DE69937030T2 - Regenerierungssystem für trauben und verwendungen davon - Google Patents

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Dennis J. Howey-in-the-Hills Gray
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues
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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Diese Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Regenieren von Weinpflanzen und von Wein-Keimplasma unter Verwendung solcher Verfahren.
  • Weintrauben sind eine laubwechselnde Fruchtpflanze von alter Herkunft. Die Weinproduktion (65 × 106 metrische Tonnen) übertrifft die jeder anderen Fruchtpflanze aus gemäßigten Breiten, und liegt auf dem dritten Rang hinter der Citrus- und Bananenproduktion. Zusätzlich übertrifft, wegen seiner Verwendung als frische Frucht, Saft, Gelee, Weintrauben und Wein, Wein all anderen Fruchtpflanzen an Wert. Daher werden erfolgreiche Anstrengungen, Weinpflanzen zu verbessern, wahrscheinlich einen großen Einfluss auf den kommerziellen Weinbau haben.
  • Gegenwärtige Verfahren zum Verbessern von Weinstöcken sind zeit- und arbeitsintensiv. Zum Beispiel ist die genetische Verbesserung von Weinpflanzen durch konventionelle Zucht durch eine Anzahl von Faktoren, wie lange Zeit bis zum Fruchtragen und variierende Ploidiegrades, eingeschränkt. Kultivierte Weinpflanzen sind auch hoch heterozygot und werden gewöhnlich nicht rein aus Samen gezogen. Darüber hinaus sind Weinpflanzenzuchtprogramme teure und langfristige Projekte. Obgleich die Pflanzenbiotechnologie eine attraktive Alternative für die genetische Verbesserung von Traubenpflanzen ist (Kuksova et al., Plant Cell Tiss. Org. Cult. 49: 17–27, 1997), kann die in vitro genetische Manipulation nur dann angegangen werden, wenn es ein effektives Regenerationssystem gibt. Dem entsprechend würden Verfahren, die irgendeines dieser Probleme vermindern, eine signifikante Verbesserung der Technik darstellen.
  • WO 93/23529 beschreibt eine stabilisierte Kultur von proembryogenen zellulären Aggregaten von Wein-Wurzelstock 41B, eingereicht unter Nr. PL92042917 bei der ECACC Sammlung, ihre Varianten und abgeleiteten Kulturen, ein Verfahren für die Vervielfältigung dieser Kultur, das es ermöglicht seine embryogene Kraft und seinen stabilisierten Zustand zu konservieren, ein Verfahren für die Entwicklung von Embryos aus einem proembryogenen Stamm zur Verwendung in Weinpflanzenregenerationstechniken und eine regenerierte Weinpflanze und Verwendung der stabilisierten Kultur, insbesondere zur Transformation von promembryogenen Zellen durch einen geeigneten Vektor.
  • Coutos-Thevenot et al. (PLANT CELL, TISSUE AND ORGAN CULTURE, vol. 29, 1992, Seiten 125–133) berichten über die somatische Embryogenese aus Weinstockzellen und Verbesserung der Embryoentwicklung durch Änderungen an den Kulturbedingungen.
  • Jayasankar et al. (IN VITRO CELLULAR AND DEVELOPMENTAL BIOLOGY, Vol. 34, März 1998 (1998-03), Seite 51A) berichten über die in vitro Selektion von Weinpflanzen auf Resistenz gegenüber dem Anthracnose-Pilz, Elsinoe ampelina.
  • Gray & Beneton (HORTSCIENCE, vol. 26, no. 6, 1991, Seite 156) berichten über mehrjährige embryogene Zellkulturen von Wein und Gray (AMERICAN JOURNAL OF BOTANY, vol. 79, no. 5, 1992, Seiten 542–546) berichten über eine somatische Embryogenese und Pflanzenregeneration aus unreifen zygotischen Embryos von Muscadine Weinsorten (Vitis rotundifolia).
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Wir haben Verfahren zum Ziehen von mehrjährigen embryogenen Weinkulturen und zum Ziehen großer Mengen von somatischem Weinembryo aus solchen mehrjährigen embryogenen Kulturen in einer relativ kurzen Periode entdeckt. Zahlreiche Vorteil werden durch die vorliegenden Verfahren bereitgestellt. Diese Ansätze ermöglichen, zum Beispiel, eine außerordentliche hohe Häufigkeit der Bildung von somatischen Embryos und die Pflanzenregeneration. Solche Häufigkeiten wurden bisher nicht bei der Rebstockregeneration irgendeiner bekannten Sorte berichtet und machen das Verfahren für die Massenproduktion von klonalen Pflanzstöcken von Weinpflanzen geeignet. Zusätzlich produzieren die Verfahren Embryos, die frei von solchen weitverbreiteten Abnormalitäten wie Fusion und Fasciation von somatischen Embryos sind. Die Verfahren der Erfindung resultieren auch in verstärkter embryogener Kulturinitiierungsfrequenz, was die Produktion von hoch embryogenen Kulturen ermöglicht, die dann durch die nachfolgenden Stufen des Regenerationsprozesses bis auf das Niveau von ganzen Pflanzen gebracht werden können. Wegen dieser Vorteile sind die Verfahren der Erfindung besonders nützlich bei der Anwendung der Biotechnologie auf die genetische Verbesserung dieser Frucht.
  • In einem ersten Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Produzieren einer mehrjährigen embryogenen Weinkultur, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
    • (a) Kultivieren eines Weinexplantatgewebes auf Kulturinitiationsmedium, besagtes Medium enthaltend wenigstens 0.01 mg/L eines Cytokins; wenigstens 0.1 mg/L eines Kohlenhydrats; und wenigstens 0.1 mg einer stickstoffhaltigen Verbindung,
    • (b) Visuelle Identifikation einer embryogenen Zelle oder einer embryogenen Zellmasse aus einer ersten Weinexplantatkultur, wobei besagte visuell identifizierten embryogene Zelle oder Zellen der embryogenen Zellmasse identifiziert werden, eine weiße bis schwachgelbe Farbe, ein bröckeliges, granuläres Erscheinungsbild zu haben und kompakt und reich an Zytoplasma zu sein,
    • (c) Transferieren besagter visuell identifizierter embryogener Zellen oder embryogener Zellmasse aus Schritt (b) in eine zweite Kultur;
    • (d) Erlauben, dass sich besagte transferierte embryogene Zelle oder embryogene Zellmasse aus Schritt (c) in zusätzliche embryogene Zellen oder embryogene Zellmassen teilen;
    • (e) Visuelle Identifikation einer embryogenen Zelle oder embryogenen Zellmasse aus Schritt (d), wobei besagte visuell identifizierte embryogene Zelle oder Zellen besagter embryogener Zellmasse aus Schritt (d) identifiziert werden, eine weiße bis schwachgelbe Farbe und ein bröckeliges, granuläres Erscheinungsbild zu haben, und
    • (f) Transferieren besagter identifizierter embryogener Zelle oder embryogener Zellmasse aus Schritt (c) in eine dritte Kultur, wodurch eine mehrjährige embryogene Weinkultur erzeugt wird,
    wobei besagtes Explantat aus Antheren, vegetativem Gewebe, Ranken, Blättern, Wurzeln, Nucellargewebe, Stämmen, Protoplasten, Perizykel, Apikalineristemgewebe, somatischen Embryos erhalten wird.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist das Verfahren auf das Produzieren eines somatischen Weinembryos gerichtet und umfasst weiterhin die Schritte:
    • (g) Erlangen einer embryogenen Zelle aus besagter mehrjährigen embryogenen Weinkultur;
    • (h) Transferieren besagter embryogener Zelle in eine neue Kultur und
    • (i) Heranzüchten eines somatischen Weinembryos aus besagter embryogener Zelle.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist das Verfahren auf die Selektion eines somatischen Weinembryos gerichtet, der resistent gegenüber einem Pflanzenpathogen ist, und weiterhin die Schritte umfasst:
    • (g) Kultivieren der mehrjährigen embryogenen Zellkultur aus Schritt (f) in einem ersten Flüssigkulturmedium, um eine zelluläre Suspensionskultur zu produzieren, besagtes erstes Flüssigkulturmedium umfassend einen Pflanzenwachstumsregulator und ein Filtrat aus einer pflanzenpathogenen Kultur, wobei besagtes Filtrat oder ein aufgereinigtes Toxin aus einem Virus, Nematoden, Insekt, Pilz, Mycoplasma oder Bakterium erhalten wird;
    • (h) Erlangen einer Weinzelle oder eines Weinzellclusters aus besagter zellulären Suspensionskultur;
    • (i) Kultivieren besagter Weinzelle oder besagten Weinzellclusters in einem zweiten Flüssigkulturmedium, um einen somatischen Weinembryo zu produzieren und
    • (j) Erlangen besagten somatischen Weinembryos, der eine Resistenz gegenüber besagten Pflanzenpathogen aufweist.
  • Weitere Ausführungsformen der Erfindung sind in den Ansprüchen offenbart.
  • Beschreibung der Zeichnungen
  • 1A ist eine Photographie einer Pflanzenkulturschale, die die embryogene Masse von „Chardonnay" zeigt, die aus eine Flüssigkulturmedium erhalten wurde. Diese Photographie wurde ungefähr zehn Wochen nach der Initiierung einer Flüssigzellkultur aufgenommen.
  • 1B ist eine Photographie einer Pflanzenkulturschale, die somatische Embryos in der Cotyledonen-Stufe zeigt. Diese Photographie wurde ungefähr zwölf Wochen nach der Initiierung der Embryonenentwicklung aufgenommen.
  • 1C ist eine Photographie einer Pflanzenkulturschale, die reife somatische Embryos zeigt, die verfrüht in Flüssigkultur auskeimen. Beachtenswert ist dier Verlängerung der Wurzeln bei vielen Embryos. Diese Photographie wurde ungefähr zwölf Wochen nach der Initiierung der Embryonenentwicklung aufgenommen.
  • 1D ist eine Photographie einer Pflanzenkulturschale, die die anfänglichen Stufen der somatischen Embryoentwicklung in einem festen Medium nach fünf Wochen des Kultivierens zeigt. Diese somatischen Embryos wurden aus embryogenen Zellmassen erhalten, die in einem Flüssigmedium kultiviert wurden (aus 1A).
  • 1E ist eine Photographie einer Pflanzenkulturschale, die die frühen Stufen der Entwicklung des somatischen Embryos in einem festen Medium zeigt. Viele frühe somatische Embryos sind hyalin und fangen nach ein paar Tagen an opak zu werden.
  • 1F ist eine Photographie einer Pflanzenkulturschale, die reife somatische Embryos zeigt, die auf einem basalen MS Medium mit 3% Saccharose keimen.
  • Eingehende Beschreibung der Erfindung
  • Wir haben ein Verfahren zum Ziehen von mehrjährigen embryogenen Weinkulturen entwickelt, das für die Regeneration von Weinpflanzen nützlich ist. Bei dem einzigartigen Keimplasma, das aus unserem Kultursystem resultiert, wurde beobachtet, dass es Weinpflanzen mit einer erhöhten Fähigkeit produziert, embryogene Kulturen zu rekreieren. Weiterhin haben wir ein Verfahren zum Ziehen großer Mengen von somatischen Weinembryos aus solchen mehrjährigen embryogenen Kulturen in einer relativ kurzen Zeit unter Verwendung einer flüssigen Suspensionskultur entwickelt.
  • Die hier verwendeten Begriffe sind wie folgt definiert:
    Mit „mehrjähriger embryogener Weinkultur" ist eine embryogene Kultur gemeint, in der embryogene Zellen oder Zellmassen wiederholt in einer in vitro Kultur selektiert, subkultiviert und gehalten werden. Solche mehrjährige embryogenen Weinkulturen werden für mindestens ein halbes Jahr, vorzugsweise drei Jahre, und am bevorzugtesten fit vier oder mehr Jahre gehalten.
  • Mit „embryogener Zelle", „embryogener Zellmasse" oder „embryogenen Kulturen" ist eine Zelle oder Sammlung von Zellen gemeint, die das inhärente Potential besitzen, sich in einen somatischen Embryo, und letztlich, in eine Pflanze zu entwickeln. Typischerweise besitzen solche Zellen großen Nuklei und dichtes Zytoplasma. Zusätzlich sind solche Zellen totipotent, insofern als sie all das genetische und strukturelle Potential besitzen, um schließlich eine ganze Pflanze zu werden.
  • Mit „erhöhtem Niveau an Embryogenese" wird eine größere Kapazität gemeint, eine embryogene Zelle oder embryogene Zellmasse in einer mehrjährigen embryogenen Weinkultur verglichen mit einem Level einer nicht-mehrjährigen embryogenen Weinkutur als Kontrolle zu produzieren. Im Allgemeinen, ist ein solches erhöhtes Niveau der Embryogenese mindestens 20%, vorzugsweise 50%, noch bevorzugter 100% und am meisten bevorzugt 250% oder höher als das Niveau einer embryogenen Kontrollkultur. Das Niveau der Embryogenese wird mit üblichen Verfahren gemessen.
