CN110024689A - 超低温脱除葡萄卷叶病毒-3方法及用途 - Google Patents

超低温脱除葡萄卷叶病毒-3方法及用途 Download PDF

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Abstract

本说明书实施例提供了一种超低温脱除葡萄卷叶病毒‑3方法及用途。所述方法包括以下步骤：取葡萄枝条单茎段，消毒杀菌后，继代在初代培养基上培养，将腋芽萌发的茎段继代到增殖培养基上培养，取含有5‑6片叶原基的茎尖栽到预培养基上，黑暗培养；将经过预培养基培养的茎尖在加载液中处理，之后，置于冰上，然后制成小滴；将冷冻保护剂包裹的茎尖放入液氮中，之后转移到卸载液中，进行解冻和卸载；将解冻后的茎尖移栽到恢复培养基上进行黑暗培养，得到不带葡萄卷叶病毒‑3的植株。

Description

超低温脱除葡萄卷叶病毒-3方法及用途
技术领域
本说明书一个或多个实施例涉及植物组培技术领域，尤其涉及超低温脱 除葡萄卷叶病毒-3方法及用途。
背景技术
葡萄卷叶病(Grapevine leafroll disease)是一种对葡萄具有严重危害 的的病毒病。会导致葡萄植株长势减弱，根系发育不良，抗逆性减弱，易受 冻害；枝蔓嫁接成活率显著降低，生根能力差。
现已研究表明引起葡萄卷叶病的病毒不止一种，其中葡萄卷叶病毒 -3(GLRaV-3)是最主要的一种。因此，亟需一种可以脱除葡萄卷叶病毒-3的方 案。
发明内容
本说明书一个或多个实施例描述了一种超低温脱除葡萄卷叶病毒-3方法 及用途，可以有效脱除葡萄卷叶病毒-3。
根据第一方面，提供了一种超低温脱除葡萄卷叶病毒-3方法，包括以下 步骤：
步骤(1)，取葡萄枝条单茎段，消毒后，移栽到初代培养基上培养，得 到腋芽萌发的茎段；其中，所述初代培养基的基础培养基为MS培养基，且在 每升MS培养基添加25-35g蔗糖；所述葡萄枝条为感染有葡萄卷叶病毒-3的 葡萄枝条；
步骤(2)，将腋芽萌发的茎段栽种到增殖培养基上培养，得到含有5-6 片叶原基的茎尖；其中，所述增殖培养基为培养基；
步骤(3)，将含有叶原基的茎尖移栽到预培养基上，黑暗培养；其中， 所述预培养基的配方包括0.4M蔗糖、0.2μM谷胱甘肽和0.16μM抗坏血酸；
步骤(4)，将经过步骤(3)中预培养基培养的茎尖在加载液中处理， 之后，置于冰上，得到冷冻保护剂滴包裹的茎尖；所述加载液的配方包括2M 蔗糖和0.4M甘油；
步骤(5)，将所述冷冻保护剂滴包裹的茎尖放入液氮中，之后转移到卸 载液中，进行解冻和卸载；其中，所述卸载液含有1.2M蔗糖；
步骤(6)，将解冻后的茎尖移栽到恢复培养基上进行黑暗培养，得到不 带葡萄卷叶病毒-3的茎尖；其中，所述恢复培养基的基础培养基为培养 基，且含有0.6M蔗糖。
在一个实施例中，在步骤(6)之后，所述方法还包括：
步骤(7)，将步骤(6)黑暗培养后的茎尖移栽到培养基进行继代 培养，并检测继代培养的植株是否带有葡萄卷叶病毒-3。
在一个示例中，在步骤(6)和步骤(7)之间，所述方法还包括：
步骤(6’)，将步骤(6)黑暗培养后的茎尖移栽到PTM培养基上进行 黑暗培养，并观察茎尖的成活率；之后，转移至光照培养，并观察茎尖的再 生率；其中，PTM培养基的基础培养基为培养基，且添加有0.5mg/L的苄 氨基腺嘌呤。
在一个实施例中，所述检测继代培养的植株是否带有葡萄卷叶病毒-3包 括：
提取待检测植株的总RNA；
以植株的总RNA为模板进行反转录合成cDNA；
以cDNA为模板，采用葡萄卷叶病毒-3特异性引物进行PCR扩增，得到 PCR产物；
根据所述PCR产物判断待检测植株是否带有葡萄卷叶病毒-3。
在一个示例中，所根据所述PCR产物判断待检测植株是否带有葡萄卷叶 病毒-3包括：
对所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析；
根据琼脂糖凝胶电泳分析结果判断待检测植株是否带有葡萄卷叶病毒 -3。
在一个实施例中，所述葡萄枝条选自以下任一种：
阳光玫瑰葡萄枝条、巨峰葡萄枝条。
在一个实施例中，在步骤(5)中，将所述冷冻保护剂滴包裹的茎尖茎尖 放入液氮中5min，立即转移到卸载液中，进行解冻和卸载30min。
在一个实施例中，在步骤(4)中，将经过步骤(3)中预培养基培养的 茎尖在加载液中处理，之后，置于冰上，得到冷冻保护剂滴包裹的茎尖，包 括：
将经过步骤(3)中预培养基培养的茎尖在加载液中处理30min，之后， 置于冰上50min，得到冷冻保护剂滴包裹的茎尖；
在步骤(5)中，所述将所述冷冻保护剂滴包裹的茎尖放入液氮中，之后 转移到卸载液中，进行解冻和卸载，包括：
将冷冻保护剂滴包裹的茎尖转移至铝箔条上，并装入冷冻管中，然后将 冷冻管放入液氮中5min。
在一个实施例中，在步骤(1)，在初代培养基上培养，得到腋芽萌发的 茎段的培养条件为：温度为20-24℃、光周期为16h、光照强度为50μmols-1m-2。
