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Die Erfindung betrifft die Regeneration von Weinreben durch somatische
Embryogenese und insbesondere eine Kultur von proembryogenen Zellaggregaten
und ein Verfahren zur Entwicklung der Embryonen ausgehend von diesen Kulturen.
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Die Regeneration von Weinreben weist als nachgeschaltete Technik der Forschung
einen essentiellen Vorteil bei der Verbesserung von Weinreben auf, die
insbesondere ein doppeltes Ziel auf dem Gebiet der Qualität der Weine und jenem
des Umweltschutzes verfolgt. Insbesondere für diesen zweiten Aspekt ist es
verständlich, dass es sehr wichtig ist, beispielsweise gegenüber bestimmten
Krankheiten resistente Pflanzen regenerieren und vermehren zu können, um den
Einsatz von Pflanzenschutzmitteln, die oftmals für die Umwelt schädlich sind, zu
verringern.
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Mit dem Ziel, die Rebenarten zu verbessern, wobei die organoleptischen
Eigenschaften der Produkte, die davon herrühren, bewahrt werden, wurden
verschiedene in vitro-Kultur- und Modifizierungstechniken insbesondere getestet, um
frühzeitige Selektionskriterien, wie beispielsweise für die Resistenz gegen
Krankheiten (BRANCHARD, M., Agronomie, 1984 4 (9), 905-911) oder für die
Toleranz gegenüber der Toxizität bestimmter Elemente des Bodens (Bouquet, A., et
al., Coll. "Amélioration de la Vigne et Culture in vitro", Paris, 1985 147-157), zu
definieren.
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Um eine solche Technik für die Regeneration von Weinreben zu entwickeln, ist es
gleichwohl erforderlich, über mindestens die folgenden Komponenten zu verfügen:
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- eine stabilisierte Kultur von proembryogenen Zellen, die repliziert oder
genetisch modifiziert werden können;
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- ein Kulturmedium und eine Technik, die deren Replikation und deren
Aufrechterhaltung ermöglichen; und
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- ein Kulturmedium und eine Technik, die die Bildung von Embryonen und
deren Entwicklung zu Keimlingen begünstigen.
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In der vorliegenden Beschreibung bezeichnet man mit "Keimling" eine Pflanze, die
von einem somatischen Embryo abstammt, analog zu dem Keimling im engeren
Sinne, der normalerweise aus der Keimung eines zygotischen Embryos aus dem
Samenkorn stammt. Noch genauer bezeichnet der in der vorliegenden Beschreibung
eingesetzte Begriff "Keimling" die Pflanze in dem Zustand, wo man nach
vollständiger Entwicklung des Embryos gut entwickelte Kotyledone von grüner Farbe
und eine Wurzelverlängerung unterscheidet.
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Es waren verschiedene Kulturverfahren für die Replikation der proembryogenen
Zellen und dis Entwicklung der Embryonen eingesetzt worden, insbesondere durch
die Bildung und Entwicklung von sekundären Embryonen, wie in US-A-4 532 733
beschrieben.
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Gleichwohl stoßen die beschriebenen Techniken auf zahlreiche Schwierigkeiten, wie
auf der Ebene der Bildung der Embryonen, die im allgemeinen anormal sind, wie
auch auf jener der Entwicklung zu Keimlingen, welche aus diesem Grunde mit
besonders geringen Ausbeuten erhalten werden.
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Es wurde insbesondere beobachtet, dass die Bildung von sekundären Embryonen,
die oftmals anormal sind, tatsächlich dazu führte, dass die Ausbeute an
entwickelten, d. h. Kotyledonen aufweisenden Embryonen am Ende der Kultur
verringert ist. So erlaubten diese Schwierigkeiten es nicht, den Einsatz dieser
Techniken infolge von Ergebnissen der angewandten Forschung im Hinblick auf
eine industrielle Produktion in Betracht zu ziehen.
