no Quadro 6. » * -42-

Ouadro 6

Fracção passada por crivo % Torpedos Simples tamanho (pm) como uma percentagem do total 100-150 85 150-200 20 200-250 5 embriões simples são separados da fracção de tamanho 100-150 pm, e são convertidos em plantas simples.

Lisboa, 3 de Março de 2000

JOÃO PEREIRA DA CRUZ ENGENHEIRO,

Agente Oficial da Propriedade industrial RUA VICTOR CORDONi 14-3* 1200 USBOA

Claims (20)

1. - 1 -

   REIVINDICAÇÕES 1. Um método para a promoção de massa pro-embriogénica (PEMs) a partir de material de explante em que as PEMs são capazes de dar origem a embriões somáticos viáveis método esse que compreende: i) Cultura de material de explante não caloso não-Daucus em contacto com um meio de cultura líquido de tecido de planta compreendendo uma quantidade eficaz de uma auxina ou de uma mistura de auxinas suficiente para promover a indução de massa pro-embriogénica (PEMs).
2. 2. Um método de acordo com a reivindicação 1 compreendendo ii) Multiplicação do número de PEMs obtidas em i) por cultura das referidas PEMs em contacto com um meio líquido contendo auxina apropriado.
3. 3. Um método para a obtenção de embriões somáticos em cultura em suspensão, método esse que compreende: i) Cultura de material de explante não caloso não -Daucus em contacto com um meio de cultura líquido de tecido de planta compreendendo uma quantidade eficaz de uma auxina ou de uma mistura de auxinas suficiente para promover a indução de massa pro-embriogénica (PEMs); ii) Multiplicação do número de PEMs obtidas em i) por cultura das referidas PEMs em contacto com um meio líquido contendo auxina apropriado; iii) Recolha das PEMs obtidas em ii) e sua colocação em contacto com um meio líquido substancialmente sem auxina para induzir formação de embrião somático; e iv) Recolha de embriões somáticos resultantes dos embriões induzidos do passo iii), em que os referidos embriões somáticos têm o mesmo nível de ploidia que o material de explante não caloso em cultura em suspensão. -2-
4. 4. Um método de acordo com a reivindicação 2, compreendendo a utilização no passo iii) de PEMs de uma fracção com tamanho seleccionado rica em PEMs viáveis.
5. 5. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o meio líquido compreende ainda uma fonte de energia de hidratos de carbono a uma concentração variando entre cerca de 15 g/1 e 90 g/1.
6. 6. Um método de acordo com a reivindicação 5, em que a concentração da fonte de energia de hidratos de carbono se situa entre cerca de 20 g/1 e 60 g/1.
7. 7. Um método de acordo com a reivindicação 5 ou com a reivindicação 6, em que a fonte de energia de hidratos de carbono é seleccionada de entre o grupo sacarose, glucose e rafínose.
8. 8. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a suspensão de PEMs contendo auxina é feita vibrar num vibromisturador.
9. 9. Um método de acordo com a reivindicação 8, em que o vibromisturador é feito vibrar em substancialmente o plano vertical.
10. 10. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o material de explante não caloso é derivado de protoplastos, caule, folha, pétala, corte de hipocótilo, meristemas apicais, embrião zigótico per se. tubérculo, feixe vascular, periciclo, ovários ou filamento de antera. -3 -
11. 11. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o material de explante não caloso é dicotilédoneo.
12. 12. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o material de explante não caloso é monocotiledóneo.
13. 13. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o nível de ploidia é diplóide.
14. 14. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o nível de ploidia é tetraplóide.
15. 15. Utilização de uma PEMs produzida de acordo com a reivindicação 1 ou 2, para estabelecimento de culturas em suspensão de embriões somáticos compreendendo embriões somáticos que são uniformes no que se refere ao nível de ploidia colocando as PEMs num meio de cultura de tecido de planta substancialmente sem auxina.
16. 16. Utilização de acordo com a reivindicação 15, em que a referida cultura em suspensão compreende embriões somáticos diplóides.
17. 17. Utilização de acordo com a reivindicação 15, em que a referida cultura em suspensão compreende embriões somáticos tetraplóides.
18. 18. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, em que a referida cultura em suspensão compreende embriões somáticos, os quais são derivados de PEMs geradas a partir de material de explante não caloso dicotiledóneo ou monocotiledóneo. -4-
19. 19. Um método para a produção de uma planta compreendendo o crescimento de um embrião somático tal como o obtido por um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 14 até se obter uma planta que seja idêntica, de um ponto de vista genético, ao material celular progenitor do explante a partir do qual é derivada.
20. 20. Um método de acordo com a reivindicação 19, em que os embriões somáticos são seleccionados de entre o grupo compreendendo Ciclames, Cucúrbitas, Licopérsicos, Alios, Begónias, Betas, Prímulas, Brássicas, Cápsicos, Cicórios, Gerberas, Impaciens, Lactucas, Orizas, Pelargónios, Petúnias, Violas, e Zeas. Lisboa, 3 de Março de 2000 JOÂO PEREIRA DA CRUZ ENGENHEIRO Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14-3* 1200 LISBOA