KR100314969B1

KR100314969B1 - 체세포배형성법

Info

Publication number: KR100314969B1
Application number: KR1019940000563A
Authority: KR
Inventors: 게리트잔반홀스트; 마크크레우거; 비르트반데르메르; 에릭포스트마; 롭아베스테
Original assignee: 왈터스몰더스; 노바르티스 시즈 비.브이.
Priority date: 1993-01-15
Filing date: 1994-01-14
Publication date: 2002-02-19
Also published as: TW367365B; AU675094B2; ES2140471T3; EP0608716A2; EP0608716B2; ATE187865T1; GR3032584T3; MA23089A1; DE69422205D1; IL108330A; DK0608716T3; CA2113374A1; JP4121160B2; ES2140471T5; US5587312A; PT608716E; EP0934691A2; EP0608716A3; KR940018012A; DE69422205T2

Abstract

본 발명은 체성 배아 현탁 배양물과 체성 배아를 포함하는 전-배발생물 현탁 배양물(PEMs)에 관한 것으로 PEMs 는 거의 유사한 배수도를 갖는 것이며, 이들로부터 식물이 유도된다. 또한 본 발명은 상술한 체성 배아를 수득하는 방법에 관한 것이다.

Description

체세포 배형성법

본 발명은 조직 배양물로부터 전체 식물을 재생하는데 적합한 개선된 체세포 배형성(somatic embryogenesis) 방법에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 액체 배지 그 자체를 사용한 체세포 배형성을 통해 체세포 배아를 획득하기 위한 개선된 방법에 관한 것이다.

〈기술적 배경〉

체세포 배형성을 효과적으로 사용하는 방법의 상업화는, 예컨대 기관형성 무성생식법보다 더 바람직하고 보다 경제적이라고 간주되고 있는데, 그 이유는 비교적 단시간 간격으로 식물의 수율을 더 높힐 수 있다는 잠재성 때문이다.

어떤 식물 세포들은 적당한 식물 조직 배양 배지에서 배양될 때 전체 식물로 분화되는 잠재력을 가진다는 것이 알려져 있다. 이러한 배지는 통상 무기염류, 수크로오스, 이노시톨, 티아민과 같은 탄소 공급원 등을 포함한다. 널리 사용되는 식물 조직 배양 배지의 예로는 무라시지 및 스쿠그(MS 배지), 린드스마이에르 및 스쿠그, 감보르그(B5 배지) 등이 있다.

이러한 식물 조직 배양 배지의 조성물은 사용된 특정 식물 세포의 성장에 적합하도록 개질시킬 수 있다. 거의 모든 식물 세포는 식물 호르몬, 예를 들면 오옥신 또는 오옥신 유사 화합물(예, 인돌 아세트산, 인돌 부티르산, 나프탈렌 아세트산, 또는 2,4-D), 및/또는 벤질 아데닌, 제아틴, 키네틴 등이 시토키닌을 필요로 한다. 최적 성장을 보장하기 위해 니코틴산, 피리독신 또는 기타 성분(예, 코코넛 밀크, 카제인 가수분해물 등) 등의 비타민류를 첨가하는 것이 바람직할 수 있다.

과거에는, 진(true) 체세포 배아를 형성시키기 위해, 체세포 배아(somatic embryo)가 유도될 수 있는 주요 발육상(growth phase) 물질로서 캘러스(callus) 물질을 사용하는 것이 요구되었는데, 캘러스 물질은 매우 큰 액포를 갖는 비분화된 세포 응집체와 매우 작은 액포를 지닌 보다 작은 원형 세포를 포함한다. 그러나, 체세포 배형성에 있어 출발 물질로서 상기 물질을 사용하는 것은 많은 단점을 가지는데, 실질적으로 유사한 표현형을 갖고/갖거나 배수도(ploidy level)가 실질적으로 균일한 다수의 식물을 얻는데 그 사용이 제한되는 것으로 입증되었다. 캘러스로부터 유래하는 식물은 소마클로날 (somaclonal) 변종 및/또는 배수도에 대해 불균일성을 나타내는 경향이 있다 [칼레프(Chaleff R.S.) (1983) Science 219 : 676∼682 : 라킨(Larkin P.J.) (1987) Iowa State Journal of Research 61(4):393∼434 ; 드 클레크(De Klerk G-J)(1990) Acta Bot. Neerl. 39(2) : 129∼144 ; 카프(Karp A.) & 브라이트(Bright S.W.J.)(1985) Oxford Surveys of Plant Molecular& Cell Biology 2 : 199∼234 ; 커스터스(Custers J.B.M) 등 (1990) Acta Bot, Neerl, 39(2) : 153∼161(cucumis sativus L.) ; 키셀리 (Kysely. W.) 등(1987) Plant cell Reports 6 : 305∼308(pisum sativum L.) ; 에즈라 (Ezura H.)(1992) Plant Science 85:209∼213(cucumis melo) ; 및 키비하르주(Kiviharju E.)등 (1992) Plant Cell, Tissue, and Organ Culture 28 : 187∼194(Cyclamen persicum Mill)].

기지의 특허 문헌의 실시예에서는 체세포 배형성에 캘러스 물질을 사용하였다. 예를 들면, WO90/01058(플랜트 제네틱스 인코포레이션)에는 광범위한 합성 오옥신의 사용 효과를 조사하면서 캘러스 물질을 사용하여 체세포 배아를 수득하는 것에 대해 기재하고 있다. 수주에 걸친 고체 배지상에서의 배양 및/또는 계대배양(subculturing)에 의해 적당한 외식편 물질로부터 캘러스 물질이 형성되거나 성장된다. 이어서, 2,4-D 또는 이의 유사체와 같은 식물 호르몬을 함유하는 배지에 캘러스 조직을 옮김으로써 체세포 배형성이 개시된다. 체세포 배아의 배수도 또는 수득된 식물의 배수도에 대한 언급은 없다. 체세포 배형성에 캘러스 물질을 사용하는 것은 유용한 유전자 풀이 풍부한 소마클로날 변종들을 획득하는 것이 관심사인 식물을 수득하는데 유용한 반면, 실질적으로 모두 같은 유전자형을 갖는 상업상 다수 식물을 단순히 얻고자 하는 종자 상인 또는 재배자들에게는 거의 사용되지 않는다.

당근 세포주는 분열 조직 세포로 구성된 미세 응집체로부터 무성 생식된다고 알려져 있으며 그들의 배아 생성능이 연구되어 있다[피. 코우토스-테베노트 등,Plant Cell Reports (1990) 8:605∼608).

상기 문헌의 저자는 오옥신 2,4-D를 포함하는 식물 조직 배양 배지에 있는 국산 당근(S1 변종)의 배축의 초기 세포 현탁액을 사용하고, 여과에 의해 세포 응집체를 분리시키고, 2,4-D를 포함하는 식물 조직 배양 배지내에 세포 응집체를 재현탁시켜서 응집체의 밀도를 증가시키고, 2,4-D 및 1% 박토-아가(bacto-agar)를 함유한 고체 식물 조직 배양 배지를 포함하는 페트리 접시에 분리된 응집체로부터의 세포 콜로니를 옮겨서 세포 콜로니 형성을 유도시키고, 이들을 영양(nurse) S1변종 캘러스 주변에 2,4-D 및 1% 박토-아가를 함유한 제2 고체 배지에 놓고, 2,4-D를 포함하는 식물 조직 배양 배지에 각 세포 콜로니를 분리시켜서 2,4-D를 함유하는 식물 조직 배양 배지내에 수득된 응집체를 계대배양하는 방법을 제안하였다. 상기 방법에 의해 수득된 세포주의 추후 분석 결과는 40개의 세포주 중 13개가 배형성되었음을 나타내었으나, 이들 세포주의 대부분은 시간이 경과함에 따라 배형성의 잠재력을 상실하였다. 하나의 세포주만이 보다 긴 시간에 걸쳐 다소 일정한 배형성 잠재력을 가졌다. 유동 세포 분석(flow cytometric analysis)에 따른 후자의 세포주는 이배체이었다.

본 발명은 현탁 배양물에서 체세포 배아를 수득하는 기술적으로 간단한 방법을 제공한다. 이 방법은 영양 캘러스 주변에 세포주를 놓아둘 필요가 없다. 따라서, 본 발명의 방법은 상업적 규모로 체세포 배아를 생성할 수 있도록 해준다. 본 발명에 따른 체세포 배아는 실질적으로 동일한 유전형을 갖는 식물을 대량으로 제공하는데 사용할 수 있다.

지금까지는, 체세포 배형성법이 식물을 획득하는 잠재적인 강력한 수단으로써 여겨졌었으나, 캘러스 물질로부터 출발하는 체세포 배형성법을 활용하는 것이 비실용적이기 때문에 상기 기술은 성공적으로 활용하지 못하였다.

놀랍게도, 고체 배지 및/또는 캘러스 조직을 사용할 필요 없이, 액체 배양 기술 그 자체를 사용하여 대량의 진 체세포 배아를 얻을 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 또한, 액체 배지내에서 PEMs 생물량을 증가시킬 수 있으며, 이로부터 체세포 배아를 대량으로 생성할 수 있는 능력을 증가시킬 수 있다는 사실이 밟혀졌다. 이러한 액체 배양 기술의 사용은 캘러스 배양/캘러스 계대배양 단계의 필요성을 제거하고, 배수도가 균일한 체세포 배아 집단을 얻는 수단을 처음으로 제공한다.

본 발명은 소마클로날 변종이 수득되는 위험을 실질적으로 감소시키거나 제거한 체세포 배형성법을 통해 체세포 배아를 수득하는 방법을 제공한다.

본 발명은 체세포 배아의 배수도가 실질적으로 균일한 비-다우커스(Daucus) 체세포 배아 현탁 배양물을 제공한다.

또한, 본 발명은 실질적으로 소정의 배수도를 갖는 체세포 배아 현탁 배양물로부터 유도되어 실질적으로 균일한 배수도(예, 이배체 식물 또는 사배체 식물)를 갖는 식물을 제공한다.

본 발명은 필수 구성요소로써 캘러스 조직 및/또는 고체 배지의 사용에 의존하지 않는, 외식편 물질로부터 대량으로 진 체세포 배아를 수득하는 보다 확실한 수단을 제공한다.

본 발명의 상기 목적 및 기타 목적들은 하기의 설명과 실시예를 통해 명백하게 알 수 있을 것이다.