  • Mit „Explant" ist ein Organ, Gewebe oder eine Zelle gemeint, das/die von einer Pflanze abgeleitet ist und in vitro für den Zweck der Initiierung einer Pflanzenzellkultur oder einer Pflanzengewebekultur kultiviert wird. Zum Beispiel, kann Explant-Weingewebe von praktisch jedem Teil des Weinstocks erhalten werden, was ohne Beschränkung Antheren, Ovarien, Eizellen, Blütengewebe, vegetatives Gewebe, Ranken, Blätter, Wurzeln, nucellares Gewebe, Stämme, Samen, Protoplasten, Pericycel, apicales Meristemgewebe, embryogenes Gewebe, somatische Embryos und zygotische Embryos einschließt.
  • Mit „Pflanzenwachstumsregulator" ist eine Verbindung gemeint, die Pflanzenzellwachstum und Teilung beeinflusst. Bevorzugte Pflanzenwachstumsregulatoren schließen natürliche oder synthetische Auxine oder Cytokine ein. Beispielhafte Auxine schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, NOA, 2,4-D, NAA, IAA, Dicamba, und Picloram. Beispielhafte Cytokine schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, BA und Zeatin.
  • Mit „somatischer Embryogenese" wird der Prozess der Initiierung und Entwicklung von Embryos in vitro aus Pflanzenzellen und -gewebe ohne sexuelle Reproduktion bezeichnet.
  • Mit „somatischem Embryo" wird ein Embryo gemeint, der in vitro aus somatischen Zellen oder embryogenen Zellen durch mitotische Zellteilung gebildet wird.
  • Mit „reifem somatischem Embryo" ist ein voll entwickelter Embryo, der Wurzel- und Triebspitzen zeigt, der eine bipolare Struktur aufweist, gemeint. Bevorzugte reife somatische Embryos sind diejenigen, die gut definierte Cotyledonen besitzen.
  • Mit „Pflänzchen" ist eine kleine keimende Pflanze gemeint, die von einem somatischem Embryo abgeleitet ist.
  • Mit „Regeneration" ist die Produktion eines Organs, Embryos oder ganzen Pflanze in Pflanzengewebekultur gemeint.
  • Mit „Pathogen" ist ein Organismus gemeint, dessen Infektion von lebendigem Pflanzengewebe eine Erkrankungsreaktion in dem Pflanzengewebe auslöst. Solche Pathogene schließen ohne Beschränkung Baktierien, Mycoplasmen, Pilze, Insekten, Nematoden, Viren und Viroide ein. Pflanzengkrankheiten, die durch diese Pathogene verursacht werden, werden in den Kapiteln 11–16 von Agrios, Plant Pathology, 3te. A., Academic Press, Inc., New York, 1988 beschrieben. Beispiele für bakterielle Pathogene schließen ohne Beschränkung Agrobacterium vitis, Agrobacterium tumefaciens, Xylella fastidosa, und Xanthomonas ampelina ein. Beispiele für Pilz-Pathogene schließen ohne Beschränkung Uncinula necator, Plasmopara viticola, Botrytis cinerea, Guignardia bidwellii, Phomophsis viticola, Elsinoë ampelina, Eutypa lata, Armillaria mellea, und Verticllium dahliae ein. Beispiele für pathogene Nematoden schließen ohne Beschränkung Wurzelknoten-Nematoden (zum Beispiel, Meloidogyne sp.), Zysten-Nematoden (zum Beispiel, Heterodera sp), Wurzel angreifende Nematoden (zum Beispiel, Rotylenchulus reniformis), und oberirdische Nematoden (zum Beispiel, Anguina funesta) ein. Beispiele für pathogene Schädlinge schließen ohne Beschränkung (z.B., Insekten) Phylloxera, Coleoptera, Lepidoptera, Homoptera, Dermptera, und Diptera ein. Beispiele für virale Pathogene schließen ohne Beschränkung „grapevine fanleaf virus" und „grapevine leafroll virus" ein.
  • Mit „erhöhtem Resistenzniveau" wird ein höheres Niveau von Resistenz oder Toleranz gegenüber einem krankheitsverursachenden Pathogen oder Schädling in einem resistenten Weinstock (oder Spross, Weinstock, Zelle oder Samen davon) als das Resistenz- oder Toleranzniveau oder beidem relativ zu einer Kontrollpflanze gemeint (d.h. ein Weinstock, der nicht der in vitro Selektion gegenüber irgendeinem Pflanzenpathogen oder Toxin enthaltendem Filtrat davon unterworfen wurde). In bevorzugten Ausführungsformen ist das Niveau der Resistenz in einer resistenten Pflanze der Erfindung mindestens 5–10% (und bevorzugt 30% oder 40%) höher als die Resistenz einer Kontrollpflanze. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist das Resistenzniveau gegenüber einem krankheitsverursachendem Pathogen 50% höher, 60% höher und am bevorzugtesten sogar 75% oder 90% höher als das Resistenzniveau einer Kontrollpflanze; wobei bis zu 100% über dem Resistenzniveau verglichen mit dem Resistenzniveau einer Kontrollpflanze am meisten bevorzugt ist. Das Resistenz- oder Toleranzniveau wird mit konventionellen Verfahren gemessen. Zum Beispiel kann das Resistenzniveau gegenüber einem Pathogen durch Vergleichen der physikalischen Eigenschaften und Charakteristika (zum Beispiel, Pflanzenhöhe und -gewicht, oder durch Vergleichen der Krankheitssymptome, zum Beispiel, verzögerter Läsionsentwicklung, verminderter Läsionsgröße, Blattwelken, -verschrumpeln, und -eindrehen, Verderben von Fruchtständen, wassertriefenden Punkten, Blattversengen und marginaler Verbrennung, und Entfärbung von Zellen) der resistenten Weinpflanzen mit Kontroll-Weinpflanzen bestimmt werden.
  • Mit „transformiert" wird jede Zelle gemeint, die ein Nukleinsäuremolekül einschließt (zum Beispiel, eine DNA Sequenz), die künstlich in eine Zelle inseriert wird und Teil des Genoms des Organismus wird (entweder durch eine integrierte oder extrachromosomal Weise zum Beispiel, ein vitales Expressionskonstrukt, das einen subgenomischen Promoter einschließt), der sich aus jener Zelle entwickelt. Wie hierin verwendet, werden transformierte Organismen oder Zellen im Allgemeinen transformierte Weinstöcke oder Weinstockkomponenten sein und das Nukleinsäuremolekül (zum Beispiel, ein Transgen) wird künstlich in die nukleären oder Plastiden-Kompartimente der Pflanzenzelle inseriert.
  • Mit "Transgen" wird jedes Nukleinsäuremolekül (zum Beispiel, DNA) gemeint, welches künstlich in eine Zelle inseriert wird und Teil des Organismus wird (in dessen Genom integriert oder extrachromosomal erhalten), der sich aus dieser Zelle entwickelt. Solch ein Transgen kann ein Gen beinhalten, welches für den transgenen Organismus teilweise oder vollständig heterolog (d. h. fremd) ist, oder kann ein Gen darstellen, welches zu einem endogenen Gen des Organismus homolog ist.
  • Die hierin beschriebenen Regenerationsverfahren wurden für die erfolgreiche Regeneration durch somatische Embryogenese einer Vielzahl von Kultivaren von Weinstock-Wurzelstöcke und -sprossen verwendet, was Autumn Seedless, Blanc du Bois, Cabernet Franc, Cabernet Sauvignon, Chardonnay (z.B., CH 01 und CH 02), Dolcetto, Merlot, Pinot Noir (z.B., PN und PN Dijon), Semillon, Weisser Riesling, Lambrusco, Stover, Thompson Seedless, Niagrara Seedless, Seval Blanc, Zinfindel, Vitis rupestris St. George, Vitis rotundifolia Carlos, Vitis rotundifolia Dixie, Vitis rotundifolia Fry, und Vitis rotundifolia Welder einschließt.
  • Unter Verwendung der hierin beschriebenen Pflanzengewebekulturverfahren, haben wir auch in vitro Selektionsverfahren entwickelt, die den Fachleuten ermöglichen, pflanzenresistente Weinstöcke zu entwickeln. Eine solche Anwendung ist die Selektion von Mutationen in Weinpflanzenzellkulturen. Bei dieser Anwendung werden die Zellen, die resistent oder empfänglich für eine bestimmte Bedingung sind, basierend auf ihrem erhöhtem oder selektivem Wachstum selektiert. Die Zellen können ferner gegenüber einem Mutagen exponiert sein, das Veränderungen in der DNA der exponierten Zellen verursacht. Die mutagenisierte DNA kann mit Standarttechniken identifiziert werden. Eine zweite, verwandte Anwendung ist die Selektion von pathogenresistenten Zellen. Die Zellen werden in Gegenwart eines Pathogens kultiviert. Zellen, die Resistenz zeigen, können dann verwendet werden, um eine pathogenresistente Pflanze zu regenerieren. Eine dritte Anmeldung ist der Transfer der genetischen Information in Weinpflanzenzellen. Die genetische Information kann eine Nukleinsäuresequenz enthalten, die für einen selektierbaren Marker kodiert. Das Kultivieren der Zellen in Gegenwart des Selektionsdrucks resultiert in der Vermehrung oder dem Überleben nur der Zellen, die die gewünschte genetische Information besitzen. Die hierin beschriebenen Verfahren ermöglichen auch dem Fachmann Weinpflanzenvarianten zu entwickeln, selektieren und propagieren, die neue und nützliche Charakteristika besitzen.
  • Die Verfahren der Erfindung sind im Allgemeinen für eine Vielzahl von Weinpflanzen anwendbar (zum Beispiel, Vitis spp., Vitis spp. hybrids, und alle Mitgleider von Euvitis und Muscadinia), was Spross und Weinstockkultivare einschließt. Beispielhafte Sprosskultivare schließen ohne Beschränkung diejenigen ein, die als Tafel- oder Traubenweine bezeichnet werden, nämlich Alden, Almeria, Anab-E-Shahi, Autumn Black, Beauty Seedless, Black Corinth, Black Damascus, Black Malvoisie, Black Prince, Blackrose, Bronx Seedless, Burgrave, Calmeria, Campbell Early, Canner, Cardinal, Catawba, Christmas, Concord, Dattier, Delight. Diamond, Dizmar, Duchess, Early Muscat, Emerald Seedless, Emperor, Exotic, Ferdinand de Lesseps, Fiesta, Flame seedless, Flame Tokay, Gasconade, Gold, Nimrod, Hunisa, Hussiene, Isabella, Italia, July Muscat, Khandahar, Katta. Kourgane, Kishmishi, Loose Perlette, Malaga, Monukka, Muscat of Alexandria, Muscat Flame, Muscat Hamburg, New York Muscat, Niabell, Niagara, Olivette blanche, Ontario, Pierce, Queen, Red Malaga, Ribier, Rish Baba, Romulus, Ruby Seedless, Schuyler, Seneca, Suavis (IP 365), Thompson seedless, und Thomuscat. Sie schließen auch die ein, die in der Weinproduktion verwendet warden, wie Aleatico, Alicante Bouschet, Aligote, Alvarelhao, Aramon, Baco blanc (22A), Burger, Cabernet franc, Cabernet, Sauvignon, Calzin, Carignane, Charbono, Chardonnay (z.B., CH 01, CH 02, CH Dijon), Chasselas dore, Chenin blanc, Clairette blanche, Early Burgundy, Emerald Riesling, Feher Szagos, Femao Pires, Flora, French Colombard, Fresia, Furmint, Gamay, Gewürztraminer, Grand noir, Gray Riesling, Green Hungarian, Green Veltliner, Grenache, Grillo, Helena, Inzolia, Lagrein, Lambrusco de Salamino, Malbec, Malvasia bianca, Mataro, Melon, Merlot, Meunier, Mission, Montua de Pilas, Muscadelle du Bordelais, Muscat blanc, Muscat Ottonel, Muscat Saint-Vallier, Nebbiolo, Nebbiolo fino, Nebbiolo Lampia, Orange Muscat, Palomino. Pedro Ximenes, Petit Bouschet, Petite Sirah, Peverella, Pinot noir, Pinot Saint-George, Primitivo di Gioa, Red Veltliner, Refosco, Rkatsiteli, Royalty, Rubired, Ruby Cabernet, Saint-Emilion, Saint Macaire, Salvador, Sangiovese, Sauvignon blanc, Sauvignon gris, Sauvignon wert, Scarlet, Seibel 5279, Seibel 9110, Seibel 13053, Semillon, Servant, Shiraz, Souzao, Sultans Crimson, Sylvaner, Tannst, Teroldico, Tinta Madeira, Tinto cao, Touriga, Traminer, Trebbiano Toscano, Trousseau, Valdepenas, Viognier, Walschriesling, Weisser Riesling und Zinfandel. Weinstocksorten schließen Couderc 1202, Couderc 1613, Couderc 1616, Couderc 3309 (Vitis riparia X rupestris), Dog Ridge, Foex 33 EM, Freedom, Ganzin 1 (A × R #1), Harmony, Kober 5BB, LN33, Millardet & de Grasset 41B (Vitis vinifera X berlandieri), Millardet & de Grasset 420A, Millardet & de Grasset 101-14 (Vitis riparia X rupestris), Oppenheim 4 (SO4), Paulsen 775, Paulsen 1045, Paulsen 1103, Richter 99, Richter 110, Riparia Gloire, Ruggeri 225, Saint-George, Salt Creek, Teleki 5A, Vitis rupestris Constantia, Vitis california und Vitis girdiana, Vitis rotundifolia, Vitis rotundifolia Carlos, Teleki 5C (Vitis berlandieri X riparia), 5BB Teleki (Selektion Kober, Vitis berlandieri X riparia), SO4 (Vitis berlandieri X rupestris) und 039-16 (Vitis vinifera X Muscadinia) ein.