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Wie man leicht versteht, werden andererseits die Ausbeuten an entwickelten
Embryonen und an Keimlingen umso höher sein, wenn die Zellen der eingesetzten
Kultur eine bedeutende embryogene Fähigkeit aufweisen.
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Die Erfindung betrifft folglich an erster Stelle eine stabilisierte Kultur von
proembryogenen Zellaggregaten, die am 29. April 1992 unter der Nr. PL9204291 7
bei der Sammlung ECACC (European Collection of Animal Cell Cultures - Division
of Biologies - Porton Down - Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, Vereinigtes Königreich)
hinterlegt worden ist, deren Varianten und die abgeleiteten Kulturen, insbesondere
jene, die äquivalente proembryogene Eigenschaften bewahrt haben.
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Unter strabilisierter Kultur versteht man eine Kultur von Zellen oder Zellaggregaten,
deren DNA-Menge pro Zellkern im Zuge der Replikationen identisch bleibt und die
mittels Regenerationstechniken eine zu der Ausgangspflanze identische Pflanze
erzeugen, wobei eine solche Stabilität sich über 4 Jahre von Kultur und
regelmäßigen Versetzungen hinaus erstrecken kann.
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Die Zellen sind hauptsächlich diploid, mit Ausnahme derjenigen unter diesen
während der Mitose, die dann tetraploid sind.
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Unter Variante oder abgeleiteter Kultur versteht man die insbesondere durch
Mutationen, durch Chromosomenumlagerungen, durch genetische Rekombination
oder durch epigentische Phänomene modifizierten Zellen.
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Unter äquivalenten proembryogenen Eigenschaften versteht man eine Kultur, die
mindestens 100 Embryonen pro mg Zellen entwickeln kann.
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Die unter der Nr. PL92042917 ECACC hinterlegte Kultur ist ein Stamm von
embryogenen Zellen, die in Form von Zellaggregaten vorliegen, der ausgehend von
Staubbeuteln der Pfropfunterlage ("porte greife") 41 B, die aus einer Kreuzung Vitis
vinifera cv. Chasselasx Vitis berlandieri stammt, erhalten worden ist.
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Um diese Zellen zu kultivieren und zu replizieren, ist es erforderlich, über ein
flüssiges Kulturmedium und eine Technik zu verfügen, die geeignet sind, die Bildung
und die Entwicklung von Embryonen zu verhindern, wobei die Mitosen ermöglicht
werden.
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So betrifft die Erfindung gleichfalls ein Verfahren zum Aufrechterhalten eines
Stamms von proembryogenen Weinrebenzellen mittels eines flüssigen
Standardkulturmediums für pflanzliche Zellen, wie beispielsweise eines Murashige
und Skoog- (MS-) oder Nitsch-und-Nitsch-Mediums, ergänzt mit Auxinen in
ausreichender Konzentration, um die Zeildifferenzierung zu Embryonen zu hemmen,
wobei die Mitosen ermöglicht werden, und dessen pH zwischen 5 und 6 liegt, der
beispielsweise mit verdünnter Natronlauge eingestellt worden ist.
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Unter den Auxinen kann man 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4D),
1-Naphthalinessigsäure (NAA), 2-Naphthoxyessigsäure (NOA) aufführen.
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Es wurde gleichwohl beobachtet, dass beim Ausführen des Verfahrens der
Erfindung die Wirkung der verschiedenen Auxine mehr oder weniger vorteilhaft ist.
So führt das Auxin 2,4D, obgleich es eine gute Vermehrung der Zellen zu Beginn der
Kultur ermöglicht, oftmals und ziemlich schnell am Ende von 2 oder 3 Wochen zu
Nekrosen und daher zu einem sehr empfindlichen Abfall der Lebensfähigkeit der
Zellen. Die Wirkung von NAA ist unterschiedlich: einerseits ist dis Vermehrung der
Zellen ziemlich langsam, und andererseits differenziert sich eine ziemlich
bedeutende Anzahl von Zellen zu Embryonen, was offensichtlich konträr zu dem
angestrebten Ziel ist.
