JPH06237659A - 有機化合物に関する改良 - Google Patents
有機化合物に関する改良Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 体細胞不定胚分化の改良。
【構成】 実質的に類似した倍数性レベルを有する体細
胞胚およびＰＥＭを含む体細胞胚懸濁培養および前胚形
成塊懸濁培養(ＰＥＭ)、そこから誘導された植物、およ
び前記体細胞胚を得る方法。
胞胚およびＰＥＭを含む体細胞胚懸濁培養および前胚形
成塊懸濁培養(ＰＥＭ)、そこから誘導された植物、およ
び前記体細胞胚を得る方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、組織培養からの総体植
物再生に適する改良された体細胞不定胚分化方法および
さらに具体的には液体培地自体を用いた体細胞不定胚分
化による体細胞胚の改良された獲得方法に関するもので
ある。
物再生に適する改良された体細胞不定胚分化方法および
さらに具体的には液体培地自体を用いた体細胞不定胚分
化による体細胞胚の改良された獲得方法に関するもので
ある。
【０００２】
【従来の技術】体細胞不定胚分化の有効な利用方法の商
業化は、比較的短い時間間隔で高収量の植物を得られる
可能性があるため、例えば器官形成クローニングよりも
望ましく、かつ経済的にも魅力あるものと考えられてい
る。
業化は、比較的短い時間間隔で高収量の植物を得られる
可能性があるため、例えば器官形成クローニングよりも
望ましく、かつ経済的にも魅力あるものと考えられてい
る。
【０００３】ある種の植物細胞は、適当な植物組織培養
培地で培養された場合に、潜在的に総体植物へ分化する
能力を有することが知られている。上記培地は、一般的
には無機塩類、炭素供給源、例えばスクロース、イノシ
トール、チアミンなどを含む。常用される植物組織培養
培地の例は、ムラシゲおよびスクーグ(ＭＳ培地)、リン
ズマイアーおよびスクーグの培地、ガンボーグによる
(Ｂ５培地)培地である。
培地で培養された場合に、潜在的に総体植物へ分化する
能力を有することが知られている。上記培地は、一般的
には無機塩類、炭素供給源、例えばスクロース、イノシ
トール、チアミンなどを含む。常用される植物組織培養
培地の例は、ムラシゲおよびスクーグ(ＭＳ培地)、リン
ズマイアーおよびスクーグの培地、ガンボーグによる
(Ｂ５培地)培地である。
【０００４】上記植物組織培養培地の組成に修飾を加え
ることにより、使用される特定植物細胞の生長を最適化
することができる。ほぼ全ての植物細胞は、植物ホルモ
ン、例えばオーキシンまたはオーキシン様化合物、例え
ばインドール酢酸、インドール酪酸、ナフタレン酢酸ま
たは２,４−Ｄ、および／またはサイトキニン、例えば
ベンジルアデニン、ゼアチン、キネチンなどを必要とす
る。最適な生長を確実にするためには、ビタミン類、例
えばニコチン酸、ピリドキシンまたは他の成分、例えば
ココヤシ果汁、カゼイン加水分解物などを加えることも
有利であり得る。
ることにより、使用される特定植物細胞の生長を最適化
することができる。ほぼ全ての植物細胞は、植物ホルモ
ン、例えばオーキシンまたはオーキシン様化合物、例え
ばインドール酢酸、インドール酪酸、ナフタレン酢酸ま
たは２,４−Ｄ、および／またはサイトキニン、例えば
ベンジルアデニン、ゼアチン、キネチンなどを必要とす
る。最適な生長を確実にするためには、ビタミン類、例
えばニコチン酸、ピリドキシンまたは他の成分、例えば
ココヤシ果汁、カゼイン加水分解物などを加えることも
有利であり得る。
【０００５】過去において、典型的な体細胞胚の形成
は、次に体細胞胚が誘導され得る一次生長相材料とし
て、非常に大きい液胞を有する細胞および非常に小さい
液胞を有するさらに小さい円形細胞の脱分化集塊を含む
カルス材料の使用を必要としてきた。しかしながら、体
細胞不定胚分化における出発材料としての上記材料の使
用は、多くの欠点を有しており、実質的に類似した表現
型を有し、および／または倍数体レベルに関して実質的
に均一である多数の植物を得る場合には有用性が制限さ
れることが判明した。カルスに端を発する植物は、倍数
体レベルに関してソマクローナル変異および／または非
均一性を示す傾向を有する[チャレフ(１９８３)、「サイ
エンス」(Ｓcience)、２１９:６７６−６８２、ラーキン
(１９８７)、「アイオワ・ステート・ジャーナル・オブ
・リサーチ」(Ｉowa Ｓtate Ｊournal of Ｒesearch)、
６１(４):３９３−４３４、デ・クラークＧ−Ｊ(１９９
０)、「アクタ・ボタニカ・ネーランディカ」(Ａcta Ｂo
t．Ｎeerl.)、３９(２):１２９−１４４、カープおよび
ブライト(１９８５)、「オックスフォード・サーベイズ
・オブ・プラント・モレキュラー・アンド・セル・バイ
オロジー」(Ｏxford Ｓurveys of Ｐlant Ｍolecular ＆
Ｃell Ｂiology)、２:１９９−２３４、カスターズ等
(１９９０)、「アクタ・ボタニカ・ネーランディカ」(Ａc
ta Ｂot．Ｎeerl.)、３９(２):１５３−１６１(ククミ
ス・サティブス・エル(cucumis sativus Ｌ.))、カイズ
リー等(１９８７)、「プラント・セル・レポーツ」(Ｐlan
t cell Ｒeports)、６:３０５−３０８(ピスム・サティ
ブム・エル(pisum sativum Ｌ.))、エズラ(１９９２)、
「プラント・サイエンス」(Ｐlant Ｓcience)、８５:２０
９−２１３(ククミス・メロ)、およびキビハルジュ等
(１９９２)、「プラント・セル、ティシュー・アンド・
オーガン・カルチャー」(Ｐlant Ｃell, Ｔissue, and
Ｏrgan Ｃulture)、２８:１８７−１９４(シクラメン・
ペルシクム・ミル(Ｃyclamen persicum Ｍill))]。
は、次に体細胞胚が誘導され得る一次生長相材料とし
て、非常に大きい液胞を有する細胞および非常に小さい
液胞を有するさらに小さい円形細胞の脱分化集塊を含む
カルス材料の使用を必要としてきた。しかしながら、体
細胞不定胚分化における出発材料としての上記材料の使
用は、多くの欠点を有しており、実質的に類似した表現
型を有し、および／または倍数体レベルに関して実質的
に均一である多数の植物を得る場合には有用性が制限さ
れることが判明した。カルスに端を発する植物は、倍数
体レベルに関してソマクローナル変異および／または非
均一性を示す傾向を有する[チャレフ(１９８３)、「サイ
エンス」(Ｓcience)、２１９:６７６−６８２、ラーキン
(１９８７)、「アイオワ・ステート・ジャーナル・オブ
・リサーチ」(Ｉowa Ｓtate Ｊournal of Ｒesearch)、
６１(４):３９３−４３４、デ・クラークＧ−Ｊ(１９９
０)、「アクタ・ボタニカ・ネーランディカ」(Ａcta Ｂo
t．Ｎeerl.)、３９(２):１２９−１４４、カープおよび
ブライト(１９８５)、「オックスフォード・サーベイズ
・オブ・プラント・モレキュラー・アンド・セル・バイ
オロジー」(Ｏxford Ｓurveys of Ｐlant Ｍolecular ＆
Ｃell Ｂiology)、２:１９９−２３４、カスターズ等
(１９９０)、「アクタ・ボタニカ・ネーランディカ」(Ａc
ta Ｂot．Ｎeerl.)、３９(２):１５３−１６１(ククミ
ス・サティブス・エル(cucumis sativus Ｌ.))、カイズ
リー等(１９８７)、「プラント・セル・レポーツ」(Ｐlan
t cell Ｒeports)、６:３０５−３０８(ピスム・サティ
ブム・エル(pisum sativum Ｌ.))、エズラ(１９９２)、
「プラント・サイエンス」(Ｐlant Ｓcience)、８５:２０
９−２１３(ククミス・メロ)、およびキビハルジュ等
(１９９２)、「プラント・セル、ティシュー・アンド・
オーガン・カルチャー」(Ｐlant Ｃell, Ｔissue, and
Ｏrgan Ｃulture)、２８:１８７−１９４(シクラメン・
ペルシクム・ミル(Ｃyclamen persicum Ｍill))]。
【０００６】特許出願の既知実例は、体細胞不定胚分化
においてカルス材料を使用している。その一例、プラン
ト・ジェネティクス・インコーポレイテッドによるＷＯ
９０／０１０５８では、カルス材料の使用による体細胞
胚の獲得および広範囲の合成オーキシンの使用効果の研
究が報告されている。カルス材料は、何週間にもわたっ
て固形培地における培養および／または継代培養の適当
な外植体から形成または生育される。次に、体細胞不定
胚分化は、植物ホルモン、例えば２,４−Ｄまたはその
類縁体を含む培地へカルス組織を移すことにより開始さ
れる。体細胞胚の倍数体レベルまたは得られた植物の倍
数体レベルについては全く述べられていない。体細胞不
定胚分化におけるカルス材料の使用は、ソマクローナル
変異体の獲得が利用可能な遺伝子プールの強化に関して
興味深いものであり得る植物を得るのには有望であり得
るが、単に実質的に全ての同じ表現型を有する営利的な
数の植物の獲得を欲するだけの種子業者または育種家に
とってはあまり有用なものではない。
においてカルス材料を使用している。その一例、プラン
ト・ジェネティクス・インコーポレイテッドによるＷＯ
９０／０１０５８では、カルス材料の使用による体細胞
胚の獲得および広範囲の合成オーキシンの使用効果の研
究が報告されている。カルス材料は、何週間にもわたっ
て固形培地における培養および／または継代培養の適当
な外植体から形成または生育される。次に、体細胞不定
胚分化は、植物ホルモン、例えば２,４−Ｄまたはその
類縁体を含む培地へカルス組織を移すことにより開始さ
れる。体細胞胚の倍数体レベルまたは得られた植物の倍
数体レベルについては全く述べられていない。体細胞不
定胚分化におけるカルス材料の使用は、ソマクローナル
変異体の獲得が利用可能な遺伝子プールの強化に関して
興味深いものであり得る植物を得るのには有望であり得
るが、単に実質的に全ての同じ表現型を有する営利的な
数の植物の獲得を欲するだけの種子業者または育種家に
とってはあまり有用なものではない。
【０００７】にんじんセルラインは、分裂組織細胞から
成るミクロクラスターからクローン化され、それらの胚
形成能について試験されたことが認められている(コウ
トス−テベノット等、「プラント・セル・レポーツ」(Ｐl
ant Ｃell Ｒeports)(１９９０)８:６０５−６０８)。
成るミクロクラスターからクローン化され、それらの胚
形成能について試験されたことが認められている(コウ
トス−テベノット等、「プラント・セル・レポーツ」(Ｐl
ant Ｃell Ｒeports)(１９９０)８:６０５−６０８)。
【０００８】著者等は、オーキシン２,４−Ｄを含む植
物組織培養培地において国産にんじん(Ｓ１株)の胚軸か
ら得た初回細胞懸濁液を使用し、ろ過により細胞クラス
ターを単離し、２,４−Ｄを含む植物組織培養培地に細
胞クラスターを再懸濁してクラスター密集度を高め、単
離クラスターからの細胞コロニーを、２,４−Ｄおよび
１％バクト−寒天を含む固体植物組織培養培地を含むペ
トリ皿に移して細胞コロニー形成を誘導し、それらをナ
ースＳ１株カルスを囲む２,４−Ｄおよび１％バクト−
寒天含有第２固形培地中に沈積させ、２,４−Ｄ含有植
物組織培養培地中で各細胞コロニーを解離させ、こうし
て得られた培養物を２,４−Ｄ含有植物組織培養培地中
で継代する方法について報告している。この方法により
得られたセルラインの後続分析では、４０セルラインの
うちの１３は胚形成能を示すが、これらのセルラインの
大部分は時間がたつうちにそれらの胚形成能を喪失して
いることが示された。唯一のセルラインが、長期間かな
り一定した胚形成能を有していた。フローサイトメトリ
ー分析によると、このセルラインは倍数体であった。
物組織培養培地において国産にんじん(Ｓ１株)の胚軸か
ら得た初回細胞懸濁液を使用し、ろ過により細胞クラス
ターを単離し、２,４−Ｄを含む植物組織培養培地に細
胞クラスターを再懸濁してクラスター密集度を高め、単
離クラスターからの細胞コロニーを、２,４−Ｄおよび
１％バクト−寒天を含む固体植物組織培養培地を含むペ
トリ皿に移して細胞コロニー形成を誘導し、それらをナ
ースＳ１株カルスを囲む２,４−Ｄおよび１％バクト−
寒天含有第２固形培地中に沈積させ、２,４−Ｄ含有植
物組織培養培地中で各細胞コロニーを解離させ、こうし
て得られた培養物を２,４−Ｄ含有植物組織培養培地中
で継代する方法について報告している。この方法により
得られたセルラインの後続分析では、４０セルラインの
うちの１３は胚形成能を示すが、これらのセルラインの
大部分は時間がたつうちにそれらの胚形成能を喪失して
いることが示された。唯一のセルラインが、長期間かな
り一定した胚形成能を有していた。フローサイトメトリ
ー分析によると、このセルラインは倍数体であった。
【０００９】
【発明の効果】本発明は、技術的に簡単な懸濁培養中で
体細胞胚が得られる方法を提供する。その方法は、特に
ナースカルスの周囲にセルラインを沈積させる必要はな
い。従って、本発明方法により商業的規模での体細胞胚
の製造が可能となる。本発明による体細胞胚は、実質的
に同じ表現型を有する植物の大量生産に使用され得る。
体細胞胚が得られる方法を提供する。その方法は、特に
ナースカルスの周囲にセルラインを沈積させる必要はな
い。従って、本発明方法により商業的規模での体細胞胚
の製造が可能となる。本発明による体細胞胚は、実質的
に同じ表現型を有する植物の大量生産に使用され得る。
【００１０】現在までのところ、体細胞不定胚分化法
は、植物獲得における潜在的に強力な手段として指摘さ
れているが、カルス材料から出発する体細胞不定胚分化
の利用は実現不可能であるため、この生産技術の有効利
用は妨げられている。
は、植物獲得における潜在的に強力な手段として指摘さ
れているが、カルス材料から出発する体細胞不定胚分化
の利用は実現不可能であるため、この生産技術の有効利
用は妨げられている。
【００１１】驚くべきことに、商業的規模での真正体細
胞胚の生産は、固形培地および／またはカルス組織を使
用する必要も無く、液体培養技術そのものの使用を通し
て達成され得ることが見出された。また、液体培地中の
ＰＥＭのバイオマス、従ってそこから体細胞胚を大量生
産させる能力を増加させ得ることも見出された。上記液
体培養技術を用いると、カルス培養／カルス継代培養工
程の使用は不必要となり、倍数性レベルに関して均一な
体細胞胚の集団を得る手段が初めて提供される。
胞胚の生産は、固形培地および／またはカルス組織を使
用する必要も無く、液体培養技術そのものの使用を通し
て達成され得ることが見出された。また、液体培地中の
ＰＥＭのバイオマス、従ってそこから体細胞胚を大量生
産させる能力を増加させ得ることも見出された。上記液
体培養技術を用いると、カルス培養／カルス継代培養工
程の使用は不必要となり、倍数性レベルに関して均一な
体細胞胚の集団を得る手段が初めて提供される。
【００１２】本発明は、ソマクローナル変異体獲得の危
険を実質的に低減化または削除する体細胞不定胚分化を
介して体細胞胚を得る方法を提供する。
険を実質的に低減化または削除する体細胞不定胚分化を
介して体細胞胚を得る方法を提供する。
【００１３】本発明は、中に含まれる体細胞胚の倍数体
レベルが実質的に均一である非ダウクス体細胞胚懸濁培
養物を提供する。
レベルが実質的に均一である非ダウクス体細胞胚懸濁培
養物を提供する。
【００１４】さらに本発明は、実質的に所望の倍数体レ
ベルを有する体細胞胚懸濁培養物から誘導される実質的
に均一な倍数性を有する植物(例、２倍体植物または４