根据第二方面，提供了第一方面所述的超低温脱除葡萄卷叶病毒-3方法 在葡萄种植中的用途。
本说明书实施例提供的超低温脱除葡萄卷叶病毒-3方法可以有效脱除葡 萄植株中的葡萄卷叶病毒-3，培育中的葡萄幼苗不带葡萄卷叶病毒-3，从而 可以减轻或避免葡萄卷叶病对葡萄种植的影响，提高葡萄产量；并本说明书 实施例提供的超低温脱除葡萄卷叶病毒-3方法实验周期短、操作简单，具有 高度产业利用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所 需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发 明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前 提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1示出本说明书披露的一个实施例的超低温脱除葡萄卷叶病毒-3方法 的流程图。
具体实施方式
应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当 理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是 为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另 外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范 围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本 发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相 同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人 员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的 方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本 发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采 用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、 细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已 有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY， John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego， 1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
现有的植物病毒脱毒技术有茎尖脱毒等。对于葡萄卷叶病毒-3，采用现 有的植物病毒脱毒技术不能有效的脱除。发明人经过大量的实验研究，提出 了一种超低温脱除葡萄卷叶病毒-3方法。接下来，在具体实施例中，对本说 明书实施例提供的超低温脱除葡萄卷叶病毒-3进行介绍。
实施例1
在本实施例中，介绍一种脱除阳光玫瑰的葡萄卷叶病毒-3的方法。参考 图1，本说明书实施例提供超低温脱除葡萄卷叶病毒-3方法包括以下步骤。
步骤(1)，取葡萄枝条单茎段，消毒杀菌后，移栽到初代初代培养基上 培养，得到腋芽萌发的茎段；其中，所述初代培养基的基础培养基为MS培养 基，且在每升MS培养基添加25-35g蔗糖；所述葡萄枝条为感染有葡萄卷叶 病毒-3的葡萄枝条。
具体的，在大田中采取感染葡萄卷叶病毒-3的半木质化的阳光玫瑰枝条， 剪成4cm左右带单芽的单茎段，用清水冲洗3h，之后取出放进超净台中，随 后用75％的酒精消毒30s，10％的次氯酸钠浸泡15min，之后用无菌水冲洗3次， 移栽到MS培养基(每升含30g蔗糖，7g琼脂，pH为5.8)中，培养条件为 22±2℃，16h光周期，光照强度50μmols-1m-2。在培养3周后，取下腋芽萌 发的茎段。
步骤(2)，将腋芽萌发的茎段栽种到增殖培养基上培养，得到含有5-6 片叶原基的茎尖；其中，所述增殖培养基为培养基。
在增殖培养基上培养的条件为22±2℃，16h光周期，光照强度50 μmols-1m-2。在增殖培养基上生长5周后，剥下1.5mm左右的茎尖(含6片左 右的叶原基)。
步骤(3)，将含有叶原基的茎尖移栽到预培养基上，黑暗培养；其中， 所述预培养基的配方包括0.4M蔗糖、0.2μM谷胱甘肽和0.16μM抗坏血酸。