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Im Gegenzug scheint es, dass NOA die besten Ergebnisse liefert.
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So wählt man gemäß einer vorteilhaften Ausführungsweise des vorerwähnten
Verfahrens der Erfindung als Auxin 2-Naphthoxyessigsäure (NOA).
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Gemäß einer Variante dieser Ausführungsweise liegt die Konzentration an NOA in
dem Kulturmedium zwischen 2,5 und 7,5 uM/l und sie beträgt vorzugsweise etwa 5
uM/l.
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Gemäß noch einer weiteren Ausführungsweise des vorerwähnten Verfahrens wird
der aus Zellaggregaten gebildete Stamm in das Kulturmedium als Inokulum in einer
Dichte zwischen etwa 3 und 8 mg frische Zellen pro Milliliter Medium eingebracht,
dann lässt man die Kultur bis zu einer 3- bis 5-fach höheren Dichte wachsen,
wonach man durch Versetzen wieder zu einer Subkultur mit im wesentlichen gleicher
Dichte zu jener der anfänglichen Inokulation gelangt.
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Vorzugsweise führt man vor dieser Subkultur ein Sieben der Zellaggregate aus, um
für die Ausführung der Subkultur lediglich jene zu bewahren, deren Größe 500 um
nicht überschreitet.
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Wenn man dieses Sieben nicht ausführt, würde man das Auftreten von zu
Embryonen differenzierten Zellen riskieren, die insbesondere aufgrund der
Tatsache, dass die Differenzierung in Gegenwart von Auxin erfolgt, zu einer
Blockierung der Entwicklung des Embryons in einem frühen Stadium führen würden
und dies auf irreversible Weise.
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Gemäß einer bevorzugten Variante dieser Ausführungsweise führt man die erwähnte
Subkultur etwa alle drei Wochen aus, wohingegen man das Kulturmedium jede
Woche durch Versetzen erneuert.
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Es scheint, dass nach vier Jahren, indem man wie unten angegeben vorgeht, sich in
einem solchen Medium die Kultur Nr. PL92042917 ECACC entwickelt hat, wobei sie
ihre embryogene Fähigkeit und ihre genetische Stabilität bewahrt hat.
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So wurde festgestellt, dass die erwähnte stabilisierte Kultur der Erfindung es erlaubt,
potentiell 400 Embryonen pro mg Zellen zu entwickeln, wohingegen der Stand der
Technik ein embryogenes Potential von einem Embryo pro mg beschreibt
(LEBRUN, L., und BRANCHARD, M., 3ème symposium sur la physiologie de la
vigne, Bordeaux, 1989, 38-41).
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Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren, das es ermöglicht, dass
diese embryogene Fähigkeit dergestalt zum Ausdruck kommt, dass Keimlinge mit
hinsichtlich einer industriellen Nutzung verträglichen Ausbeuten erhalten werden,
wobei es sich versteht, dass diese Keimlinge nur mit der Maßgabe erhalten werden
können, dass die Embryonen sich vollständig entwickeln können, ohne, wie bei den
früheren Verfahren, Anomalien zu erzeugen.
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So wurde unerwarteterweise gefunden, dass die Erneuerung des Kulturmediums in
regelmäßigen Zeitabständen bis zu der Gewinnung der Keimlinge es erlaubt, ein
solches Ergebnis zu erzielen.
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Die Erfindung betrifft folglich gleichfalls ein Verfahren zur Entwicklung der
Embryonen ausgehend von einem proembryogenen Stamm, der für die
Regeneration von Weinreben bestimmt ist, in dem der Stamm in einem geeigneten
flüssigen Kulturmedium kultiviert wird, das in regelmäßigen Zeitabständen erneuert
wird bis zum Erhalt von Keimlingen, bei welchen man zwei gut entwickelte
Kotyledonen von im Allgemeinen grüner Farbe und eine längliche Wurzel
unterscheidet.