倍体植物)を提供する。
ベルを有する体細胞胚懸濁培養物から誘導される実質的
に均一な倍数性を有する植物(例、２倍体植物または４
倍体植物)を提供する。
【００１５】本発明は、外植体から大量の真正体細胞胚
が得られるより確実な手段であって、カルス組織の使用
に依存および／または上記手段の必須成分として固形培
地を使用しない手段を提供する。
が得られるより確実な手段であって、カルス組織の使用
に依存および／または上記手段の必須成分として固形培
地を使用しない手段を提供する。
【００１６】これらおよび本発明の他の対象は、以下の
記載および実施例を一読すれば明白である。
記載および実施例を一読すれば明白である。
【００１７】
【発明の構成】本発明は、前胚形成塊(ＰＥＭ)が生存可
能な体細胞胚を形成させ得る外植体からのＰＥＭ形成の
促進方法であって、非カルス植物組織を、有効量のオー
キシンまたはオーキシン混合物を含む液体植物組織培養
培地と接触させて置くことを特徴とする方法を提供す
る。前胚形成塊(ＰＥＭ)形成の促進とは、ＰＥＭ形成を
誘導し得、および／またはＰＥＭバイオマスを増加させ
得ることを意味する。
能な体細胞胚を形成させ得る外植体からのＰＥＭ形成の
促進方法であって、非カルス植物組織を、有効量のオー
キシンまたはオーキシン混合物を含む液体植物組織培養
培地と接触させて置くことを特徴とする方法を提供す
る。前胚形成塊(ＰＥＭ)形成の促進とは、ＰＥＭ形成を
誘導し得、および／またはＰＥＭバイオマスを増加させ
得ることを意味する。
【００１８】使用される外植体は、双子葉または単子葉
植物種であり得る。好ましくは、外植体は、双子葉植物
種から誘導される。典型的には、体細胞胚は、前胚形成
塊(ＰＥＭ)、すなわちカルス材料とは形態的に異なり、
分裂組織クラスターとしても知られている構造から誘導
される。ＰＥＭは、誘導される外植体と同じ倍数性レベ
ルまたは複数の倍数性レベルを有する。すなわち、２倍
体および４倍体細胞を含む外植体は、２倍体植物から採
取され、そこから生じる２倍体および４倍体ＰＥＭは、
さらに液体培地中で培養する前にふるい分け、細胞選別
などにより分離されるべきであり得る。
植物種であり得る。好ましくは、外植体は、双子葉植物
種から誘導される。典型的には、体細胞胚は、前胚形成
塊(ＰＥＭ)、すなわちカルス材料とは形態的に異なり、
分裂組織クラスターとしても知られている構造から誘導
される。ＰＥＭは、誘導される外植体と同じ倍数性レベ
ルまたは複数の倍数性レベルを有する。すなわち、２倍
体および４倍体細胞を含む外植体は、２倍体植物から採
取され、そこから生じる２倍体および４倍体ＰＥＭは、
さらに液体培地中で培養する前にふるい分け、細胞選別
などにより分離されるべきであり得る。
【００１９】ＰＥＭは、実質的に分化した生長中の植物
組織を含み、真正体細胞胚の前駆体としてみなされ得
る。光学顕微鏡(×４０〜×１００倍率)下では、ＰＥＭ
は、小さな液胞を含む小さな円形の細胞質に富む細胞の
集塊として現れる。それ自体本発明のＰＥＭは、それら
が誘導される植物の親細胞と遺伝学用語では実質的に同
一のものであるとしてみなされ得、究極的には真正体細
胞胚であって、両極性である、すなわち分裂機能を備え
た根および茎組織から根および茎を発生させる能力を有
するものとして認識可能な胚を発生させ得る。すなわ
ち、生存し得る真正体細胞胚はまた、当業界で常用され
る適当なさらに別の処理に付された場合、遺伝学的に言
えば、それが誘導される外植体始原細胞材料と実質的に
同一である少なくとも１種の苗木を生じ得るものであ
る。
組織を含み、真正体細胞胚の前駆体としてみなされ得
る。光学顕微鏡(×４０〜×１００倍率)下では、ＰＥＭ
は、小さな液胞を含む小さな円形の細胞質に富む細胞の
集塊として現れる。それ自体本発明のＰＥＭは、それら
が誘導される植物の親細胞と遺伝学用語では実質的に同
一のものであるとしてみなされ得、究極的には真正体細
胞胚であって、両極性である、すなわち分裂機能を備え
た根および茎組織から根および茎を発生させる能力を有
するものとして認識可能な胚を発生させ得る。すなわ
ち、生存し得る真正体細胞胚はまた、当業界で常用され
る適当なさらに別の処理に付された場合、遺伝学的に言
えば、それが誘導される外植体始原細胞材料と実質的に
同一である少なくとも１種の苗木を生じ得るものであ
る。
【００２０】本発明方法での使用に適した植物組織材料
は、植物器官またはその一部、または他の好適に分化し
た植物組織、例えば原形質体から得られる外植体であ
る。上記組織は、幹、葉、花弁、胚軸部分、成長点、子
房、接合子胚自体、塊茎、維管束、内鞘、別の花糸など
から成る群から選択され得る。別法として、適当な外植
体は、体細胞胚自体であり得る。植物組織は、興味の対
象である任意の植物種から採取され得、単子葉または双
子葉植物から選択される植物組織を含む。興味の対象で
ある植物タイプの選択は、「ハンドブック・フォー・シ
ードリング・エバリュエイション」(Ｈandbook for Ｓee
dling Ｅvaluation)、ベケンダムおよびグロブ、ＩＳＴ
Ａ、チューリッヒ、スイス国、１９７９、２８−２９頁
に示されており、これを引用して説明の一部とする。好
ましい植物タイプには、シクラメン、ウリ、リコペルシ
コン(Ｌycopersicon)、好ましくは食卓用または食用リ
コペルシコン、アリウム、ベゴニア、ベータ(Ｂeta)、
サクラソウ、アブラナ、トウガラシ、シコリウム(Ｃich
orium)、ガーベラ、ホウセンカ、ラクツカ(Ｌactuca)、
オリザ(Ｏryza)、ペラルゴニューム、ペチュニア、スミ
レおよびトウモロコシ属から成る群から選ばれるものが
ある。最も好ましいのは、シクラメン、ウリ、ベータ、
例えばベータ・ブルガリス(Ｂeta vulgaris、テンサ
イ)、アブラナ、例えばブラシカ・オレラセア(Ｂ．oler
acea)またはブラシカ・ナプス(Ｂ．napus)、スミレ、ペ
ラルゴニュームおよびトウガラシから成る群から選ばれ
る植物タイプである。
は、植物器官またはその一部、または他の好適に分化し
た植物組織、例えば原形質体から得られる外植体であ
る。上記組織は、幹、葉、花弁、胚軸部分、成長点、子
房、接合子胚自体、塊茎、維管束、内鞘、別の花糸など
から成る群から選択され得る。別法として、適当な外植
体は、体細胞胚自体であり得る。植物組織は、興味の対
象である任意の植物種から採取され得、単子葉または双
子葉植物から選択される植物組織を含む。興味の対象で
ある植物タイプの選択は、「ハンドブック・フォー・シ
ードリング・エバリュエイション」(Ｈandbook for Ｓee
dling Ｅvaluation)、ベケンダムおよびグロブ、ＩＳＴ
Ａ、チューリッヒ、スイス国、１９７９、２８−２９頁
に示されており、これを引用して説明の一部とする。好
ましい植物タイプには、シクラメン、ウリ、リコペルシ
コン(Ｌycopersicon)、好ましくは食卓用または食用リ
コペルシコン、アリウム、ベゴニア、ベータ(Ｂeta)、
サクラソウ、アブラナ、トウガラシ、シコリウム(Ｃich
orium)、ガーベラ、ホウセンカ、ラクツカ(Ｌactuca)、
オリザ(Ｏryza)、ペラルゴニューム、ペチュニア、スミ
レおよびトウモロコシ属から成る群から選ばれるものが
ある。最も好ましいのは、シクラメン、ウリ、ベータ、
例えばベータ・ブルガリス(Ｂeta vulgaris、テンサ
イ)、アブラナ、例えばブラシカ・オレラセア(Ｂ．oler
acea)またはブラシカ・ナプス(Ｂ．napus)、スミレ、ペ
ラルゴニュームおよびトウガラシから成る群から選ばれ
る植物タイプである。
【００２１】本発明方法での使用に適した液体植物組織
培養培地は、胚形成の誘導および／または促進に適した
液体植物組織培養培地であればよい。当業界で常用され
る塩基性培地の例には、ガンボーグのＢ５培地(Ｂ５)、
ムラシゲおよびスクーグ培地(ＭＳ)およびその変形があ
る。
培養培地は、胚形成の誘導および／または促進に適した
液体植物組織培養培地であればよい。当業界で常用され
る塩基性培地の例には、ガンボーグのＢ５培地(Ｂ５)、
ムラシゲおよびスクーグ培地(ＭＳ)およびその変形があ
る。
【００２２】本発明の企図するところでは、ＰＥＭ形成
を誘導し得る充分な量のオーキシンを、初期誘導相で外
植体または他の適当な出発物質を含む適当な液体培養培
地に加え、そしてその初期誘導相後、ＰＥＭの生長およ
び増殖を促進し得るさらに別の適当な液体培養培地を使
用し、その培地では、オーキシン(複数もあり得る)濃度
(複数もあり得る)を適当な間隔で補充する。従って、懸
濁の発生段階がＰＥＭレベルで固定されているという確
証を得るため、例えば当業界で公知の標準ＨＰＬＣ技術
を用い、時間をかけてオーキシン濃度をモニターするの
が有利である。また、オーキシン(複数もあり得る)に伴
い得る有毒な副作用を回避し、さらに生存し得る状態で
ＰＥＭを維持するためには、植物組織培養培地にオーキ
シン(複数もあり得る)を加えすぎないことが重要であ
る。
を誘導し得る充分な量のオーキシンを、初期誘導相で外
植体または他の適当な出発物質を含む適当な液体培養培
地に加え、そしてその初期誘導相後、ＰＥＭの生長およ
び増殖を促進し得るさらに別の適当な液体培養培地を使
用し、その培地では、オーキシン(複数もあり得る)濃度
(複数もあり得る)を適当な間隔で補充する。従って、懸
濁の発生段階がＰＥＭレベルで固定されているという確
証を得るため、例えば当業界で公知の標準ＨＰＬＣ技術
を用い、時間をかけてオーキシン濃度をモニターするの
が有利である。また、オーキシン(複数もあり得る)に伴
い得る有毒な副作用を回避し、さらに生存し得る状態で
ＰＥＭを維持するためには、植物組織培養培地にオーキ
シン(複数もあり得る)を加えすぎないことが重要であ
る。
【００２３】ＰＥＭ生長および増殖用の液体植物組織培
養培地は、体細胞不定胚分化の誘導および促進相が行な
われ得るようにオーキシン濃度および／または他の必須
成分が適当な間隔で簡単に補充される初期誘導相植物組
織培養培地であり得る。初期誘導相培地はまた、適当な
間隔で適当なオーキシン濃度を含む新鮮な植物組織培養
培地と交換され得、この場合、液体植物組織培養培地
は、最初に使用された適当ではあるが異なる液体植物組
織培養培地とは同一または異なるものであり得る。すな
わち、使用される現実の植物組織培養培地(複数もあり
得る)のタイプは、それらが液体であり、適当なオーキ
シン濃度の存在下でＰＥＭ形成の誘導および／または促
進に使用され得るものであれば、本発明にとって厳密な
ものではないことがわかる。
養培地は、体細胞不定胚分化の誘導および促進相が行な
われ得るようにオーキシン濃度および／または他の必須
成分が適当な間隔で簡単に補充される初期誘導相植物組
織培養培地であり得る。初期誘導相培地はまた、適当な
間隔で適当なオーキシン濃度を含む新鮮な植物組織培養
培地と交換され得、この場合、液体植物組織培養培地
は、最初に使用された適当ではあるが異なる液体植物組
織培養培地とは同一または異なるものであり得る。すな
わち、使用される現実の植物組織培養培地(複数もあり
得る)のタイプは、それらが液体であり、適当なオーキ
シン濃度の存在下でＰＥＭ形成の誘導および／または促
進に使用され得るものであれば、本発明にとって厳密な
ものではないことがわかる。
【００２４】また、必要なオーキシン濃度は、植物の種
類によって異なり、植物の変種ごとに変化し得ることは
容易に理解され得る。所定の変種に関して最適な結果を
与えるオーキシンのタイプおよび濃度は、標準試験によ
り決定され得る。植物変種によっては、オーキシンの混
合物を使用するのが有利であり得る。本発明方法での使
用に適したオーキシンおよびオーキシン様化合物の例に
は、インドール酢酸、インドール酪酸、ナフタレン酢酸
およびそれらの混合物がある。オーキシンレベルは、Ｐ
ＥＭの生長および形成を促進する濃度に維持される。
類によって異なり、植物の変種ごとに変化し得ることは
容易に理解され得る。所定の変種に関して最適な結果を
与えるオーキシンのタイプおよび濃度は、標準試験によ
り決定され得る。植物変種によっては、オーキシンの混
合物を使用するのが有利であり得る。本発明方法での使
用に適したオーキシンおよびオーキシン様化合物の例に
は、インドール酢酸、インドール酪酸、ナフタレン酢酸
およびそれらの混合物がある。オーキシンレベルは、Ｐ
ＥＭの生長および形成を促進する濃度に維持される。
【００２５】オーキシン濃度は、ＰＥＭ数または興味の
対象であるバイオマスおよび植物の種類によって、好ま
しくは約０.１mg／l〜約３０mg／lの濃度で維持され
る。オーキシンの適当な混合物は、ＮＡＡおよび２,４
−Ｄを適当な濃度で含み得る。ナフタレン酢酸(ＮＡＡ)
の有効なオーキシン濃度は、興味の対象である植物の種
類によって、一般には約０−２０mg／lの範囲であり、
２,４−Ｄの場合は約０.１mg／lないし約１０mg／l以下
の範囲である。例えば、シクラメンＰＥＭは、ＮＡＡの
存在を必要とはしないが、初期濃度約５−１０mg／lの
２,４−Ｄの存在を必要とする。リコペルシコンＰＥＭ
は、初期濃度２０mg／lのＮＡＡおよび初期濃度１mg／l
の２,４−Ｄを必要とすることが見出された。
対象であるバイオマスおよび植物の種類によって、好ま
しくは約０.１mg／l〜約３０mg／lの濃度で維持され
る。オーキシンの適当な混合物は、ＮＡＡおよび２,４
−Ｄを適当な濃度で含み得る。ナフタレン酢酸(ＮＡＡ)
の有効なオーキシン濃度は、興味の対象である植物の種
類によって、一般には約０−２０mg／lの範囲であり、
２,４−Ｄの場合は約０.１mg／lないし約１０mg／l以下
の範囲である。例えば、シクラメンＰＥＭは、ＮＡＡの
存在を必要とはしないが、初期濃度約５−１０mg／lの
２,４−Ｄの存在を必要とする。リコペルシコンＰＥＭ
は、初期濃度２０mg／lのＮＡＡおよび初期濃度１mg／l
の２,４−Ｄを必要とすることが見出された。
【００２６】使用される植物変種および植物組織培養培
地によっては、非植物毒性量のサイトキニンをオーキシ
ン含有培地に加えることによりオーキシン取り込みを容
易にすることが有利であり得る。
地によっては、非植物毒性量のサイトキニンをオーキシ
ン含有培地に加えることによりオーキシン取り込みを容
易にすることが有利であり得る。
【００２７】本発明はまた、懸濁培養中実質的に同じ倍
数性レベルを有する体細胞胚を得る方法であって、 i)前胚形成塊(ＰＥＭ)形成の誘導を促進するのに充分な
有効量のオーキシンまたはオーキシン混合物を含む液体
植物組織培養培地と接触させた状態で外植体を培養し、 ii)適当なオーキシン含有液体植物組織培養培地と接触
させた状態でi)で得られたＰＥＭの数を増加させ、 iii)ii)で得られたＰＥＭを集め、それらを実質的オー
キシン不含有液体培地と接触させた状態に置き、そして iv)iii)で生成されたＰＥＭから誘導去れた胚を集める
ことを含む方法を提供する。
数性レベルを有する体細胞胚を得る方法であって、 i)前胚形成塊(ＰＥＭ)形成の誘導を促進するのに充分な
有効量のオーキシンまたはオーキシン混合物を含む液体
植物組織培養培地と接触させた状態で外植体を培養し、 ii)適当なオーキシン含有液体植物組織培養培地と接触
させた状態でi)で得られたＰＥＭの数を増加させ、 iii)ii)で得られたＰＥＭを集め、それらを実質的オー
キシン不含有液体培地と接触させた状態に置き、そして iv)iii)で生成されたＰＥＭから誘導去れた胚を集める
ことを含む方法を提供する。
【００２８】この方法の段階i)およびii)については上
記で検討されている。それらは例えば下記の要領で行な
われ得る。