〈상세한 설명〉

본 발명은 외식편 물질로부터 전배형성물(pro-embryogenic mass; PEM)의 형성을 촉진하는 방법에 있어서 PEM이 생존가능한 체세포 배아를 산출할 수 있으며, 유효량의 오옥신 또는 오옥신들의 혼합물을 포함하는 액체 식물 조직 배양배지와 비-캘러스 식물 조직을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 전배형성물(PEM)의 형성을 촉진시킨다는 것은 PSM 형성을 유발할 수 있거나 및/또는 PEM 생물량을 증가시킬 수 있음을 의미한다.

사용된 외식편 물질은 쌍자엽 식물종 또는 단자엽 식물종일 수 있다. 외식편 물질은 쌍자엽 식물종으로부터 유래된 것이 바람직하다. 통상, 체세포 배아는 전배형성물들(PEMs)로부터 유래되며, PEMs의 구조는 캘러스 물질과는 형태학적으로 다르며, 분열조직 응집체로도 알려져 있다. PSMs는 이들이 유래된 외식편 물질과 동일한 배수도(들)를 갖는다. 따라서, 이배체 식물로부터 이배체 세포 및 사배체 세포를 포함하는 외식편 물질을 취한 경우, 그 결과 생성된 이배체 및 사배체 PEMs는 추가로 액체 배지에서 배양하기 전에 체질(sieving), 세포 분류 등을 통해 분리되어야 할지도 모른다.

PEMs는 실질적으로 분화된 성장 식물 조직을 포함하고, 진 체세포 배아의 전구 물질로 간주될 수 있다. 광학 현미경(40 배율 내지 100 배율)하에서 PEMs는 작은 액포를 포함하는 세포질이 풍부한 작은 원형의 세포 집괴(conglomerate)모양이다. 본 발명의 상기 PEMs는 유전적 관점에서 그들이 유래된 식물의 모세포와 실질적으로 동일하다고 간주될 수 있으며, 궁극적으로 배아가 뿌리 및 어린싹의 분열 조직으로부터 뿌리 또는 어린 싹을 생성시키는 능력을 가진 양극성으로 간주될 수 있는 진 체세포 배아를 산출한다. 따라서, 생존가능한 진 체세포 배아는 적어도 하나의 묘목을 생성시킬 수 있으며, 당업계에서 통상적으로 사용하는 바와 같이 적절한 추가 처리를 수행하는 경우 이 묘목은 유전학적으로 말하자면 그것이 유래된 이식 조상 세포 물질과 실질적으로 동일하다.

본 발명의 방법에 사용하기에 적당한 식물 조직 물질은 임의의 식물 기관 또는 이의 부분 또는 기타 적절히 분화된 식물 조직, 예를 들면 원형질체로부터 수득될 수 있는 외식편 물질이다. 이러한 조직은 줄기, 잎, 꽃잎, 배축 단면, 정단 분열 조직, 자방, 접합성 배아 그 자체, 괴경, 유관속, 내초, 꽃밥 필라멘트 등으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 대안으로서, 적당한 외식편 물질은 체세포 배아 그자체일 수 있다. 식물 조직은 관심있는 임의의 식물종으로부터 취할 수 있고, 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물로부터 선택된 식물 조직을 포함한다. 스위스, 취리히에 소재한 ISTA 에서 1979년 출판하고, 본 명세서에서 참고로 인용되고 있는 J.Bekendam 및 R. Grob의 "Handbook for Seedling Evaluation", 페이지 28∼29와 부록 페이지 122∼126에서 관심있는 식물 종류를 선택할 수 있다. 바람직한 식물 종류는 시클라멘, 호리병박, 라이코페르시콘 바람직하게는 식탁용 또는 식용라이코페르시콘, 알리엄, 베고니아, 베타스, 앵초속 식물, 브라시카스, 고추, 시코륨, 거베라, 임페이션, 락투카스, 오리자스, 펠라고늄, 페투니아, 비올라, 및 제아스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 들 수 있다. 가장 바람직한 식물 종류는 시클라멘, 호리병박, 베타 불가리스(사탕 무)등과 같은 베타스, 비 올레라세아 또는 비.나푸스 등과 같은 브라시카스, 비올라, 펠라고늄 및 고추로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 방법에 사용하기 적합한 액체 식물 조직 배양 배지는 배형성을 유발 및/또는 촉진하기 적합한 임의의 액체 식물 조직 배양 배지일 수 있다. 당 분야에서 통상적으로 사용하는 기본 배지의 예로는 감보르그의 B5 배지(B5), 무라시지와 스쿠그 배지(MS) 및 이들의 변형을 포함한다.

본 발명은 PEM 형성을 유도할 수 있기에 충분한 량의 오옥신을 초기 유도 단계에서 외식편 물질 또는 기타 적절한 출발 물질을 함유하는 적당한 액체 배양 배지에 첨가하고, 이러한 초기 유도 단계 이후에, 적당한 간격으로 오옥신 농도가 보충되어 PEM 성장 및 증식을 촉진시킬 수 있는 추가의 적당한 액체 배양 배지를 사용하는 것을 예상한다. 따라서, 당업계에 알려진 표준 HPLC 기술을 사용하여 시간 경과에 따른 오옥신 농도를 모니터링하여 현탁액의 발생 상태가 PEM 농도로 정해지도록 확실하게 하는 것이 유리하다. 또한, 식물 조직 배양 배지에 너무 많은 양의 오옥신을 첨가하지 않아, 오옥신의 독성 부작용을 회피하고 생존가능한 상태로 PEM을 유지할 수 있도록 하는 것이 중요하다.

PEM 성장 및 증식용 액체 식물 조직 배양 배지는 초기 유도 단계 식물 조직 배양 배지일 수 있는데, 여기서 오옥신 농도 및/또는 기타 주성분들이 적당한 간격으로 단순히 보충되어 체세포 배형성의 유도 및 촉진 단계가 일어날 수 있으며; 또한, 초기 유도 단계 배지는 적당한 간격으로 적절한 오옥신 농도를 함유하는 새로운 식물 조직 배양 배지로 대체될 수 있고, 따라서 액체 식물 조직 배양 배지는 초기에 사용된 적당하나 다른 액체 식물 조직 배양 배지와 동일하거나 다를 수 있다. 따라서, 식물 조직 배양 배지(들)가 액체이고 적절한 오옥신 농도의 존재하에서 PEM 형성을 유도 및/또는 촉진하는데 사용할 수 있는 것인 한, 사용된 실제 식물 조직 배양 배지(들) 종류는 본 발명에서 중요하지 않다는 것을 알 수 있다.

또한, 필요한 오옥신의 농도는 식물종에 따라 달라질 것이고 식물 변종에 따라 달라질 수 있음을 쉽게 알 수 있다. 주어진 변종에 대한 최적의 결과를 얻기 위한 오옥신의 종류 및 농도는 표준 테스트에 의해 결정할 수 있다. 식물 변종에 따라 오옥신들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 오옥신 및 오옥신-유사 화합물의 예로는 인돌 아세트산, 인돌 부티르산, 나프탈렌 아세트산 및 이들의 혼합물이 있다. 오옥신의 농도는 PEMs의 성장 및 형성을 촉진시킬 정도의 농도로 유지한다.

오옥신 농도는 PEM의 수 또는 생물량 및 관심있는 식물종에 따라 약 0.1 mg/l 내지 약 30 mg/l의 농도로 유지되는 것이 바람직하다. 오옥신들의 적당한 혼합물은 NAA 및 2,4-D를 적당한 농도로 포함할 수 있다. 관심있는 식물종에 따라 나프탈렌 아세트산(NAA)의 유효 오옥신 농도는 일반적으로 약 0∼20 mg/l이고, 2,4-D의 유효 오옥신 농도는 약 0.1 mg/l 내지 약 10 mg/l이다. 예를 들면, 시클라멘 PEMs은 NAA를 필요로 하지 않지만 약 5∼10 mg/l의 초기 농도의 2,4∼D를 필요로 한다. 라이코페르시콘 PEMs은 초기 농도 20 mg/l의 NAA와 초기 농도 1 mg/l의 2,4-D를 필요로 한다.

사용된 식물 변종 및 식물 조직 배양 배지에 따라, 오옥신 함유 배지에 비-식물유해량의 시토키닌을 첨가하여 오옥신 흡수를 촉진시키는 것이 바람직할 수 있다.

또한, 본 발명은 현탁 배양물에서 실질적으로 동일한 배수도의 체세포 배아를 수득하기 위한 방법을 제공하며, 이 방법은 하기 단계 i) 내지 iv)를 포함한다:

i) 전배형성물(PEM) 형성의 유도를 촉진시키기에 충분한 유효량의 오옥신 또는 오옥신 혼합물을 포함하는 액체 식물 조직 배양 배지와 접촉시켜 외식편 물질을 배양하는 단계,

ⅱ) 적당한 오옥신 함유 액체 식물 조직 배양 배지와 접촉시켜 상기 단계 i)에서 얻은 PEMs의 숫자를 증대시키는 단계,

ⅲ) 상기 단계 ⅱ)에서 수득된 PEMs를 수집하고 이들을 실질적으로 오옥신이 없는 액체 배지에 배치하는 단계, 및

ⅳ) 상기 단계 ⅲ)에서 형성된 PEM 유래의 배아를 수집하는 단계.

상기 방법 중 단계 i) 및 ⅱ)는 전술하였다. 이들은 예를 들어 다음과 같이 수행될 수 있다:

관심있는 종에 따라 약 0.1 mg/l 내지 약 30 mg/l의 농도로 오옥신 또는 오옥신들의 혼합물을 함유하는, B5 배지 또는 MS 배지와 같은 적당한 액체 배지에 외식편 물질을 배치하는데, 이는 PEM 형성을 유도하는데 효과적이다. 외식편 물질을 배양액 1 ℓ 당 0.01 g 생체중 내지 약 100 g 생체중, 바람직하게는 배양액 1 ℓ 당 1.0 g 생체중 내지 약 10 g 생체중의 적당한 밀도로 수주 정도의 시간 기간 동안 즉, PEM이 출현하는 시간 동안 배양한다. 배양 기간은 관심있는 식물종에 따라 약 2주 내지 약 14주 또는 그 이상일 수 있고, 통상적으로는 약 4주 내지 약 8주이다. 통상 수득된 PEMs를, 예컨대 배지 희석 또는 배지 교환을 통해 초기 외식편 물질 배양물로부터 분리하고, 동일 또는 유사한 새로운 액체 배지에서 추가로 배양한다.