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Man führt die Erneuerung des Kulturmediums vorteilhafterweise durch Verpflanzen
aus.
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Vorteilhafterweise bringt man bei jeder Erneuerung des Mediums oder jedem
Verpflanzen die Dichte der Kultur zu der anfänglichen Dichte der Inokulation zurück.
Allgemein und abhängig von der Dichte der Kultur während der Inokulation wird der
Stamm zwischen 3 und 7 Tagen kultiviert, dann täglich verpflanzt, bis Keimlinge
erhalten werden.
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Die Dichte der Kultur während der Inokulation liegt vorteilhafterweise zwischen 0,5
und 2 ul sedimentierten (1 · g) Zellen pro ml Medium, vorzugsweise zwischen 1 und
2 ul/ml, So wird man bei einer Dichte zwischen 1 und 2 ul die regelmäßigen
Erneuerungen des Mediums oder Verpflanzungen zwischen 3 und 4 Tagen nach
dem Beginn der Kultur beginnen, wohingegen man diese bei niedrigeren Dichten
zwischen dem 5. und 6. Tag ausführt.
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Unter geeignetem flüssigem Kulturmedium versteht man ein flüssiges
Standard-Kulturmedium für pflanzliche Zellen, das frei von Auxin ist.
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Vorzugsweise handelt es sich um ein flüssiges Standardmedium, wie das Murashige
und Skoog-Medium (1962), das dem Fachmann wohlbekannt ist, frei von Auxin ist
und so modifiziert wird, dass es lediglich die Hälfte der Konzentration an
Makroelementen enthält, dass die Saccharose durch Glycerin und Maltose ersetzt
worden ist und zu dem ein Casein-Hydrolysat zugesetzt worden ist.
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In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist der Stamm vorteilhafterweise während der
anfänglichen Inokulation für die Initiierung der Embryonen aus Zellaggregaten einer
Größe zwischen 200 und 500 um zusammengesetzt.
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Solche Aggregate werden durch Kultur des Stamms, vorzugsweise gemäß dem
zuvor beschriebenen Aufrechterhaltungsverfahren des Stamms in Gegenwart von
Auxin, erhalten, dann nacheinander durch einen Filter mit einer Porosität von etwa
500 um, um die Aggregate größerer Größe zu entfernen, dann durch einen Filter mit
einer Porosität von etwa 200 um, um lediglich die Zellaggregate zwischen 200 um
und 500 um zu bewahren, filtriert. Schließlich werden diese Aggregate vorzugsweise
mit dem vorerwähnten geeigneten Kulturmedium dergestalt gewaschen, dass im
wesentlichen jede Spur von Auxin entfernt wird.
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Indem man gemäß dem Verfahren der Erfindung vorgeht, durchlaufen die
ausgehend von den Zellaggregaten gebildeten Embryonen nacheinander die
folgenden Entwicklungsstadien: globulär, herzförmig, "Torpedo" und reife
Embryonen oder Keimlinge.
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Es kann vorteilhaft sein, obgleich nicht unabdingbar, dem Kulturmedium ein
Cytokinin, wie Zeatin, ab dem Moment, wo die Embryonen das "Torpedo"-Stadium
erreicht haben, zuzusetzen, um die spätere Entwicklung zu begünstigen. Gleichwohl
darf die Dauer der Kultur in Gegenwart von Cytokinin nicht die Dauer überschreiten,
jenseits von welcher Störungen der Kultur auftreten könnten.
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Diese Dauer beträgt beispielsweise für Zeatin etwa 5 Tage.
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Ab dem Zeitpunkt, wo die Keimlinge erhalten werden, werden sie auf festes Medium,
beispielsweise Agar, in Gegenwart eines geeigneten Mediums transferiert, um
entwickelte Pflanzen zu erhalten.