記で検討されている。それらは例えば下記の要領で行な
われ得る。
【００２９】外植体を、興味の対象である種類によって
約０.１mg／l〜約３０mg／lの濃度でオーキシンまたは
オーキシン混合物を含み、ＰＥＭ形成の誘導に有効であ
る適当な液体培地、例えばＢ５培地またはＭＳ培地中に
置く。外植体を、週単位で時間測定された期間(この期
間中にＰＥＭが現れる)、約０.０１グラム(生重量)／l
〜約１００グラム(生重量)／l(培養物)、好ましくは約
１.０グラム(生重量)／l〜約１０グラム(生重量)／lの
適当な密度で培養する。この期間は、興味の対象である
植物の種類によって、約２週間〜約１４週間またはそれ
以上、典型的には約４週間〜約８週間の範囲であり得
る。典型的には、得られたＰＥＭを、例えば培地希釈ま
たは培地取り替えにより初期外植体培養から分離し、そ
して同じまたは類似した新鮮な液体培地でさらに培養す
る。
約０.１mg／l〜約３０mg／lの濃度でオーキシンまたは
オーキシン混合物を含み、ＰＥＭ形成の誘導に有効であ
る適当な液体培地、例えばＢ５培地またはＭＳ培地中に
置く。外植体を、週単位で時間測定された期間(この期
間中にＰＥＭが現れる)、約０.０１グラム(生重量)／l
〜約１００グラム(生重量)／l(培養物)、好ましくは約
１.０グラム(生重量)／l〜約１０グラム(生重量)／lの
適当な密度で培養する。この期間は、興味の対象である
植物の種類によって、約２週間〜約１４週間またはそれ
以上、典型的には約４週間〜約８週間の範囲であり得
る。典型的には、得られたＰＥＭを、例えば培地希釈ま
たは培地取り替えにより初期外植体培養から分離し、そ
して同じまたは類似した新鮮な液体培地でさらに培養す
る。
【００３０】得られたＰＥＭは、ＰＥＭ形成誘導に要求
される条件と同一または類似した環境条件下で直ちに生
長または増殖相に入り得る。ＰＥＭ数の増加またはＰＥ
Ｍバイオマスがモニターされ、増大するのが見られるこ
とから、便宜上、この相をここでは増殖相と称す。
される条件と同一または類似した環境条件下で直ちに生
長または増殖相に入り得る。ＰＥＭ数の増加またはＰＥ
Ｍバイオマスがモニターされ、増大するのが見られるこ
とから、便宜上、この相をここでは増殖相と称す。
【００３１】ＰＥＭ形成の誘導が観察された後、顕著な
ＰＥＭの発達を伴うこと無く、オーキシン濃度がＰＥＭ
の生長および増殖を促進するのに充分なレベルで維持さ
れるように液体植物組織培養培地をモニターする。オー
キシンレベルが適当な時間間隔でＰＥＭ増殖を促進する
のに充分なレベルで制御されるように、増殖相は、選り
抜きの液体植物組織培養培地の標準希釈物中での継代培
養を必要とし得る。別法として、ＰＥＭを、初期外植体
培養から分離し、オーキシン含有植物組織培養培地中に
置き、流加培養または連続培養システムを用いることに
より、単に所望のＰＥＭバイオマスとなるまで増殖させ
得る。典型的には、この方法は、オーキシン濃度を一定
期間約０.１mg／lのレベルより上に維持することを必要
とする。増殖相に関する期間は、真正体細胞胚への変換
にいかに多くのＰＥＭが要求されるかによって年単位で
測定され得るが、通常、増殖相は、月または週単位で測
定され、要求されるＰＥＭバイオマスの量によって例え
ば約２〜約３０週である。増殖相において１回、ＰＥＭ
は実質的オーキシン不含有植物組織培養培地中に置き換
えられる時点で集められ得、次いでそれらは続けて真正
体細胞胚へ生長し得る。これは、本明細書記載のふるい
分け、すなわち好適なサイズのふるい(例、１５０μm孔
サイズのふるい)を通過し得るが、より小さいサイズの
ふるい(例、１００μm孔サイズのふるい)では保持され
るあるサイズのＰＥＭフラクションの選択を含み得る。
ＰＥＭの発達を伴うこと無く、オーキシン濃度がＰＥＭ
の生長および増殖を促進するのに充分なレベルで維持さ
れるように液体植物組織培養培地をモニターする。オー
キシンレベルが適当な時間間隔でＰＥＭ増殖を促進する
のに充分なレベルで制御されるように、増殖相は、選り
抜きの液体植物組織培養培地の標準希釈物中での継代培
養を必要とし得る。別法として、ＰＥＭを、初期外植体
培養から分離し、オーキシン含有植物組織培養培地中に
置き、流加培養または連続培養システムを用いることに
より、単に所望のＰＥＭバイオマスとなるまで増殖させ
得る。典型的には、この方法は、オーキシン濃度を一定
期間約０.１mg／lのレベルより上に維持することを必要
とする。増殖相に関する期間は、真正体細胞胚への変換
にいかに多くのＰＥＭが要求されるかによって年単位で
測定され得るが、通常、増殖相は、月または週単位で測
定され、要求されるＰＥＭバイオマスの量によって例え
ば約２〜約３０週である。増殖相において１回、ＰＥＭ
は実質的オーキシン不含有植物組織培養培地中に置き換
えられる時点で集められ得、次いでそれらは続けて真正
体細胞胚へ生長し得る。これは、本明細書記載のふるい
分け、すなわち好適なサイズのふるい(例、１５０μm孔
サイズのふるい)を通過し得るが、より小さいサイズの
ふるい(例、１００μm孔サイズのふるい)では保持され
るあるサイズのＰＥＭフラクションの選択を含み得る。
【００３２】ＰＥＭ形成および増殖は、液体植物組織培
養培地に適当な炭素エネルギー供給源、好都合には可溶
性炭水化物、例えばスクロース、グルコースまたはラフ
ィノースを補充することにより有利に影響される。典型
的な炭水化物濃度は、植物組織培養培地に対し１５g／l
〜９０g／l、好ましくは２０g／l〜６０g／lの範囲に含
まれる。
養培地に適当な炭素エネルギー供給源、好都合には可溶
性炭水化物、例えばスクロース、グルコースまたはラフ
ィノースを補充することにより有利に影響される。典型
的な炭水化物濃度は、植物組織培養培地に対し１５g／l
〜９０g／l、好ましくは２０g／l〜６０g／lの範囲に含
まれる。
【００３３】増殖相は、フラスコまたはバイオリアクタ
ー中で遂行され得る。バイオリアクターは、２次細胞代
謝物製造を目的とする細胞懸濁液の培養に関する業界で
は公知であるが、ＰＥＭ培養を目的とするバイオリアク
ターの使用についてはこれまでのところ報告されていな
い。我々は、バイオリアクターが、比較的短い時間間隔
で非常に大量のＰＥＭを製造するのに有用であり得るこ
とを見出した。
ー中で遂行され得る。バイオリアクターは、２次細胞代
謝物製造を目的とする細胞懸濁液の培養に関する業界で
は公知であるが、ＰＥＭ培養を目的とするバイオリアク
ターの使用についてはこれまでのところ報告されていな
い。我々は、バイオリアクターが、比較的短い時間間隔
で非常に大量のＰＥＭを製造するのに有用であり得るこ
とを見出した。
【００３４】便宜上、ＰＥＭ懸濁培養からパックした細
胞容量を、適当なバイオリアクター中、興味の対象であ
るＰＥＭの種類によって、充分量の適当な炭素エネルギ
ー供給源、例えばスクロース、グルコースおよびラフィ
ノースを、約１５g／lないし９０g／lまたはそれ以上、
好ましくは約２０g／l〜約６０g／lの濃度で含む適当な
培地に接種する。プレイルおよびベック[(１９９１)「ア
クタ・ホルティクルツラエ」(Ａcta Ｈorticulturae)２
８９、「プラント・テクノロジー」(Ｐlant Ｔechnolog
y):１７９−１９２]は、バイブロミキサーの使用による
バイオリアクター中での体細胞不定胚分化について記載
しているが、その試験では、ＰＥＭが体細胞胚へ生長す
る前にＰＥＭ形成および増殖が行なわれることは示唆さ
れていない。ＰＥＭ懸濁培養物においてバイオリアクタ
ー中でバイブロミキサーを使用すると、ＰＥＭの寿命が
時間をかけて顕著に増加し、ＰＥＭバイオマスの増大が
助長され、ＰＥＭバイオマス喪失が低減化され、ＰＥＭ
の凝集が阻止されることが見出された。穿孔した混合プ
レートまたは撹はんディスクを備えたバイブロミキサー
(各々アプリコンＢＶ(オランダ国)およびチェマップ・
アクチエンゲゼルシャフト(スイス国)から入手可能)を
バイオリアクターの固定面に設置し、実質的にその固定
面で振動させると、ＰＥＭ懸濁培養物はＰＥＭバイオマ
スを著しく喪失することなく混合または撹はんされる。
胞容量を、適当なバイオリアクター中、興味の対象であ
るＰＥＭの種類によって、充分量の適当な炭素エネルギ
ー供給源、例えばスクロース、グルコースおよびラフィ
ノースを、約１５g／lないし９０g／lまたはそれ以上、
好ましくは約２０g／l〜約６０g／lの濃度で含む適当な
培地に接種する。プレイルおよびベック[(１９９１)「ア
クタ・ホルティクルツラエ」(Ａcta Ｈorticulturae)２
８９、「プラント・テクノロジー」(Ｐlant Ｔechnolog
y):１７９−１９２]は、バイブロミキサーの使用による
バイオリアクター中での体細胞不定胚分化について記載
しているが、その試験では、ＰＥＭが体細胞胚へ生長す
る前にＰＥＭ形成および増殖が行なわれることは示唆さ
れていない。ＰＥＭ懸濁培養物においてバイオリアクタ
ー中でバイブロミキサーを使用すると、ＰＥＭの寿命が
時間をかけて顕著に増加し、ＰＥＭバイオマスの増大が
助長され、ＰＥＭバイオマス喪失が低減化され、ＰＥＭ
の凝集が阻止されることが見出された。穿孔した混合プ
レートまたは撹はんディスクを備えたバイブロミキサー
(各々アプリコンＢＶ(オランダ国)およびチェマップ・
アクチエンゲゼルシャフト(スイス国)から入手可能)を
バイオリアクターの固定面に設置し、実質的にその固定
面で振動させると、ＰＥＭ懸濁培養物はＰＥＭバイオマ
スを著しく喪失することなく混合または撹はんされる。
【００３５】好ましくは、バイブロミキサーを実質的に
垂直面で振動させる。本発明方法で使用されるバイブロ
ミキサーの一般的稼動振動数は５０Ｈzである。振幅
は、好都合には±６mmまたはそれ未満の程度である。一
旦、所望の数の体細胞胚を生じ得るＰＥＭバイオマスが
得られると、ＰＥＭを実質的オーキシン不含有液体植物
組織培養培地と接触した状態に置くことができ、そこで
それらは体細胞胚に生長し得る。
垂直面で振動させる。本発明方法で使用されるバイブロ
ミキサーの一般的稼動振動数は５０Ｈzである。振幅
は、好都合には±６mmまたはそれ未満の程度である。一
旦、所望の数の体細胞胚を生じ得るＰＥＭバイオマスが
得られると、ＰＥＭを実質的オーキシン不含有液体植物
組織培養培地と接触した状態に置くことができ、そこで
それらは体細胞胚に生長し得る。
【００３６】有利にはＰＥＭ懸濁液を曝気する。これは
自体公知の方法で遂行され得る。バイブロミキサーを使
用する場合、空気は、例えば多孔分散装置を用いてバイ
ブロミキサーリアクター中へ散布され得る。
自体公知の方法で遂行され得る。バイブロミキサーを使
用する場合、空気は、例えば多孔分散装置を用いてバイ
ブロミキサーリアクター中へ散布され得る。
【００３７】上記および実施例から、様々なパラメータ
ー、例えばオーキシンのタイプおよび濃度、サイトキニ
ンの存在、エネルギー(炭水化物)供給源、撹はんまたは
振動数、酸素供給、光の強度および波長に関する最適条
件は、使用される植物材料によって異なることになる。
上記の最適条件は、標準試験(実施例で説明されている)
を用いて決定され得る。本発明による体細胞胚獲得方法
の後続段階iii)およびiv)は、下記の要領で実施され得
る。
ー、例えばオーキシンのタイプおよび濃度、サイトキニ
ンの存在、エネルギー(炭水化物)供給源、撹はんまたは
振動数、酸素供給、光の強度および波長に関する最適条
件は、使用される植物材料によって異なることになる。
上記の最適条件は、標準試験(実施例で説明されている)
を用いて決定され得る。本発明による体細胞胚獲得方法
の後続段階iii)およびiv)は、下記の要領で実施され得
る。
【００３８】ＰＥＭから体細胞胚への発達の促進は、オ
ーキシン不含有植物組織培養培地中にＰＥＭを置くこと
により達成され得る。生存し得るＰＥＭは、体細胞胚に
発達し得る。オーキシン不含有培地に移す前に、ＰＥＭ
を有利には例えばナイロンメッシュを通してふるいにか
け、最も効果的に所望の体細胞胚を発生するＰＥＭサイ
ズフラクションを選択する。生存不可能なＰＥＭの含有
率が高すぎると、体細胞胚の形成は阻止される。一般
に、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、さ
らに好ましくは少なくとも１５％の率で生存可能なＰＥ
Ｍを含むＰＥＭを使用するのが望ましい。最適サイズフ
ラクションは、標準スクリーニング試験により決定され
得る。
ーキシン不含有植物組織培養培地中にＰＥＭを置くこと
により達成され得る。生存し得るＰＥＭは、体細胞胚に
発達し得る。オーキシン不含有培地に移す前に、ＰＥＭ
を有利には例えばナイロンメッシュを通してふるいにか
け、最も効果的に所望の体細胞胚を発生するＰＥＭサイ
ズフラクションを選択する。生存不可能なＰＥＭの含有
率が高すぎると、体細胞胚の形成は阻止される。一般
に、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、さ
らに好ましくは少なくとも１５％の率で生存可能なＰＥ
Ｍを含むＰＥＭを使用するのが望ましい。最適サイズフ
ラクションは、標準スクリーニング試験により決定され
得る。
【００３９】選ばれたサイズのＰＥＭは、例えばふるい
または当業界における他のサイズ選別手段により回収さ
れ得る。熟練者であれば、所望の大きさをしたＰＥＭ
(特に高含有率の生存可能なＰＥＭを有するＰＥＭフラ
クション)のサイズは、本明細書で詳述されている通り
種類によって異なることはわかるはずである。
または当業界における他のサイズ選別手段により回収さ
れ得る。熟練者であれば、所望の大きさをしたＰＥＭ
(特に高含有率の生存可能なＰＥＭを有するＰＥＭフラ
クション)のサイズは、本明細書で詳述されている通り
種類によって異なることはわかるはずである。
【００４０】ＰＥＭのふるい分けられたフラクション
は、所定サイズ範囲内のＰＥＭを得るためＰＥＭをろ過
手段、例えば既知孔サイズのネットメッシュ、例えばナ
イロンメッシュに通すことにより得られるものである。
ＰＥＭは、植物の種類によっては直径約１mm以下のサイ
ズを有し得るが、ＰＥＭの集合体は直径５mm以下であり
得る。一般的に述べると、個々のＰＥＭの望ましいサイ
ズはμmで記される程度である。ＰＥＭのサイズは、そ
こから誘導される単一体細胞胚の獲得にとって重要なも
のではないことが見出された。好ましくは、集められた
ＰＥＭフラクションは、その中の各ＰＥＭが適当な条件
下で１個の体細胞胚を生じ得るものである。当然、特定
の生存可能なふるい分けられたＰＥＭフラクションのサ
イズは、植物の種類によって変化する。例えば、キュウ
リにとって最も有用なＰＥＭフラクションは、ＰＥＭの
サイズが約１００μm−約１５０μmの範囲のものであ
る。シクラメンの場合のＰＥＭフラクションは、約１５
０μm−約３００μmである。より好ましくは、ＰＥＭフ
ラクションは、各ＰＥＭが少なくとも１個の体細胞胚、
好ましくは単一体細胞胚を生じ得るものである。
は、所定サイズ範囲内のＰＥＭを得るためＰＥＭをろ過
手段、例えば既知孔サイズのネットメッシュ、例えばナ
イロンメッシュに通すことにより得られるものである。
ＰＥＭは、植物の種類によっては直径約１mm以下のサイ
ズを有し得るが、ＰＥＭの集合体は直径５mm以下であり
得る。一般的に述べると、個々のＰＥＭの望ましいサイ
ズはμmで記される程度である。ＰＥＭのサイズは、そ
こから誘導される単一体細胞胚の獲得にとって重要なも
のではないことが見出された。好ましくは、集められた
ＰＥＭフラクションは、その中の各ＰＥＭが適当な条件
下で１個の体細胞胚を生じ得るものである。当然、特定