수득된 PEMs는 PEM 형성을 유도하는데 필요한 배지와 동일 또는 유사한 주위 조건하에서 즉각적으로 성장 또는 증식 단계에 들어 갈 수 있다. 편의상, 상기 단계는 본 명세서에서 증식 단계로 지칭하는데, 이는 PEM 수 또는 PEM 생물량의 증가량을 모니터링한 결과 성장하는 것으로 나타났기 때문이다.

PEM 형성의 유도가 관찰된 후 액체 식물 조직 배양 배지를 모니터링하여 현저한 PEM 발생 없이 PEM 성장 및 증식을 촉진시키기에 충분한 수준으로 오옥신 농도를 유지하도록 한다. 증식 단계에서는 특선한 액체 식물 조직 배양 배지를 정규적으로 희석하여 계대배양함으로써, 적당한 시간 간격 동안 PEM 증식을 촉진시키는데 충분한 농도로 오옥신 농도를 조절한다. 별법으로, PEMs를 초기 외식편물질 배양물부터 분리하여 오옥신 함유 식물 조직 배양 배지에 배치시키고 공급 배치(fed-batch) 또는 연속 배양 시스템을 사용하여 소정의 PEM 생물량으로 간단하게 증식시킬 수 있다. 통상, 이 경우 상기 기간동안 오옥신 농도를 약 0.1 mg/l 이상으로 유지한다. 증식 단계에 소요되는 기간은 얼마나 많은 PEM들이 진 체세포 배아로 전환되는데 필요한지에 좌우되어 수년이 걸리 수도 있으나, 일반적으로 증식 단계는 요구된 PEM 생물량의 양에 따라 약 2 내지 약 30주와 같이 수 개월 또는 수주가 걸린다. 일단, 증식 단계에 있는 PEM들은 어느 때이고 수집하여 실질적으로 오옥신이 없는 식물 조직 배양 배지로 옮겨, 이어서 진 체세포 배아로 발생시킬 수 있다. 본 명세서에서 언급한 바와 같이, 체질을 할 수 있는데, 즉, 적절한 크기의 체(예, 구멍 크기가 150 ㎛인 체)에는 통과할 수 있으나, 그 보다 작은 크기의 체(예, 구멍 크기가 100 mm인 체)에는 남아있는 특정 크기의 PEM 분획을 선택할 수 있다.

적당한 탄소 에너지 공급원, 편의상 수크로오스, 글루코오스 또는 라피노스등의 가용성 탄수화물을 액체 식물 조직 배양 배지에 보급함으로써 PEM 형성 및 증식에 유리한 영향을 준다. 통상의 탄수화물 농도는 (식물 조직 배양 배지 1ℓ당) 15 g/ℓ 내지 90 g/ℓ, 바람직하게는 20 g/ℓ 내지 60 g/ℓ이다.

증식 단계는 플라스크 또는 생물 반응기내(bioreactor)에서 수행할 수 있다. 생물 반응기는 2 차 세포 대사 산물을 제조하기 위한 세포 현탁액을 배양하는 분야에서는 알려져 있으나, PEM 배양에 생물 반응기를 사용하는 기술은 현재까지 개시되지 않았다. 본 발명자는 비교적 짧은 시간내에 다량의 PEMs를 생성시키는데 생물 반응기가 유용할 수 있다는 사실을 밝혀냈다.

편의상, 적당한 생물 반응기에서, PEM 현탁 배양물로부터 팩킹된 세포 용량을 충분한 양의 적절한 탄소 에너지 공급원, 예를 들면 수크로오스, 글루코오스 및 라피노스를 관심있는 PEM 종에 따라 약 15 g/l 내지 약 90 g/l 또는 그 이상, 바람직하게는 약 20 g/l 내지 약 60 g/l 함유한 적당한 배지내에 접종하였다. 프레일(Preil W.) 및 베크(Beck A.)의 문헌 [(1991) Acta Horticulturae 289, Plant Technology: 179∼192]은 진동 혼합기(vibromixer)를 사용하는 생물 반응기에서의 체세포 배형성에 관해 기술하였으나, 상기 연구에는 PEMs가 체세포 배아로 발생되기 전에 PEM 형성 및 증식을 수행하는 것에 대해서는 언급한 바 없다. PEM 현탁 배양물에 생물 반응기내의 진동 혼합기를 사용하면, PEMs 수명의 연장을 크게 증가시키고, PEM 생물량을 증가시키는데 조력하며, PEM 생물량 손실을 감소시키고, PEMs의 응집화를 방지한다는 것을 발견하였다. 생물 반응기내 고정된 평면에 위치한 천공형 혼합 플레이트 또는 교반 디스크(각각 네덜란드의 Applikon BV 및 스위스의 Chemap AG에서 시판)를 장착한 진동 혼합기는 실질적으로 고정된 평면을 진동시켜 PEM 생물량을 크게 손실함이 없이 PEM 현탁액 배양물을 혼합 또는 교반시킨다.

진동 혼합기는 실질적으로 수직 평면으로 진동하는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법에 사용하는 진동 혼합기의 통상 작동 진동수는 50 Hz이고, 진폭은 ±6 mm 또는 그 이하로 하는 것이 편리하다. 소정의 체세포 배아 수를 산출할 수 있는 PEM 생물량이 일단 얻어지면, PEM들을 실질적으로 오옥신이 없는 액체 식물 조직 배양 배지와 접촉하게 배치하여 체세포 배아로 발생하게 할 수 있다.

PEM 현탁액은 통기(通氣)시키는 것이 바람직하다. 통기는 공지된 방법 그자체로 실시될 수 있다. 진동 혼합기가 사용되는 경우에, 다공성 살포 장치를 사용하여 진동 혼합기 반응기내에 공기를 살포할 수 있다.

전술한 내용 및 실시예들로부터 알 수 있듯이, 오옥신의 종류 및 농도, 시토키닌의 존재, 에너지(탄수화물) 공급원, 교반 또는 진동 진동수, 산소 공급, 빛의 강도 및 파장 등의 다양한 변수에 대한 최적 조건은 사용된 식물 물질에 따라 크게좌우될 것이다. 이러한 최적 조건은 표준 테스트(실시예에서 설명한 바와 같음)를 사용하여 결정할 수 있다. 본 발명에 따라 체세포 배아를 수득하기 위한 방법 중 추후 단계인 ⅲ) 및 ⅳ)는 다음과 같이 수행할 수 있다:

PEM의 체세포 배아로의 발생을 촉진하는 것은 오옥신이 없는 식물 조직 배양 배지내에 PEMs를 배치함으로써 달성할 수 있다. 생존가능한 PEMs는 체세포 배아로 발생될 수 있다. 오옥신이 없는 배지로 옮기기 전에, 예를 들면 나일론 메쉬를 통해, PEMs를 체질하여 소정의 체세포 배아를 가장 효과적으로 발생시키는 PEM 크기 분획을 선택하는 것이 바람직하다. 비-생존가능성 PEMs의 함량이 너무 과다한 경우에는 체세포 배아 형성이 억제될 것이다. 일반적으로, 5% 이상, 바람직하게는 10% 이상, 더욱 바람직하게는 15% 이상의 생존가능성 PEMs를 함유하는 PEMs를 사용하는 것이 바람직하다. 최적 크기의 분획은 표준 체질 테스트에 의해 결정할 수 있다.

선택된 크기의 PEM은 예를 들면 체질 또는 당업계에서 공지된 기타 임의의 크기 분류 수단을 사용하여 수집할 수 있다. 숙련된 자는 바람직한 크기의 PEMs(예, 생존가능한 PEMs를 고함량으로 갖는 PEM 분획)를 본 명세서에서 기술한 바와 같이 종에 따라 다를 것이라는 것을 알 수 있을 것이다.

규정 크기 범위의 PEMs를 얻기 위해, PEMs의 체질된 분획물은 기지의 구멍 크기의 그물 메쉬, 예를 들면 나일론 메쉬 등의 여과 수단에 PEMs를 통과시켜 수득된 것이다. PEMs는 식물 종에 따라 직경이 최대 약 1 mm까지의 임의의 크기일 수 있으나, PEMs의 응집물은 직경이 최대 5 mm일 수 있다. 일반적으로, 개개의 PEMs의 소정 크기는 ㎛ 정도이다. PEMs의 크기는 이들로부터 유래된 단일의 체세포 배아를수득하는데 중요하다는 것이 밝혀졌다. 수집된 PEM 분획은 그 안에 있는 각 PEM이 적절한 조건하에서 하나의 체세포 배아를 생성할 수 있는 것이 바람직하다. 당연히, 체질된 생존가능한 특정 PEM 분획의 크기는 식물종에 따라 달라진다. 예를 들면, 오이에 있어 가장 유용한 PEM 분획은 PEMs가 약 100 ㎛ 내지 약 150 ㎛ 사이의 크기를 갖는 것이다. 시클라멘에 있어서, PEM 분획은 약 150 ㎛ 내지 약 300 ㎛이다. 바람직한 PEM 분획은 각 PEM이 하나 이상의 체세포 배아, 바람직하게는 단일의 체세포 배아를 생성할 수 있는 것이다.

실질적으로 오옥신이 없는 액체 식물 조직 배양 배지는 PEMs를 체세포 배아로 발생될 수 있도록 하는 배지이다. 따라서, 실질적으로 오옥신이 없는 액체 식물 조직 배양 배지는 잔량의 오옥신이 존재하나 실질적으로 PEMs가 체세포 배아로 발생하는 것을 방해하지 않는 오옥신-고갈된 식물 조직 배양 배지일 수 있거나, 오옥신이 없는 식물 조직 배양일 수 있다는 것을 내포하고 있다. 당연히, 숙련된 자는 얼마나 많은 체세포 배아가 요구되는지에 따라 실질적으로 오옥신이 없는 식물 조직 배양 배지를 플라스크 또는 적당한 생물 반응기, 예를 들면 진동 혼합기가 장착된 생물 반응기내에 배치할 수 있다는 것을 알 것이다. 이어서, 수득된 체세포 배아는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 식물로 전환시킬 수 있다. 따라서, PEM 생물량을 모니터링함으로써 다량의 체세포 배아를 상업적 규모로 얻을 수 있다.

오옥신이 없는 배지는 편의상 15 g/l 내지 90 g/l, 바람직하게는 20 g/l 내지 60 g/l의 농도로 용해성 탄수화물 에너지 공급원을 포함한다. 적당한 탄수화물 에너지 공급원으로는 수크로오스, 글루코오스 및 라피노스가 있다.