  • Es folgt nun eine Beschreibung für jedes der zuvor erwähnten Verfahren. Diese Beispiele werden nur zur Veranschaulichung der Erfindung bereitgestellt und sollten nicht als einschränkend verstanden werden.
  • Mehrjährige Weinembryokultursysteme
  • Das folgende Verfahren erwies sich als effektiv für die Produktion von mehrjährigen Weinkulturen, und für die Regeneration von Weinstöcken durch somatische Embryogenese.
  • Explant-Gewebe und Kulturinitiierung
  • In dem Kulturinitiierungsschritt wird Explantmaterial aus dem Feld, Gewächshaus, oder in vitro Mikrovermehrungskulturen von Sprossen von Weinstock gesammelt und in eine in viro Kultur platziert. Dieses Explantmaterial wird typischerweise aus Blättern, Antheren oder Tendrilen gesammelt, wird aber auch aus anderen vegetativen oder reproduktiven Geweben des Weinstocks erhalten. Nachdem es gesammelt war, wurde das Explantgewebe, wenn gewünscht, an der Oberfläche gemäß Standartverfahren sterilisiert, und dann in ein geeignetes Kulturinitiierungsmedium in einer Petrischale platziert.
  • Jedes einer Anzahl von wohl bekannten Medien kann verwendet werden, z.B., Murashige und Skoog (MS) und Nitsch's Medium. Solche Medien schließen typischerweise anorganische Salze, Vitamine, Mikronährstoffe, eine Stickstoffquelle und eine Kohlenstoffquelle, wie Saccharose, Maltose, Glucose, Glyzerin, Inositol und ähnliche ein. Zum Beispiel kann Saccharose bei einer Konzentraton von ungefähr 1 g/L bis ungefähr 200 g/L hinzugefügt werden; und bevorzugt bei einer Konzentration von ungefähr 30 g/L bis ungefähr 90 g/L. Darüber hinaus kann die Zusammensetzung eines solchen Pflanzengewebekulturmediums modifiziert werden, um das Wachstum der jeweiligen eingesetzten Pflanzenzelle zu optimieren. Zum Beispiel kann das Kultureninitiierungsmedium aus jedem der in Tabelle 1 aufgeführten Grundmedien hergestellt werden. Tabelle 1
    ZUSAMMENSETZUNG DER GEWÖHNLICH IN DEN BEISPIELEN VERWENDETEN MEDIEN
    Komponente MS Modifizertes MS Nitsch
    (mg/L außer anders angegeben)
    KNO3 1900.0 3033.3 950.0
    NH4NO3 1650.0 – 720.0
    NH4Cl – 363.7 –
    MgSO4·7H2O 370.0 370.0 185.0
    CaCl2 440.0 440.0 166.0
    KH2PO4 170.0 170.0 68.0
    Na2EDTA 37.23 37.23 37.3
    FeSO4·7H2O 27.95 27.95 27.95
    MnSO4·H2O 16.9 16.9 18.9
    Kl 0.83 0.83 –
    H3BO3 6.2 16.2 10.0
    ZUSAMMENSETZUNG DER GEWÖHNLICH IN DEN BEISPIELEN VERWENDETEN MEDIEN
    Komponente MS Modifizertes MS Nitsch
    (mg/L außer anders angegeben)
    ZnSO4·7H2O 8.6 8.6 10.0
    Na2MoO4·2H2O 0.25 0.25 0.25
    CuSO4·5H2O 0.025 0.025 0.025
    CoCl2·6H2O 0.025 0.025 0.025
    Glycine 2.0 2.0 –
    Nikotinsäure 0.5 0.5 1.0
    Pyridoxin HCl 0.5 0.5 1.0
    Thiamin HCl 0.1 0.1 1.0
    Inositol 0.1 g/L 11.0 g/L 0.1 g/L
    Saccharosee 130.0 g/L; 60.0 g/L 30.0 g/L; 60.0 g/L; 90.0 g/L 20.0 g/L
    Aktivierte Holzkohle – 0.5 g/L; 1.0 g/L; 2.0 g/L –
    Agar 7.0 g/L 7.0 g/L 8.0 g/L
    pH 5.5 5.5 5.5
  • Wenn gewünscht kann das Initiierungsmedium ein Auxin oder eine Mischung von Auxinen bei einer Konzentration von ungefähr 0.001 mg/L bis ungefähr 100 mg/L enthalten, abhängig von der interessierenden Sorte, die für das Induzieren der Produktion von embryogenen Zellen oder embryogenen Zellmassen auf das Explant-Gewebe wirksam ist. Zum Beispiel kann Explant-Gewebe auf einem durch Agar gefestigtem Medium vom Nitsch-Typ, das mit z.B. ungefähr 0.01 mg/L bis ungefähr 10 mg/L 2,4-D, und bevorzugt mit ungefähr 0.5 mg/L bis ungefähr 3.0 mg/L 2,4-D supplementiert wurde, gehalten werden. 2,4-D ist nur ein Beispiel eines Auxins, das in den Verfahren der Erfindung nützlich ist. Andere Auxine schließen zum Beispiel NAA, NOA, IAA, Dicamba und Picloram ein. Zusätzlich können, wenn gewünscht, andere Pflanzenwachstumsregulatoren in das Medium bei Standartkonzentrationen eingeschlossen werden. Zum Beispiel können Cytokinine (z.B. ein natürlich vorkommendes oder synthetisches Cytokinin wie BA oder Zeatin), falls vorhanden, bei einer Konzentration von ungefähr 0.01 mg/L bis ungefähr 10 mg/L, und bevorzugt ungefähr 0.3 mg/L, abhängig von der interessierende Sorte verwendet werden. In einigen Fällen können andere Klassen von Wachstumsregulatoren, wie ABA oder GA, in geeigneten Standartkonzentrationen eingeschlossen warden. Zum Beispiel kann ABA bei einer Konzentration von ungefähr 0.5 mg/L bis ungefähr 20 mg/L, und bevorzugt bei einer Konzentration von ungefähr 5 mg/L hinzugefügt werden; und GA kann bei einer Konzentration von ungefähr 0.1 mg/L bis ungefähr 30 mg/L, und bevorzugt bei einer Konzentration von 5 mg/L hinzugefügt werden. Die Zugabe von Pflanzenwachstumsregulatoren in dieser Stufe ist nicht notwendig für die Induktion der Embryogenese. Zusätzlich kann das Initiierungsmedium auch aktivierte Holzkohle (0.1–2.0 g/L) oder ein ähnliche den Fachleuten bekanntes Adsorptionsmittel enthalten.
  • Kultivieren des Explant-Gewebes während dieses Stadiums wird bevorzugt im Dunkeln bei 22–30°C ausgeführt, obgleich es auch unter Geringlichtbedingungen oder, in vollem Licht durchgeführt werden kann. Nach ungefähr ein bis vier Wochen in Kultur, werden dann Explantgwebekulturen in volles Licht mit einer 16-stündigen Photoperiode platziert. Kulturen werden dann wöchentlich auf das Vorliegen der erscheinenden embryogenen Zellen oder embryogenen Zellmassen gescannt. Embryogene Zellen oder Zellmassen werden basierend auf ihrer Morphologie identifiziert. Embryogene Zellmassen tendieren im Allgemeinen dazu farblich weiß bis blassgelb zu sein, oft sind sie hyalin. Sie können von einem sehr frühen, kleinem Stadium an (10-20-Zell Aggregate) erkannt werden, basierend auf ihrer Farbe und bröckeligen granulären Erscheinung. Embryogene Kulturen werden auch durch ihre (wie unter dem Mikroskop gesehene) kompakte Natur mit Zellen, die reich an Cytoplasma sind, identifiziert. Die embryogenen Kulturen erscheinen mit varrierender Häufigkeit, abhängig von einer Vielzahl von Faktoren, die einschließen, aber nicht beschränkt sind auf, Genotyp, Natur und Typ des Explants, Mediumzusammensetzung und Jahreszeit der Ernte. Sorgfältige visuelle Inspektion ist für die Kulturerhaltung notwendig, um Transfer der geeigneten embryoartigen Strukturen zu sichern. Sobald sie identifiziert sind, werden embryogene Zellen oder Zellmassen dann in Kulturhaltungsmedium transferiert, wie hier beschrieben wird.
  • Kulturhaltung
  • Embryogene Zellen oder embryogene Zellmassen werden sorgfältig entfernt und in ein Kulturhaltungsmedium transferriert. Wieder kann jegliches einer Anzahl von wohl bekannten Medien, wie z.B., MS und Nitsch's Medium verwendet werden. Obgleich nicht im Allgemeinen benötigt, können Pflanzenwachstumsregulatoren, wie oben beschrieben, hinzugefügt werden.
  • Im Allgemeinen kann embryogenes Gewebe durch Subkultivierung in regelmäßigen Abständen (z.B. alle ein bis vier Wochen, oder alle vier bis acht Wochen) in neues Haltungsmedium gehalten werden, wie hier beschrieben wird. Alternativ kann embryogenes Gewebe in ein Flüssigkulturmedium (z.B. MS, B-5 oder Nitsch) platziert werden und als eine flüssige embryogene Suspension, wie her beschrieben wird, gezogen werden. Embryogene Zellmassen werden gezogen, um die embryogene Zell-Biomasse, wie benötigt, durch Teilung von expandierenden Kulturen während des Transfers, zu erhöhen. Die Kulturen können dann induziert werden, sich in Richtung erhöhter Embryogenese oder in Richtung geringerer Embryogenese und unorganisierterem embryogenem Zellwachstum zu entwickeln, indem die Kultur wiederholt manipuliert wird, was die sorgfältige Selektion von embryogenen Zellen und Zellmassen während des Transfers einschließt. Es wurde nicht nur gefunden, dass wiederholter Transfer von embryogenen Zellen oder Zellmassen nicht nur das Wachstum von embryogenem Gewebe erhöht, sondern auch die Prozess der somatischen Embryogenese ermöglicht. Die Kulturen sind in dem Sinne mehrjährig, das sie typischerweise für über zwei Jahre überdauern.
  • Eine Schlüsselkomponente des vorliegenden Ansatzes involviert die sorgfältige Selektion der embryogenen Zellen aus explantiertem Gewebe gefolgt von wiederholter Selektion und wiederholtem Subkultivieren des selektierten embryogenen Gewebes. Es wurde nicht nur gefunden, dass dieses Material nützlich bei der Regenerierung ganzer Weinpflanzen aus somatischen Embryos ist, sondern es wurde auch gefunden, dass es eine signifikant erhöhte Embryogenesekapazität besitzt, die Produktion von somatischen Embryos einschließend. Durch das Ausführen dieses Verfahrens wird das Wachstum der embryogenen Zellen angereichert, was den Prozess der somatischen Embryobildung und nachfolgenden Pflanzenregeneration beschleunigt.
  • Es wurde beobachtet, dass das Explantmaterial, das von Pflanzen genommen wurde, die aus klonalem Explantgewebe gezogen wurden, ein verstärktes embryogenes Potential aufwies verglichen mit Explantmaterial, das aus klonalem Explantgewebe genommen wurde, das nicht für die Produktion embryogener Zellen kultiviert wurde. Es wurde beobachtet, dass dieser Anstieg des embryogenen Potentials sich nach zwei oder mehr aufeinander folgenden Initiierungs-, Kultur- und Pflanzenregenerationszyklen erhöht (z.B. klonale Pflanze → Explant → embryogene Kulturinitiierung → somatischer Embryo → aus somatischem Embryo abgeleitete Pflanze → Explant). Es ist nicht notwendig, eine somatische Embryo abgeleitete Pflanze als die Quelle des Explants zu verwenden; somatische Embryos oder sogar embryogene Kulturen, die in neues Medium transferriert wurden, werden auch neue somatische Embryos mit erhöhtem embryogenem Potential produzieren. Solches Explantmaterial wird bequem als in vitro Auxilaraustriebkulturen gehalten werden, die als die Quelle für vegetative Explante dienen; jedoch sind auch andere Verfahren der Pflanzenhaltung auch akzeptabel.
  • Keimung und Pflanzenwachstum
  • Somatische Embryos, die aus den oben beschriebenen Kulturen erhalten wurden, lässt man danach zu Weinpflänzchen gemäß Standartverfahren keimen. Zum Beispiel werden somatische Keimungsmediums (Embryos auf die Oberfläche eines z.B. MS Medium) in sterilen Petrischalen platziert. Die Kulturen, die die Embryos enthalten, werden in einer Wachstumskammer unter Hellbedingungen (16-stündige Photoperiode) inkubiert. Während der Keimung taucht die Wurzel auf und das Epicotyl beginnt zu wachsen. Wenn Weinpflänzchen, die auf Keimungsmedium gezogen werden, eine ausreichende Größe erreichen (1 cm mit mindestens zwei Blättern), können sie aus den Kulturschalen entfernt werden und in eine sterilisierte Tonmischung gepflanzt werden. Pflänzchen werden typischerweise in Aufzugskontainer in eine erdlose Tonmischung transferiert (z.B. Vermiculit, Perlit oder ProMixTM, V. J. Growers, Apopka, FL). Wenn gewünscht, können Pflänzchen in eine Wachstumskammer oder eine Gewächshaus-Feuchtigkeitskammer platziert werden und werden unter Bedingungen mit hoher Luftfeuchtigkeit (90% Feuchtigkeit) für das Pflänzchenwachstum und die Akklimatisierung inkubiert. Danach können akklimatisierte Pflänzchen nach draußen in einen Weingarten oder ein Gewächshaus tranferriert werden.