の生存可能なふるい分けられたＰＥＭフラクションのサ
イズは、植物の種類によって変化する。例えば、キュウ
リにとって最も有用なＰＥＭフラクションは、ＰＥＭの
サイズが約１００μm−約１５０μmの範囲のものであ
る。シクラメンの場合のＰＥＭフラクションは、約１５
０μm−約３００μmである。より好ましくは、ＰＥＭフ
ラクションは、各ＰＥＭが少なくとも１個の体細胞胚、
好ましくは単一体細胞胚を生じ得るものである。
【００４１】実質的オーキシン不含有液体植物組織培養
培地は、ＰＥＭを体細胞胚に発達させ得るものである。
すなわち、実質的オーキシン不含有液体植物組織培養培
地は、残留レベルのオーキシンは存在し得るが、オーキ
シンレベルが存在したとしても、ＰＥＭから体細胞胚へ
の発達を実質的に妨害することの無いオーキシン枯渇植
物組織培養培地であり得るか、またはそれはオーキシン
不含有植物組織培養培地であり得ると予測される。当
然、熟練者であれば、実質的オーキシン不含有植物組織
培養培地が、いかに多くの体細胞胚が所望されるかによ
って、フラスコまたは適当なバイオリアクター、例えば
バイブロミキサーを取り付けたものの中に置かれ得るこ
とは認識できるはずである。次いで、得られた体細胞胚
は、当業界で公知の方法を用いて植物に変換され得る。
すなわち、ＰＥＭバイオマスをモニターすることによ
り、大量の体細胞胚を商業的規模で得ることが可能とな
る。
培地は、ＰＥＭを体細胞胚に発達させ得るものである。
すなわち、実質的オーキシン不含有液体植物組織培養培
地は、残留レベルのオーキシンは存在し得るが、オーキ
シンレベルが存在したとしても、ＰＥＭから体細胞胚へ
の発達を実質的に妨害することの無いオーキシン枯渇植
物組織培養培地であり得るか、またはそれはオーキシン
不含有植物組織培養培地であり得ると予測される。当
然、熟練者であれば、実質的オーキシン不含有植物組織
培養培地が、いかに多くの体細胞胚が所望されるかによ
って、フラスコまたは適当なバイオリアクター、例えば
バイブロミキサーを取り付けたものの中に置かれ得るこ
とは認識できるはずである。次いで、得られた体細胞胚
は、当業界で公知の方法を用いて植物に変換され得る。
すなわち、ＰＥＭバイオマスをモニターすることによ
り、大量の体細胞胚を商業的規模で得ることが可能とな
る。
【００４２】オーキシン不含有培地は、好都合には１５
g／l〜９０g／l、好ましくは２０g／l〜６０g／lの濃度
で可溶性炭水化物エネルギー供給源を含む。適当な炭水
化物エネルギー供給源には、スクロース、グルコースお
よびラフィノースがある。
g／l〜９０g／l、好ましくは２０g／l〜６０g／lの濃度
で可溶性炭水化物エネルギー供給源を含む。適当な炭水
化物エネルギー供給源には、スクロース、グルコースお
よびラフィノースがある。
【００４３】商業的規模の体細胞胚数は、顧客の必要条
件によって数百(例、５００)〜数百万(例、３００００
００)またはそれ以上の数値の範囲内で変動し得る。例
えば、必要条件が約２０００００植物に対するものであ
る場合、ＰＥＭバイオマスが実質的に約２０００００体
細胞胚を生じ得る状態に到達するまでＰＥＭ増殖は続行
される。次に、前述のＰＥＭをオーキシン不含有液体植
物組織培養培地と接触した状態に置くと、そこでそれら
は体細胞胚に発達することができる。
件によって数百(例、５００)〜数百万(例、３００００
００)またはそれ以上の数値の範囲内で変動し得る。例
えば、必要条件が約２０００００植物に対するものであ
る場合、ＰＥＭバイオマスが実質的に約２０００００体
細胞胚を生じ得る状態に到達するまでＰＥＭ増殖は続行
される。次に、前述のＰＥＭをオーキシン不含有液体植
物組織培養培地と接触した状態に置くと、そこでそれら
は体細胞胚に発達することができる。
【００４４】一旦真正体細胞胚が実質的オーキシン不含
有植物組織培養培地中で発達すると、それらは、当業界
で常用されている技術を用いてオーキシン不含有植物組
織培養培地から分離され、植物に変換され得る。
有植物組織培養培地中で発達すると、それらは、当業界
で常用されている技術を用いてオーキシン不含有植物組
織培養培地から分離され、植物に変換され得る。
【００４５】体細胞胚は、好都合には商業的使用前に生
存不可能なＰＥＭから分離される。これは、自体公知の
方法で行なわれ得る。生存不可能なＰＥＭは、一般に体
細胞胚よりも小さい。体細胞胚は、例えば手動的、ふる
い分けまたは細胞選別により単離され得る。
存不可能なＰＥＭから分離される。これは、自体公知の
方法で行なわれ得る。生存不可能なＰＥＭは、一般に体
細胞胚よりも小さい。体細胞胚は、例えば手動的、ふる
い分けまたは細胞選別により単離され得る。
【００４６】本発明のさらに別の態様では、実質的に全
て同じ倍数性レベルを有する体細胞胚を含む体細胞胚の
バッチが提供される。体細胞胚のバッチは、商業的要件
によって数百ないし数万またはそれ以上を含み得る。好
ましくは、体細胞胚のバッチは、実質的に２倍体の体細
胞胚または実質的に４倍体の体細胞胚を含む。体細胞胚
のバッチは、単に液体培地が排出された体細胞胚の懸濁
液であり得、体細胞胚は適当な容器に入れられる。容器
の周囲環境は、高い相対湿度、例えば１００％を有し
得、０℃より高く、約１５℃以下の適当な冷温で維持さ
れ得る。この方法で貯蔵された体細胞胚は、約４日間以
下の間維持され得る。別法として、体細胞胚は、デシケ
ーター(乾燥)処理、冷凍、ペレット化、ゲル封入などに
付され得る。
て同じ倍数性レベルを有する体細胞胚を含む体細胞胚の
バッチが提供される。体細胞胚のバッチは、商業的要件
によって数百ないし数万またはそれ以上を含み得る。好
ましくは、体細胞胚のバッチは、実質的に２倍体の体細
胞胚または実質的に４倍体の体細胞胚を含む。体細胞胚
のバッチは、単に液体培地が排出された体細胞胚の懸濁
液であり得、体細胞胚は適当な容器に入れられる。容器
の周囲環境は、高い相対湿度、例えば１００％を有し
得、０℃より高く、約１５℃以下の適当な冷温で維持さ
れ得る。この方法で貯蔵された体細胞胚は、約４日間以
下の間維持され得る。別法として、体細胞胚は、デシケ
ーター(乾燥)処理、冷凍、ペレット化、ゲル封入などに
付され得る。
【００４７】本発明は、実質的に全て同じ倍数性レベル
を有する体細胞胚を含む、ダウクスとは異なるさらに別
の体細胞胚懸濁培養物を提供する。好ましい体細胞胚は
２倍体または４倍体である。体細胞胚は、双子葉または
単子葉植物外植体から誘導される。以下、実施例により
本発明の説明を行う。当然、実施例はいかなる意味でも
本発明の範囲を制限するものとして見なされるべきでは
ないものとする。
を有する体細胞胚を含む、ダウクスとは異なるさらに別
の体細胞胚懸濁培養物を提供する。好ましい体細胞胚は
２倍体または４倍体である。体細胞胚は、双子葉または
単子葉植物外植体から誘導される。以下、実施例により
本発明の説明を行う。当然、実施例はいかなる意味でも
本発明の範囲を制限するものとして見なされるべきでは
ないものとする。
【００４８】
実施例１ 胚形成シクラメン細胞培養の開始およびそこからの体細
胞胚。 シクラメン変種「コンチェルト・スカーレット」(スルイ
スおよびグルート)の種子を、７０％エタノール(２分
間)および次亜塩素酸ナトリウムの１.５％溶液(４５分
間)により表面殺菌し、次いで滅菌水で充分に洗浄(３
回)する。２３℃で２−４週間湿った紙の上で種子を発
芽させ、発芽した塊茎を外植体として使用する。３つの
塊茎を、２３℃で暗所中、１００rpmの回転震とう器(Ｇ
１０ジャイロロータリーシェーカー、ニューブルンスウ
ィック・サイエンティフィック、エディソン、ニュージ
ャージー、アメリカ合衆国)において２０g／lのスクロ
ース、１０mg／lの２,４−Ｄ、１００mg／lのミオイノ
シトール、１.０mg／lのニコチン酸、１.０mg／lのピリ
ドキシンＨＣl、１０mg／lのチアミンＨＣlを補った塩
基性Ｂ５培地(デュチェファ・ビオヘミーＢＶから入手
可能、ハールレム、オランダ国)１０ml中で培養する。
７日後、培地を新鮮な培地と交換する。さらに７日後、
培養物を新鮮な培地により２０ml容量に希釈(５倍)す
る。さらに７日後、希釈培養物からの塊茎外植体の維管
束および内鞘を含む中心髄を、塊茎外植体から分離し、
２０g／lのスクロース、１００mg／lのミオイノシトー
ル、１.０mg／lのニコチン酸、１.０mg／lピリドキシン
ＨＣl、１０mg／lのチアミンＨＣl、５mg／lの２,４−
Ｄおよび１mg／lのキネチンを補った塩基性Ｂ５培地２
５ml中で塊茎の残りとは別に継代培養する。継代培養物
を４週間毎週２倍に希釈する。前胚形成塊は約４週目に
現れる。上記要領で２週間さらに継代培養することによ
り、ＰＥＭを増殖させる。２０g／lのスクロース、１０
０mg／lのミオイノシトール、１.０mg／lのニコチン
酸、１.０mg／lのピリドキシンＨＣl、１０mg／lのチア
ミンＨＣlを補ったオーキシンおよびサイトキニン不含
有Ｂ５培地でさらに培養することにより、ＰＥＭは生存
可能な真正体細胞胚に発達し得る。
胞胚。 シクラメン変種「コンチェルト・スカーレット」(スルイ
スおよびグルート)の種子を、７０％エタノール(２分
間)および次亜塩素酸ナトリウムの１.５％溶液(４５分
間)により表面殺菌し、次いで滅菌水で充分に洗浄(３
回)する。２３℃で２−４週間湿った紙の上で種子を発
芽させ、発芽した塊茎を外植体として使用する。３つの
塊茎を、２３℃で暗所中、１００rpmの回転震とう器(Ｇ
１０ジャイロロータリーシェーカー、ニューブルンスウ
ィック・サイエンティフィック、エディソン、ニュージ
ャージー、アメリカ合衆国)において２０g／lのスクロ
ース、１０mg／lの２,４−Ｄ、１００mg／lのミオイノ
シトール、１.０mg／lのニコチン酸、１.０mg／lのピリ
ドキシンＨＣl、１０mg／lのチアミンＨＣlを補った塩
基性Ｂ５培地(デュチェファ・ビオヘミーＢＶから入手
可能、ハールレム、オランダ国)１０ml中で培養する。
７日後、培地を新鮮な培地と交換する。さらに７日後、
培養物を新鮮な培地により２０ml容量に希釈(５倍)す
る。さらに７日後、希釈培養物からの塊茎外植体の維管
束および内鞘を含む中心髄を、塊茎外植体から分離し、
２０g／lのスクロース、１００mg／lのミオイノシトー
ル、１.０mg／lのニコチン酸、１.０mg／lピリドキシン
ＨＣl、１０mg／lのチアミンＨＣl、５mg／lの２,４−
Ｄおよび１mg／lのキネチンを補った塩基性Ｂ５培地２
５ml中で塊茎の残りとは別に継代培養する。継代培養物
を４週間毎週２倍に希釈する。前胚形成塊は約４週目に
現れる。上記要領で２週間さらに継代培養することによ
り、ＰＥＭを増殖させる。２０g／lのスクロース、１０
０mg／lのミオイノシトール、１.０mg／lのニコチン
酸、１.０mg／lのピリドキシンＨＣl、１０mg／lのチア
ミンＨＣlを補ったオーキシンおよびサイトキニン不含
有Ｂ５培地でさらに培養することにより、ＰＥＭは生存
可能な真正体細胞胚に発達し得る。
【００４９】実施例２ 胚形成性シクラメン細胞懸濁培養の開始およびそこから
の体細胞胚。 シクラメン種子(品種コンチェルト・シャルラーケン・
オテロ、ツァーデュニーＢＶから入手)を、７０％エタ
ノール(２分間)および１％次亜塩素酸ナトリウム(４５
分間)で表面殺菌し、滅菌水で充分に洗浄(３回)する。
種子を２３℃で暗所中、２〜５週間湿った紙の上で発芽
させる。発芽した塊茎を外植体として使用し、２〜８片
に切断する。デ・ラート等(１９８７)「プラント・ブリ
ーディング」(Ｐlant Ｂreeding)９９:３０３−３０７の
指示に従い、外植体の倍数性レベルを測定すると、２倍
体であることが見出された。
の体細胞胚。 シクラメン種子(品種コンチェルト・シャルラーケン・
オテロ、ツァーデュニーＢＶから入手)を、７０％エタ
ノール(２分間)および１％次亜塩素酸ナトリウム(４５
分間)で表面殺菌し、滅菌水で充分に洗浄(３回)する。
種子を２３℃で暗所中、２〜５週間湿った紙の上で発芽
させる。発芽した塊茎を外植体として使用し、２〜８片
に切断する。デ・ラート等(１９８７)「プラント・ブリ
ーディング」(Ｐlant Ｂreeding)９９:３０３−３０７の
指示に従い、外植体の倍数性レベルを測定すると、２倍
体であることが見出された。
【００５０】３つの塊茎からの外植体を、暗所中２３℃
の温度で回転震とう器(１００rpm)中、２０g／lのスク
ロース、５mg／lの２,４−ジクロロフェノキシ酢酸およ
び１mg／lのキネチンを補った塩基性Ｂ５培地(デュチェ
ファ・ビオヘミーＢＶ、ハールレム、オランダ国)１０m
l中で培養する。全フラスコをアルミニウムホイルで被
覆する。１週間後、２５０mlフラスコ中、２０g／lのス
クロース、５mg／lの２,４−Ｄ、１００mg／lのミオイ
ノシトール、１.０mg／lのニコチン酸、１.０mg／lのピ
リドキシンＨＣl、１０mg／lのチアミンＨＣlおよび１m
g／lのキネチンを補った塩基性Ｂ５培地で培養物を５０
ml容量に５倍希釈する。さらに２週間後、培養物が含む
ＰＥＭを、広いノズルを有するピペットで培養物の残り
から分離し、別々に培養する。ＰＥＭは、本質的に小さ
な円形の原形質細胞により構成される細胞クランプとし
て視覚的に同定される。この段階で、ＰＥＭは、細胞の
単一クランプまたは互いに付着した細胞の若干のクラン
プとして同定される。広いノズルを有するピペットを用
いて２５０mlフラスコ中、２０g／lのスクロース、５mg
／lの２,４−Ｄ、１００mg／lのミオイノシトール、１.
０mg／lのニコチン酸、１.０mg／lのピリドキシンＨＣ
l、１０mg／lのチアミンＨＣlおよび１mg／lのキネチン
を補って最終容量５０mlにした塩基性Ｂ５培地にパック
した細胞１mlを接種することにより、培養物を２週間ご
とに継代培養する。２分間７００×gで培養物からの試
料を遠心分離にかけることより、パックした細胞容量
(ＰＣＶ)、すなわちＰＣＶ(開始)およびＰＣＶ(最終)に
関する遠心分離後の全細胞量を測定する。シュレーゲル
(１９８１)、「アルゲメイン・ミクロビオロジー」(Ａllg
emeine Ｍicrobiologie)、ティーメ、ステュットガル
ト、１９０頁の公式を用いてＰＣＶ(開始)およびＰＣＶ
(最終)の測定値から算出したところによると、胚形成性
セルラインは、一般に約４〜６日の倍加時間で生長す
る。この方法で得られた胚形成性セルラインを少なくと
も４５週間維持すると、遺伝学的に安定している、すな
わち倍数性レベルは２倍体、最初の外植体の場合と同じ
である。
の温度で回転震とう器(１００rpm)中、２０g／lのスク
ロース、５mg／lの２,４−ジクロロフェノキシ酢酸およ
び１mg／lのキネチンを補った塩基性Ｂ５培地(デュチェ
ファ・ビオヘミーＢＶ、ハールレム、オランダ国)１０m
l中で培養する。全フラスコをアルミニウムホイルで被
覆する。１週間後、２５０mlフラスコ中、２０g／lのス
クロース、５mg／lの２,４−Ｄ、１００mg／lのミオイ
ノシトール、１.０mg／lのニコチン酸、１.０mg／lのピ
リドキシンＨＣl、１０mg／lのチアミンＨＣlおよび１m
g／lのキネチンを補った塩基性Ｂ５培地で培養物を５０
ml容量に５倍希釈する。さらに２週間後、培養物が含む
ＰＥＭを、広いノズルを有するピペットで培養物の残り
から分離し、別々に培養する。ＰＥＭは、本質的に小さ
な円形の原形質細胞により構成される細胞クランプとし
て視覚的に同定される。この段階で、ＰＥＭは、細胞の
単一クランプまたは互いに付着した細胞の若干のクラン
プとして同定される。広いノズルを有するピペットを用
いて２５０mlフラスコ中、２０g／lのスクロース、５mg
／lの２,４−Ｄ、１００mg／lのミオイノシトール、１.