시판용 체세포 배아의 양은 소비자의 요구에 따라 수백(예, 500) 내지 수백만(예, 3,000,000) 또는 그 이상의 범위로 걸쳐 있다. 일례로, 약 200,000개의 식물이 요구되는 경우에, PEM 증식은 PEM 생물량이 실질적으로 약 200,000개의 체세포 배아를 산출할 때까지 계속된다. 이어서, 이러한 PEMs는 오옥신이 없는 액체 식물 조직 배양 배지와 접촉시켜 둠으로써, 체세포 배아로 발생될 수 있다.

일단, 진 체세포 배아를 실질적으로 오옥신이 없는 식물 조직 배양 배지에서 발생시키면, 오옥신이 없는 식물 조직 배양 배지로부터 분리시키고 통상 당 분야에서 사용되는 기술을 사용하여 식물로 전환시킬 수 있다.

시판 용도로 사용하기 앞서 체세포 배아를 비생존성 PEMs로부터 분리하는 것이 편리하다. 이것은 공지의 방법 그 자체로 실시될 수 있다. 비생존성 PEMs는 일반적으로 체세포 배아 보다 더 작다. 체세포 배아는 예를 들면 체질 또는 세포 분류에 의한 방법으로 분리될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서는, 실질적으로 배수도가 전부 동일한 체세포 배아를 포함하는 체세포 배아 배치를 제공한다. 체세포 배아 배치는 상업적인 요구에 따라 수백 내지 수만 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 체세포 배아 배치는 실질적으로 이배체 체세포 배아 또는 실질적으로 사배체 체세포 배아를 포함한다. 체세포 배아 배치는 단순히 액체 배지가 유출되고 체세포 배아가 적당한 용기내에 놓여진 체세포 배아의 현탁물일 수 있다. 상기 용기의 주변 환경은 높은 상대 습도, 예를 들면 100%일 수 있고, 0℃ 내지 약 15℃의 적당히 낮은 온도로 유지될 수 있다. 이러한 방식으로 저장된 체세포 배아는 약 최대 4일까지 보존할 수있다. 대안으로, 체세포 배아를 건조, 동결, 펠릿화, 겔에서의 캡슐화 등으로 처리할 수 있다.

또한, 본 발명은 배수도가 실질적으로 전부 동일한 체세포 배아를 포함하는, 다우커스(Daucus)와 상이한 체세포 배아 현탁 배양물을 제공한다. 바람직한 체세포 배아는 이배체 또는 사배체이다. 체세포 배아는 쌍자엽 외식편 물질 또는 단자엽 외식편 물질로부터 유래된 것이다. 이제 하기 실시예에 따라 본 발명을 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예들에 의해 본 발명의 범위는 제한되지 않는다.

실시예 1 :배형성 시클라멘 세포 배양의 유도 및 이로부터 발생된 체세포 배아

시클라멘 변종 종자인 "콘세르토 스칼렛"[술리스 앤드 그루트(Sluis and Groot)] 70% 에탄올(2분 동안)과 1.5% 의 차아염소산나트륨 용액(45분 동안)으로 표면 살균하고, 이어서 살균수로 3회 철저히 세척하였다. 이 종자를 습지 상에 2 내지 4 주 동안 23℃ 온도에서 발아시키고, 출현된 괴경을 외식편 물질로 사용하였다. 3 개의 괴경을 20 g/l의 수크로오스, 10 mg/l의 2,4-D, 100 mg/l의 미오-이노시톨, 1.0 mg/l의 니콘틴산, 1.0 mg/l의 피리독신 HCl, 10 mg/l의 티아민 HCl로 보충된 10 ml 기본 B5 배지(네덜란드왕국, 할렘에 소재한 듀체파 바이오케미에 비브이사에서 시판)에서 23℃, 암실, 100 rpm의 회전식 교반기(미국, 뉴저지주 에디슨에 소재한 뉴 브런스윅 사이언티픽사의 G10 지로로터리 교반기)를 사용하여 배양하였다. 7일 후, 상기 배지를 새로운 배지로 대체하였다. 추가의 7일 후, 상기 배양물을 새로운 배지로 50 ml 부피로 희석(5 배)하였다. 그후 7일 후, 희석된 배양물로부터 나온 괴경 외식편 물질의 유관속 및 내초를 포함하는 중앙 수(central pith)를 괴경 외식편 물질로부터 분리하고, 나머지 괴경과 별개로 20 g/l의 수크로오스, 100 mg/l의 미오-이노시톨, 1.0 mg/l의 니콘틴산, 1.0 mg/l의 피리독신 HCl, 10 mg/l의 티아민 HCl, 5 mg/l의 2,4-D 및 1 mg/l의 키네틴으로 보충된 25 ml의 기본 B5 배지내에서 계대배양했다. 계대배양물을 4주 동안 주당 2배로 희석하였다. 전배형성물이 약 4주 후에 출현하였다. PEMs는 전술한 바와 같이 2주동안 추가로 계대배양함으로써 증식시켰다. PEMs는 20 g/l의 수크로오스, 100 mg/l의 미오-이노시톨, 1.0 mg/l의 니콘틴산, 1.0 mg/l의 피리독신 HCl, 10 mg/l의 타아민 HCl로 보충된, 오옥신 및 시토키닌 부재의 B5 배지상에 추가로 배양함으로써 생존가능성 있는 진 체세포 배아로 발생할 수 있었다.

실시예 2 :배형성 시클라멘 세포 현탁 배양물의 유도 및 이로부터 발생된 체세포 배아

시클라멘 종자를(자두니에 비브이의 콘세르토 스칼라켄 오델로) 70% 에탄올(2분 동안)과 1% 의 차아염소산나트륨 용액(45분 동안)으로 표면 살균하고, 살균수로 3회 철저히 세척하였다. 상기 종자를 습지 상에 2 내지 5주 동안 23℃의 암실에서 발아시켰다. 출현된 괴경을 외식편 물질로 사용하고 2 내지 8 조각으로 잘랐다. 외식편 물질의 배수도는 드 라트(De Laat A,A,M)등의 문헌[(1987)Plan Breeding 99:303∼307]에 기재된 방법에 따라 측정하여, 이배체임을 확인하였다.

세개의 괴경에서 취한 외식편 물질을 50 ml 플라스크내에 20 g/l의 수크로오스, 5 mg/l의 2,4-디클로로페녹시아세트산 및 1 mg/l의 키네틴으로 보충된 10 ml의기본 B5 배지(네덜란드 할렘에 소재한 듀체파 바이오케이에 비브이사 제품)에서 23℃, 암실, 회전식 교반기(100 rpm)를 사용하여 배양시켰다. 모든 플라스크는 알루미늄 호일로 커버하였다. 1주후 상기 배양물을 20 g/l의 수크로오스, 5 mg/l의 2,4-D, 100 mg/l의 미오-이노시톨, 1.0 mg/l의 니코틴산, 1.0 mg/l의 피리독신 HCl, 10 mg/l의 티아민 HCl 및 1 mg/l의 키네틴으로 보충된 기본 B5 배지로 5 배 희석하여 250 ml의 플라스크내에 용량이 50 ml가 되었다. 추가의 2주후 상기 배양물은 PEMs를 포함하였는데, 큰 노즐을 갖는 피펫으로 배양물의 나머지 부분으로부터 PEM을 분리하고, 개별적으로 배양하였다. PEMs는 주로 작은 원형의 세포질 세포로 구성된 세포 응집물로서 육안으로 확인되었다. 이 단계에서 PEMs는 단일의 세포 응집물 또는 서로 결합된 다수의 세포 응집물로 확인되었다. 큰 노즐을 갖는 피펫을 사용하여 20 g/l의 수크로오스, 5 mg/l의 2,4-D, 100 mg/l의 미오-이노시톨, 1.0 mg/l의 니코틴산, 1.0 mg/l의 피리독신 HCl, 10 mg/l의 티아민 HCl 및 1 mg/l의 키네틴으로 보충된 기본 B5 배지내에 1 ml의 팩킹된 세포를 250 ml의 플라스크에 접종하여 최종 부피 50 ml가 되도록 함으로써 상기 배양물을 2주마다 계대배양시켰다. 팩킹된 세포 용량(PCV), 즉 PCV_초기및 PCV_최종에 대한 원심분리후 총 세포량은 배양물에서 취한 시료를 2분 동안 700x g로 원심 분리함으로써 측정하였다. 배형성 세포주는 일반적으로 슈레겔(Schlegel, H,G.)의 문헌 [(1981) Allgemeine Microbiologie, Thieme, Stuttgart, 페이지 190]에 기재된 식을 사용하여 PCV_초기및 PCV_최종의 측정치로부터 계산된 바와 같이, 약 4 내지 6일간의 배가 시간(doublingtime)으로 성장하였다. 이 방법으로 얻은 배형성 세포주는 45주 이상 유지되었고, 유전적으로 안정하며, 즉 배수도는 외식편 물질 출처의 배수도와 동일한 이배체이었다.

구멍 크기가 각각 250 ㎛ 및 100 ㎛인 나일론 메쉬를 통해 PEM 배양물을 체질함으로써 PEMs를 선별하였다. 계대배양하고 8일후 가장 높은 수의 PEMs/ml가 얻어졌다. 이 분획은 최적의 배아 발생을 나타냈으며, PEM 배양물의 PCV당 가장 높은 수의 배아를 산출하였다. 체질된 PEMs의 수는 일반적으로 PCV 1 ml 당 1000 내지 5000 PEMs 범위이었다.

체질후, PEMs를 세척하고 발생 배지, 즉 수크로오스 또는 글루코오스가 174 mM 농도로 보충된 MS 또는 B5 배지에 접종하였다. 25 내지 50 PEMs/ml를 알루미늄 호일 및 네스코필름(일본, Bando Chemicals Ind. LTD)으로 밀봉된 플라스크에서 배양하였다. 3주 내지 4주 후, 접합성 배아와 닮은 토르페도 형태의 배아가 형성되었다. 이 방법을 사용하여 250,000개의 배아를 생성시켰다. 상기 드 라트(De Laat A.M.M)에서 기재한 바와 같은 유등 세포 계수 분석법을 사용하여 배아 배양물 중 무작위 시료에 대해 500개의 체세포 배아의 DNA 함량을 평가했다. 모든 배아는 이배체임이 확인되었다.