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Die nachfolgenden Beispiele erlauben es, eine bevorzugte Ausführungsweise des
erfindungsgemäßen Verfahrens, angewandt auf dis unter der Nr. PL92042917
ECACC hinterlegte Kultur, zu veranschaulichen, ohne gleichwohl anzustreben,
dessen Umfang zu beschränken.
Beispiel 1: Erhaltung des embryogenen Stamms
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Die Kultur von Zellaggregaten, erhalten ausgehend von Staubblättern der
Pfropfunterlage ("porte greife") 41 B, wird durch Kultivierung und regelmäßiges
Versetzen in ein flüssiges Standard-Kulturmedium für pflanzliche Zellen, das im
Handel erhältlich ist, wie ein Murashige und Skoog (MS)-Medium, das mit 2-
Naphthoxyessigsäure (NOA) ergänzt ist, aufrechterhalten.
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Die Kulturen werden in 250 ml-Erlenmeyerkolben mit 80 ml Medium unter Bewegung
bei etwa 110 U/min bei 21ºC vorzugsweise im Dunkeln ausgeführt.
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Die Konzentration an Auxin beträgt 5 uM/l und der pH wird vor dem Autoklavieren
des Mediums bei 120ºC während 20 min durch 0,1 N Natronlauge auf 5,8
eingestellt.
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Der Stamm wird dann als Inokulum in einer Dichte zwischen 3 und 8 mg frische
Zellen pro ml Medium eingebracht und man lässt die Kultur bis zu einer 3- bis 5-fach
höheren Dichte wachsen. Man führt dann ein Sieben der Zellaggregate durch einen
Nylonschirm mit Poren einer Größe von 500 um dergestalt aus, dass die Aggregate
mit einer größeren Größe entfernt werden. Die Kultur wird jede Woche in das
ergänzte MS-Medium versetzt.
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Der Siebvorgang wird in regelmäßigen Zeitabständen, etwa alle zwei oder drei
Wochen, abhängig von der Dichte des Kulturmediums erneut ausgeführt.
Beispiel 2: Initiierung und Entwicklung der Embryonen
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Das für die Entwicklung von somatischen Embryonen eingesetzte Kulturmedium ist
ein modifiziertes flüssiges MS-Kulturmedium, das insbesondere 18 g/l Maltose und
4,6 g Glycerin, die die Saccharose ersetzen, und 1 g/l Caseinhydrolysat enthält.
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Dieses Medium, das frei von Auxin ist, wird bei einem pH von 5,8, der durch die
Zugabe von 0,1 N Natronlauge eingestellt worden ist, eingesetzt.
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Das Kulturmedium wird 20 min bei 120ºC autoklaviert. Die undifferenzierten
Zellkulturen, die aus der gemäß dem Protokoll von Beispiel 1 aufrechterhaltenen
Zellkultur stammen, werden nacheinander durch Nylonschirme mit Poren einer
Größe von 500 um, dann 200 um dergestalt filtriert, dass für die Inokulation der
Kultur lediglich Zellaggregate mit einer Größe zwischen diesen zwei Werten
beibehalten werden.
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Die auf dem zweiten Filter zurückgehaltenen undifferenzierten Zellaggregate werden
dann 3-mal mit dem modifizierten MS-Medium gewaschen, dann in 30 ml dieses
Mediums suspendiert.
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Die Zelldichte, ausgedrückt in pl Zellvolumen pro ml Medium, wird nach
Sedimentation (1 · g) der Zellen in einem graduierten konischen Röhrchen
bestimmt.
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Man inokuliert dann 80 ml modifiziertes MS-Kulturmedium mit einer Suspension von
Zellaggregaten in einer Dichte von 1 pl/ml in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben.