０mg／lのニコチン酸、１.０mg／lのピリドキシンＨＣ
l、１０mg／lのチアミンＨＣlおよび１mg／lのキネチン
を補って最終容量５０mlにした塩基性Ｂ５培地にパック
した細胞１mlを接種することにより、培養物を２週間ご
とに継代培養する。２分間７００×gで培養物からの試
料を遠心分離にかけることより、パックした細胞容量
(ＰＣＶ)、すなわちＰＣＶ(開始)およびＰＣＶ(最終)に
関する遠心分離後の全細胞量を測定する。シュレーゲル
(１９８１)、「アルゲメイン・ミクロビオロジー」(Ａllg
emeine Ｍicrobiologie)、ティーメ、ステュットガル
ト、１９０頁の公式を用いてＰＣＶ(開始)およびＰＣＶ
(最終)の測定値から算出したところによると、胚形成性
セルラインは、一般に約４〜６日の倍加時間で生長す
る。この方法で得られた胚形成性セルラインを少なくと
も４５週間維持すると、遺伝学的に安定している、すな
わち倍数性レベルは２倍体、最初の外植体の場合と同じ
である。
【００５１】ＰＥＭ培養物を、各々２５０μmおよび１
００μmの孔サイズを有するナイロンメッシュに通して
ふるい分けることにより、ＰＥＭを選択する。継代培養
の８日後、ＰＥＭ／mlの最高数に到達する。このフラク
ションからは、最適な胚の発達が誘導され、ＰＥＭ培養
の１ＰＣＶ当たりの胚の最高数が達成される。ふるい分
けされたＰＥＭの数は、一般に１０００〜５０００ＰＥ
Ｍ／ml ＰＣＶの範囲である。
００μmの孔サイズを有するナイロンメッシュに通して
ふるい分けることにより、ＰＥＭを選択する。継代培養
の８日後、ＰＥＭ／mlの最高数に到達する。このフラク
ションからは、最適な胚の発達が誘導され、ＰＥＭ培養
の１ＰＣＶ当たりの胚の最高数が達成される。ふるい分
けされたＰＥＭの数は、一般に１０００〜５０００ＰＥ
Ｍ／ml ＰＣＶの範囲である。
【００５２】ふるい分け後、ＰＥＭを洗浄し、生長培
地、すなわちスクロースまたはグルコースを補って１７
４ミリモルの濃度にしたＭＳまたはＢ５培地に接種す
る。２５〜５０ＰＥＭ／mlを、アルミニウムホイルおよ
びネスコフィルム(バンドー・ケミカル・インダストリ
ー社、日本)で密閉したフラスコ中で培養する。３〜４
週間後、接合子胚に似た魚雷型胚が形成される。この方
法を用いると、２５００００の胚が形成される。胚培養
の無作為標本に対してデ・ラート(前出)により報告され
たフローサイトメトリー分析技術を用いると、５００体
細胞胚のＤＮＡ含有率が評価される。胚は全て、２倍体
であることが見出された。
地、すなわちスクロースまたはグルコースを補って１７
４ミリモルの濃度にしたＭＳまたはＢ５培地に接種す
る。２５〜５０ＰＥＭ／mlを、アルミニウムホイルおよ
びネスコフィルム(バンドー・ケミカル・インダストリ
ー社、日本)で密閉したフラスコ中で培養する。３〜４
週間後、接合子胚に似た魚雷型胚が形成される。この方
法を用いると、２５００００の胚が形成される。胚培養
の無作為標本に対してデ・ラート(前出)により報告され
たフローサイトメトリー分析技術を用いると、５００体
細胞胚のＤＮＡ含有率が評価される。胚は全て、２倍体
であることが見出された。
【００５３】シクラメン胚の変換(すなわち発芽)は、塊
茎形成、次いで不定根の形成を含み、液体培地、すなわ
ち各々約１１６ミリモルまたは５８ミリモルのグルコー
スまたはスクロース含有率を有するＭＳまたはＢ５培地
で胚を培養することにより誘導される。塊茎形成は、塊
茎または塊茎様構造の胚軸からの生長として定義され
る。さらに初葉を形成する子葉の生長は、液体培地また
は固体培地、例えばパーライト、滅菌土壌などで行なわ
れ得る。
茎形成、次いで不定根の形成を含み、液体培地、すなわ
ち各々約１１６ミリモルまたは５８ミリモルのグルコー
スまたはスクロース含有率を有するＭＳまたはＢ５培地
で胚を培養することにより誘導される。塊茎形成は、塊
茎または塊茎様構造の胚軸からの生長として定義され
る。さらに初葉を形成する子葉の生長は、液体培地また
は固体培地、例えばパーライト、滅菌土壌などで行なわ
れ得る。
【００５４】無菌条件下(炭素供給源の存在下)または非
滅菌条件(炭素供給源を全く加えず)下、変換胚をパーラ
イトまたは鉢植え用土に直接播種すると、１８°〜２０
℃で暗所中２〜４週間後に子葉形成が示される。約９０
％という高い相対湿度を使用する。９０％を越える胚
が、無菌条件下で子葉段階に変換する。一旦子葉が現れ
ると、生じた苗木を明所に置き、温室へ移す前に寒気に
さらして強くする。
滅菌条件(炭素供給源を全く加えず)下、変換胚をパーラ
イトまたは鉢植え用土に直接播種すると、１８°〜２０
℃で暗所中２〜４週間後に子葉形成が示される。約９０
％という高い相対湿度を使用する。９０％を越える胚
が、無菌条件下で子葉段階に変換する。一旦子葉が現れ
ると、生じた苗木を明所に置き、温室へ移す前に寒気に
さらして強くする。
【００５５】実施例３ 胚形成性トマト細胞培養の開始 トマト変種「マンハッタン」(スルイスおよびグルート)の
種子を、７０％エタノール(２分間)および１５分間次亜
塩素酸ナトリウムの１.５％溶液で表面滅菌し、次いで
滅菌水により充分に洗浄(３回)する。２３℃の温度で３
日間にわたり、種子を湿った紙の上で発芽させる。完全
な実生を集め、各実生を４片に切断し、次いでそれらを
外植体として使用する。１０実生をこの方法で切断し、
循環可能な１６時間明所期間および８時間暗所期間で、
２３℃で１００rpmの回転震とう器において２０g／lの
スクロース、２０mg／lのＮＡＡ、１mg／lの２,４−
Ｄ、１mg／lのキネチン、１００mg／lのミオイノシトー
ル、１mg／lのニコチン酸、１mg／lのピリドキシンＨＣ
lおよび１０mg／lのチアミンＨＣlを補った液体塩基性
Ｂ５培地(デュチェファ・ビオヘミーＢＶから入手可
能、ハールレム、オランダ国)１５ml中でインキュベー
ションする。当業界で公知のＨＰＬＣ技術を用いて、培
養培地をオーキシン濃度についてモニターする。一旦オ
ーキシン濃度が０.１mg／lより下に下がると、約７日間
後、２０g／lのスクロース、２０mg／lのＮＡＡ、１mg
／lの２,４−Ｄ、１mg／lのキネチン、１００mg／lのミ
オイノシトール、１mg／lのニコチン酸、１mg／lのピリ
ドキシンＨＣlおよび１０mg／lのチアミンＨＣlを補っ
た新鮮な塩基性Ｂ５培地(デュチェファ・ビオヘミーＢ
Ｖから入手可能、ハールレム、オランダ国)１５mlを加
えて、３０mlの培養物の容量にする。外植体および細胞
を１５分間静置し、使用済み培地１５mlを除き、新鮮な
培地１５mlを補充して培養物を清新することにより、こ
の培養物を４−７日ごとに継代培養する。外植体の初回
培養後、約４−７週間後に、前胚形成塊(ＰＥＭ)が観察
される。上記要領で２週間さらに継代培養することによ
り、ＰＥＭを増殖させる。ＮＡＡ、２,４−Ｄおよびキ
ネチンを除いて上記と同様に補ったオーキシン不含有塩
基性Ｂ５培地においてＰＥＭをさらに継代培養すると、
真正体細胞胚が観察される。
種子を、７０％エタノール(２分間)および１５分間次亜
塩素酸ナトリウムの１.５％溶液で表面滅菌し、次いで
滅菌水により充分に洗浄(３回)する。２３℃の温度で３
日間にわたり、種子を湿った紙の上で発芽させる。完全
な実生を集め、各実生を４片に切断し、次いでそれらを
外植体として使用する。１０実生をこの方法で切断し、
循環可能な１６時間明所期間および８時間暗所期間で、
２３℃で１００rpmの回転震とう器において２０g／lの
スクロース、２０mg／lのＮＡＡ、１mg／lの２,４−
Ｄ、１mg／lのキネチン、１００mg／lのミオイノシトー
ル、１mg／lのニコチン酸、１mg／lのピリドキシンＨＣ
lおよび１０mg／lのチアミンＨＣlを補った液体塩基性
Ｂ５培地(デュチェファ・ビオヘミーＢＶから入手可
能、ハールレム、オランダ国)１５ml中でインキュベー
ションする。当業界で公知のＨＰＬＣ技術を用いて、培
養培地をオーキシン濃度についてモニターする。一旦オ
ーキシン濃度が０.１mg／lより下に下がると、約７日間
後、２０g／lのスクロース、２０mg／lのＮＡＡ、１mg
／lの２,４−Ｄ、１mg／lのキネチン、１００mg／lのミ
オイノシトール、１mg／lのニコチン酸、１mg／lのピリ
ドキシンＨＣlおよび１０mg／lのチアミンＨＣlを補っ
た新鮮な塩基性Ｂ５培地(デュチェファ・ビオヘミーＢ
Ｖから入手可能、ハールレム、オランダ国)１５mlを加
えて、３０mlの培養物の容量にする。外植体および細胞
を１５分間静置し、使用済み培地１５mlを除き、新鮮な
培地１５mlを補充して培養物を清新することにより、こ
の培養物を４−７日ごとに継代培養する。外植体の初回
培養後、約４−７週間後に、前胚形成塊(ＰＥＭ)が観察
される。上記要領で２週間さらに継代培養することによ
り、ＰＥＭを増殖させる。ＮＡＡ、２,４−Ｄおよびキ
ネチンを除いて上記と同様に補ったオーキシン不含有塩
基性Ｂ５培地においてＰＥＭをさらに継代培養すると、
真正体細胞胚が観察される。
【００５６】実施例４ 胚形成性トマト細胞培養の開始。 トマト変種「マジョルカ」(スルイスおよびグルート)の種
子を、７０％エタノール(２分間)および１５分間次亜塩
素酸ナトリウムの１.５％溶液で表面滅菌し、次いで滅
菌水により充分に洗浄(３回)する。暗所中２３℃の温度
で７日間種子を湿った紙の上で発芽させる。子葉を集
め、断片に切断し、外植体として使用する。３実生の６
子葉をこの方法で切断し、暗所中２３℃で１００rpmの
回転震とう器において４mg／lの２,４−Ｄおよび０.５m
g／lのキネチンを補った液体培地Ａ(表１参照)１５ml中
でインキュベーションする。１４日後、上記ホルモンを
含む新鮮な培地Ａ(表１参照)３５mlを加える。上記ホル
モンを補った新鮮な培地Ａ(表１参照)中で２倍希釈する
ことにより、培養物を１４日ごとに継代培養する。外植
体の初回培養の約４週間後、ＰＥＭが観察される。上記
要領でさらに継代培養することにより、ＰＥＭを増殖さ
せる。
子を、７０％エタノール(２分間)および１５分間次亜塩
素酸ナトリウムの１.５％溶液で表面滅菌し、次いで滅
菌水により充分に洗浄(３回)する。暗所中２３℃の温度
で７日間種子を湿った紙の上で発芽させる。子葉を集
め、断片に切断し、外植体として使用する。３実生の６
子葉をこの方法で切断し、暗所中２３℃で１００rpmの
回転震とう器において４mg／lの２,４−Ｄおよび０.５m
g／lのキネチンを補った液体培地Ａ(表１参照)１５ml中
でインキュベーションする。１４日後、上記ホルモンを
含む新鮮な培地Ａ(表１参照)３５mlを加える。上記ホル
モンを補った新鮮な培地Ａ(表１参照)中で２倍希釈する
ことにより、培養物を１４日ごとに継代培養する。外植
体の初回培養の約４週間後、ＰＥＭが観察される。上記
要領でさらに継代培養することにより、ＰＥＭを増殖さ
せる。
【００５７】
【表１】 培地Ａの組成 大量成分(g／l): ＮＨ4ＮＯ3…１.２０、 (ＮＨ4)2ＳＯ4…０.６６、 ＫＨ2ＰＯ4…０.５５、 ＫＮＯ3…１.０１、 ＭgＣl2・６Ｈ2Ｏ…０.３０、 ＣaＣl2…０.２２、 くえん酸…０.５、 スクロース…２０。 大量成分 ２ml貯蔵溶液／l ビタミン類 ガンボーグＢ５(１mg／l) １ml貯蔵溶液
／l ＫＯＨ(１モル)を用いてpＨを５.８に調節。 少量成分(貯蔵溶液)(g／l): ＦeＳＯ4・７Ｈ2Ｏ…６.９、 ＣuＳＯ4・５Ｈ2Ｏ…０.６５、 ＣoＣl2・６Ｈ2Ｏ…０.１２、 ＭnＣl2・４Ｈ2Ｏ…２.９７、 ＮaＭoＯ4・２Ｈ2Ｏ…０.２４、 ＫＩ…０.０４１、 ＨＢＯ3…１.５、 ＺnＳＯ4・７Ｈ2Ｏ…４.３、 ＮiＳＯ4・６Ｈ2Ｏ…０.３９、 くえん酸…２、 pＨ＝２.３ g２４ ビタミン類ガンボーグＢ５(デュチェファ)、 ミオイノシトール１００g／l ニコチン酸１g／l チアミン−ＨＣl１g／l を補った貯蔵溶液
／l ＫＯＨ(１モル)を用いてpＨを５.８に調節。 少量成分(貯蔵溶液)(g／l): ＦeＳＯ4・７Ｈ2Ｏ…６.９、 ＣuＳＯ4・５Ｈ2Ｏ…０.６５、 ＣoＣl2・６Ｈ2Ｏ…０.１２、 ＭnＣl2・４Ｈ2Ｏ…２.９７、 ＮaＭoＯ4・２Ｈ2Ｏ…０.２４、 ＫＩ…０.０４１、 ＨＢＯ3…１.５、 ＺnＳＯ4・７Ｈ2Ｏ…４.３、 ＮiＳＯ4・６Ｈ2Ｏ…０.３９、 くえん酸…２、 pＨ＝２.３ g２４ ビタミン類ガンボーグＢ５(デュチェファ)、 ミオイノシトール１００g／l ニコチン酸１g／l チアミン−ＨＣl１g／l を補った貯蔵溶液
【００５８】実施例５ 胚形成性キュウリ細胞懸濁培養の開始およびそこからの
体細胞胚。 キュウリ変種「パンドレックス」(スルイスおよびグルー
ト)の種子を、７０％エタノール(２分間)および次亜塩
素酸ナトリウムの１.５％溶液(４５分間)で表面滅菌
し、次いで滅菌水により充分に洗浄(３回)する。キュウ
リ種子を２３℃で２日間湿った紙の上で発芽させる。種
子から発芽した幼根を外植体として使用する。１５の幼
根を、２３℃の温度で暗所中１００rpmの回転震とう器
において２０g／lのスクロース、２mg／lの２,４−Ｄお
よび１mg／lのキネチンを補い、ビタミンを加えた塩基
性液体ＭＳ培地(デュチェファ・ビオヘミーＢＶから入
手可能、ハールレム、オランダ国)１０ml中で培養す
る。当業界で公知のＨＰＬＣ技術を用いることにより、
培養培地をオーキシン濃度についてモニターする。オー
キシン濃度が＜０.１mg／lに下がった後、約５日後、２
０g／lのスクロース、２mg／lの２,４−Ｄおよび１mg／
lのキネチンを補った５０mlの塩基性液体ＭＳ培地＋ビ
タミン(デュチェファ・ビオヘミーＢＶから入手可能、
ハールレム、オランダ国)で培養物を５倍に希釈する。
２０g／lのスクロース、２mg／lの２,４−Ｄおよび１mg
／lのキネチンを補った塩基性液体ＭＳ培地＋ビタミン
(デュチェファ・ビオヘミーＢＶから入手可能、ハール
レム、オランダ国)で培養物を２倍希釈することによ
り、培養物を２週間ごとに継代培養する。８週間後、前
胚形成塊が現れる。
体細胞胚。 キュウリ変種「パンドレックス」(スルイスおよびグルー
ト)の種子を、７０％エタノール(２分間)および次亜塩
素酸ナトリウムの１.５％溶液(４５分間)で表面滅菌
し、次いで滅菌水により充分に洗浄(３回)する。キュウ
リ種子を２３℃で２日間湿った紙の上で発芽させる。種
子から発芽した幼根を外植体として使用する。１５の幼
根を、２３℃の温度で暗所中１００rpmの回転震とう器
において２０g／lのスクロース、２mg／lの２,４−Ｄお
よび１mg／lのキネチンを補い、ビタミンを加えた塩基
性液体ＭＳ培地(デュチェファ・ビオヘミーＢＶから入
手可能、ハールレム、オランダ国)１０ml中で培養す
る。当業界で公知のＨＰＬＣ技術を用いることにより、
培養培地をオーキシン濃度についてモニターする。オー
キシン濃度が＜０.１mg／lに下がった後、約５日後、２
０g／lのスクロース、２mg／lの２,４−Ｄおよび１mg／
lのキネチンを補った５０mlの塩基性液体ＭＳ培地＋ビ
タミン(デュチェファ・ビオヘミーＢＶから入手可能、
ハールレム、オランダ国)で培養物を５倍に希釈する。
２０g／lのスクロース、２mg／lの２,４−Ｄおよび１mg
／lのキネチンを補った塩基性液体ＭＳ培地＋ビタミン
(デュチェファ・ビオヘミーＢＶから入手可能、ハール
レム、オランダ国)で培養物を２倍希釈することによ
り、培養物を２週間ごとに継代培養する。８週間後、前
胚形成塊が現れる。
【００５９】次いで、２週間ごとに５０mlでパックした
細胞容量０.４mlを、１０mg／lの２,４−Ｄおよび０.５
mg／lのキネチンを補った培地Ａ(表１の)に接種するこ
とにより、ＰＥＭ培養物をさらに継代培養する。シュレ
ーゲルの公式(前出)を用いて測定したところによると、
キュウリセルラインの倍加時間は約２.７日である。大
きさ１００−１５０μm間のＰＥＭに対して、培養物を
各々孔サイズ１５０μmおよび１００μmのナイロンメッ
シュに通してふるい分けることにより、ＰＥＭを選択す
る。１００−１５０μmフラクションからは、ＰＥＭ培
養物の１ＰＣＶ当たり最高数の単一体細胞胚が生じる。
このセルラインからのＰＥＭは、２倍体または４倍体で
ある。デ・ラート等の方法(前出)により測定したとこ
ろ、２倍体および４倍体細胞間の比率は、１０mg／lの
２,４−Ｄおよび０.５mg／lのキネチンを補った液体培
地Ａでは２年を越す期間一定のままである。ＰＥＭは２
倍体および４倍体植物を生じる。２倍体:４倍体の測定
比率は、ＰＥＭおよび植物に反映されている。
細胞容量０.４mlを、１０mg／lの２,４−Ｄおよび０.５
mg／lのキネチンを補った培地Ａ(表１の)に接種するこ
とにより、ＰＥＭ培養物をさらに継代培養する。シュレ
ーゲルの公式(前出)を用いて測定したところによると、
キュウリセルラインの倍加時間は約２.７日である。大
きさ１００−１５０μm間のＰＥＭに対して、培養物を
各々孔サイズ１５０μmおよび１００μmのナイロンメッ
シュに通してふるい分けることにより、ＰＥＭを選択す
る。１００−１５０μmフラクションからは、ＰＥＭ培
養物の１ＰＣＶ当たり最高数の単一体細胞胚が生じる。
このセルラインからのＰＥＭは、２倍体または４倍体で
ある。デ・ラート等の方法(前出)により測定したとこ
ろ、２倍体および４倍体細胞間の比率は、１０mg／lの
２,４−Ｄおよび０.５mg／lのキネチンを補った液体培
地Ａでは２年を越す期間一定のままである。ＰＥＭは２
倍体および４倍体植物を生じる。２倍体:４倍体の測定
比率は、ＰＥＭおよび植物に反映されている。
【００６０】２０gのスクロースおよび５マイクロモル
のＡＢＡを補ったオーキシンおよびサイトキニン不含有
ＭＳ培地でＰＥＭを培養することにより、ＰＥＭを真正