시클라멘 배아의 전환(즉, 발아)은 괴경 형성 및 이후 부정근 형성을 포함하며, 액체 배지, 즉 각각 116 mM 또는 58 mM 함량의 글루코오스 또는 수크로오스를 갖는 MS 또는 B5 배지 상에서 배아를 배양함으로써 유도되었다. 괴경 형성은 괴경 또는 괴경 유사 구조의 배축으로부터의 발생으로써 정의된다. 제1엽을 형성하는 떡잎의 추가 발생은 액체 배지 또는 진주암, 살균된 토양 등의 고체 배지에서 일어날 수 있다.

전환된 배아를 살균 조건(탄소 공급원이 존재함)하에서 또는 비살균 조건(첨가된 탄소 공급원이 없음)하에서 진주암 또는 화분 토양에 직접 심었고 18°내지 20℃의 암실에서 2 내지 4주후 떡잎이 형성된 것을 관찰하였다. 약 90%의 높은 상대 습도를 이용하였다. 배아의 90% 이상이 살균 조건하에서 떡잎 단계로 전환되었다. 떡잎이 나타난 묘목을 온실로 옮기기 전에 빛에 놓아서 튼튼하게 하였다.

실시예 3 :배형성 토마토 세포 배양의 유도

토마토 변종 종자인 "맨하탄" (슬리스 앤드 그루트)을 70% 에탄올(2분 동안) 및 1.5%의 차아염소산나트륨 용액으로 15분 동안 표면 살균한 다음 살균수로 3회 철저히 세척하였다. 이 종자를 습지상의 23℃에서 3 일에 걸쳐 발아시켰다. 완전한 묘종을 수집하고, 각 묘종을 4 조각으로 잘라 외식편 물질로서 사용하였다. 10 개의 묘종을 상기 방식으로 잘랐고, 20 g/l의 수크로오스, 20 mg/l의 NAA, 1 mg/l의 2,4-D, 1 mg/l의 키네틴, 100 mg/l의 미오-이노시톨, 1 mg/l의 니코틴산, 1 mg/l의 피리독신 HCl 및 10 mg/l의 티아민 HCl로 보충된 15 ml의 액체 기본 B5 배지(네덜란드 왕국, 할렘에 소재한 듀체파 바이오케미에 비브이 사에서 시판)내에서 23℃, 100 rpm의 회전식 교반기를 사용하여 16 시간의 명 기간과 8 시간의 암 기간 주기로 항온배양하였다. 당업계에 공지된 HPLC 기술을 이용하여 오옥신 농도에 대하여 배양 배지를 모니터링하였다. 약 7일 후, 오옥신 농도가 0.1 mg/l 이하로 떨어지면, 20 g/l의 수크로오스, 20 mg/l의 NAA, 1 mg/l의 2,4-D, 1 mg/l의 키네틴, 100mg/l의 미오-이노시톨, 1 mg/l의 니콘틴산, 1 mg/l의 피리독신 HCl 및 10 mg/l의 티아민 HCl로 보충된 15 ml의 새로운 기본 B5 배지(네덜란드 왕국, 할렘에 소개한 듀체파 바이오케미에 비브이 사에서 시판)을 첨가하여 배양물의 용량이 30 ml가 되도록 하였다. 상기 배양물을 4 내지 7일마다 외식편 물질과 세포들을 15분 동안 침전시키고 사용된 배지의 15 ml를 따라 낸 다음 15 ml의 새로운 배지로 새로 보충함으로써 계대배양하였다. 외식편 물질의 초기 배양한지 약 4 내지 7 주 후에, 전배형성물(PEMs)이 관찰되었다.

PEMs 를 전술한 바와 같이 2주 기간 동안 추가로 계대배양함으로써 증식시켰다. 이 PEMs를 NAA, 2,4-D 및 키네틴을 제외하고는 전술한 것과 동일하게 보충된 오옥신 부재의 기본 B5 배지상에서 추가로 계대배양하였고, 진 체세포 배아가 관찰되었다.

실시예 4 :배형성 토마토 세포 배양의 유도

토마토 변종 종자인 "마조르카" (술리스 앤드 그루트)를 70% 에탄올(2분동안) 및 1.5%의 차아염소산나트륨 용액으로 15분간 표면 살균한 다음, 살균수로 3회 철저히 세척하였다. 상기 종자를 습지상에서 23℃의 암실 조건하에서 7일 동안 발아시켰다. 떡잎은 수집하여 조각으로 잘라서 외식편 물질로 사용하였다. 3개의 묘종 떡잎 6개를 상기 방식으로 자르고, 4 mg/l의 2,4-D 및 0.5 mg/l의 키네틴으로 보충된 15 ml의 액체 배지 A(표 1 참조)내에서 23℃, 100 rpm의 회전식 교반기를 사용하여 배양하였다. 14일 후, 전술한 바와 같은 호르몬을 포함하는 35 ml 의 새로운 배지 A(표 1 참조)를 첨가하였다. 상기 배양물을 전술한 바와 같은 호르몬으로 보충된 새로운 배지 A(표 1 참조)로 2배 희석함으로써 14일 마다 계대배양하였다. 외식편 물질의 초기 배양후 약 4 주후 PEMs가 관찰되었다. PEMs를 전술한 바와 같이 추가로 제대배양함으로써 증식시켰다.

표 1 : 배지 A 의 조성

주 성분g/l

NH₄NO₃1.20

(NH₄)₂SO₄0.66

KH₂PO₄0.55

KNO₃1.01

MgCl₂·6H₂O 0.30

CaCl₂0.22

시트르산 0.5

수크로오스 20

미량 성분 2 ml 원액/l

비타민 감보르그 B5(1mg/l) 1 ml 원액/l

KOH(1 몰)을 사용하여 pH를 5.8로 조절함.

미량 성분 (원액) g/1

FeSO₄·7H₂O 6.9

CuSO₄·5H₂O 0.65

CoCl₂·6H₂O 0.12

MnCl₂·4H₂O 2.97

NaMoO₄·2H₂O 0.24

KI 0.041

HBO₃1.5

ZnSO₄·7H₂O 4.3

NiSO₄·6H₂O 0.39

시트르산 2

pH = 2.3

g24

비타민 감보르그 B5 (듀체파) ; 원액

보충물 :

미오-이노시톨 100 g/l

니코틴산 1 g/l

티아민-HCl 1 g/l

실시예 5 :배형성 오이 세포 현탁 배양의 유도 및 이로부터 발생된 체세포 배아

오이 변종 종자인 "판도렉스"(술리스 앤드 그루트)를 70%의 에탄올 용액(2분 동안) 및 1.5% 차아염소산나트륨 용액(45분 동안)으로 표면 살균한 다음, 살균수로 3회 철저히 세척하였다. 상기 오이 종자를 습지상에서 2일 동안 23℃에서 발아시켰다. 종자로부터 출현된 어린 뿌리를 외식편 물질로 사용하였다. 15개의 어린 뿌리를 20 g/l의 수크로오스, 2 mg/l의 2,4-D 및 1 mg/l의 키네틴으로 보충된 10 ml의 기본 액체 MS 배지 + 비타민류(네덜란드 왕국, 할렘에 소재한 듀체파 바이오케미에 비브이 사에서 시판)에서 23℃, 암실, 100 rpm의 회전식 교반기를 사용하여 배양하였다. 배양물 배지를 당업계에서 공지된 HPLC 기술을 이용하여 오옥신 농도에 대해 모니터링하였다. 오옥신 농도가 0.1 mg/l 이하로 떨어진지 약 5일 후, 상기 배양물을 20 g/l의 수크로오스, 2 mg/l의 2,4-D 및 1 mg/l의 키네틴으로 보충된 50 ml의 기본 액체 MS 배지 + 비타민류(네덜란드왕국, 할렘에 소재한 듀체파 바이오 케미에 비브이 사에서 시판)로 5배 희석하였다. 배양물을 20 g/l의 수크로오스, 2 mg/l의 2,4-D 및 1 mg/l의 키네틴으로 보충된 기본 액체 MS 배지 + 비타민류(네덜란드왕국, 할렘에 소재한 듀체파 바이오 케미에 비브이사에서 시판)로 2배 희석함으로써 2 주간 계대배양하였다. 8주 후, 전배형성물이 나타났다.

이어서, 10 mg/l의 2,4-D 및 0.5 mg/l의 키네틴으로 보충된 50 ml의 배지 A(표 1)에서 2주 마다 0.4 ml의 충전된 세포 부피량을 접종함으로써 PEM 배양물을 추가로 계대배양하였다. 오이 세포주의 배가 시간은 슈레겔(상기 참조)의 식을 사용하여 측정된 바와 같이 약 2.7일이었다. 100∼150 ㎛ 크기의 PEMs을 얻기 위해 구멍의 크기가 각각 150 ㎛ 및 100 ㎛인 나일론 메쉬를 통해 배양물을 체질함으로써PEMs를 선별하였다. 100∼150 ㎛ 분획은 PEM 배양물의 단위 PCV 당 가장 높은 수의 단일 체세포 배아를 산출하였다. 이러한 세포주에서 취한 PEMs는 이배체 또는 사배체이었다. 이배체와 사배체 세포간의 비율은 상기 드 라트등의 방법에 의해 측정된 바와 같이 2년에 걸친 시간 동안 10 mg/l의 2,4-D 및 0.5 mg/l의 키네틴으로 보충된 액체 배지 A 에서 일정하게 보존되었다. PEMs는 이배체 뿐만아니라 사배체 식물도 생성한다. 측정된 이배체 : 사배체 비율은 PEMs 뿐만아니라 식물에도 반영된다.

20 g의 수크로오스 및 5 μM의 ABA로 보충된 오옥신 및 시토키닌 부재의 MS 배지상에 PEMs를 배양함으로써 PEMs가 진 체세포 배아로 발생되었다.

실시예 6: 100% 이배체 또는 100% 사배체 현탁 배양물을 얻기위해 배형성 오이 세포주를 조작하기.

실시예 5의 현탁물은 배수도가 동일한 배아의 발생을 야기하는 이배체 및 사배체 PEMs로 구성되어 있다.

직경이 약 2 mm인 개개의 PEMs를 실시예 5의 방법에 따라 유도된 13주 경과된 세포 현탁물로부터 선별하였다. 드 라트 등의 문헌[(1987) Plant Breeding 99, 303∼307]에 기재된 방법에 따라 개개의 PEMs의 배수도를 측정한 결과, PEMs가 100% 이배체 또는 100% 사배체 임을 보여주었다. 실시예 5에서 기술한 바와 같은 기본 M5 액체 배지에서 15주(즉, 격주로 계대배양함)의 기간에 걸쳐 개개의 PEMs를 추가로 배양한 결과, 상기 드 라트 등의 방법을 사용하여 측정한 것과 동일한 100% 이배체 또는 100% 사배체를 포함하는 세포주를 얻었다. 이배체 PEMs는 이배체 배아 및 이배체 식물을 생성하였다. 사배체 PEMs는 사배체 배아 및 사배체 식물을 생성하였다.