  • In einem Beispiel beschreiben wir die Produktion einer mehrjährigen embryogenen Kultur von Vitis vinifera cv. "Thompson Seedless." Pflanzenabgeleitete Mutterkulturen wurden aus einem Blatt erhalten, das oberflächendesinfiziert wurde und in ein Kulturinitiierungsmedium inokuluiert wurde, das von Nitsch (1968) beschrieben wurde und durch Gray D. J. ("Somatic Embryogenesis in Grape." In: Somatic embryogenesis in woody perennials, Vol. 2, Gupta P. K., Jain S. M. und Newton R. J. (Hrg.), Kluwer Academic. Dordrecht, The Netherlands, S. 191–217, 1995) modifiziert wurde. Das Medium enthielt ungefähr 1.1 mg/L 2,4-D und ungefähr 0.05 mg/L BA. Nach dem Explantieren des Gewebes wurden die Kulturbehälter für sechs Wochen in vollständiger Dunkelheit inkubiert. Es wurde beobachtet, dass das meiste des explantierten Gewebes innerhalb dieser sechs Wochenperiode eine Masse undifferenzierter hoch-vakuolisierter Zellen bildete. Embryogene Kulturen, die durch ihre kompakte Natur und das Vorliegen von Zellen identifiziert wurden, die reich an Cytoplasma waren, wurden wiederholt subkultiviert. Die resultierende Kultur wurde durch das oben beschriebene Selektionsverfahren erhalten, gefolgt von Subkultivierung (für ungefähr 6 Wochen), bis genug embryogene Kultur verfügbar war. Ein somatischer Embryo, der ursprünglich aus der Mutterpflanze erhalten wurde (d.h., Embryo der ersten Generation), wurde zum Keimen gebracht, und seine Austriebsspitze wurde verwendet, um eine in vitro Mikrovermehrungskultur zu schaffen. Blätter aus der Pflanze, die aus der Kultur abgeleitet wurden, wurden dann verwendet, um eine neue embryogene Kultur zu produzieren (zweite Generation). Ein somatischer Embryo, der aus der Kultur erhalten wurde, wurde in ähnlicher Weise verwendet, um die dritte Generation zu schaffen. Die embryogene Reaktion von Vitis vinifera cv. "Thompson Seedless" aus durch in vitro Mikrovermehrungskultur abgeleiteten Blättern wird in Tabelle 2 dargestellt (siehe unten). Diese Ergebnisse zeigen den Vergleich von Blättern aus getopften von Mutterpflanzen abgeleiteten Kulturen mit Blättern von Pflanzen, die aus Kulturen abgeleitet werden, die aus gekeimten somatischen Embryos der dritten Generation erhalten wurden. Tabelle 2
    Kulturherkunft Anzahl der kultivierten Blätter Anzahl der embryogenen Kulturen % Antwort pro Blatt
    Mutterpflanze 195 0* 0
    Somatischer Embryo der dritten Generation 200 14 7#
    * Andere Experimente resultierten in einer embryogenen Kultur. # Die Reaktion pro Blatt betrug 30%.
  • Zusätzlich wurden auch mehrjährige embryogene Kulturen von anderen Weinpflanzen mit den hier beschriebenen Verfahren produziert, was einschließt: Viris longii, Vitis rotundifolia (cv. Carlo und Dixie), Vitis rupestris, Vitis vinifera (cv. Autumn Seedless, Cabernet Sauvignon, Cabernet Franc, Chardonnay, Dolcetto, Gamay Beaujolais, Lambrusco, Pinot Noir. Semillon, Tokay, Weißer Riesling, Zinfindel, und ähnliche), und zahlreiche Vitis Hybride (cv. Blanc du Bois, Niagara Seedless, Seyval Blanc, Stover, Southern Home und ähnliche).
  • Produktion von hoch-embryogenen Weinpflanzenzellen mit einer flüssigen Suspension- oder Festkultur
  • Es wurde auch ein Verfahren für die Produktion von großen Mengen von somatischen Weinpflanzenembryos mit entweder einer flüssigen Zellsuspensionskultur oder einem Festkultursystem entwickelt. Diese Verfahren sind auch besonders nützlich für das Produzieren von hoch embryogenen Zellen, die in der Lage sind, sich in ganze Pflanzen zu regenerieren. Unten wird ein einfaches Protokoll für die effiziente somatische Embryogenese von Weinstock mit entweder einer flüssigen Zellsuspensionkultur oder einem festen Kultursystem dargestellt.
  • Im Allgemeinen schließt das Verfahren einen Multiphasenkultivierungsprozess ein, der typischerweise (i) Kulturinitiierung; (ii) Identifikation und Isolierung von embryogenen Zellen oder embryogenen Zellmassen; (iii) Produktion von mehrjährigen embryogenen Kulturen; und (iv) Konzentration der hoch embryogenen Zellcluster involviert. Das Verfahren involviert die folgenden Schritte.
  • Explantgewebe wird auf eine geeignetes Kulturinitiierungsmedium platziert, wie hierin beschrieben wird. Nach ungefähr sechs Wochen auf Kulturinitiierungsmedium werden embryogene Zellen und embryogene Zellmassen identifiziert. Sobald embryogene Kulturen identifizert sind, die weniger als 1 mm Durchmesser haben können, werden sie isoliert und auf frischem Initiierungsmedium kultiviert, j das Wachstum anzuregen, wie hier beschrieben wird. Subkultivieren der embryogenen Kulturen resultiert typischerweise in der Bildung von somatischen Embryos. Embryogene Kulturen und somatische Embryos in frühem Stadium, die von diesen Kulturen erhalten wurden, werden weiter in einem geeigneten flüssigen Pflanzanzuchtsmedium kultiviert. Zum Beispiel, das Nährmedium für Pflanzengewebekultur bestehend aus B-5 Medium (Gamborg et al., Exp. Cell. Res. 50: 151–158, 1968; Sigma Chemicals, St. Louis, MO), das wie durch DeWald et al. al. (J. Amer. Soc. Hort. Sci. 114: 712–716, 1989) und Litz et al. ("Somatic embryogenesis in mango," 1995, siehe oben) beschrieben wurde, modifiziert wurde. Das modifizierte Medium besteht aus Den B-5 Hauptsalzen, MS Nebensalzen und Vitaminen, Glutamin (ungefähr 400 mg/L), und Saccharose oder kommerziellem Tafelzucker (ungefähr 60 g/L). Vor dem Autoklavieren wird der pH des Mediums auf ungefähr 5.8 eingestellt. Obgleich 2,4-D (ungefähr 0.5–2.0 mg/L) der bevorzugte in diesem Medium verwendete Wachstumsregulator ist, können andere Wachstumsregulatoren wie zum Beispiel Dicamba, Picloram, NOA, oder 2,4,5-Trichlorophenoxessigaäure, auch bei geeigneten Konzentrationen verwendet werden, zum Beispiel, den oben beschriebenen. Flaschen, die die embryogenen Zellkulturen, somatischen Embryos, oder beide, enthalten, werden danach bei ungefähr 26°C auf einem Rotationsschüttler bei 125 upm in Dunkelheit oder diffusem Licht inkubiert. Die Kulturen werden dann, wie hier beschrieben, subkultiviert, typischerweise einmal alle zehn bis vierzehn Tage, aber die genaue Subkultivierungsverfahren können abhängig von dem Wachstum und der Vermehrung der embryogenen Zellcluster variieren.
  • Innerhalb von ungefähr sechs bis acht Wochen wird eine feine Zellsuspension produziert, die aus hoch vaktuolisierten länglichen Zellen (nicht embryogenen Zellen), und aus eine geringeren Anzahl von kleinen, zytoplasmareichen isodiametrischen Zellen (embryogenen Zellen) besteht. Sobald genügend Kultur produziert ist, können die differenzierten Embryos aus der Kultur durch Sieben entfernt werden, und die differenzierten Embryos werden verworfen. Es wurde gefunden, dass kontinuierliche Haltung der gesiebten embryogenen Zellsuspensionskultur in modifiziertem B-5 Flüssigmedium begleitet von periodischen Subkultivierungen die Biomasse der embryogenen Zellcluster erhöht.
  • Nach ungefähr zwölf bis sechzehn Wochen wird eine große Masse hoch konzentrierter embryogener Weinzellen typischerweise beobachtet. Die Zeit, die für die Konzentration der embryogenen Zellen oder embryogenen Zellmassen benötigt wird, kann abhängig von zahlreichen Faktoren, was die Sorte, den Genotyp und die Kulturbedingungen einschließt, variieren. Embryogene Zellen in diesem Stadium sind in praktisch jedem Typ von genetischem Transformationsverfahren besonders nützlich. Diese embryogenen Zellen können auch induziert werden gemäß irgendeinem Standartverfahren in somatische Embryos zu differenzieren, z.B. durch Kultivieren der Zellen in modifiziertem B-5 Flüssigmedium ohne Wachstumsregulatoren für eine Periode von ungefähr vier bis sechs Wochen. Alternativ, können die somatischen Embryos im frühem Stadium in Medium platiert werden, das durch die Zugabe eine geeigneten Gelierungsagens, wie Gellan Gum, Agarose, Agar oder jedem ähnlichen Agens zu weiteren Differenzierung der somatischen Embryos in vollständiger Dunkelheit verfestigt wurde. Wenn gewünscht können Embryos des Torpedo/Cotyledonen Stadiums individuell auf einem Standartreifungsmedium subkultiviert werden, z.B. einem Reifungsmedium bestehend aus MS Nährformulierungen. Reife somatische Embryos werden dann in eine Wachstumskammer zur Keimung, und zur Regeneration zu Pflanzen in einem geeigneten Behälter transferiert. Die Häufigkeit der Bildung somatischer Embryos mit diesem Verfahren ist typischerweise hoch.
  • Es folgt nun eine Beschreibung der Ergebnisse für die Produktion von embryogenen Zellen und Zellmassen, die aus einer Flüssigkeitssuspensions- und Festkulturen von „Thompson Seedless" und zwei verschiedenen Klonen von Chardonnay, CH 01 und CH 02 erhalten wurden.
  • Asynchrone somatische Embryos von Vitis vinifera cv. "Thompson Seedless" und Chardonnay, CH 01 und CH 02, die von mehrjährigem embryogenen Gewebe erhalten wurden, wurden weiter in einem Flüssigmedium kultiviert, um eine Suspensionskultur von Callusgewebe zu produzieren. Nach ungefähr vierzehn Tagen und nach ungefähr zwei bis drei Subkultivierungen (eine Subkultivierung wurde ungefähr alle vierzehn Tage durchgeführt), wurde ein amorpher, gelblich bis kremigweiß gefärbter Callus produziert. Als Ergebnis der Produktion des Callusgewebes erschienen die Flüssigkulturmedien in dem Gewebekulturflasche als eine dichte Suspension. Mikroskopische Untersuchung offenbarte, dass die Calluszellen länglich und hoch vakuolisiert waren, und keine Anzeichen für embryogene Kapazität aufwiesen. Amorphe Callus vermehrten sich weiter, selbst wenn die somatischen Embryos, die verwendet wurden, um die Kultur zu initiieren, aus der Kultur entfernt wurden.
  • Nach ungefähr sechs Wochen in modifiziertem B-5 Flüssigmedium wurde die Produktion von kleinen Cluster von cytoplasmareichen Zellen als weißen Klumpen beobachtet (1A). Es wurde beobachtet, dass diese embryogenen Massen sich exponentiell vermehrten, und bis an die Kapazitätsgrenze der Flasche innerhalb von ungefähr zehn bis zwölf Wochen wuchsen.
  • Kontinuierliche Haltung dieser embryogenen Massen in einer einzelnen Einheit (d.h. in einer Flasche) ist oft verheerend, da gefunden wurde, dass die Kulturen an Qualität verlieren, und schließlich braun werden. Das Teilen dieser embryogenen Kulturen in kleinere Einheiten während des Subkultivierens hilft dabei, die Biomasse der geteilten Kulturen zu vermehren und zu erhöhen. Es wurde gefunden, dass unter den zwei gestesteten Sorten beide Klone von „Chardonnay" gleich schnell wuchsen und "Thompson Seedless" im Wachstum überholten. Während die embryogenen Masse von „Chardonnay" eine kremigweiße bis gelbliche Farbe besaßen, waren die von "Thompson Seedless" schmutzigweiß oder bräunlich. Zusätzlich schien "Thompson Seedless" gegenüber der Kulturdichte empfindlicher zu sein, da beobachtet wurde, dass die Zellen dunkel wurden, wenn die Kulturdichte nicht korrigiert wurde. Die bevorzugte Kulturdichte war ungefähr 400 mg embryogene Zellen pro 40 mL flüssiges modifiziertes B5 Medium in einer 125 mL Flasche.