体細胞胚に生長させる。
のＡＢＡを補ったオーキシンおよびサイトキニン不含有
ＭＳ培地でＰＥＭを培養することにより、ＰＥＭを真正
体細胞胚に生長させる。
【００６１】実施例６ 胚形成性キュウリセルラインの操作による１００％２倍
体または１００％４倍体懸濁培養物の獲得。 実施例５の懸濁液は、２倍体および４倍体ＰＥＭにより
構成され、同じ倍数性レベルを有する胚の発生をもたら
す。
体または１００％４倍体懸濁培養物の獲得。 実施例５の懸濁液は、２倍体および４倍体ＰＥＭにより
構成され、同じ倍数性レベルを有する胚の発生をもたら
す。
【００６２】直径約２mmの個々のＰＥＭを、実施例５の
方法により開始された１３週令細胞懸濁液から選び出
す。デ・ラート等(１９８７)「プラント・ブリーディン
グ」(Ｐlant Ｂreeding)、９９、３０３−３０７頁の方
法による倍数性レベルに関する個々のＰＥＭの測定結果
は、ＰＥＭが１００％２倍体または１００％４倍体であ
ることを示している。実施例５に記載されている塩基性
Ｍ５液体培地中で１５週間にわたって個々のＰＥＭをさ
らに培養すると(すなわち継代培養を２週間ごとに遂
行)、デ・ラート等の方法(前出)を用いて測定したとこ
ろ１００％２倍体または１００％４倍体細胞から成るセ
ルラインが得られた。２倍体ＰＥＭからは、２倍体胚お
よび２倍体植物が生じる。４倍体ＰＥＭからは、４倍体
胚および４倍体植物が生じる。
方法により開始された１３週令細胞懸濁液から選び出
す。デ・ラート等(１９８７)「プラント・ブリーディン
グ」(Ｐlant Ｂreeding)、９９、３０３−３０７頁の方
法による倍数性レベルに関する個々のＰＥＭの測定結果
は、ＰＥＭが１００％２倍体または１００％４倍体であ
ることを示している。実施例５に記載されている塩基性
Ｍ５液体培地中で１５週間にわたって個々のＰＥＭをさ
らに培養すると(すなわち継代培養を２週間ごとに遂
行)、デ・ラート等の方法(前出)を用いて測定したとこ
ろ１００％２倍体または１００％４倍体細胞から成るセ
ルラインが得られた。２倍体ＰＥＭからは、２倍体胚お
よび２倍体植物が生じる。４倍体ＰＥＭからは、４倍体
胚および４倍体植物が生じる。
【００６３】実施例７ 胚形成性キュウリセルラインの操作による１００％２倍
体または１００％４倍体懸濁培養物の獲得。 キュウリ変種「パンドレックス」(スルイスおよびグルー
ト)の植物を、実施例３の方法を用いて無菌条件下で生
長させる。大きさ約１cmの子房を外植体として使用す
る。デ・ラート等(前出)の方法に従い倍数性レベルを測
定すると、外植体が完全に２倍体であることが示され
た。果実の約半分を約０.５mm厚さの薄片に切り刻み、
２３℃の温度で暗所中１００rpmの回転震とう器におい
て、２０g／lのスクロース、２mg／lの２,４−Ｄおよび
１mg／lのキネチンを補った１０mlの塩基性液体ＭＳ培
地＋ビタミン(デュチェファ・ビオヘミーＢＶから入手
可能、ハールレム、オランダ国)中で培養する。当業界
で公知のＨＰＬＣ技術を用いることにより、培養培地を
オーキシン濃度についてモニターする。オーキシン濃度
が＜０.１mg／lに下がった後、約５日後、２０g／lのス
クロース、２mg／lの２,４−Ｄおよび１mg／lのキネチ
ンを補った５０mlの塩基性液体ＭＳ培地＋ビタミン(デ
ュチェファ・ビオヘミーＢＶから入手可能、ハールレ
ム、オランダ国)で培養物を５倍に希釈する。上記要領
で補ったＭＳ培地で培養物を２倍希釈することにより、
培養物を２週間ごとに継代培養する。
体または１００％４倍体懸濁培養物の獲得。 キュウリ変種「パンドレックス」(スルイスおよびグルー
ト)の植物を、実施例３の方法を用いて無菌条件下で生
長させる。大きさ約１cmの子房を外植体として使用す
る。デ・ラート等(前出)の方法に従い倍数性レベルを測
定すると、外植体が完全に２倍体であることが示され
た。果実の約半分を約０.５mm厚さの薄片に切り刻み、
２３℃の温度で暗所中１００rpmの回転震とう器におい
て、２０g／lのスクロース、２mg／lの２,４−Ｄおよび
１mg／lのキネチンを補った１０mlの塩基性液体ＭＳ培
地＋ビタミン(デュチェファ・ビオヘミーＢＶから入手
可能、ハールレム、オランダ国)中で培養する。当業界
で公知のＨＰＬＣ技術を用いることにより、培養培地を
オーキシン濃度についてモニターする。オーキシン濃度
が＜０.１mg／lに下がった後、約５日後、２０g／lのス
クロース、２mg／lの２,４−Ｄおよび１mg／lのキネチ
ンを補った５０mlの塩基性液体ＭＳ培地＋ビタミン(デ
ュチェファ・ビオヘミーＢＶから入手可能、ハールレ
ム、オランダ国)で培養物を５倍に希釈する。上記要領
で補ったＭＳ培地で培養物を２倍希釈することにより、
培養物を２週間ごとに継代培養する。
【００６４】８週間後、前胚形成塊が出現する。ＰＥＭ
培養物を、１０mg／lの２,４−Ｄおよび０.５mg／lのキ
ネチンを補った培地Ａ(表１)中で実施例５の記載と同様
に継代培養する。パックした細胞容量０.４mlを、１０m
g／lの２,４−Ｄおよび０.５mg／lのキネチンを補った
培地Ａ５０mlに接種する。シュレーゲルの公式(前出)を
用いて測定したところによると、キュウリセルラインの
倍加時間は培地Ａ(表１)では約２.７日である。デ・ラ
ート等(前出)の方法に従いＰＥＭ懸濁液の倍数性レベル
を測定すると、２倍体であることが見出された。大きさ
１００−１５０μm間のＰＥＭに対して培養物をナイロ
ンメッシュに通してふるい分けることにより、ＰＥＭを
選択する。２０g／lのスクロースを補ったオーキシンお
よびサイトキニン不含有ＭＳ培地において選択されたＰ
ＥＭを培養することにより、ＰＥＭを真正体細胞胚に生
長させる。この方法を用いると、２０００００の胚がＰ
ＥＭ培養物から４週間で形成される。デ・ラートの方法
(前出)を用いると、無作為選別された５００の体細胞胚
の倍数性レベルは全て、２倍体であることが見出され
た。
培養物を、１０mg／lの２,４−Ｄおよび０.５mg／lのキ
ネチンを補った培地Ａ(表１)中で実施例５の記載と同様
に継代培養する。パックした細胞容量０.４mlを、１０m
g／lの２,４−Ｄおよび０.５mg／lのキネチンを補った
培地Ａ５０mlに接種する。シュレーゲルの公式(前出)を
用いて測定したところによると、キュウリセルラインの
倍加時間は培地Ａ(表１)では約２.７日である。デ・ラ
ート等(前出)の方法に従いＰＥＭ懸濁液の倍数性レベル
を測定すると、２倍体であることが見出された。大きさ
１００−１５０μm間のＰＥＭに対して培養物をナイロ
ンメッシュに通してふるい分けることにより、ＰＥＭを
選択する。２０g／lのスクロースを補ったオーキシンお
よびサイトキニン不含有ＭＳ培地において選択されたＰ
ＥＭを培養することにより、ＰＥＭを真正体細胞胚に生
長させる。この方法を用いると、２０００００の胚がＰ
ＥＭ培養物から４週間で形成される。デ・ラートの方法
(前出)を用いると、無作為選別された５００の体細胞胚
の倍数性レベルは全て、２倍体であることが見出され
た。
【００６５】実施例８ 倍数性レベルに関して安定したＰＥＭ懸濁液の維持。 キュウリＰＥＭ懸濁液を、１０mg／lの２,４−Ｄおよび
０.５mg／lのキネチンを補った培地Ａ(表１)において生
長させる。継代培養中、大量成分および少量成分を各継
代培養段階でＰＥＭ必要量に対して過剰にしておくこと
により、継代培養期間(すなわち２週間)中、これらの成
分の不足がおこらないようにする。同じ方法でオーキシ
ンレベル(すなわち１０mg／lの２,４−Ｄ)を維持する。
継代培養開始時にキネチン(すなわち０.５mg／l)を培地
に加え、４日で培地から枯渇させる。当業界で公知の標
準ＨＰＬＣ技術を用い、時間をかけてオーキシン濃度を
モニターすることにより、懸濁液の生長段階がＰＥＭレ
ベルで固定されることを確実にする。胚形成性２倍体Ｐ
ＥＭ懸濁液を２年以下の間、１０mg／lの２,４−Ｄおよ
び０.５mg／lのキネチンを補った培地Ａ(表１)中で維持
すると、それらは安定した倍数性レベルを示す。胚形成
性４倍体ＰＥＭ懸濁液を６箇月間維持すると、それらは
安定した倍数性レベルを示す。胚の生長が開始されるま
でこの倍数性レベルを維持する。
０.５mg／lのキネチンを補った培地Ａ(表１)において生
長させる。継代培養中、大量成分および少量成分を各継
代培養段階でＰＥＭ必要量に対して過剰にしておくこと
により、継代培養期間(すなわち２週間)中、これらの成
分の不足がおこらないようにする。同じ方法でオーキシ
ンレベル(すなわち１０mg／lの２,４−Ｄ)を維持する。
継代培養開始時にキネチン(すなわち０.５mg／l)を培地
に加え、４日で培地から枯渇させる。当業界で公知の標
準ＨＰＬＣ技術を用い、時間をかけてオーキシン濃度を
モニターすることにより、懸濁液の生長段階がＰＥＭレ
ベルで固定されることを確実にする。胚形成性２倍体Ｐ
ＥＭ懸濁液を２年以下の間、１０mg／lの２,４−Ｄおよ
び０.５mg／lのキネチンを補った培地Ａ(表１)中で維持
すると、それらは安定した倍数性レベルを示す。胚形成
性４倍体ＰＥＭ懸濁液を６箇月間維持すると、それらは
安定した倍数性レベルを示す。胚の生長が開始されるま
でこの倍数性レベルを維持する。
【００６６】実施例９ テンサイＰＥＭ懸濁培養の開始およびそこからの体細胞
胚。 テンサイの種子(ヒレショーグ・アクチーボラゲット、
スエーデン国)を、エタノールの７０％溶液(２分間)お
よび次亜塩素酸ナトリウムの１.５％溶液(４５分間)に
より表面殺菌し、次いで滅菌水で充分に洗浄(３回)す
る。テンサイ種子を２３℃で７〜１４日間湿った紙の上
で発芽させる。発芽した種子からの子葉を外植体として
使用する。２３℃の温度で暗所中１００rpmの回転震と
う器において、１０mg／lの２,４−Ｄおよび０.５mg／l
のキネチンを補った液体培地Ａ(表１)１０ml中で６子葉
を培養する。培養物を、１または２週間後１０mg／lの
２,４−Ｄおよび０.５mg／lのキネチンを補った液体培
地Ａ(表１)により５０mlに希釈(５倍)する。上記要領で
補った培地Ａ(表１)で培養物を２倍希釈するか、または
培地を上記要領で補った新鮮な培地Ａと交換することに
より、培養物を２週間ごとに継代培養する。４〜６週間
後、体細胞胚が外植体組織に出現する。胚を外植体から
採取し、別々に培養する。４週間後、培養された胚はＰ
ＥＭを形成する。１０mg／lの２,４−Ｄおよび０.５mg
／lのキネチンを補った表１の培地Ａを補充することに
より、ＰＥＭ培養物をさらに継代培養する。
胚。 テンサイの種子(ヒレショーグ・アクチーボラゲット、
スエーデン国)を、エタノールの７０％溶液(２分間)お
よび次亜塩素酸ナトリウムの１.５％溶液(４５分間)に
より表面殺菌し、次いで滅菌水で充分に洗浄(３回)す
る。テンサイ種子を２３℃で７〜１４日間湿った紙の上
で発芽させる。発芽した種子からの子葉を外植体として
使用する。２３℃の温度で暗所中１００rpmの回転震と
う器において、１０mg／lの２,４−Ｄおよび０.５mg／l
のキネチンを補った液体培地Ａ(表１)１０ml中で６子葉
を培養する。培養物を、１または２週間後１０mg／lの
２,４−Ｄおよび０.５mg／lのキネチンを補った液体培
地Ａ(表１)により５０mlに希釈(５倍)する。上記要領で
補った培地Ａ(表１)で培養物を２倍希釈するか、または
培地を上記要領で補った新鮮な培地Ａと交換することに
より、培養物を２週間ごとに継代培養する。４〜６週間
後、体細胞胚が外植体組織に出現する。胚を外植体から
採取し、別々に培養する。４週間後、培養された胚はＰ
ＥＭを形成する。１０mg／lの２,４−Ｄおよび０.５mg
／lのキネチンを補った表１の培地Ａを補充することに
より、ＰＥＭ培養物をさらに継代培養する。
【００６７】ＰＥＭ懸濁液を、まず孔サイズ５００μm
のナイロンメッシュ、次いで孔サイズ１００μmのナイ
ロンメッシュでふるい分けることにより、ＰＥＭを集め
る。ＰＥＭフラクション１００−５００μmからは、一
般に単一体細胞胚が優先的に形成される。ＰＥＭは、上
記要領で補ったオーキシンおよびサイトキニン不含有培
地Ａ培地で培養されると、真正体細胞胚に生長する。
のナイロンメッシュ、次いで孔サイズ１００μmのナイ
ロンメッシュでふるい分けることにより、ＰＥＭを集め
る。ＰＥＭフラクション１００−５００μmからは、一
般に単一体細胞胚が優先的に形成される。ＰＥＭは、上
記要領で補ったオーキシンおよびサイトキニン不含有培
地Ａ培地で培養されると、真正体細胞胚に生長する。
【００６８】実施例１０ 胚形成性コショウＰＥＭ懸濁培養の開始。 コショウの種子(品種ゲデオン(スルイス・エン・グルー
ト))に、エタノールの７０％溶液(２分間)および次亜塩
素酸ナトリウムの１.５％溶液(４５分間)により表面殺
菌を施し、次いで滅菌水で充分に洗浄する(３回)。コシ
ョウ種子を２３℃で７〜１４日間湿った紙の上で発芽さ
せる。発芽した種子からの子葉を外植体として使用す
る。２３℃の温度で暗所中１００rpmの回転震とう器に
おいて、１０mg／lの２,４−Ｄを補った液体培地Ａ(表
１)１０ml中で６子葉を培養する。２週間後、培養物を
５０mlに５倍希釈する。上記要領で培養物を２倍希釈す
るか、または培地を１０mg／lの２,４−Ｄを補った新鮮
な培地Ａ(表１)と交換することにより、培養物を２週間
ごとに継代培養する。２〜４週間後、外植体の切断端部
から胚が現れる。胚を外植体から採取し、培養物から除
去し、４mg／lの２,４−Ｄおよび０.５mg／lのゼアチン
を補った液体培地Ａ(表１)において継代培養する。４週
間後、前胚形成塊が現れる。上記要領でさらに継代培養
することにより、ＰＥＭを増大させる。実施例５の記載
に従って懸濁液をふるい分けることにより、ＰＥＭを集
める。フラクション１００−５００μmからは、単一体
細胞胚が優先的に形成される。ＰＥＭを、オーキシンお
よびサイトキニン不含有培地Ａ(表１)で培養する。
ト))に、エタノールの７０％溶液(２分間)および次亜塩
素酸ナトリウムの１.５％溶液(４５分間)により表面殺
菌を施し、次いで滅菌水で充分に洗浄する(３回)。コシ
ョウ種子を２３℃で７〜１４日間湿った紙の上で発芽さ
せる。発芽した種子からの子葉を外植体として使用す
る。２３℃の温度で暗所中１００rpmの回転震とう器に
おいて、１０mg／lの２,４−Ｄを補った液体培地Ａ(表
１)１０ml中で６子葉を培養する。２週間後、培養物を
５０mlに５倍希釈する。上記要領で培養物を２倍希釈す
るか、または培地を１０mg／lの２,４−Ｄを補った新鮮
な培地Ａ(表１)と交換することにより、培養物を２週間
ごとに継代培養する。２〜４週間後、外植体の切断端部
から胚が現れる。胚を外植体から採取し、培養物から除
去し、４mg／lの２,４−Ｄおよび０.５mg／lのゼアチン
を補った液体培地Ａ(表１)において継代培養する。４週
間後、前胚形成塊が現れる。上記要領でさらに継代培養
することにより、ＰＥＭを増大させる。実施例５の記載
に従って懸濁液をふるい分けることにより、ＰＥＭを集
める。フラクション１００−５００μmからは、単一体
細胞胚が優先的に形成される。ＰＥＭを、オーキシンお
よびサイトキニン不含有培地Ａ(表１)で培養する。
【００６９】実施例１１ 胚形成性スミレＰＥＭ懸濁培養の開始およびそこからの
体細胞胚。 スミレの種子(品種デルタ・バイオレット(スルイス・エ
ン・グルート))に、エタノールの７０％溶液(２分間)お
よび次亜塩素酸ナトリウムの１.５％溶液(３０分間)に
より表面殺菌を施し、次いで滅菌水で充分に洗浄する
(３回)。スミレ種子を２３℃で７〜１４日間湿った紙の
上で発芽させる。発芽した種子からの子葉を外植体とし
て使用する。２３℃の温度で暗所中１００rpmの回転震
とう器において、４mg／lの２,４−Ｄおよび０.１mg／l
のキネチンを補った液体培地Ａ(表１)１０ml中で６子葉
を培養する。２週間後、培養物を、４mg／lの２,４−Ｄ
および０.１mg／lのキネチンを補った液体培地Ａ(表１)
により５０mlに５倍希釈する。培養物を２倍希釈する
か、または培地を４mg／lの２,４−Ｄおよび０.１mg／l
のキネチンを補った新鮮な培地Ａ(表１)と交換すること
により、培養物を２週間ごとに継代培養する。８〜１０
週間後、前胚形成塊が現れる。上記要領でさらに継代培
養することにより、ＰＥＭを増大させる。使用されるナ
イロンメッシュ孔サイズが５０μmおよび２５０μmであ
ること以外は実施例５の記載と同じ要領で懸濁液をふる
い分けることにより、ＰＥＭを集める。ＰＥＭは、上記
要領で補ったオーキシンおよびサイトキニン不含有培地
Ａ(表１)で培養されると、単一体細胞胚に生長する。
体細胞胚。 スミレの種子(品種デルタ・バイオレット(スルイス・エ
ン・グルート))に、エタノールの７０％溶液(２分間)お
よび次亜塩素酸ナトリウムの１.５％溶液(３０分間)に
より表面殺菌を施し、次いで滅菌水で充分に洗浄する
(３回)。スミレ種子を２３℃で７〜１４日間湿った紙の
上で発芽させる。発芽した種子からの子葉を外植体とし
て使用する。２３℃の温度で暗所中１００rpmの回転震
とう器において、４mg／lの２,４−Ｄおよび０.１mg／l
のキネチンを補った液体培地Ａ(表１)１０ml中で６子葉
を培養する。２週間後、培養物を、４mg／lの２,４−Ｄ
および０.１mg／lのキネチンを補った液体培地Ａ(表１)
により５０mlに５倍希釈する。培養物を２倍希釈する
か、または培地を４mg／lの２,４−Ｄおよび０.１mg／l
のキネチンを補った新鮮な培地Ａ(表１)と交換すること
により、培養物を２週間ごとに継代培養する。８〜１０
週間後、前胚形成塊が現れる。上記要領でさらに継代培
養することにより、ＰＥＭを増大させる。使用されるナ