실시예 7: 100% 이배체 또는 100% 사배체의 현탁 배양물을 얻기 위해 배형성 오이 세포주를 조작하기.

오이 변종 식물 "판도렉스"(술리스 앤드 그루트)를 실시예 3의 방법을 사용하여 살균 조건하에서 성장시켰다. 약 1 cm 크기의 자방을 외식편 물질로 사용하였다. 전술한 드 라트 등의 방법에 따라 배수도를 측정함으로써 상기 외식편 물질이 완전한 이배체임을 확인하였다. 과실의 약 반을 약 0.5 mm 두께로 얇게 절단하여 23℃의 암실에서 100 rpm으로 회전식 교반기를 사용하여 20 g/l의 수크로오스, 2 mg/l의 2,4-D 및 1 mg/l의 키네틴으로 보충된 10 ml의 기본 액체 MS 배지 + 비타민류(네덜란드왕국, 할렘에 소재한 듀체파 바이오 케미에 비브이 사에서 시판)에서 배양하였다. 배양 배지를 당업계에서 공지된 HPLC 기술을 이용하여 오옥신 농도를 모니터하였다. 오옥신 농도가 0.1 mg/l 이하로 떨어진 지 약 85 일후, 배양물을 20 g/l의 수크로오스, 2 mg/l의 2,4-D 및 1 mg/l의 키네틴으로 보충된 기본 액체 MS 배지 + 비타민류 (네덜란드왕국, 할렘에 소재한 듀체파 바이오 케미에 비브이 사에서 시판) 50 ml 로 5배 희석하였다. 배양물을 전술한 바와 같이 보충된 MS 배지로 2배 희석함으로써 2주마다 계대배양하였다.

8주 후 전배형성물이 출현하였다. PEM 배양물을 실시예 5에서 기술한 바와 같이 10 mg/l의 2,4-D 및 0.5 mg/l의 키네틴으로 보충된 배지 A(표 1)로 계대배양하였다. 0.4 ml의 팩킹된 세포 용량을 10 mg/l의 2,4-D 및 0.5 mg/l의 키네틴으로 보충된 50 ml의 배지 A에 접종하였다. 오이 세포주의 배가 시간은 슈레겔(상기 참조)의 식을 사용하여 측정하였을 때 배지 A(표 1)에서 약 2.7일이었다. PEM 현탁물의 배수도는 전술한 드 라트 등의 방법에 따라 측정하였고 그 결과 이배체임이 밝혀졌다. PEMs를 나일론 메쉬를 통해 배양물을 체질함으로써 100∼150 ㎛ 크기의 PEMs를 선택하였다. 선택된 PEMs를 20 g/l의 수크로오스로 보충된 오옥신 및 시토키닌이 부재의 MS 배지상에 배양함으로써 PEMs가 진체세포 배아로 발생되었다. 이 방법을 사용하여 PEM 배양물로부터 4주내에 200,000개의 배아가 생성되었다. 무작위로 선택된 500개의 체세포 배아의 배수도는 전술한 드 라트 등의 방법에 따라 모두 이배체임이 확인되었다.

실시예 8 :배수도에 대해 안정한 PEM 현탁물의 보존

오이 PEM 현탁물을 10 mg/l의 2,4-D 및 0.5 mg/l의 키네틴으로 보충된 배지 A(표 1)에서 성장시켰다. 계대배양동안 각 계대배양 단계에서 주성분 및 미량 성분을 PEM 요구량보다 과량으로 보유시켜 계대배양 간격(즉, 2주) 동안 상기 성분들이 부족하지 않도록 하였다. 오옥신의 양(즉, 10 mg/l의 2,4-D)을 상기와 같은 방식으로 유지시켰다. 키네틴(즉, 0.5 mg/l)을 계대배양 초기에 배지내에 첨가하여 4일 만에 배지로부터 고갈되도록 했다. 당 분야에서 공지된 표준 HPLC 기술을 사용하여 시간 경과에 따른 오옥신 농도를 모니터링하여 현탁물의 발생 단계가 PEM 농도에 맞춰지도록 하였다. 배형성 이배체 PEM 현탁물을 10 mg/l의 2,4-D 및 0.5 mg/l의 키네틴으로 보충된 배지 A(표 1)에서 2년 동안 보존시킨 결과, 안정한 배수도를 보여주었다. 배형성 사배체 PEM 현탁액은 6 개월 동안 보존시켰으며, 안정한 배수도를 나타내었다. 이러한 배수도는 배아 발생이 시작될 때까지 보존되었다.

실시예 9: 배형성 사탕무 PEM 현탁 배양의 유도 및 이로부터 발생된 체세포 배아

사탕무의 종자(스웨덴 왕국, 힐레스호그 AB)를 70% 에탄올 용액(2분 동안) 및 1.5%의 차아염소산나트륨 용액(45분 동안)으로 표면 살균한 다음, 살균수로 3회 철저히 세척하였다. 사탕무 종자를 습지상에서 7 내지 14일 동안 23℃에서 발아시켰다. 발아된 종자의 떡잎을 외식편 물질로서 사용하였다. 6개의 떡잎을 10 mg/l의 2,4-D 및 0.5 mg/l의 키네틴으로 보충된 10 ml의 액체 배지 A(표 1)에서 100 rpm의 회전식 교반기를 사용하여 23℃의 암실 조건하에서 배양하였다. 상기 배양물은 10 mg/l의 2,4-D 및 0.5 mg/l의 키네트로 보충된 액체 배지 A(표 1)로 5배 희석하여 1 내지 2 주후에 50ml 가 되었다. 전술한 바와 같이 보충된 배지 A(표 1)로 배양물을 2배 희석하거나 전술한 바와 같이 보충된 새로운 배지 A로 상기 배지를 대체함으로써 배양물을 2주 간격으로 계대배양하였다. 4 내지 6주후에 체세포 배아가 외식편 조직에 출현하였다. 배아를 외식편에서 떼어내어 별도로 배양하였다. 4주 후, 배양된 배아는 PEMs를 생성하였다. PEM 배양물을 10 mg/l의 2,4-D 및 0.5 mg/l의 키네틴으로 보충된 표 1의 배지 A로 새로 보충함으로써 추가로 계대배양하였다.

PEM 현탁물을 먼저 구멍 크기가 500 ㎛인 나일론 메쉬로 체질한 다음, 구멍 크기가 100 ㎛인 나일론 메쉬로 체질하여 PEMs를 수집하였다. 일반적으로, 100∼500 ㎛의 PEM 분획은 주로 단일의 체세포 배아를 생성하였다. PEMs를 전술한 바와 같이 보충된 오옥신 및 시토키닌 부재의 배지 A에 배양하여 진 체세포 배아로 발생시켰다.

실시예 10: 배형성 후추 PEM 현탁 배양물의 유도

후추 종자(슬리스 앤드 그루트의 재배종 게데온)를 70% 에탄을 용액(2분 동안) 및 1.5%의 차아염소산나트륨 용액(45분 동안)으로 표면 살균한 다음, 살균수로 3회 철저히 세척하였다. 후추 종자를 습지상에서 7 내지 14일 동안 23℃에서 발아시켰다. 발아된 종자의 떡잎을 외식편 물질로서 사용하였다. 6개의 떡잎을 10 mg/l의 2,4-D으로 보충된 10 ml의 액체 배지 A(표 1)에서 100 rpm의 회전식 교반기를 사용하여 23℃의 암실 조건하에서 배양하였다. 상기 배양물을 5배로 희석하여 2주 후에 50 ml가 되었다. 전술한 바와 같이 배양물을 2배 희석하거나 10 mg/l의 2,4-D로 보충된 새로운 액체 배지 A(표 1)로 상기 배지를 대체함으로써 배양물을 2주 간격으로 계대배양하였다. 2 내지 4 주 후에 배아가 외식편의 절단면에 나타났다. 배아를 외식편에서 떼어내어 배양물로부터 제거하여 4 mg/l의 2,4-D 및 0.5 mg/l의 제아틴으로 보충된 액체 배지 A(표 1)에서 계대배양하였다. 4주 후에, 전배형성물이 출현하였다. PEMs를 전술한 바와 같이 추가로 계대배양함으로써 증식시켰다. PEMs를 실시예 5에 설명한 바와 같이 현탁물을 체질함으로써 수집하였다. 100∼500 ㎛의 분획은 주로 단일의 체세포 배아를 생성하였다. PEMs를 오옥신 및 시토키닌이 없는 배지 A(표 1)에 배양하였다.

실시예 11: 배형성 비올라 PEM 현탁 배양물의 유도 및 이로부터 발생된 체세포 배아

비올라의 종자(술리스 앤드 그루트의 재배종 델타 바이올렛)를 70% 에탄올 용액(2분 동안) 및 1.5%의 차아염소산나트륨 용액(30분 동안)으로 표면 살균한 다음, 살균수로 3회 철저히 세척하였다. 비올라 종자를 습지상에서 7 내지 14 일 동안 23℃에서 발아시켰다. 발아된 종자의 떡잎을 외식편 물질로 사용하였다. 6개의 떡잎을 4 mg/l의 2,4-D 및 0.1 mg/l의 키네틴으로 보충된 10 ml의 액체 배지 A(표 1)에서 100 rpm의 회전식 교반기를 사용하여 23℃의 암실 조건하에서 배양하였다. 이 배양물을 4 mg/l 의 2,4-D 및 0.1 mg/l의 키네틴으로 보충된 액체 배지 A(표 1)로 5배 희석하여 2주 후에 50 ml가 되었다. 배양물을 2배 희석하거나 4 mg/l의 2,4-D 및 0.1 mg/l의 키네틴으로 보충한 새로운 액체 배지 A(표 1)로 상기 배지를 대체함으로써 배양물을 2주 간격으로 계대배양하였다. 8 내지 10주 후에, 전배형성물이 출현하였다. 전술한 바와 같이 추가로 계대배양함으로써 PEMs를 증식시켰다. 사용된 나일론 메쉬의 구멍이 50 ㎛ 및 250 ㎛라는 점을 제외하고는 실시예 5에서 기술한 바와 같이 현탁물을 체질함으로써 PEMs를 수집하였다. 전술한 바와 같이 보충된 오옥신 및 시토키닌 부재의 배지 A(표 1)에 PEMs를 배양하였고, 단일의 체세포 배아로 발생시켰다.