  • Somatische Embryoproduktion in Flüssigkultur
  • Embryogene Massen wurden durch einen 960 Micron Nylonsieb passiert und in einem sterilem Becher gesammelt. Es wurde gefunden, dass das Sieben der embryogenen Massen, um Embryogenese in Flüssigkultur zu initiieren, zwei Zwecken dient. Erstens, eine gewisser Grad an Synchronisierung der Embryodifferenzierung wurde erreicht. Zweitens, die Bildung von Abnormalitäten des somatischen Embryos während der Differenzierung, wie Fasciation oder Fusion, wurde vermindert. Nach vier bis sechs Wochen in Flüssigmedium wurden kleine, weiße somatische Embryos in dem globulären oder frühem Herzstadium beobachtet. Sieben der Kulturen in diesem Stadium ermöglichte nicht einen Anstieg der Embryodifferenzierung.
  • Nach ungefähr acht Wochen, waren somatische Embryos Hat sichtbar, und es wurde gefunden, dass ein paar wenige Embryos das Cotyledonen Stadium der Embryoentwicklung erreicht hatten. Sieben der differenzierten Embryos und Kultivieren dieser in einer getrennten Flasche, ermöglichte jedoch eine schnellere Differenzierung, wie auch die Synchronisierung der Embryoentwicklung.
  • Es wurde gefunden, dass sowohl „Chardonnay" Klone CH01 als auch CH02 leicht in somatische Embryos differenzieren. Geeignetes Sieben und Dichteanpassung (durchgeführt durch Kultivieren von ungefähr 1000 mg somatischer Embryos pro 40 mL Medium) stellte größere Synchronisierung und Vereinzelung, wie auch Embryodifferenzierung (1B), sicher. Innerhalb von ungefähr zwölf bis vierzehn Wochen nach Subkultivierung in flüssigem Embryogenesemedium, begannen vereinzelte somatische Embryos grün zu werden und Würzelchen verlängerten sich, was den Einsatz verfrühter Keimung anzeigte (1C).
  • Es wurde gefunden, dass Kulturen von "Thompson Seedless" anfänglich nicht über das Herzstadium in Flüssigkultur hinausgingen. Zusätzlich wurde gefunden, dass die Embryos mehr geclustert sind, was oft in der Bildung von fusionierten somatischen Embryos resultierte. Entfernung der abnormalen Embryos und Verringern der Kulturdichte um die Hälfte resultierte in normaler somatischer Embryogenese in Flüssigkultur. Diese somatischen Embryos erreichten in ungefähr vierzehn bis achtzehn Wochen Reife.
  • Somatische Embryoproduktion in festem Medium
  • Es wurde beobachtet, dass embryogene Zellen oder embryogene Zellmassen, die aus Flüssigkulturen erhalten wurden, schon drei Wochen nach Kulturinitiierung in somatische Embryos differenzieren. Nach vier Wochen Kultur enthüllte mikroskopische Untersuchung auch die Bildung von globulären und herzförmigen somatischen Embryos auf dem Callusgewebe (1D). Die somatischen Embryos waren hyalin, und ähnelten denen eines hyperhydrischen Zustands (1E); jedoch fuhren die Embryos fort zu differenzieren, und es wurde gefunden, dass sie sich in weiteren drei bis vier Wochen in reife somatische Embryos entwickeln. Es wurde beobachtet, dass diese somatischen Embryos einen Suspensor entwickelten (1E). Zusätzlich wurde beobachtet, dass die embryogenen Zellen sich in eine Masse von asynchronen somatischen Embryos entwickeln.
  • Eine der interessanten Beobachtungen aus diesen Experimenten war, dass die Mehrheit der somatischen Embryos als individuelle Einheiten entstanden, und nicht als kleine Klumpen, obwohl es einige wenige Klumpen somatischer Embryos gab. In solchen Fällen reichte die Anzahl der somatischen Embryos von sechs bis zehn in jedem Klumpen, und diese Embryos wurden leicht von dem Callusgewebe getrennt. Embryos, die in dem Cotyledonenstadium vorgefunden wurden, wurden jede Woche isoliert und zur Reifung subkultiviert. Jeder Klumpen einer embryogenen Massen fuhr weiter für mindestens zwölf Wochen somatische Embryos zu produzieren. Embryogene Zellmassen tendierten dazu in festem Medium, enthaltend Gel-Gro (ICN Biochemicals), braun zu werden, aber diese Entfärbung beeinflusst die Lebensfähigkeit der Kultur nicht nachteilig. Ungefähr vier oder fünf Wochen später, begannen die Cluster der somatischen Embryos auf der Oberfläche der braunen embryogenen Zellen oder embryogenen Zellmassen zu erscheinen.
  • Reifung, Keimung und Pflanzenregeneration des somatischen Embryos
  • Drei Reifungsmedien – Mango-Reifungsmedium (Litz et al., „Somatich embryogenesis in mango", 1995, siehe oben); mit Agar verfestigtes Mango-Reifungsmedium (7 g/L); und MS Grundmedium mit 3% Saccharose – wurden untersucht, um ihre Eignung einzuschätzen, Reifung und Pflanzenregeneration des somatischen Embryos voranzutreiben. Unsere Ergebnisse zeigten an, dass ein MS Grundmedium enthaltend 3% Saccharose am effektivsten dabei war, die Reifung, Keimung und Pflanzenregeneration der Embryos, sowohl der Embryos, die aus festem Medium erhalten wurden als auch der vorzeitig keimenden Embryos, die aus Flüssigmediumkulturen erhalten wurden, zu fördern (1D). Obgleich gute Keimung auf Mango-Reifungsmedium mit Agar erfolgte, war die Qualität der Regeneranen nicht so gut wie mit MS Salzen mit 3% Saccharose. Embryos aus den zwei untersuchten Systemen (d.h. flüssige und feste Medien) zeigten untereinander Variationen in Hinblick auf Keimung und Regeneration. Obwohl Embryos in Flüssigkulturen frühzeitig gereift waren, wurde ein Fortsetzen der Keimung in diesen Kulturen nicht beobachtet. Es wurde jedoch gefunden, dass beim Transfer in das Festmedium die Embryos fortfuhren mit dem Keimungsprozess, uns führten zu der Bildung von Weinpflanzen mit einem dichten Wurzelsystem. Weitere Haltung in Flüssigmedium nach der Wurzelbildung führte zu Hyperhydrizität und schließlich war die Pflanzenregeneration aus diesen Embryos vermindert. Entsprechend ist es bevorzugt, dass die somatischen Embryos aus der Flüssigkeit entfernt und in festes Medium transferiert werden sollten, sobald sie vorreif keimen.
  • Langzeitkonservierung von suspensionsabgeleiteten somatischen Weinembryos und Regeneration von Pflanzen
  • Wir haben ein Verfahren zur Langzeitaufbewahrung von somatischen Embryos entwickelt. Reife somatische Embryos aus Suspensionskulturen von „Chardonnay" wurden auf sterilem Filterpapier in einer Sicherheitsbank mit Laminarfluss blotgetrocknet und dann in sterilen Petrischalen bei 6°C aufbewahrt. Proben wurden von diesen Schalen periodisch entnommen und auf MS Medium mit 3% Saccharose zum Keimen gebracht. Keimung (d.h. das Auftauchen von Wurzeln aus dem somatischen Embryo) und Pflanzenregeneration wurden aufgezeichnet. Tabelle 3 zeigt die Daten von Klon CH 02 nach 22 Monaten in Aufbewahrung, und Tabelle 4 zeigt die Daten von Klon CH 01 nach 5 Monaten in Aufbewahrung. Tabelle 3
    Versuchsnummer Anzahl der Embryos Anzahl der gekeimten Embryos (Prozentsatz der gekeimten Embryos) Anzahl der Pflanzen Ausbeute in Prozent
    1 87 81 (93.1) 69 79.3
    2 42 40 (95.2) 35 83.3
    3 41 41 (100.0) 30 73.2
    Insgesamt 170 162 (95.3) 134 78.8
    Tabelle 4
    Versuchsnummer Anzahl der Embryos Anzahl der gekeimten Embryos (Prozentsatz der gekeimten Embryos) Anzahl der Pflanzen Ausbeute in Prozent
    1 15 15 (100.0 13 67
    2 15 15 (100.0) 13 86.7
    3 15 13 (86.7) 9 60.0
    4 15 12 (80.0) 7 46.7
    5 15 13 (86.7) 9 60.0
    6 15 11 (73.3) 9 60.0
    7 15 15 (100.0) 14 93.3
    8 15 13 (86.7) 9 60.0
    Insgesamt 120 107 (89.2) 83 69.2
  • Direktes Aussähen der aus Suspensionskultur abgeleiteten somatischen Weinstockembryos
  • „Chardonnay" und „Thompson Seedless" somatische Weinstockembryos werden aus Flüssigkulturen, wie hier beschrieben, produziert. Suspensions abgeleitete reife somatische Embryos werden in der Laminarfluss-Sicherheitsbank kurz blotgetrocknet und direkt in Magentabehältern zum Keimen gebracht, die eine der folgenden Topfmedien enthalten: i) Sand; II) ProMixTM kommerzielles Topfmischung (CPM); oder CPM, das mit Sand bedeckt wurde. Jedes Gefäß, das 20 mL destilliertes Wasser und das Topfmedium enthält, wurde durch Autoklavieren für 30 Minuten sterilisiert und über Nacht vor dem Inokulieren der somatischen Embryos abgekühlt. Drei somatische Embryos wurden in jedes Gefäß platziert. Das Aussehen wurde unter aseptischen Bedingungen durchgeführt und die Container wurden geschlossen und bei 26°C mit einer 16-stündigen Photoperiode bei 75 μmol s–1 m–2 Lichtintensität inkubiert. Die Resultate enthüllten, dass CPM, das mit Sand bedeckt wurde, ideal für die Pflanzenentwicklung war. Obgleich Sand die Keimung mehr förderte, waren die resultierenden Pflanzen chlorotisch und ihre Überlebensrate war gering. Es gab mehr Kontamination von somatischen Embryos auf reinem CPM. Die vorliegende Studie öffnet den Raum für die Vervielfältigung von Weinpflanzen unter Verwendung von Suspensionskulturen in großem Maßstab und schafft die Basis für das Ziehen von somatischen Embryos in Bioreaktoren.
  • Die oben beschriebenen experimentellen Ergebnisse wurden unter Verwendung der folgenden Techniken durchgeführt.
  • Kulturinitiierung
  • Embryogene Kulturen wurden aus Antheren und Ovarien der Sorte „Chardonnay" (CH 01 und CH 02) initiiert, und aus den Blättern der Sorte „Thompson Seedless" gemäß Standartverfahren, z.B. denjenigen, die hier beschrieben sind. Somatische Embryos dieser Kulturen, die in modifiziertem MS Medium initiiert und gehalten wurden, wurden verwendet, um flüssige Zellsuspensionskulturen zu initiieren. Typischerweise sind diese Kulturen hoch asynchron bei der embryonalen Entwicklung und Differenzierung, so dass jedes Inoculum aus somatischen Embryos in vielen Entwicklungsstadien bestand.
  • Etablierung von Flüssigkulturen aus differenzierten somatischen Embryos
  • Die Zusammensetzung des Flüssigmediums war von dem Medium, das durch Litz et al., siehe oben, beschrieben wurde, wie folgt angepasst worden. Callusinduktion wurde durch die Zugabe von 1 mg/L 2,4-D in das Medium erreicht. Der pH des Mediums wurde auf ungefähr 5.8 angepasst, und es wurde in 40 mL Aliquots in 125 mL Erlenmeyerkolben verteilt. Die Flaschen wurden mit hochstabiler Aluminiumfolie vor dem Autoklavieren bedeckt. Nach dem Abkühlen wurde ungefähr ein Gramm des somatischen Embryos in das Flüssigmedium mit einem sterilisierten Spatel unter aseptischen Bedingungen transferiert. Der Hals der Flasche wurde mit Parafilm verschlossen, und die Kulturen wurden dann im Halbdunkel (diffusem Licht) auf einem Rotationsschüttler bei ungefähr 120 upm inkubiert. Die Kulturen wurden mindestens einmal alle zwei Wochen subkultiviert.
  • Flaschen, die die Suspensionkulturen enthielten, wurden aus dem Kreisschüttler entfernt, und den Kulturen wurde ermöglicht, sich für ungefähr 15 Minuten zu setzen. Der Überstand wurde vorsichtig in eine sterile Flasche dekantiert, was die embryogene Zellen in einem Minimalvolumen ließ (ungefähr 5 mL). Ungefähr 35 mL frisches Flüssigmedium wurde den embryogenen Zellen hinzugefügt und schnell verwirbelt. Der gesamte Inhalt der Flasche wurden in eine sterile 125 mL Flasche transferiert. Diese zweite Flasche, die die embryogenen Zellen enthält, wurde dann mit Parafilm versiegelt und in den Kreisschüttler zurückgebracht.