Nach 4 Tagen Kultur, vorzugsweise im Dunkeln, führt man täglich ein Verpflanzen in
das modifizierte MS-Medium, bis Keimlinge erhalten werden, für eine mittlere Dauer
von 15 bis 17 Tagen aus.
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Die Gesamtdauer der Entwicklung der Embryonen, die die verschiedenen
Entwicklungsstadien globulär, herzförmig, dann torpedoförmig durchlaufen, bevor
sie einen Keimling ergeben, beträgt etwa 20 Tage. Beim Auftreten des Torpedo-
Stadiums, etwa 10 bis 12 Tage nach dem Beginn der Kultur, setzt man 5 mg/l Zeatin,
ein Hormon, das die Entwicklung der Kotyledonen und des Apex begünstigt, für eine
Dauer von maximal 5 Tagen zu.
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Die Keimlinge werden dann in ein festes Agarmedium (modifiziertes MS-Medium,
das die Hälfte der Konzentration an Mikro- und Makroelementen, 20 g/l Saccharose,
7 g/l Difco-Bacto-Agar bei pH 5,8 enthält) ohne jeglichen Zusatz von
Wachstumsregulator transferiert.
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Entwickelte Pflanzen werden durch Kultivierung der Keimlinge bei 25ºC unter einer
Lichtintensität von 40 bis 50 uE·m&supmin;²·s&supmin;¹ (Leuchtstoffröhre Mazda fluo A9TFRS4O/BI)
mit einer Photoperiode von 16 h während etwa 40 Tagen erhalten.
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Dieses in mehreren Wiederholungen mit embryogenen Zellaggregaten ausgeführte
Verfahren erlaubt es, etwa 60% bis 95% Keimlinge bezogen auf die Anzahl von
anfänglich gebildeten Embryonen zu erhalten.
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Die Vergleichsdaten zwischen verschiedenen Verfahren der Entwicklung der
Embryonen mit oder ohne Versetzen sind in der Tabelle 1 angegeben.
TABELLE 1
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Alle Versuche wurden bei identischer Zusammensetzung des flüssigen Mediums
und identischer anfänglicher Inokulationsdichte ausgeführt.
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Tabelle 1 zeigt einerseits (Spalten 2 bis 6) die Anzahl von Embryonen gemäß ihrem
Entwicklungsstadium für hundert Embryonen am Ende der Kultur in flüssigem
Medium (20 Tage oder 26 Tage) und andererseits (Spalte 6) die Anzahl von
normalen entwickelten Pflanzen nach vierzig Tagen Kultur auf festem Agarmedium
für hundert transferierte Keimlinge, wie zuvor angegeben.
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Man stellt fest, dass gemäß den früheren Verfahren in Abwesenheit von täglichem
Versetzen (1. Zeile der Ergebnisse) die Embryonen im "Herz"-Stadium, ja sogar dem
"globulären" Stadium blockiert bleiben, wohingegen gemäß dem Verfahren der
Erfindung (2. Zeile der Ergebnisse) mit einem täglichen Versetzen während 16
Tagen ausgehend von dem 4. Kultivierungstag 91% der Embryonen in das
"Keimling"-Stadium gelangt sind und dann in der Lage sind, normale entwickelte
Pflanzen zu erzeugen. Im Gegenzug beobachtet man (3. Zeile der Ergebnisse),
dass, wenn die täglichen Versetzungen nicht ausreichend frühzeitig ausgeführt
werden, eine Blockierung der Entwicklung der Embryonen im Torpedo-Stadium
erfolgt und dass so keinerlei Keimlinge erhalten werden können.
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So kann man dank des erfindungsgemäßen Verfahrens für einhundert ausgehend
von dem Stamm von embryogenen Zellaggregaten erzeugte Embryonen etwa 90
Keimlinge am Ende der Kultur in flüssigem Medium und etwa 75 entwickelte normale
Pflanzen nach Transfer auf festes Medium erhalten, was dieses Verfahren mit einer
industriellen Nutzung verträglich macht.