실시예 12: 배형성 제라늄 PEM 현탁 배양물의 유도

제라늄의 종자(술리스 앤드 그루트의 재배종 풀사르 레드)를 70% 에탄올 용액(2분 동안) 및 1.5%의 차아염소산나트륨 용액(30분 동안)으로 표면 살균한 다음, 살균수로 3회 철저히 세척하였다. 제라늄 종자를 습지상에서 7 내지 14일 동안 23℃에서 발아시켰다. 발아된 종자의 떡잎을 외식편 물질로서 사용하였다. 6개의 떡잎을 4 mg/l의 2,4-D 및 0.1 mg/l의 키네틴으로 보충된 10 ml의 액체 배지 A(표 1)에서 100 rpm의 회전식 교반기를 사용하여 23℃의 암실 조건하에서 배양하였다. 상기 배양물을 4 mg/l의 2,4-D 및 0.1 mg/l의 키네틴으로 보충된 액체 배지 A(표 1)로 5배 희석하여 1주 후에 50 ml가 되게 하였다. 4 mg/l의 2,4-D 및 0.1 mg/l의 키네틴으로 보충된 액체 배지 A(표 1)로 배양물을 2배 희석하거나 전술한 바와 같은 것으로 보충된 새로운 배지 A로 상기 배지를 대체함으로써 배양물을 2주 간격으로 계대배양하였다.

4 내지 6주 후에 전배형성물이 나타났다. PEMs는 전술한 바와 같이 추가로 계대배양함으로써 증식시켰다. 사용된 나일론 메쉬의 구멍이 50 ㎛ 및 250 ㎛라는 점을 제외하고는 실시예 5에서 기술한 바와 같이 현탁물을 체질함으로써 PEMs를 수집하였다. 50∼250 ㎛의 PEM 분획은 주로 단일의 체세포 배아를 산출하였다. PEMs는 오옥신 및 시토키닌이 없는 배지 A(표 1)에서 배양하였고 단일의 체세포 배아로 발생되었다.

실시예 13 : 생물 반응기에서 PEM 생물량의 증식

4×8 ml PCV를 실시예 5에서 설명한 바와 같이 계대배양된 오이 PEM 현탁 배양물로부터 수집하여 임펠러가 장착된 통상의 2 ℓ 생물 반응기 2 개와 Chemap AG에서 시판하는 진동 혼합기가 장착된 생물 반응기 2 개를 포함하는 4 개의 생물 반응기(Applikon Dependable Instruments B.V.)내에 접종하였는데, 각각의 생물 반응기는 10 mg/l의 2,4-D 및 0.5 mg/l의 키네틴으로 보충된 1ℓ의 배지 A(표 1)를 함유하였다. 반응기 챔버의 하부를 향해 배치된 진동기 샤프트의 말단에 위치한 15 ㎛ 다공성 살포 장치를 통해 공기를 진동혼합기 반응기내로 살포하였다. 진동 혼합 반응기중 하나에 용해된 산소 농도는 당업계에 공지된 표준 기술에 따라 40%이었고, 다른 하나는 97%로 측정되었다. 수직으로 배치된 진동 혼합기를 50 Hz의 진동수와 최대 증폭 ±6 mm에서 작동시켰다. 수직 평면에서 진동 운동하고 수평 운동은 최소로 유지하도록 진동 혼합기를 배치하였다. 교반 디스크는 진동 샤프트의 말단에 장착하여 유체가 루프 모양의 흐름이 되게 하여 반응기 용기의 주변부로부터의 세포 현탁액이 기저를 향하게 이어서 상향으로 올라오도록 하였다.

공기를 15 ㎛ 다공성 살포기가 장착된 살포관을 통해 생물반응기의 하부에서 종래의 생물반응기내에 살포하였다. 용해된 산소 농도는 전술한 바와 같이 각각 40% 및 97%의 농도로 측정되었다. 임펠러의 교반 속도는 약 150 rpm ± 50 rpm으로 유지시컸다.

접종하고 6주 후 배가 시간을 측정하였고, PEM 현탁물로부터 PEMs을 체질하였으며, PEMs/ml PCV를 실시예 5에서 기술한 바와 같이 측정하였다.

진동혼합기의 사용은 단위 부피당 보다 많은 수의 PEMs를 산출하였다(표 2; 제l도).

표 2

장치 배가 시간(일) PEMs/ml PCV

임펠러 2.3 200

(40% DO₂)⁽¹⁾

임펠러 2.7 620

(97% DO₂)

진동 혼합기 2.8 2284

(40% DO₂)

진동 혼합기 3.3 3710

(97% DO₂)

(1) DO₂= 용해된 산소

실시예 14: 진동 혼합기가 설치된 생물 반응기에서 PEM 생물량의 증식 2×8 ml PCV를 실시예 3에서 설명한 바와 같이 계대배양된 오이 PEM 현탁 배양물로부터 수집하여 Chemap AG에서 시판하는 진동 혼합기가 장착된 2 ℓ 생물 반응기 2 개를 포함하는 두개의 진동 혼합 생물 반응기(Applikon Dependable Instruments B.V.)내에 접종하였다. 하나의 생물 반응기는 10 mg/l의 2,4-D 및 0.5 mg/l의 키네틴으로 보충된 1 ℓ의 배지 A(표 1)를 함유하고, 다른 하나는 수크로오스 농도가 55 g/l인 것을 제외하고는 전술한 것과 같은 것으로 보충된 1 ℓ의 배지 A를 함유하였다. 반응기 챔버의 기저 부근의 진동기 샤프트의 말단에 위치한 15 ㎛ 다공성 살포 장치를 통해 공기를 진동혼합기 반응기내로 살포하였다. 용해된 산소 농도는 당업계에 공지된 표준 기술에 따라 97%로 측정되었다. 진동 혼합기를 50 Hz 진동수와 최대 증폭 ±6 mm에서 작동시켰다. 측면 또는 수평 운동은 최소로 유지하는 반면 수직 평면에서 진동 운동하도록 진동 혼합기를 배치하였다. 교반 디스크는 진동 샤프트의 말단엔 장착하여 유체가 루프 모양의 흐름이 되게 하여 반응기 용기 주변부로부터의 세포 현탁액이 기저로 향하고 이어서 위로 올라오도록 하였다.

접종하고 6주 후 배가 시간을 측정하였고, PEM 현탁물로부터 PEMs를 체질하였으며, PEMs/ml PCV는 실시예 5에서와 같이 측정하였다. 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

표 3

장치 배가 시간(일) PEMs/ml PCV

진동 혼합기 3.3 2284

(97%, 20 g/l 수크로오스)

진동 혼합기 2.9 6000

(97%, 55 g/l 수크로오스)

실시예 15: 교반된 생물 반응기/ 진동 혼합기 생물 반응기로부터 시간 경과에 따른 PEMs 의 생존력 비교

3×8 ml PCV를 실시예 5에서 나타낸 바와 같은 계대배양된 오이 PEM 현탁 배양물에서 수집하여, 10 mg/l의 2,4-D 및 0.5 mg/l의 키네틴으로 보충된 1 ℓ의 배지 A(표 1)를 함유하는 임펠러가 장착된 종래의 2 ℓ생물 반응기 1 개와 Chemap AG에서 시판하는 진동 혼합기가 장착된 생물 반응기 2 개를 포함하되 이중 하나는 전술한 바와 같이 보충된 1 ℓ의 배지 A를 함유하고 나머지는 수크로오스 농도가 55 g/l인 점을 제외하고는 전술한 바와 같이 보충된 1 ℓ의 배지 A를 함유하는 3개의 생물 반응기(Applikon Dependable Instruments B.V.)내에 접종하였다.

반응기 챔버의 바닥을 향해 배치된 진동기 샤프트의 말단에 위치한 15 ㎛ 다공성 살포 장치를 통해 공기를 진동혼합기 반응기내로 살포하였다. 진동 혼합 반응기예 용해된 산소 농도는 당업계에 공지된 표준 기술에 따라 97%로 측정되었다. 진동 혼합기를 50 Hz 진동수와 최대 증폭 ±6 mm에서 작동시켰다. 수직 평면에서 진동 운동하고 수평 운동은 최소로 유지하도록 진동 혼합기를 배치하였다. 교반디스크는 진동 샤프트의 말단에 장착하여 유체가 루프 모양의 흐름이 되도록 하여 반응기 용기 주변부로부터의 세포 현탁액이 기저를 향하고 이어서 위로 올라오도록 하였다.

15 ㎛ 다공성 살포기가 장착된 살포관을 통해 생물반응기의 하부에서 기존의 생물반응기내에 공기를 살포하였다. 용해된 산소 농도는 전술한 바와 같이 97%의 농도로 측정되었다. 임펠러의 교반 속도는 약 150 rpm ± 50 rpm으로 유지하였다.

PEMs/ml PCV는 배양의 초기에 측정하였고, 배가 시간은 실시예 5에 나타낸 바와 같이 6 내지 14일에 측정하였다.

결과를 살펴보면, 교반된 생물 반응기에서 PEMs의 수치는 시간의 경과에 따라 크게 감소하는 반면, 진동 혼합기내의 PEMs의 수치는 수크로오스 농도 20 g/l에서 시간의 경과에 따라 거의 일정하였다. PEM 수치는 수크로오스 농도 55 g/l에서 6일 내에 3배까지 증가함을 보여주었다(표 4).