  • Die amorphen Callus, die aus den somatischen Embryos erzeugt wurden, wurden wie folgt gesammelt. Die embryogene Suspension, die die differenzierten somatischen Embryos und Callus beinhaltet., wurde ermöglicht sich in den Flaschen zu setzen. Ungefähr die Hälfte des Mediumüberstandes wurden dekantiert, und der Rest wurden verwirbelt und schnell durch ein vorsterilisiertes Nylonsieb (960 Micron) filtriert, das über einem 150 mL Becherglas platziert war. Während die differenzierten somatischen Embryos in dem Sieb zurückgehalten wurden, wurde der feine Callus, der zusammen mit dem flüssigen Medium hindurchtrat, in dem Becherglas gesammelt. Der Callus, der dann in dem Becherglas gesammelt wurde, wurde als nächstes durch ein steriles doppelt gefaltetes Kimwipe filtriert, das über einem sterilem Trichter platziert war. Die amorphen Callus, die an dem Kimwipe hefteten, wurde danach von dem Kimwipe mit einem sterilisiertem Spatel entfernt, und in frischem flüssigen Kulturmedium resuspendiert. Ungefähr 100 mg der Callus wurden in jede Flasche verbracht. Diese Flüssigkulturen wurden, wie hier beschrieben, ungefähr einmal alle vierzehn Tage in modifiziertem B-5 Flüssigmedium, das 2,4-D enthält, subkultiviert.
  • Produktion von somatischem Embryo in Suspensionskultur
  • Embryogene Zellen oder Zellmassen, die in flüssigen Suspensionskulturen initiiert wurden, wurden mit einem 960 Micron Sieb gesiebt, und die feinere Fraktion wurden in flüssigem Embryogenesemedium unter aseptischen Bedingungen geerntet. Die Mediumzusammensetzung war die gleiche, wie die des Initiierungsmediums; jedoch wurde 2,4-D aus dem Medium weggelassen und ungefähr 0.05 mg/L BA wurde hinzugefügt. Nach Anpassen des pH auf 5.8 wurde das Medium als 40 mL Aliquots in 125 mL Erlenmeyerflaschen verteilt, mit Aluminiumfolie bedeckt und autoklaviert. Ungefähr 100 mg Callus wurde in jeder Flasche kultiviert. Die Kulturen wurden im Halbdunkel bei 25°C auf einem Rotationsschüttler bei 120 upm gehalten und einmal alle 14 Tage subkultiviert. Sieben der Kulturen wurde nach Bedarf vorgenommen, um die die differenzierten somatischen Embryos zu synchronisieren. Feinere Siebgrößen (z.B. 520 Micron Siebe) können, falls notwendig, auch eingesetzt werden.
  • Keimung der somatischen Embryos aus Suspensionskulturen und Regeneration
  • Grünende somatische Embryos mit länglichen Würzelchen wurden aus den Suspensionskulturen gesiebt. Somatische Embryos wurden individuell gepickt und kultiviert. Drei verschiedene Medien – Mangoreifungsmedium (Litz et al., "Somatic embryogenesis in mango", 1995, siehe oben), mit Agar (7 g/L) statt Gel-Gro verfestigtes Mangoreifungsmedium, und MS Grundmedium mit 3% Saccharose – wurden auf Keimung und Pflanzenregeneration getestet. Pflanzenwachstumsregulatoren wurden aus diesen Medienpräparationen weggelassen. Fünfundzwanzig Embryos wurden in jeder Standartpetrischale kultiviert, und acht Schalen jedes Mediums wurden getestet. Nach Versiegeln mit Parafilm wurden die Kulturen in einer Wachstumskammer mit einer 16 Stunden Photoperiode inkubiert. Pflänzchen mit vier echten Blättern wurden danach in Erde transferiert.
  • Produktion von somatischem Embryo in Festmedium
  • Embryogene Zellen und embryogene Zellmassen, die in Suspensionskulturen produziert wurden, wurden, wie oben beschrieben, geerntet und dann in festes Embryogenesemedium transferiert. Das Medium bestand aus den gleichen Verbindungen wie das flüssige Embryogenesemedium, und war mit 2.0 g/L Gel-Gro oder 7 g/L Agar verfestigt. Ungefähr 50 mg Callus wurde als ein Klumpen auf eine mediumenthaltende Petrischale platziert und jede Schale besaß zwei solcher Klumpen. Nach dem Inoculieren wurden die Petrischalen mit Parafilm versiegelt und in vollständiger Dunkelheit inkubiert. Das Subkultivieren wurde durchgeführt, nach dem Differenzierung des somatischen Embryos beobachtet wurde. Somatische Embryos, die von den embryogenen Zellen oder embryogenen Zellmassen produziert wurden, wurden wöchentlich gezählt, beginnend nach sechs Wochen Kultur. Embryos der Cotyledonen Stadiums wurden gezählt und zur Reifung subkultiviert.
  • Reifung und Keimung von somatischen Embryos aus Festmedium
  • Reife somatische Embryos, die ungefähr 5 mm lang waren, wurden aus der asynchronen Masse isoliert und auf Reifungsmedium kultiviert. Fünfundzwanzig reife somatische Embryos wurden in jeder Standartpetrischale auf MS Medium mit 3% Saccharose kultiviert. Die Kulturen wurden im Dunklen gehalten, bis sie keimten. Nach Verlängerung der Keimwurzel wurden sie in Licht bei einer 16 Stunden Photoperiode transferiert. Pflänzchen mit mindestens vier echten Blättern wurden danach in Erde transferiert.
  • Selektion von krankheitsresistenten embryogenen Weinstockzellen und -pflanzen
  • Die mehrjährigen embryogenen Weinkulturen der Erfindung können für die Selektion oder das Screenen nach Weinzellen verwendet werden, die gegenüber toxischen Substanzen resistent sind, wie den Substanzen, die durch Pflanzenpathogene produziert werden. Solche Pathogene schließen, ohne Beschränkung, Bakterien, Mycoplasmen, Pilze, Insekten, Nematoden, Viren und Viroide ein. Pflanzenkrankheiten, die durch diese Pathogene verursacht werden, werden in den Kapiteln 11–16 von Agrios, Plant Pathology, 3te A., Academic Press, Inc., New York, 1988 beschrieben. Beispiele für bakterielle Pathogene schließen, ohne Beschränkung, Agrobacterium vitis, Agrobacterium tumefaciens, Xylella fastidosa, und Xanthomonas ampelina ein. Beispiele für Pilzepathogene schließen, ohne Beschränkung, Uncinula necator, Plasmopara viticola, Botrytis cinerea, Guignardia bidwellii, Phomophsis viticola, Elsinoë ampelina, Eutypa lata, Armillaria mellea, und Verticllium dahliae ein. Beispiele für pathogene Nematoden schließen ohne Beschränkung Wurzelknoten-Nematoden (zum Beispiel, Meloidogyne sp.), Zysten-Nematoden (zum Beispiel, Heterodera sp), Wurzel angreifende Nematoden (zum Beispiel, Rotylenchulus reniformis), und oberirdische Nematoden (zum Beispiel, Anguina funesta) ein. Beispiele für pathogene Schädlinge schließen ohne Beschränkung (z.B., Insekten) Phylloxera, Coleoptera, Lepidoptera, Homoptera, Dermptera, und ein. Beispiele für vitale Pathogene schließen ohne Beschränkung „grapevine fanleaf virus" und „grapevine leafroll virus" ein.
  • Durch Exponieren der embryogenen Kulturen gegenüber einem rohen Kulturfiltrat oder einem aufgereinigtem Toxin, das von einem Pflanzenpathogen erhalten wurde, können resistente Weinzellen, selektiert und vermehrt werden. Weinzellen, die den Selektionsdruck überleben, werden erwartungsgemäß nicht nur dem Selektionstoxin, sondern auch der ursprünglichen Mikrobe gegenüber resistent sein, die das Toxin produziert. Darüber hinaus kann, wegen der Dynamiken des Selektionsprozesses, induzierte Resistenz auch gegen eine Reihe von krankheitsverursachenden Organismen über die ursprünglichen für die Selektion verwendete Mikrobe hinaus funktionieren. Da die Selektion auf dem zellulären Level ausgeführt wird, ist es wahrscheinlich, das Weinpflanzen, die von den Zellen regeneriert wurden, die selektierten Eigenschaften zeigen. Insbesondere ermöglicht dieses System einem Fachmann auf die gewünschte Eigenschaft aus unter tausenden von Zellen in einer einzigen Kulturflasche oder Petrischale hin zu selektieren oder screenen.
  • Weinstockkrankheiten
  • Zahlreiche Mikroben attackieren Weinstöcke und verursachen eine Vielzahl von Krankheiten. Diese Krankheiten schließen Pilzkrankheiten von Blättern und Früchten (wie Schwarz-Rot und Anthracnose), Pilzerkrankungen des vaskulären Systems und der Wurzeln (Wie Esca, Schwarze Masern, Schwarzer Toter Arm, und Eutypa-Zurücksterben), bakterielle Krankheiten (wie Kronengalle und die Pierce Krankheit), Krankheiten, die durch Viren und virusähnliche Agenzien verursacht werden (wie Rupestrisstammfraß, „Grapevine Leafroll", und Weinstock-Fächerblatt-Degeneration), wie auch Krankheiten, die durch Nematoden und Mycoplasmen verursacht werden, ein.
  • Eine Krankheit, die Weinstöcke betrifft, ist Antracnose, auch bekannt als Vogelaugenfleckenkrankheit, die durch den Pilz Elsinoë ampelina verusacht wird. Unter günstigen Bedingungen attackiert dieser Pilz fast alle oberirdischen Teile des Weinstocks, einschließlich der Früchte, was großen Schaden an der Frucht erzeugt. Anthracnose bewirkt das Erscheinen von kreisförmigen Läsionen mit braunen oder schwarzen Rändern und runder oder winkeligen Rändern auf der Weinstockpflanze. Das Zentrum der Läsionen wird gräulich-weiß und stirbt schließlich ab und fällt ab, was eine „Einschussloch-" Erscheinung zurücklässt. Die Krankheit betrifft besonders junge Blätter, was die normale Entwicklung verhindert. Neue Triebe sind auch betroffen und nehmen eine offensichtlich verbrannte Erscheinung an. Fruchttrauben sind auch für die Pilzinfektion während ihrer gesamten Entwicklung empfänglich, Läsionen auf den Beeren reichen bis in das Mark, was oft ein Aufbrechen bewirkt. (Pearson und Goheen, Compendium of Grape Disease, APS Press, St. Paul, MN, 1988).
  • Pathogenfiltrat
  • Ein Elsinoë ampelina Kulturfiltrat mit toxischer Aktivität wurde wie folgt hergestellt. Vollstärke Czapekk-Dox Mediumbrühe (Fischer Scientific, Springfield, NJ) wurde durch Auflösen der benötigten Menge des Brühenmischung in entionisiertem Wasser (DI) hergestellt. Das Medium wurde als 50 mL Aliquots in 125 mL Erlenmeyerflaschen verteilt. Nach dem Autoklavieren und Abkühlen, wurden 100 μL einer Elsinoë ampelina Sporensuspension in jede Flasche hinzugefügt (Tag 1); die Flasche wurde dann in einem Rotationsschüttler bei 120 upm für eine Woche im Dunklen inkubiert. Nach einer Woche wurden die Inhalte in jeder Flasche in 100 mL Vollstärke Czapekk-Dox in einem 250 mL Erlenmeyerkolben transferiert und die Inkubation wurde für zwei weitere Wochen fortgeführt. Am Ende dieser Periode (d.h. drei Wochen nach Tag 1), wurde das Pilzkulturfiltrat durch Filtern des Inhalts jeder Flasche durch eine steriles vielschichtiges Käsetuch gesammelt. Das rohe Kulturfiltrat wurden bei –4°C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt, wie zuvor beschrieben wurde (Subramanian, J., „Selection and characterization of resistance in mango (Magnifera indica L.) embryogenic cultures to the phytotoxin produced by Colletotrichum gloeosporiodes, Penz.," Ph. D. Dissertation, University of Florida, Gainesville, 1995).
  • Vor der Zugabe zu den Kulturmedien für die in vitro Selektion, wurde das gefrorene Kulturfiltrat bei Raumtemperatur aufgetaut (ohne Erhitzen), dessen pH auf 5.8 eingestellt, und durch ein 0.2 Micronfilter filtersterilisiert (Nalgene, Rochester, NY). Es wurde gefunden, dass dieses filtersterilisierte Pathogenfiltrat seine toxische Aktivität beibehielt.
  • Selektion
  • Das Elsinoë ampelina Kulturfiltrat wurde als nächstes zu Flüssigsuspensionskulturen von V. vinifera cv. „Chardonnay" embryogenen Zellen und embryogenen Zellmassen in modifiziertem B-5 Medium hinzugefügt, um Zellen mit Resistenz gegen das toxische Pilzkulturfiltrat zu selektieren. Die embryogenen Weinzellen und embryogenen Weinzellmassen wurde wie oben beschrien angezogen; jedoch wurde in dieser in vitro Selektion das Medium, in dem die Zellen gezogen wurden, mit bekannten Volumina von Elsinoë ampelina Kulturfiltrat supplementiert. Geeignete Verdünnungen von Pathogenfiltrat wurden durch Untersuchen der Toxizität des Filtrat unter Verwendung von Verdünnungsreihenanalysen bestimmt. Diese Experimente demonstrierten, dass ein 40% (v/v) Kulturfiltrat für die in vitro Selektion nützlich war.