イロンメッシュ孔サイズが５０μmおよび２５０μmであ
ること以外は実施例５の記載と同じ要領で懸濁液をふる
い分けることにより、ＰＥＭを集める。ＰＥＭは、上記
要領で補ったオーキシンおよびサイトキニン不含有培地
Ａ(表１)で培養されると、単一体細胞胚に生長する。
【００７０】実施例１２ 胚形成性ペラルゴニュームＰＥＭ懸濁培養の開始。 ペラルゴニュームの種子(品種パルサー・レッド(スルイ
ス・エン・グルート))に、エタノールの７０％溶液(２
分間)および次亜塩素酸ナトリウムの１.５％溶液(３０
分間)により表面殺菌を施し、次いで滅菌水で充分に洗
浄する(３回)。ペラルゴニューム種子を２３℃で７〜１
４日間湿った紙の上で発芽させる。発芽した種子からの
子葉を外植体として使用する。２３℃の温度で暗所中１
００rpmの回転震とう器において、４mg／lの２,４−Ｄ
および０.１mg／lのキネチンを補った液体培地Ａ(表１)
１０ml中で６子葉を培養する。１週間後、培養物を、４
mg／lの２,４−Ｄおよび０.１mg／lのキネチンを補った
液体培地Ａ(表１)により５０mlに５倍希釈する。４mg／
lの２,４−Ｄおよび０.１mg／lのキネチンを補った液体
培地Ａ(表１)で培養物を２倍希釈するか、または培地を
上記要領で補った新鮮な培地Ａと交換することにより、
培養物を２週間ごとに継代培養する。
ス・エン・グルート))に、エタノールの７０％溶液(２
分間)および次亜塩素酸ナトリウムの１.５％溶液(３０
分間)により表面殺菌を施し、次いで滅菌水で充分に洗
浄する(３回)。ペラルゴニューム種子を２３℃で７〜１
４日間湿った紙の上で発芽させる。発芽した種子からの
子葉を外植体として使用する。２３℃の温度で暗所中１
００rpmの回転震とう器において、４mg／lの２,４−Ｄ
および０.１mg／lのキネチンを補った液体培地Ａ(表１)
１０ml中で６子葉を培養する。１週間後、培養物を、４
mg／lの２,４−Ｄおよび０.１mg／lのキネチンを補った
液体培地Ａ(表１)により５０mlに５倍希釈する。４mg／
lの２,４−Ｄおよび０.１mg／lのキネチンを補った液体
培地Ａ(表１)で培養物を２倍希釈するか、または培地を
上記要領で補った新鮮な培地Ａと交換することにより、
培養物を２週間ごとに継代培養する。
【００７１】４〜６週間後、前胚形成塊が現れる。上記
要領でさらに継代培養することにより、ＰＥＭを増殖さ
せる。使用されるナイロンメッシュ孔サイズが２５０μ
mおよび５０μmであること以外は実施例５の記載と同じ
要領で懸濁液をふるい分けることにより、ＰＥＭを集め
る。５０−２５０μmのＰＥＭフラクションからは、単
一体細胞胚が優先的に形成される。ＰＥＭは、オーキシ
ンおよびサイトキニン不含有培地Ａ(表１)で培養される
と、単一体細胞胚に生長する。
要領でさらに継代培養することにより、ＰＥＭを増殖さ
せる。使用されるナイロンメッシュ孔サイズが２５０μ
mおよび５０μmであること以外は実施例５の記載と同じ
要領で懸濁液をふるい分けることにより、ＰＥＭを集め
る。５０−２５０μmのＰＥＭフラクションからは、単
一体細胞胚が優先的に形成される。ＰＥＭは、オーキシ
ンおよびサイトキニン不含有培地Ａ(表１)で培養される
と、単一体細胞胚に生長する。
【００７２】実施例１３ バイオリアクター中で増殖しているＰＥＭバイオマス。 ４×８mlのＰＣＶを、実施例５の記載に従い継代培養さ
れたキュウリＰＥＭ懸濁培養から集め、インペラーを備
えた２つの慣用的な２リットルのバイオリアクターおよ
びチェマップ・アクチエンゲゼルシャフトから市販され
ているバイブロミキサーを備えた２つのバイオリアクタ
ーを含む４つのバイオリアクター(アプリコン・デペン
ダブル・インスツルメンツＢＶ)に接種する。これら
は、各々１０mg／lの２,４−Ｄおよび０.５mg／lのキネ
チンを補った培地Ａ(表１)１リットルを含む。空気は、
リアクターチャンバーの下部に向かって設置されたバイ
ブレーターシャフトの端部に位置する１５μm多孔分散
装置を介してバイブロミキサーリアクター中へ散布され
る。当業界で公知の標準技術に従うと、一方のバイブロ
ミキサーリアクターにおける溶解酸素濃度は４０％およ
び他方における濃度は９７％で測定される。垂直に位置
するバイブロミキサーは、５０Ｈzの振動数および±６m
mの最大振幅で稼動される。振動運動は垂直面で行なわ
れ、水平運動は最小に保たれるように、バイブロミキサ
ーを設置する。流体が、基部、次いで上方に向かってリ
アクター容器の周囲から細胞懸濁液を引き寄せる流動ル
ープに向けられるように、撹はんディスクを振動シャフ
トの端部に取り付ける。
れたキュウリＰＥＭ懸濁培養から集め、インペラーを備
えた２つの慣用的な２リットルのバイオリアクターおよ
びチェマップ・アクチエンゲゼルシャフトから市販され
ているバイブロミキサーを備えた２つのバイオリアクタ
ーを含む４つのバイオリアクター(アプリコン・デペン
ダブル・インスツルメンツＢＶ)に接種する。これら
は、各々１０mg／lの２,４−Ｄおよび０.５mg／lのキネ
チンを補った培地Ａ(表１)１リットルを含む。空気は、
リアクターチャンバーの下部に向かって設置されたバイ
ブレーターシャフトの端部に位置する１５μm多孔分散
装置を介してバイブロミキサーリアクター中へ散布され
る。当業界で公知の標準技術に従うと、一方のバイブロ
ミキサーリアクターにおける溶解酸素濃度は４０％およ
び他方における濃度は９７％で測定される。垂直に位置
するバイブロミキサーは、５０Ｈzの振動数および±６m
mの最大振幅で稼動される。振動運動は垂直面で行なわ
れ、水平運動は最小に保たれるように、バイブロミキサ
ーを設置する。流体が、基部、次いで上方に向かってリ
アクター容器の周囲から細胞懸濁液を引き寄せる流動ル
ープに向けられるように、撹はんディスクを振動シャフ
トの端部に取り付ける。
【００７３】空気は、１５μm多孔スパージャーを備え
た分散管を介してバイオリアクター下部の慣用的バイオ
リアクター中へ散布される。溶解酸素濃度は、上記要領
により各々４０％および９７％の濃度で測定される。イ
ンペラーの撹はん速度を約１５０rpm±５０rpmに維持す
る。
た分散管を介してバイオリアクター下部の慣用的バイオ
リアクター中へ散布される。溶解酸素濃度は、上記要領
により各々４０％および９７％の濃度で測定される。イ
ンペラーの撹はん速度を約１５０rpm±５０rpmに維持す
る。
【００７４】接種の６日後、倍加時間を測定し、ＰＥＭ
懸濁液からＰＥＭをふるい分け、ＰＥＭ／ml ＰＣＶを
実施例５の記載に従い測定する。バイブロミキサーを使
用すると、１単位容量当たりより多数のＰＥＭが得られ
る(表２、図１)。
懸濁液からＰＥＭをふるい分け、ＰＥＭ／ml ＰＣＶを
実施例５の記載に従い測定する。バイブロミキサーを使
用すると、１単位容量当たりより多数のＰＥＭが得られ
る(表２、図１)。
【００７５】
【表２】 装置 倍加時間 ＰＥＭｓ／ml ＰＶＣ (日) インペラー ２.３ ２００ (４０％ＤＯ2)(1) インペラー ２.７ ６２０ (９７％ＤＯ2) バイブロミキサー ２.８ ２２８４ (４０％ＤＯ2) バイブロミキサー ３.３ ３７１０ (９７％ＤＯ2) (１)ＤＯ2＝溶解酸素
【００７６】実施例１４ バイブロミキサーバイオリアクター中で増殖しているＰ
ＣＶバイオマス。 ２×８mlのＰＣＶを、実施例３の記載に従い継代培養さ
れたキュウリＰＥＭ懸濁培養から集め、チェマップ・ア
クチエンゲゼルシャフトから市販されているバイブロミ
キサーを備えた２つの２リットルバイオリアクターを含
む２つのバイブロミキサーバイオリアクター(アプリコ
ン・デペンダブル・インスツルメンツＢＶ)に接種す
る。一方のバイオリアクターは、１０mg／lの２,４−Ｄ
および０.５mg／lのキネチンを補った培地Ａ(表１)１リ
ットルを含み、他方もスクロース濃度が５５g／lである
こと以外は上記と同じ要領で補った培地Ａ１リットルを
含む。空気は、リアクターチャンバー基部付近のバイブ
レーターシャフトの端部に位置する１５μm多孔分散装
置を介してバイブロミキサーリアクター中へ散布され
る。溶解酸素濃度は、当業界で公知の標準技術に従い９
７％で測定される。バイブロミキサーは、５０Ｈzの振
動数および±６mmの最大振幅で稼動される。振動運動は
垂直面で行なわれ、左右または水平運動は最小に保たれ
るように、バイブロミキサーを設置する。流体が、基
部、次いで上方に向かってリアクター容器の周囲から細
胞懸濁液を引き寄せる流動ループ中で流れるように、撹
はんディスクを振動シャフトの端部に取り付ける。
ＣＶバイオマス。 ２×８mlのＰＣＶを、実施例３の記載に従い継代培養さ
れたキュウリＰＥＭ懸濁培養から集め、チェマップ・ア
クチエンゲゼルシャフトから市販されているバイブロミ
キサーを備えた２つの２リットルバイオリアクターを含
む２つのバイブロミキサーバイオリアクター(アプリコ
ン・デペンダブル・インスツルメンツＢＶ)に接種す
る。一方のバイオリアクターは、１０mg／lの２,４−Ｄ
および０.５mg／lのキネチンを補った培地Ａ(表１)１リ
ットルを含み、他方もスクロース濃度が５５g／lである
こと以外は上記と同じ要領で補った培地Ａ１リットルを
含む。空気は、リアクターチャンバー基部付近のバイブ
レーターシャフトの端部に位置する１５μm多孔分散装
置を介してバイブロミキサーリアクター中へ散布され
る。溶解酸素濃度は、当業界で公知の標準技術に従い９
７％で測定される。バイブロミキサーは、５０Ｈzの振
動数および±６mmの最大振幅で稼動される。振動運動は
垂直面で行なわれ、左右または水平運動は最小に保たれ
るように、バイブロミキサーを設置する。流体が、基
部、次いで上方に向かってリアクター容器の周囲から細
胞懸濁液を引き寄せる流動ループ中で流れるように、撹
はんディスクを振動シャフトの端部に取り付ける。
【００７７】接種の６日後、倍加時間を測定し、ＰＥＭ
懸濁液からＰＥＭをふるい分け、ＰＥＭ／ml ＰＣＶを
実施例５の記載に従い測定する。結果を下記表３に示
す。
懸濁液からＰＥＭをふるい分け、ＰＥＭ／ml ＰＣＶを
実施例５の記載に従い測定する。結果を下記表３に示
す。
【００７８】
【表３】 装置 倍加時間 ＰＥＭｓ／ml ＰＶＣ (日) バイブロミキサー ３.３ ２２８４ (９７％、２０g/lスクロース) バイブロミキサー ２.９ ６０００ (９７％、５５g/lスクロース)
【００７９】実施例１５ 撹はんバイオリアクター対バイブロミキサーバイオリア
クターからのＰＥＭの生存能力の経時比較。 ３×８mlのＰＣＶを、実施例５の記載に従い継代培養さ
れたキュウリＰＥＭ懸濁培養から集め、１０mg／lの２,
４−Ｄおよび０.５mg／lのキネチンを補った培地Ａ(表
１)１リットルを含むインペラーを備えた１つの慣用的
な２リットルのバイオリアクターおよびチェマップ・ア
クチエンゲゼルシャフトから市販されているバイブロミ
キサーを備えた２つのバイオリアクターを含む３つのバ
イオリアクター(アプリコン・デペンダブル・インスツ
ルメンツＢＶ)に接種する。一方は上記要領で補った培
地Ａ１リットルを含み、他方もスクロース濃度が５５g
／lであること以外は上記と同じ要領で補った培地Ａ１
リットルを含む。
クターからのＰＥＭの生存能力の経時比較。 ３×８mlのＰＣＶを、実施例５の記載に従い継代培養さ
れたキュウリＰＥＭ懸濁培養から集め、１０mg／lの２,
４−Ｄおよび０.５mg／lのキネチンを補った培地Ａ(表
１)１リットルを含むインペラーを備えた１つの慣用的
な２リットルのバイオリアクターおよびチェマップ・ア
クチエンゲゼルシャフトから市販されているバイブロミ
キサーを備えた２つのバイオリアクターを含む３つのバ
イオリアクター(アプリコン・デペンダブル・インスツ
ルメンツＢＶ)に接種する。一方は上記要領で補った培
地Ａ１リットルを含み、他方もスクロース濃度が５５g
／lであること以外は上記と同じ要領で補った培地Ａ１
リットルを含む。
【００８０】空気は、リアクターチャンバーの下部に向
かってバイブレーターシャフトの端部に位置する１５μ
m多孔分散装置を介してバイブロミキサーリアクター中
へ散布される。当業界で公知の標準技術に従うと、バイ
ブロミキサーリアクターにおける溶解酸素濃度は９７％
で測定される。バイブロミキサーは、５０Ｈzの振動数
および±６mmの最大振幅で稼動される。振動運動は垂直
面で行なわれ、水平振動運動は最小に保たれるように、
バイブロミキサーを設置する。流体が、基部、次いで上
方に向かってリアクター容器の周囲から細胞懸濁液を引
き寄せる流動ループで流れるように、撹はんディスクを
振動シャフトの端部に取り付ける。
かってバイブレーターシャフトの端部に位置する１５μ
m多孔分散装置を介してバイブロミキサーリアクター中
へ散布される。当業界で公知の標準技術に従うと、バイ
ブロミキサーリアクターにおける溶解酸素濃度は９７％
で測定される。バイブロミキサーは、５０Ｈzの振動数
および±６mmの最大振幅で稼動される。振動運動は垂直
面で行なわれ、水平振動運動は最小に保たれるように、
バイブロミキサーを設置する。流体が、基部、次いで上
方に向かってリアクター容器の周囲から細胞懸濁液を引
き寄せる流動ループで流れるように、撹はんディスクを
振動シャフトの端部に取り付ける。
【００８１】空気は、１５μm多孔スパージャーを備え
た分散管を介してバイオリアクター下部の慣用的バイオ
リアクター中へ散布される。溶解酸素濃度は、上記要領
により９７％の濃度で測定される。インペラーの撹はん
速度を約１５０rpm±５０rpmに維持する。
た分散管を介してバイオリアクター下部の慣用的バイオ
リアクター中へ散布される。溶解酸素濃度は、上記要領
により９７％の濃度で測定される。インペラーの撹はん
速度を約１５０rpm±５０rpmに維持する。
【００８２】ＰＥＭ／ml ＰＣＶを培養開始時に測定
し、実施例５と同じ要領で６および１４日目に倍加時間
を測定する。
し、実施例５と同じ要領で６および１４日目に倍加時間
を測定する。
【００８３】結果は、撹はんバイオリアクター中のＰＥ
Ｍの数がその間顕著に減少し、バイブロミキサー中のＰ
ＥＭの数が２０g／lのスクロース濃度でその間ほぼ一定
したままであることを示す。ＰＥＭ数は、５５g／lのス
クロース濃度で６日以内に３倍まで増加することが示さ
れた(表４)。
Ｍの数がその間顕著に減少し、バイブロミキサー中のＰ
ＥＭの数が２０g／lのスクロース濃度でその間ほぼ一定
したままであることを示す。ＰＥＭ数は、５５g／lのス
クロース濃度で６日以内に３倍まで増加することが示さ
れた(表４)。
【００８４】
【表４】 装置 ＰＥＭｓ／ml ＰＶＣ 第０日目 第６日目 第１４日目 インペラー ２３００ ８００ ４０ (９７％、２０g/lスクロース) バイブロミキサー ２３００ ２３００ ２２８０ (９７％、２０g/lスクロース) バイブロミキサー ２３００ ６０００ ６０００ (９７％、５５g/lスクロース)
【００８５】実施例１６ バイオリアクターにおける魚雷段階体細胞胚へのＰＥＭ
の生長。 ２×１０００００のふるい分けされたＰＥＭを、実施例
１５の記載に従い継代培養されたキュウリＰＥＭ懸濁培
養物から集め(５５g／lスクロース、vb／９７％Ｄo２
中)、インペラーを備えた１つの慣用的な２リットルの
バイオリアクターおよびチェマップ・アクチエンゲゼル
シャフトから市販されているバイブロミキサーを備えた
１つのバイオリアクターを含む２つのバイオリアクター
(アプリコン・デペンダブル・インスツルメンツＢＶ)に
接種する。各々２０g／lのスクロースおよび５.０マイ
クロモルの濃度でＡＢＡを含む１リットルのＭＳ培地を
含む。酸素は、リアクターチャンバーの基部付近に位置
するバイブレーターシャフトの端部に設置された１５μ
m多孔分散装置を介してバイブロミキサーリアクター中
へ散布される。当業界で公知の標準技術に従うと、バイ
ブロミキサーリアクターにおける酸素濃度は９７％で測
定される。バイブロミキサーは、５０Ｈzの振動数およ
び±６mmの最大振幅で稼動される。振動運動は垂直面で
行なわれ、水平運動は最小に保たれるように、バイブロ
ミキサーを設置する。流体が、基部、次いで上方に向か
ってリアクター容器の周囲から細胞懸濁液を引き寄せる
流動ループで流れるように、撹はんディスクを振動シャ
フトの端部に取り付ける。
の生長。 ２×１０００００のふるい分けされたＰＥＭを、実施例
１５の記載に従い継代培養されたキュウリＰＥＭ懸濁培
養物から集め(５５g／lスクロース、vb／９７％Ｄo２
中)、インペラーを備えた１つの慣用的な２リットルの
バイオリアクターおよびチェマップ・アクチエンゲゼル
シャフトから市販されているバイブロミキサーを備えた
１つのバイオリアクターを含む２つのバイオリアクター
(アプリコン・デペンダブル・インスツルメンツＢＶ)に
接種する。各々２０g／lのスクロースおよび５.０マイ
クロモルの濃度でＡＢＡを含む１リットルのＭＳ培地を
含む。酸素は、リアクターチャンバーの基部付近に位置
するバイブレーターシャフトの端部に設置された１５μ
m多孔分散装置を介してバイブロミキサーリアクター中
へ散布される。当業界で公知の標準技術に従うと、バイ
ブロミキサーリアクターにおける酸素濃度は９７％で測
定される。バイブロミキサーは、５０Ｈzの振動数およ
び±６mmの最大振幅で稼動される。振動運動は垂直面で
行なわれ、水平運動は最小に保たれるように、バイブロ
ミキサーを設置する。流体が、基部、次いで上方に向か
ってリアクター容器の周囲から細胞懸濁液を引き寄せる
流動ループで流れるように、撹はんディスクを振動シャ
フトの端部に取り付ける。
【００８６】酸素は、１５μm多孔スパージャーを備え
た分散管を介してバイオリアクター下部の慣用的バイオ