표 4

장치 PEMs/ml PCV

0일 6일 14일

임펠러 2300 800 40

(97%, 20 g/l 수크로오스)

진동 혼합기 2300 2300 2280

(97%, 20 g/l 수크로오스)

진동 혼합기 2300 6000 6000

(97%, 55 g/l수크로오스)

실시예 16: 생물 반응기내에서 PEMs가 토르페도(Torpedo) 단계의 체세포 배아로 발생

2 ×100,000개의 체질된 PEMs를 실시예 15에서 기술한 바와 같이 계대배양된 오이 PEM 현탁 배양물(vb에 있는 55 g/l의 수크로오스/97% Do2)에서 수집하여 임펠러가 장착된 종래의 2 ℓ생물 반응기 1 개와 Chemap AG에서 시판하는 진동 혼합기가 장착된 생물 반응기 1 개를 포함하는 2개의 생물 반응기(Applikon Dependable Instruments B.V.)내에 접종하였는데, 이때, 각 생물반응기는 20 g/l의 수크로오스와 5.0 μM 농도의 ABA를 포함하는 1 ℓ의 MS 배지를 함유하였다. 반응기 챔버의 하부 근처에 배치된 진동기 샤프트의 말단에 위치한 15 ㎛ 다공성 살포 장치를 통해 산소를 진동혼합기 반응기내로 살포하였다. 진동 혼합 반응기내의 산소 농도는 당업계에 공지된 표준 기술에 따라 97%로 측정되었다. 진동 혼합기는 50 Hz 진동수와 최대 증폭 ±6 mm에서 작동시켰다. 수직 평면에서 진동 운동하고 수평 운동은 최소로 유지하도록 진동 혼합기를 배치하였다. 교반 디스크는 진동 샤프트의 말단에 장착하여 유체가 루프 모양의 흐름이 되도록하여 반응기 용기 주변부로부터의 PEMs이 기저로 향하고 이어서 위로 올라오도록 하였다.

15 ㎛ 다공성 살포기가 장착된 살포관을 통해 생물반응기의 아래에서 기존의생물반응기내에 산소를 살포하였다. 용해된 산소 농도는 상술한 바와 같이 초기 농도가 97%로 측정되었고, 7 일 경과후 30% ±5%로 감소되었다. 8 일째 용해된 산소 농도는 97%로 다시 조정되었고 이 수준으로 유지시켰다. 임펠러의 교반 속도는 약 190 rpm ±5 rpm으로 유지시켰다.

기존의 생물 반응기는 PEM가 완전히 성숙된 사용 가능한 토르페도 단계의 체세포 배아 발생 효율 10 내지 15%를 갖도록 하였다. 진동 혼합기 생물 반응기는 PEM가 20% 이상의 완전히 성숙된 사용 가능한 토르페도 단계의 체세포 배아 발생 효율을 갖도록 하였다. 사용 가능한 토르페도 단계의 체세포 배아는 통상의 관상 식물로 성장한다.

실시예 17: 체세포 배아로부터 유도된 시클라멘 식물의 형태 안정성

실시예 2의 F1 잡종으로부터 유도된 시클라멘 체세포 배아를 화분 토양에 심어 묘목으로 전환시켰다. 제1엽이 형성된 후, 묘목을 온실에 옮겨서 성숙할 때까지 재배했다. 식물을 개화 단계까지 성장시켰다. 현화(懸花) 식물의 형태 조사 결과, 상기 식물에서 이상이 발견되지 않았다. 유전적 차이에 기인한 소마클로날 변종은 상기 식물에서 발견되지 않았다.

실시예 18: 체세포 배아에서 유도된 오이 식물중의 유전적 소마클로날 변종

F1 잡종 식물로부터 유도된 실시예 6의 체세포 배아를 소르바로드 플러그즈(Baumgartner papier, Switzerland)상에서 식물로 전환시켰고 과실이 열린 식물로 성장시켰다. 배수도는 상기의 드 라트 등의 방법에 따라 80 개의 식물에서 측정하였다. 모든 식물은 같은 배수도를 지녔고 유전 차이에 기인한 소마클로날 변종은 관찰되지 않았다.

실시예 19: 오이 체세포 배아의 식물로의 전환

오이 PEMs를 광도가 낮은 진동 혼합기가 장착된 생물 반응기에서 증식시키고, 체질(100∼150 ㎛)하여, 20 g/l의 수크로오스 및 5 ㎛의 ABA로 보충된 5000개 PEMs/50 ml MS 배지의 농도로 삼각 플라스크내에 접종하였다. PEMs를 두개의 배치로 분리시켜 빛과 어둠속에서 체세포 배아로 추가 발생시켰다. 두개의 배치로부터 나온 체세포 배아는 빛하에서 식물로 전환되었다. 어둠속에서 배양된 PEMs에서 유도된 체세포 배아에 있어서 체세포 배아가 식물로 전환되는 효율이 빛하에서 발생된 체세포 배아에 비해 보다 높았다(표 5).

표 5

밝기 조건 토르페도의 식물로의 총 전환율[%]

명 28.6

암 62.7

실시예 20: 식물로의 전환에 적합한 단일의 토르페도의 형성과 관련이 있는 PEM 응집물의 크기

10 mg/l의 2,4-D 및 0.5 mg/l의 키네틴으로 보충된 배지를 사용하여 상기 실시예 5에서 기술한 바와 같이 수득한 9일 경과된 PEM 현탁물(PEM 농도는 50 ml PCV/ℓ)을 다른 크기의 나일론 메쉬로 체질하여 세개의 다른 크기의 PEM 분획, 즉 100∼150 ㎛, 150∼200 ㎛ 및 200∼250 ㎛의 분획을 얻었다. 배아 발생은 3 μM의 ABA를 포함하는 MS 배치 중에 약 25∼50 PEMs/ml의 PEM 초기 농도로 실시하였다.발생 배양 9일 후, 토르페도 단계의 배아의 수를 광학 현미경으로 평가하였다. 단일의 토르페도의 수는 다중 토르페도의 수와 비교하여 평가하였다. 토르페도/PEM 비율은 5-15%이었다. 크기가 100 ㎛ 미만인 분획은 PEMs를 함유하지 않았다. 그 결과를 표 6에 나타내었다.

표 6

체의 분획 크기(㎛) 총량을 기준으로 단일의 토르페도의 비율(%)

100∼150 85

150~200 20

200∼250 5

단일의 배아는 주로 100∼150 ㎛ 크기의 분획으로 분리되었고, 단일 식물로 전환되었다.

제1도는 임펠러 또는 진동 혼합기의 사용과 PEMs(수)/ ℓ의 관계를 도시한 것이다.

Claims

현탁 배양물에서 동일한 배수도의 체세포 배아를 수득하는 방법에 있어서, i ) 무기염들, 탄소 공급원 및 오옥신 또는 오옥신들의 혼합물을 포함하는 식물 배양에 일반적으로 사용되는 액체 배지와 접촉시켜 비-다우커스 카로타엘(non-Daucus carotaL.) 유래의 식물 조직 또는 식물 체세포 배아 유래의 비-캘러스 외식편 물질을 배양함으로써, 전배형성물(PEM) 형성의 유도를 촉진시키는 단계;

ⅱ) 초기 액체 배지에 오옥신 농축물 또는 기타 주요 성분들 또는 이들 모두를 주기적으로 보충하는 것 또는 초기 액체 배지를 무기염들, 탄소 및 오옥신 또는 오옥신들의 혼합물을 포함하는 새로운 식물 조직 배양 배지로 교체하는 것에 의해, 단계 i)에서 형성된 PEM을 오옥신 함유 PEM 현탁액에서 성장 및 증식시키는 단계:

ⅲ) 비-응집성 PEM들의 경우 직경 1mm크기까지, 응집성 PEM들의 경우 직경 5mm 크기까지의 PEM을 수집하는 단계;

ⅳ) 상기 수집된 PEM들을 오옥신이 없거나 PEM이 체세포배아로 발달하는데 방해가 되지 않을 정도의 오옥신 잔량을 갖는 액체 배지에서 배양하는 단계; 및

v) ⅳ) 단계를 통해 생성된 체세포 배아를 오옥신 부재 식물 조직 배양 배지로부터 분리시켜 수집하는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 단계 ⅲ)은 비-응집성 PEM들의 경우 직경 1mm크기까지, 응집성 PEM들의 경우 직경 5mm 크기까지의 PEM들의 분획을 사용하며, 상기 분획은 5% 이상의 생존가능한 PEM들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항의 방법에 따라 제조되고 배수도가 전부 동일한 비-다우커스 카로타 엘

(non--Daucus carotaL.) 체세포 배아.
제1항에 있어서,

상기 액체 배지는 탄수화물 에너지 공급원을 15 g/ℓ 내지 90 g/ℓ의 농도로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제21항에 있어서,

상기 탄수화물 에너지 공급원의 농도는 20 g/ℓ내지 60 g/ℓ인 것을 특징으로 하는 방법.
제4항 또는 제5항에 있어서,

상기 탄수화물 에너지 공급원은 수크로오스, 글루코오스 및 라피노스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서,

상기 오옥신 함유 PEM 현탁물은 진동 혼합기내에서 진동시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서,

상기 진동 혼합기는 수직 평면으로 진동되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서,

상기 외식편 물질은 원형질체, 줄기, 잎, 꽃잎, 배축 절편, 정단 분열 조직, 접합성 배아 그 자체, 괴경, 유관속, 내초, 자방 또는 꽃밥 필라멘트로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서,

모두 동일한 배수도를 갖는 수백개 내지 수만개의 체세포 배아를 포함하는 것을 특징으로 하는 체세포 배아.
제3항 또는 제10항에 있어서,

액체 배지를 유출시키고 용기에 놓여있는 것을 특징으로 하는 체세포 배아.
제3항 또는 제10항에 있어서,

건조 처리된 것을 특징으로 하는 체세포 배아.
제3항 또는 제10항에 있어서,

펠렛화된 것을 특징으로 하는 체세포 배아.
제3항 또는 제10항에 있어서,

겔로 캡슐화된 것을 특징으로 하는 체세포 배아.
제3항 또는 제10항에 있어서,

이배체인 것을 특징으로 하는 체세포 배아.
제3항 또는 제10항에 있어서,

사배체인 것을 특징으로 하는 체세포 배아.
제3항 또는 제10항에 있어서,

쌍자엽 외식편 물질로부터 유래된 것을 특징으로 하는 체세포 배아.
제3항 또는 제10항에 있어서,

단자엽 외식편 물질로부터 유래된 것을 특징으로 하는 체세포 배아.
제3항 또는 제10항에 있어서,

시클라멘(Cyclamens), 호리병박(Cucurbits), 라이코페르시콘(Lycopersicons), 알리엄(Alliums), 베고니아(Begonias), 베타스(Betas), 앵초속 식물(Primulas), 브라시카스(Brassicas), 고추(Capsicums), 시코륨(Cichoriums), 거베라(Gerberas), 임페이션(Impatiens), 락투카스(Lactucas), 오리자스(Oryzas), 펠라고늄(Pelargoniums), 페투니아(Petunias), 비올라(Violas) 및 제아스(Zeas)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 체세포 배아.
제19항에 있어서,

시클라멘, 호리병박, 베타스, 브라시카스, 비올라, 펠라고늄 및 고추로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 체세포 배아.