  • Kulturen von embryogenen „Chardonnay" Zellen und embryogenen „Chardonnay" Zellmassen wurden in Flüssigmedium enthaltend 40% (v/v) Pilzkulturfiltrat bei ungefähr 26°C auf einem Rotationsschüttler (125 upm) bei diffusem Licht gehalten. Subkultivieren wurden einmal alle zehn Tage vorgenommen; während jeder Subkultivierung wurde filtersterilisiertes Kulturfiltrat verwendet, um das Medium zu verdünnen. Selektion mit Kulturfiltrat wurde für vier oder fünf Zyklen von Subkultivierungen (jeder Zyklus = zehn Tage) weitergeführt. Während die meisten der embryogenen Zellen starben, überlebten einige sehr wenige Zellen, oft weniger als 1%, den Selektionsdruck. Resistente Kulturlinien wurden durch Entziehen des Selektionsdruckes nach vier oder fünf Zyklen etabliert und Wachsenlassen der überlebenden Zellen in modifiziertem B-5 Medium ohne Kulturfiltrat etabliert. Dieser resistenten Zellen proliferierten, und somatische Embryos wurden mit den hier beschriebenen Verfahren produziert.
  • Embryogene Zellkulturen, die durch den Selektionsprozess erhalten wurden, wurden danach auf Resistenz gegenüber Elsinoë ampelina unter Verwendung einer Anzahl von in vitro Bioassays getestet. Wir analysierten zuerst, ob die resistenten Weinstocklinien eine Aktivität produzieren, die das Wachstum des Pilzes inhibieren konnte. Für diese Zweck wurde das Kulturmedium (d.h. konditioniertes Kulturmedium) aus einer resisteten Kulturlinie auf eine inhibitorische Aktivität gegen den Pilz getestet. Konditionierte Medien wurden aus verschiedenen Zellkulturen mit Resistenz zu Elsinoë gesammelt und in zahlreichen Konzentrationen verwendet, um Pilzanzuchtsmedien herzustellen. Eine aktiv wachsende Mycelkolonie wurde in das Zentrum einer Petrischale, die ein Pilzanzuchtsmedium enthielt platziert, das mit oder ohne (Kontroll-) konditioniertem Medium aus einer resistenten Weinstockkulturlinie hergestellt war, und unter Standartbedingungen inkubiert. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigten, das das Wachstum des Pilzes durch ein Pilzanzuchtsmedium enthaltend 25% oder mehr konditioniertes Medium inhibiert wurde.
  • Um weiter das Vorliegen einer Antipilz-Aktivität in resistenten Weinstockkulturen zu zeigen, wurden resistente Linien, wie auch Kontrolllinien, in festes Pflanzenanzuchtsmedium in sechs und zwölf Uhr Positionen in Petrischalen platziert, und in Dunkelheit für vier Wochen inkubiert. Nach dieser Periode wurde ein Pfropfen Mycel einer aktiv wachsenden Elsinoë Kolonie in das Zentrum der Petrischalen platziert und unter Standartbedingungen inkubiert. Es wurde beobachtet, dass der Pilz schnell wuchs und die Kontrollkulturen infizierte. Dem gegenüber wurde das Pilzwachstum auf den Schalen, die Weinzellkulturen mit Resistenz gegenüber dem Elsinoë Kulturfiltrat enthielten, inhibiert. Hyphen wuchsen nicht frei durch das Medium in den Schalen, die diese resistenten Kulturen enthielten, verglichen mit dem Pilzhyphenwachstum durch das Medium in Schalen, die Kontrol- (d.h. nicht resitente) Kulturen enthielten. Eine dicke Matte von Mycelium, wie sie in den Schalen, die Kontrollkulturen enthielten, gesehen wurde, wurde nie in den Schalen, die Elsinoë ampelina resistente Kulturen enthielten, gebildet. Diese Fähigkeit der resistenten Kulturen das Wachstum von Elsinoë ampelina zu inhibieren wurde neun Monate nach Selektion beibehalten, was zeigte, dass die genetischen Veränderungen in den resistenten Kulturen stabil waren.
  • Zusätzlich wurden die Weinstockkulturen, die resistent gegenüber Elsinoë ampelina waren, auf Resistenz gegenüber einem zweiten Pilzpathogen, Fusarium oxysporum, getestet. Resistente Linien, wie auch Kontrolllinien, wurden in festem Pflanzenanzuchtsmedium in sechs und zwölf Uhrpositionen in Petrischalen platziert, und bei Dunkelheit für vier Wochen inkubiert. Nach dieser Periode wurden ein Pfropfen Mycel einer aktiv wachsenden Fusarium oxysporum Kolonie in das Zentrum der Petrischalen platziert und bei Raumtemperatur mit einer 16 Stunden Photoperiode inkubiert. Es wurde beobachtet, dass der Pilz schnell wuchs und die Kontrollkulturen infizierte. Dem gegenüber wurde das Wachstum von Fusarium oxysporum auf den Schalen, die Weinzellkulturen mit Resistenz gegenüber dem Elsinoë Kulturfiltrat inhibiert. Hyphen wuchsen nicht frei durch das Medium in den Schalen, die diese resistenten Kulturen enthielten, verglichen mit dem Pilzhyphenwachstum durch das Medium in Schalen, die Kontrol- (d.h. nicht resitente) Kulturen enthielten. Eine dicke Matte von Fusarium Mycelium, wie sie in den Schalen, die Kontrollkulturen enthielten, gesehen wurde, wurde nie in den Schalen, die Elsinoë ampelina resistente Kulturen enthielten, gebildet. Dieses Experiment zeigte, dass die resistenten Weinstockkulturen nicht nur resistent gegenüber Elsinoë ampelina, sondern auch gegenüber resistent Fusarium oxysporum waren.
  • Eine weitere Analyse wurde unternommen, um zu bestimmen, ob die pilzresistenten Weinstockkulturen somatische Embryos erzeugen könnten, die auch resistent gegenüber Elsinoë ampelina waren. Somatische Embryos, die von resistenten Kulturen abgeleitet wurden, und Kontroll- (d.h. nicht resistente) Kontrolle wurden entweder in Medium enthaltend 40% (v/v) Pilzkulturfiltrat oder in Kontrollmedium enthaltend kein Pilzkulturfiltrat gezogen. Während sich somatische Embryos, die von den resistenten Kulturen stammten, normal sowohl indem Pilzkultur enthaltenden Filtrat als auch dem Kontrollmedium bildeten und keimten, wurden somatische Embryos, die von den Kontrollkulturen abgeleitet wurden, nekrotisch und starben schließlich in dem Pilzkulturfiltrat enthaltendem Medium, aber starben nicht in dem Kontrollmedium. Die Nekrose der Kontrolle in dem Pilzkulturfiltrat enthaltenden Medium war rasch genug, um die somatischen Kontrollembryos innerhalb von zweiundsiebzig Stunden der Kulturinitiierung dunkel werden zu lassen. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigten, dass die somatischen Embryos, die von resistenten Zellkulturen erhalten wurden, auch gegenüber dem Pilzfiltrat resistent waren. Weiterhin wurde beobachtet, dass diese resistenten somatischen Embryos einer Konzentration von Elsinoë ampelina Kulturfiltrat widerstehen, die derjenigen gleich war, der ihre resitenten embryogenen Vorläuferzellen und embryogenen Zellmassen widerstanden.
  • Krankheitsresistente Pflanzen
  • Embryogene Kulturen wurden in vitro gegen Pilzkulturfiltrat selektiert, das durch Elsinoë ampelina produziert wurde. Pflanzen wurden aus den selektierten Kulturen regeneriert und in dem Gewächshaus akklimatisiert. Pflanzen aus selektierten Linien und unselektierten Kontrollen wurden mit einer Sporensuspension (1 × 106 Sporen/mL) bis zum Herablaufen besprüht. Die Pflanzen wurden individuelle in Beutel verpackt, um die Feuchtigkeit für 3 Tage zu erhalten (eine Bedingung, die optimal für das Pathogen ist, um die Antracnosekrankheit zu verursachen). Die Beutel wurden dann entfernt und die Pflanzen wurden auf Anthracnosesymptome untersucht. All die unselektierten Kontrollen wiesen einen sehr hohen Grad der Empfänglichkeit auf, und in den meisten Fällen gab es wegen der Krankheit innerhalb von 3 Tag Blattabfall. Unter den 40 verschiedenen Pflanzen aus den zwei selektierten Linien zeigte nur eine Pflanze milde Anthracnosesymptome. Diese Daten zeigten, dass die Resistenz, die durch embryogene Zellen während in vitro Selektion erworben wurde, in eine Resistenz der ganzen Pflanze gegen das Pathogen übersetzt werden kann.
  • Regenerierte Pflanzen können auf Resistenz gegen Anthracnose gemäß Standartverfahren getestet werden. Zum Beispiel werden Sporensuspensionen von Elsinoë ampelina durch Suspendieren der Sporenmassen aus frischen Kolonien des Pilzes in sterilem entionisiertem Wasser (DI) hergestellt und die Sporendichte wird auf 100,000 Sporen/mL unter Verwendung eines Hemocytometers eingestellt. Junge Blätter von im Gewächshaus gezogenen Trieben oder Pflanzen werden gesammelt und vorsichtig mit DI Wasser gewaschen. Auf die Blattlamina wird 100 μL Sporensuspension in einem Punkt platziert und, um die Inokulierung des Pilzes zu ermöglichen, wird ein scharfer Einstich am Zentrum des Punktes gemacht. Mindestens zwei solcher Punkte werden in jedem Blatt gemacht. Die Blätter werden unter feuchten Bedingungen (d.h., idealen Bedingungen für die Entwicklung der Symptome) für mindestens 72 Stunden inkubiert und dann wird eine Läsionsentwicklung, wie zuvor beschrieben beobachtet (Subramanian, J., Ph. D. Dissertation. University of Florida, Gainesville, 1995, siehe oben). Ähnliche Tests mit DI Wasser allein dienen als eine Kontrolle. Zusätzlich werden Blätter von Sorten, von denen bekannt ist, das für sie für Anthracnose emfänglich oder gegen dieser resistent sind, inokuliert, und die Läsionen aus diesen Blättern dienen als ein Standart, um die Empfänglichkeit/Resistenz der regenerierten Pflanzen, die aus in vitro selektierten embryogenen Zellen abgeleitet wurden, einzuschätzen. Aus einer statistischen Analyse dieser Daten, werden die Resistenzniveaus gegen Elsinoë ampelina und Antracnose bestimmt. Weinpflanzen mit einem erhöhten Resistenzniveau gegen Elsinoë ampelina und Anthracnose oder beiden relativ zu Kontrollpflanzen werden als in der Erfindung nützlich seiend angesehen.
  • Weinstocktransformation
  • Das hier beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um transformierte Pflanzen zu produzieren. Zellen können in jedem Schritt des Prozesses des Erzeugens eines abgeleiteten somatischen Embryos transformiert werden. Somit schließen Gewebe und Zellen, die für die Transformation geeignet sind, explantiertes Gewebe, embryogene Zellen, embryogene Zellmassen und somatische Embryos ein (reife somatische Embryos einschließend).
  • Zellkulturen, die gemäß den Verfahren der Erfindung hergestellt wurden, können mit DNA transformiert werden, die ein gewünschtes Transgen umfasst. Solche Zellen können zum Beispiel mit Genen transformiert werden, die Resistenz gegenüber Pathogenen, Krankheiten, oder Schädlingen, oder jeder Kombination davon, vermitteln. Zum Beispiel ist eine Anzahl von Bacillus thurigiensis Genen, die Proteine kodieren, die für eine Anzahl von Schädlingen toxisch sind, wohl bekannt und in den Verfahren der Erfindung nützlich. Zahlreiche Standartverfahren sind für das Einführen eines Transgens in einen Pflanzenwirt verfügbar, mit denen eine transgene Pflanze erzeugt wird. Nach Konstruktion des Pflanzenexpressionsvektors sind zahlreiche Standartverfahren zum Einführen des Vektors in einen Pflanzenwirt verfügbar, wodurch eine transgene Pflanze erzeugt wird. Diese Verfahren schließen ein: (1) Agrobacterium-vermittelte Transformation (A. tumefaciens oder A. rhizogenes) (siehe, z.B., Lichtenstein und Fuller In: Genetic Engineering, vol 6, PWJ Rigby, Hrg., London, Academic Press, 1987; und Lichtenstein, C. P., und Draper, J,. In: DNA Cloning, Vol II, D. M. Glover, Hrg., Oxford. IRI Press, 1985)); (2) das Partikeltransportsystem (siehe, z.B., Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603 (1990); oder BioRad Technical Bulletin 1687, siehe oben); (3) Mikroinjektionsprotokolle (siehe, z.B., Green et al., siehe oben); (4) Polyethylenglycol (PEG) Verfahren (siehe, z.B., Draper et al., Plant Cell Physiol. 23: 451, 1982; oder z.B., Zhang und Wu, Theor. Appl. Genet. 76: 835, 1988); (5) Liposom-vermittelte DNA-Aufnahme (siehe, z.B., Freeman et al., Plant Cell Physiol. 25: 1353, 1984); (6) Elektroporationsverfahren (siehe, z.B., Gelvin et al., siehe oben; Dekeyser et al., siehe oben; Fromm et al., Nature 319: 791, 1986; Sheen Plant Cell 2: 1027, 1990; oder Jang und Sheen Plant Cell 6: 1665, 1994); und (7) das Vortex-Verfahren (siehe, z.B., Kindle, oben). Das Transformationsverfahren ist nicht für die Erfindung kritisch. Jedes Verfahren, das eine effiziente Transformation bereitstellt, kann eingesetzt werden. Wenn neuere Verfahren verfügbar werden, um Früchte oder Wirtszellen zu transformieren, können sie direkt eingesetzt werden.