リアクター中へ散布される。溶解酸素濃度は、上記要領
により９７％の出発濃度で測定され、７日間かけて３０
％±５％に下がる。８日目、溶解酸素濃度を９７％にリ
セットし、そのレベルを維持する。インペラーの撹はん
速度を約１９０rpm±５rpmに維持する。
た分散管を介してバイオリアクター下部の慣用的バイオ
リアクター中へ散布される。溶解酸素濃度は、上記要領
により９７％の出発濃度で測定され、７日間かけて３０
％±５％に下がる。８日目、溶解酸素濃度を９７％にリ
セットし、そのレベルを維持する。インペラーの撹はん
速度を約１９０rpm±５rpmに維持する。
【００８７】慣用的バイオリアクターは、１０−１５％
間の、ＰＥＭ〜完全生長した使用可能な魚雷段階体細胞
胚生長効率を有する。バイブロミキサーバイオリアクタ
ーは、２０％より大きい、ＰＥＭ〜完全生長した使用可
能な魚雷段階体細胞胚生長効率を有する。使用可能な魚
雷段階体細胞胚は、正常に見える植物を生じるものであ
る。
間の、ＰＥＭ〜完全生長した使用可能な魚雷段階体細胞
胚生長効率を有する。バイブロミキサーバイオリアクタ
ーは、２０％より大きい、ＰＥＭ〜完全生長した使用可
能な魚雷段階体細胞胚生長効率を有する。使用可能な魚
雷段階体細胞胚は、正常に見える植物を生じるものであ
る。
【００８８】実施例１７ 体細胞胚から誘導されたシクラメン植物の形態学的安定
性。 実施例２のＦ１雑種から誘導されたシクラメン体細胞胚
を、鉢植え用土に体細胞胚を置くことにより苗木に変換
させる。初葉形成後、苗木を温室に移し、成熟させる。
植物を開花段階に生長させる。開花植物の形態学的試験
からは植物の異常性は全く示されない。植物からは、遺
伝学的差異によるソマクローナル変異は全く観察されな
い。
性。 実施例２のＦ１雑種から誘導されたシクラメン体細胞胚
を、鉢植え用土に体細胞胚を置くことにより苗木に変換
させる。初葉形成後、苗木を温室に移し、成熟させる。
植物を開花段階に生長させる。開花植物の形態学的試験
からは植物の異常性は全く示されない。植物からは、遺
伝学的差異によるソマクローナル変異は全く観察されな
い。
【００８９】実施例１８ 体細胞胚から誘導されたキュウリ植物における遺伝学的
ソマクローナル変異。 Ｆ１雑種植物から誘導された実施例６の体細胞胚を、ソ
ルバロッド・プラグ(バウムガルトナー・パピエル、ス
イス国)において植物に変換し、結実植物に生長させ
る。デ・ラート等(前出)の方法により、８０植物につい
て倍数性レベルを測定する。遺伝学的ソマクローナル変
異が観察されないことから、植物は全て同じ倍数性レベ
ルおよび差異を有する。
ソマクローナル変異。 Ｆ１雑種植物から誘導された実施例６の体細胞胚を、ソ
ルバロッド・プラグ(バウムガルトナー・パピエル、ス
イス国)において植物に変換し、結実植物に生長させ
る。デ・ラート等(前出)の方法により、８０植物につい
て倍数性レベルを測定する。遺伝学的ソマクローナル変
異が観察されないことから、植物は全て同じ倍数性レベ
ルおよび差異を有する。
【００９０】実施例１９ キュウリ体細胞胚から植物への変換。 キュウリＰＥＭを、低い光強度でバイブロミキサーを備
えたバイオリアクターにおいて増殖させ、ふるいにかけ
(１００−１５０μm)、２０g／lのスクロースおよび５
マイクロモルのＡＢＡを補ったＭＳ培地５０ml当たり５
０００ＰＥＭの密度でエルレンマイヤーフラスコ中に接
種する。ＰＥＭを２つのバッチに分け、これらをさらに
明所および暗所で体細胞胚に生長させる。両バッチから
の体細胞胚を明所で植物に変換させる。結果は、暗所で
培養されたＰＥＭから誘導された体細胞胚の場合の体細
胞胚から植物への変換効率が、明所で培養された体細胞
胚の場合よりも高いことを示している(表５)。
えたバイオリアクターにおいて増殖させ、ふるいにかけ
(１００−１５０μm)、２０g／lのスクロースおよび５
マイクロモルのＡＢＡを補ったＭＳ培地５０ml当たり５
０００ＰＥＭの密度でエルレンマイヤーフラスコ中に接
種する。ＰＥＭを２つのバッチに分け、これらをさらに
明所および暗所で体細胞胚に生長させる。両バッチから
の体細胞胚を明所で植物に変換させる。結果は、暗所で
培養されたＰＥＭから誘導された体細胞胚の場合の体細
胞胚から植物への変換効率が、明所で培養された体細胞
胚の場合よりも高いことを示している(表５)。
【表５】 明るさの条件 魚雷型胚から植物への総合的変換率[％] 明所 ２８.６ 暗所 ６２.７
【００９１】実施例２０ 植物への変換に適した単一魚雷型胚の形成に対するＰＥ
Ｍ集合体のサイズ。 １０mg／gの２,４−Ｄおよび０.５mg／lのキネチンを補
った培地を用いて上記実施例５の記載に従い得られた９
日令のＰＥＭ懸濁液(５０ml ＰＣＶ／lのＰＥＭ濃度)
を、３つの独立事象としてナイロンメッシュでふるい分
けることにより、３種の異なるサイズのＰＥＭフラクシ
ョン:１００−１５０μ、１５０−２００μおよび２０
０−２５０μを得る。胚の生長は、３マイクロモルのＡ
ＢＡを含むＭＳ培地中約２５−５０ＰＥＭ／mlの初期Ｐ
ＥＭ濃度で遂行される。９日の生長培養後、魚雷段階の
胚の数を光学顕微鏡で評価する。単一魚雷型胚の数を、
多重魚雷型胚の数に対して評価する。魚雷型胚／ＰＥＭ
比は５−１５％である。サイズが１００μm未満のフラ
クションはＰＥＭを含まない。結果を表６に示す。
Ｍ集合体のサイズ。 １０mg／gの２,４−Ｄおよび０.５mg／lのキネチンを補
った培地を用いて上記実施例５の記載に従い得られた９
日令のＰＥＭ懸濁液(５０ml ＰＣＶ／lのＰＥＭ濃度)
を、３つの独立事象としてナイロンメッシュでふるい分
けることにより、３種の異なるサイズのＰＥＭフラクシ
ョン:１００−１５０μ、１５０−２００μおよび２０
０−２５０μを得る。胚の生長は、３マイクロモルのＡ
ＢＡを含むＭＳ培地中約２５−５０ＰＥＭ／mlの初期Ｐ
ＥＭ濃度で遂行される。９日の生長培養後、魚雷段階の
胚の数を光学顕微鏡で評価する。単一魚雷型胚の数を、
多重魚雷型胚の数に対して評価する。魚雷型胚／ＰＥＭ
比は５−１５％である。サイズが１００μm未満のフラ
クションはＰＥＭを含まない。結果を表６に示す。
【表６】 ふるい分けされたフラ 全体に対する割合とし クションのサイズ(μm) ての単一魚雷型胚(％) １００−１５０ ８５ １５０−２００ ２０ ２００−２５０ ５ 単一胚は、１００−１５０μmサイズのフラクションか
ら手で分離され、単一植物に変換される。
ら手で分離され、単一植物に変換される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 キュウリＰＥＭ懸濁液からＰＥＭをふるい分
け、ＰＥＭ／mlＰＣＶを測定した結果を示す棒グラフで
ある。
け、ＰＥＭ／mlＰＣＶを測定した結果を示す棒グラフで
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ９３００７０５ (32)優先日 1993年１月15日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (72)発明者 ウィールト・ファン・デル・メール オランダ1602エルウェー・エンクハイゼ ン、ヘラルトブラントウェッヒ25番 (72)発明者 エリック・ポストマ オランダ1628エムヘー・ホールン、セデル 35番 (72)発明者 ロブ・アベステー オランダ1602エーエヌ・エンクハイゼン、 クルート30番
Claims (20)
- 【請求項１】 前胚形成塊(pro-embryogenic mass)(Ｐ
ＥＭ)から生存可能な体細胞胚が形成され得る外植体か
らのＰＥＭ形成の促進方法であって、非カルス外植体
が、前胚形成塊(ＰＥＭ)形成を誘導するのに充分なオー
キシンまたはオーキシン混合物の有効量を含む液体植物
組織培養培地と接触した状態に置かれることを特徴とす
る方法。 - 【請求項２】 懸濁培養において実質的に同じ倍数体レ
ベルの体細胞胚を得る方法であって、 i)前胚形成塊(ＰＥＭ)形成の誘導を促進するのに充分な
オーキシンまたはオーキシン混合物の有効量を含む液体
培地と接触した状態で外植体を培養し、 ii)適当なオーキシン含有液体培地と接触した状態でi)
で得られたＰＥＭの数を増幅させ、 iii)ii)で得られたＰＥＭを集め、それらを実質的オー
キシン不含有液体培地と接触した状態に置き、 iv)iii)で生成されたＰＥＭから誘導された体細胞胚を
集めることを含む方法。 - 【請求項３】 iii)段階において、生存し得るＰＥＭに
富む選択されたサイズ分画のＰＥＭを用いることを含
む、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 液体培地がさらに約１５g／lないし９０
g／l間の濃度で炭水化物エネルギー供給源を含む、請求
項１〜３記載の方法。 - 【請求項５】 炭水化物エネルギー供給源濃度が約２０
g／lないし６０g／lの範囲に含まれる、請求項４記載の
方法。 - 【請求項６】 炭水化物エネルギー供給源が、スクロー
ス、グルコースおよびラフィノース群から選択される、
請求項４または請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 オーキシン含有ＰＥＭ懸濁液をバイブロ
ミキサー中で振動させる、請求項１〜６記載の方法。 - 【請求項８】 バイブロミキサーを実質的垂直面で振動
させる、請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 外植体が、原形質体、幹、葉、花弁、胚
軸部分、成長点、接合子胚自体、塊茎、維管束、内鞘、
子房または別の花糸に由来する請求項１〜８のいずれか
１項記載の方法。 - 【請求項１０】 実質的に全て同じ倍数体レベルを有す
る体細胞胚を含む非ダウクス植物材料からの体細胞胚懸
濁培養物。 - 【請求項１１】 実質的倍数体の体細胞胚を含む、請求
項１０記載の体細胞胚懸濁培養物。 - 【請求項１２】 実質的４倍体の体細胞胚を含む、請求
項１０記載の体細胞胚懸濁培養物。 - 【請求項１３】 体細胞胚が、双子葉または単子葉植物
外植体から生成されたＰＥＭから誘導される、請求項１
０〜１２のいずれか１項記載の懸濁培養物。 - 【請求項１４】 体細胞胚が、シクラメン、ウリ、リコ
ペルシコン(Ｌycopersicon)、アリウム、ベゴニア、ベ
ータ(Ｂeta)、サクラソウ、アブラナ、トウガラシ、シ
コリウム(Ｃichorium)、ガーベラ、ホウセンカ、ラクツ
カ(Ｌactuca)、オリザ(Ｏryza)、ペラルゴニューム、ペ
チュニア、スミレおよびトウモロコシ属から成る群から
選択される、請求項１０〜１３のいずれか１項記載の懸
濁培養物。 - 【請求項１５】 双子葉植物外植体から得られる、請求
項１４記載の懸濁培養物。 - 【請求項１６】 シクラメン、ウリ、ベータ、アブラ
ナ、スミレ、ペラルゴニュームおよびトウガラシから成
る群から選択される、請求項１５記載の懸濁培養物。 - 【請求項１７】 実質的に倍数体である細胞から成るＰ
ＥＭを含む懸濁培養物。 - 【請求項１８】 実質的に全て同じ倍数体レベルを有す
る非ダウクス性体細胞胚。 - 【請求項１９】 実質的に全ての倍数性体細胞胚または
実質的に全ての４倍性体細胞胚を含む、請求項１８記載
の体細胞胚。 - 【請求項２０】 請求項２〜１９記載の体細胞胚から得
られる植物。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB939300705A GB9300705D0 (en) | 1993-01-15 | 1993-01-15 | Improvements in or relating to organic compounds |
| GB9300729 | 1993-01-15 | ||
| GB9300705 | 1993-01-15 | ||
| GB939300729A GB9300729D0 (en) | 1993-01-15 | 1993-01-15 | Improvements in or relating to organic compounds |
| GB9300706 | 1993-01-15 | ||
| GB9300707 | 1993-01-15 | ||
| GB939300706A GB9300706D0 (en) | 1993-01-15 | 1993-01-15 | Improvements in or relating to organic compounds |
| GB939300707A GB9300707D0 (en) | 1993-01-15 | 1993-01-15 | Improvements in or relating to organic compounds |
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|---|---|
| JPH06237659A true JPH06237659A (ja) | 1994-08-30 |
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ID=27450981
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP00247094A Expired - Lifetime JP4121160B2 (ja) | 1993-01-15 | 1994-01-14 | 有機化合物に関する改良 |
Country Status (18)
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| EP (2) | EP0934691A3 (ja) |
| JP (1) | JP4121160B2 (ja) |
| KR (1) | KR100314969B1 (ja) |
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| DK (1) | DK0608716T4 (ja) |
| ES (1) | ES2140471T5 (ja) |
| GR (1) | GR3032584T3 (ja) |
| IL (1) | IL108330A (ja) |
| MA (1) | MA23089A1 (ja) |
| PT (1) | PT608716E (ja) |
| TR (1) | TR28634A (ja) |
| TW (1) | TW367365B (ja) |
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| GB9703628D0 (en) * | 1997-02-21 | 1997-04-09 | Abdelrahman Layla Z | Sugar cane production |
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| WO1999065291A2 (en) * | 1998-06-12 | 1999-12-23 | Silvagen Inc. | A process for ex vitro sowing and germination of plant somatic embryos |
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| US7381562B2 (en) | 2002-05-30 | 2008-06-03 | Weyerhaeuser Company | Methods for producing cotyledonary pine embryos utilizing a gibberellin |
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| US7521237B2 (en) | 2003-06-23 | 2009-04-21 | Weyerhaeuser Nr Company | Methods for promoting maturation of conifer somatic embryos |
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| US7732205B2 (en) | 2003-07-30 | 2010-06-08 | Weyerhaeuser Nr Company | Development and stratification of pine somatic embryos using a liquid system |
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| CA2568476C (en) | 2005-12-22 | 2015-03-17 | Weyerhaeuser Company | Methods for storing conifer somatic embryo germinants |
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| CN105104183B (zh) * | 2015-08-26 | 2017-07-04 | 北京农业生物技术研究中心 | 一种菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法 |
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-
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