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Die durch das oben beschriebene Verfahren erhaltenen entwickelten Pflanzen
werden dann nach deren erforderlicher Anpassung an die äußeren Bedingungen der
Kultur in Erde gesetzt, um eine regenerierte Weinrebe zu erhalten.
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Die Erfindung betrifft folglich gleichfalls die Weinrebe, die aus Pflanzen regeneriert
worden ist, welche von Keimlingen stammen, die durch das zuvor beschriebene
Verfahren erhalten worden sind,.
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Wenn man schließlich über eine stabilisierte Kultur von Zellaggregaten mit hoher
embryogener Fähigkeit, ein geeignetes Kulturmedium für deren Erhaltung und ein
wirksames Verfahren zur Entwicklung der Embryonen verfügt, kann das Ganze in
vorteilhafter Weise für die folgenden Anwendungen eingesetzt werden:
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- Selektion von resistenten Pflanzen durch Screening, beispielsweise in
Gegenwart eines Toxins;
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- konforme Vermehrung von Weinreben;
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- Gewinnung und Fusion von Protoplasten;
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- Transformation von Weinreben durch Mutagenese und
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- Transformation von Weinreben durch genetische Transformation.
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Dieser letzte Punkt ist in dem Maße besonders interessant, wo die bekannten
Beispiele genetischer Transformationen durch die spätere Entwicklung der
transformierten Zellen zu Embryonen limitiert werden.
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Tatsächlich beobachtet man bei den bekannten Techniken von genetischen
Transformationen von Weinreben bei einer beträchtlichen Anzahl von
transformierten Zellen eine Blockierung bei der Differenzierung zu Embryonen.
Indem man von einem Stamm mit hoher embryogener Fähigkeit ausgeht, kann man
so im allgemeinen mit einer ausreichenden Menge von transformierten Embryonen
rechnen.
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Die Erfindung betrifft folglich gleichfalls die Verwendung der unter der Nr.
PL92042917 ECACC hinterlegten stabilisierten Kultur, von deren Varianten und
abgeleiteten Kulturen, insbesondere jenen, die äquivalente proembryogene
Eigenschaften bewahrt haben, für die Transformation der Zellen durch einen
geeigneten Vektor, gefolgt von der Regeneration zu einer Pflanze.
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Unter geeignetem Vektor versteht man ein jegliches Mittel, das den Transfer, die
Integration in das Genom, die Expression und die Replikation eines Gens in das
Innere bzw. dem Inneren einer pflanzlichen Zelle ermöglicht.
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Unter den bekannten Vektoren werden vorzugsweise die von Agrobacterium
abgeleiteten, wie beispielsweise in dem Europäischen Patent Nr. 0 176 112
beschrieben, eingesetzt werden.
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Aus denselben Gründen betrifft die Erfindung gleichfalls die Verwendung der unter
der Nr. PL92042917 hinterlegten stabilisierten Kultur und von deren Varianten und
abgeleiteten Kulturen, insbesondere jenen, die äquivalente proembryogene
Eigenschaften bewahrt haben, für die Gewinnung von Protoplasten von Weinreben.
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Man wird hauptsächlich die Methoden zur Gewinnung von Protoplasten einsetzen,
die in allgemeiner Weise (Cell and Tissue Culture in Forestry, Band 2, Hrsg. JM.
B4NGA, Don J. DURZAN, Martines NIJHOFF Publishers 1987, DORDRECHT,
BOSTON, LANCASTER) oder insbesondere für Weinreben (BESSIS, R., & al.,
journées sur l'amélioration de la vigne et culture in-vitro, organiéses par MOET-
HENNESSY, S. A., PARIS, April 1985, S. 195-196; LEBRUN, L., journées sur
l'amelioration de la vigne et culture in-vitro, organisees par MOET-HENNESSY,
S.A., PARIS, April 1985, S. 215) beschrieben worden sind.