  • Das folgende ist ein Beispiel, das eine bestimmte Techik skizziert, eine Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation. Bei dieser Technik wird der allgemeine Prozess des Manipulierens von Genen, die in das Genom von Pflanzenzellen transformiert werden sollen, in zwei Phasen ausgeführt. Zuerst werden die Klonierungs- und DNA-Modifikationsschritte in E. coli durchgeführt. Und das Plasmid, das das interessierende Genkonstrukt enthält, wird durch Konjugation oder Elektroporation in Agrobacterium transferiert. Als zweites wird der resultierende Agrobacterium Stamm verwendet, um die Pflanzenzellen zu transformieren. Somit enthält das Plasmid des verallgemeinerten Pflanzenexpressionsvektors einen Replikationsstart, der ihm ermöglicht, in Agrobacterium zu replizieren und einen Replikationsstart für hohe Kopienzahlen, der in E. coli funktionell ist. Dies erlaubt die einfache Produktion und das Testen von Transgenen in E. coli vor dem Transfer in Agrobacterium für die nachfolgende Einführung in Pflanzen. Resistenzgene können auf dem Vektor vorliegen, einer für die Selektion in Bakterien, zum Beispiel, Streptomycin, und ein anderer, der in Pflanzen funktionieren wird, zum Beispiel, ein Gen, das für die Kanamyzin-Resitenz oder eine Herbizidresistenz kodiert. Auch liegen in dem Vektor Restriktions-Endonuclease-Stellen für die Hinzufügung eines oder mehrerer Transgene und direktionaler T-DNA Begrenzungssequenzen vor, die, wenn sie durch die Transferfunktionen von Agrobacterium erkannt werden, die DNA-Region, die in die Pflanze transferiert wird, begrenzen.
  • In einem anderen Beispiel können Pflanzenzellen transformiert werden, indem Wolfram-Mikroprojektile in die Zelle geschossen werden, auf die klonierte DNA gefällt wurde. In dem „Biolistic Apparatus" (Bio-Rad), der zum Schießen verwendet wird, treibt eine Schießpulverladung (Kalbier 22 „Power Piston Tool Charge") oder ein Luftdruckstoß ein Plastik-Makroprojektil durch einen Gewehrlauf. Ein Aliquot einer Suspension von Wolframpartikeln, auf die DNA gefällt wurde, wird auf der Vorderseite des Plastik-Makroprojektils platziert. Letzteres wird auf eine Acrylstopplatte gefeuert, die ein Loch durch sie hindurch besitzt, das zu klein für das Makroprojektil ist, um durch es hindurchzutreten. Im Ergebnis schlägt das Plastikmakroprojektil gegen die Stopplatte, und die Wolfram-Mikroprojektile setzen ihren Weg gegen ihr Ziel durch das Lock in der Platte fort. Für die vorliegende Erfindung kann das Ziel jede Pflanzenzelle, Gewebe, Samen oder Embryo sein. Die DNA, die in die Zelle auf den Mikroprojektilen eingeführt wird, wird entweder in den Nucleus oder den Chlorplasten integriert. Im Allgemeinen sind Transfer und Expression von Transgenen in Pflanzenzellen nur Routinetätigkeiten für den Fachmann, und sind Hauptwerkzeuge geworden, um Genexpressionsstudien in Pflanzen durchzuführen, und um verbesserte Pflanzensorten, die von landwirtschaftlichem und kommerziellem Interesse sind, herzustellen.

Claims (19)

  1. Verfahren zur Produktion einer mehrjährigen embryogenen Weinkultur, besagtes Verfahren umfassend die Schritte: (a) Kultivieren eines Weinexplantatgewebes auf Kulturinitiationsmedium, besagtes Medium enthaltend wenigstens 0.01 mg/L eines Cytokins; wenigstens 0.1 mg/L eines Kohlenhydrats; und wenigstens 0.1 mg einer stickstoffhaltigen Verbindung, (b) Visuelle Identifikation einer embryogenen Zelle oder einer embryogenen Zellmasse aus einer ersten Weinexplantatkultur, wobei besagte visuell identifizierten embryogenen Zellen oder Zellen der embryogenen Zellmasse identifiziert werden, eine weiße bis schwachgelbe Farbe, ein bröckeliges, granuläres Erscheinungsbild zu haben und kompakt und reich an Zytoplasma zu sein, (c) Transferieren besagter visuell identifizierter embryogenen Zellen oder embryogener Zellmasse aus Schritt (b) in eine zweite Kultur; (d) Erlauben, dass sich besagte transferierte embryogenen Zellen oder embryogenen Zellmassen aus Schritt (c) in zusätzliche embryogene Zellen oder embryogene Zellmassen teilen; (e) Visuelle Identifikation einer embryogenen Zelle oder embryogenen Zellmasse aus Schritt (d), wobei besagte visuell identifizierte embryogene Zelle oder Zellen besagter embryogener Zellmasse aus Schritt (d) identifiziert werden, eine weiße bis schwachgelbe Farbe und ein bröckeliges, granuläres Erscheinungsbild zu haben, und (f) Transferieren besagter identifizierter embryogener Zellen oder embryogener Zellmasse aus Schritt (c) in eine dritte Kultur, wodurch eine mehrjährige embryogene Weinkultur erzeugt wird, wobei besagtes Explantat aus Antheren, vegetativen Gewebe, Ranken, Blättern, Wurzeln, Nucellargewebe, Stämmen, Protoplasten, Perizykel, Apikalineristemgewebe, somatischen Embryos erhalten wird.
  2. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin besagtes Explantat ein Explantat einer Art ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alden, Ahneria, Anab-E-Shahi, Autumn Black, Beauty Seedless, Black Corinth, Black Damascus, Black Malvoisie, Black Prince, Blackrose, Bronx Seedless, Burgrave, Calmeria, Campbell Early, Canner, Cardinal, Catawba, Christmas, Concord, Dattier, Delight, Diamond, Dizmar, Duchess, Early Muscat, Emerald Seedless, Emperor, Exotic, Ferdinand de Lesseps, Fiesta, Flameseedless, Flame Tokay, Gasconade, Gold, Himrod, Hunisa, Hussiene, Isabella, Italia, July Muscat, Khandahar, Katta, Kourgane, Kishmishi, Loose Perlette, Malaga, Monukka, Muscat of Alexandria, Muscat Flame, Muscat Hamburg, New York Muscat, Niabell, Niagara, Olivette blanche, Ontario, Pierce, Queen, Red Malaga, Ribier, Rish Baba, Romulus, Ruby Seedless, Schuyler, Seneca, Suavis (IP 365), Thompson seedless, Thomuscat, Aleatico, Alicante Bouschet, Aligote, Alvarelhao, Aramon, Baco blanc (22A), Burger, Cabernet franc, Cabernet, Sauvignon, Calzin, Carignane, Charbono, Chardonnay CH01, Chardonnay CH 02, Chardonnay CH Dijon, Chasselas dore, Chenin blanc, Clairette blanche, Early Burgundy, Emerald Riesling, Feher Szagos, Fernao Pires, Flora, French Colombard, Fresia, Furmint, Gamay, Gewurztraminer, Grand noir, Gray Riesling, Green Hungarian, Green Veltliner, Grenache, Grillo, Helena, Inzolia, Lagrein, Lambrusco de Salamino, Malbec, Malvasia bianca, Mataro, Melon, Merlot, Meunier, Mission, Montua de Pilas, Muscadelle du Bordelais, Muscat blanc, Muscat Ottonel, Muscat Saint-Vallier, Nebbiolo, Nebbiolo fino, Nebbiolo Lampia, Orange Muscat, Palomino, Pedro Ximenes, PetitBouschet, Petite Sirah, Peverella, Pinot noir, Pinot Saint-George, Primitivo di Gioa, Red Veltliner, Refosco, Rkatsiteli, Royalty, Rubired, Ruby Cabernet, Saint-Emilion, Saint Macaire, Salvador, Sangiovese, Sauvignon blanc, Sauvignon gris, Sauvignon vert, Scarlet, Seibel 5279, Seibel 9110, Seibel 13053, Semillon, Servant, Shiraz, Souzao, Sultana Crimson, Sylvaner, Tannat, Teroldico, Tinta Madeira, Tinto cao, Touriga, Traminer, Trebbiano Toscano, Trousseau, Valdepenas, Viognier, Walschriesling, White Riesling, Zinfandel, Couderc 1202, Couderc 1613, Couderc 1616, Couderc 3309 (Vitis riparia X rupestris), Dog Ridge, Foex 33 EM, Freedom, Ganzin 1 (A × R #1), Harmony, Kober 5BB, LN33, Millardet & de Grasset 41B (Vitis vinifera X berlandien), Millardet & de Grasset 420A, Millardet & de Grasset 101-14 (Vitis riparia X rupestris), Oppenheim 4 (SO4), Paulsen 775, Paulsen 1045, Paulsen 1103, Richter 99, Richter 110, Riparia Gloire, Ruggeri 225, Saint-George, Salt Creek, Teleki 5A, Vitis rupestris Constantia, Vitis california und Vitis girdiana, Vitis rotundifolia, Vitis rotundifolia Carlos, Teleki 5C (Vitis berlandieri X riperia), 5BB Teleki (Selektion Kober, Vitis berlandieri X riperia), SO4 (Vitis berlandeieri X rupestris) und 039-16 (Vitis vinifera X Muscadinia).
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Produktion eines somatischen Weinembryos, weiterhin umfassend die Schritte: (g) Erlangen einer embryogenen Zelle aus besagter mehrjährigen embryogenen Weinkultur; (h) Transferieren besagter embryogener Zelle in eine neue Kultur und (i) Heranzüchten eines somatischen Weinembryos aus besagter embryogener Zelle.
  4. Das Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei besagte Kultur in Schritt (h) ein flüssiges Medium ist.
  5. Das Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei besagte Flüssigkultur B5 Hauptsalze und MS Nebensalze umfasst.
  6. Das Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei besagte Kultur in Schritt (h) ein festes Medium umfasst.
  7. Das Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei besagte Kultur in Schritt (h) ein Medium umfasst, das einen Planzenwachstumsregulator enthält.
  8. Das Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei besagter Planzenwachstumsregulator ein Auxin, NOA, Dicamba, Picloram, NAA, IAA, 2,4-D, ein Cytokinin, Benzyladenin, Zeatin, Thidiazuron, Abscisinsäure oder Gibberilinsäure ist.
  9. Das Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Erlangen besagte embryogener Zelle aus besagter Kultur in Schritt (g) Filtration, Sedimantation oder Selektion umfasst.
  10. Das Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei besagte Flüssigkultur gesiebt wird, um die Formation von differenzierten somatischen Weinembryonen zu synchronisieren.
  11. Das Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei besagte embryogene Zelle oder Zellmasse mit DNA transformiert wird.
  12. Das Verfahren gemäß Anspruch 3, weiterhin umfassend das Heranzüchten einer Weinpflanze aus dem somatischen Weinembryo.
  13. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Selektion eines somatischen Weinembryos, der resistent gegenüber einem Pflanzenpathogen ist, weiterhin umfassend die Schritte: (g) Kultivieren der mehrjährigen embryogenen Zellkultur aus Schritt (f) in einem ersten Flüssigkulturmedium, um eine zelluläre Suspensionskultur zu produzieren, besagtes erstes Flüssigkulturmedium umfassend einen Pflanzenwachstumsregulator und ein Filtrat aus einer pflanzenpathogenen Kultur, wobei besagtes Filtrat oder ein aufgereinigtes Toxin aus einem Virus, Nematoden, Insekt, Pilz, Mycoplasma oder Bakterium erhalten wird; (h) Erlangen einer Weinzelle oder eines Weinzellclusters aus besagter zellulären Suspensionskultur; (i) Kultivieren besagter Weinzelle oder besagten Weinzellclusters in einem zweiten Flüssigkulturmedium, um einen somatischen Weinembryo zu produzieren und (j) Erlangen besagten somatischen Weinembryos, der eine Resistenz gegenüber besagten Pflanzenpathogen aufweist.
  14. Das Verfahren gemäß Anspruch 13, weiterhin umfassend das Transferieren besagten somatischen Weinembryos in ein Germinationsmedium, um eine Weinpflanze heranzuzüchten.
  15. Das Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei besagter Virus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Grapevine Fanleaf Virus, Rupestris Stem Pitting Virus und Grapevine Leafroll Virus.
  16. Das Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei besagter Nematode ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Root-Knot Nematode, ein Zystennematode, ein wurzelangreifender Nematode und ein Übergrund-Nematode.
  17. Das Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei besagtes Insekt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phylloxera, Coleoptera, Lepidoptera, Homoptera, Dermptera, und Diptera.
  18. Das Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei besagter Pilz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Uncinula necator, Plasmopara viticola, Botrytis cinerea, Guignardia bidwellii, Phomophsis viticola, Elsinoe ampelina, Eutypa lata, Armillaria mellea, und Verticllium dahliae.
  19. Das Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei besagtes Bakterium ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Agrobacterium vitis, Agrobacterium tumefaciens, Xylella fastidosa, und Xanthomonas ampelina.
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