在步骤(3)中，黑暗培养2天。步骤(3)中的培养条件为黑暗培养， 即不添加光照，温度与步骤(1)、(2)相同。
步骤(4)，将经过步骤(3)中预培养基培养的茎尖在加载液中处理， 之后，置于冰上，得到冷冻保护剂滴包裹的茎尖；所述加载液的配方包括2M 蔗糖和0.4M甘油。
冷冻保护剂具体为含有30％(v/v)的甘油、15％(v/v)的乙二醇、15％ (v/v)的二甲基亚砜(DMSO)和0.4M蔗糖的MS液体培养基。
具体的，在步骤(4)中，将经过步骤(3)中预培养基培养的茎尖在加 载液中处理30min，之后将茎尖取出，置于已在冰上预冷的冷冻保护剂中，并 继续在冰上放置50min，得到冷冻保护剂滴包裹的茎尖。
步骤(5)，将所述冷冻保护剂滴包裹的茎尖放入液氮中，之后转移到卸 载液中，进行解冻和卸载；其中，所述卸载液含有1.2M蔗糖。
具体的，将冷冻保护剂滴包裹的茎尖分别转移至0.6cm×1.5cm铝箔条上， 并装入冷冻管中，然后将冷冻管放入液氮中5min。之后迅速将冷冻管中携带 有茎尖的铝箔条转移至含有1.2M蔗糖的卸载液中进行解冻和卸载30min。卸 载液的温度为室温。
步骤(6)，将解冻后的茎尖移栽到恢复培养基上进行黑暗培养，得到不 带葡萄卷叶病毒-3的茎尖；其中，所述恢复培养基的基础培养基为培养 基，且含有0.6M蔗糖。
具体的，解冻后的茎尖迅速转移到含有0.6M蔗糖和7g/L的琼脂的培养基中黑暗培养1天。黑暗培养的条件同(3)。
接着，将步骤(6)黑暗培养后的茎尖移栽到PTM培养基上进行黑暗培养 3天(条件同步骤(3))，观察茎尖的成活率；之后，转移至光照培养(条 件同步骤(1))，4周后观察茎尖的再生率；其中，PTM培养基的基础培养 基为培养基，且添加有0.5mg/L的苄氨基腺嘌呤。
观察到的成活率为75％，再生率为56％。
然后，将再生的茎尖，即试管苗移栽到培养基进行继代培养，每5 周继代培养一次，不进行扩繁操作。5周后检测继代培养的植株是否带有葡萄 卷叶病毒-3。不带病毒的植株移栽到穴盘中，7个月后复检葡萄卷叶病毒-3 的带毒情况，如果不带毒则为无葡萄卷叶病毒-3的植株。
对于葡萄卷叶病毒-3的检测可通过以下方式进行。
提取待检测植株的总RNA；具体可以采取待检测植株的部分组织，然后提 取总RNA。
接着，以植株的总RNA为模板进行反转录合成cDNA。
然后，以cDNA为模板，采用葡萄卷叶病毒-3特异性引物进行PCR扩增， 得到PCR产物。
之后，根据所述PCR产物判断待检测植株是否带有葡萄卷叶病毒-3。具 体的，对所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析；根据琼脂糖凝胶电泳分析 结果判断待检测植株是否带有葡萄卷叶病毒-3。
检测结果发现，脱毒率达100％，即所有待检测植株均为不带病毒的植株。 对葡萄卷叶病毒-3的检测的各步骤的实施，可以参考现有技术介绍，此处不 在赘述。
本说明书实施例提供的超低温脱除葡萄卷叶病毒-3方法可以有效脱除阳 光玫瑰植株中的葡萄卷叶病毒-3，培育中的葡萄幼苗不带葡萄卷叶病毒-3， 从而可以减轻或避免葡萄卷叶病对葡萄种植的影响，提高葡萄产量；并本说 明书实施例提供的超低温脱除葡萄卷叶病毒-3方法实验周期短、操作简单， 具有高度产业利用价值。
实施例2
在本实施例中，介绍一种脱除巨峰的葡萄卷叶病毒-3的方法。具体如下，
步骤(1)，取带有单芽的葡萄枝条单茎段，消毒杀菌后，移栽到初代培 养基上培养，得到腋芽萌发的茎段；其中，所述初代培养基的基础培养基为 MS培养基，且在每升MS培养基添加25-35g蔗糖；所述葡萄枝条为感染有葡 萄卷叶病毒-3的葡萄枝条。
具体的，在大田中采取感染葡萄卷叶病毒-3的半木质化的巨峰枝条，剪 成4cm左右带单芽的单茎段，用清水冲洗3h，之后取出放进超净台中，随后 用75％的酒精消毒30s，10％的次氯酸钠浸泡15min，之后用无菌水冲洗3次， 移栽到MS培养基(每升含30g蔗糖，7g琼脂，pH为5.8)中，培养条件为 22±2℃，16h光周期，光照强度50μmols-1m-2。在培养3周后，取下腋芽萌 发的茎段。
步骤(2)，将腋芽萌发的茎段栽种到增殖培养基上培养，得到含有5-6 片叶原基的茎尖；其中，所述增殖培养基为培养基。
在增殖培养基上培养的条件为22±2℃，16h光周期，光照强度50 μmols-1m-2。在增殖培养基上生长5周后，剥下1.5mm左右的茎尖(含6片左 右的叶原基)。
步骤(3)，将含有叶原基的茎尖移栽到预培养基上，黑暗培养；其中， 所述预培养基的配方包括0.4M蔗糖、0.2μM谷胱甘肽和0.16μM抗坏血酸。
在步骤(3)中，黑暗培养2天。步骤(3)中的培养条件为黑暗培养， 即不添加光照，温度与步骤(1)、(2)相同。
步骤(4)，将经过步骤(3)中预培养基培养的茎尖在加载液中处理， 之后，置于冰上，得到冷冻保护剂滴包裹的茎尖；所述加载液的配方包括2M 蔗糖和0.4M甘油。
冷冻保护剂具体为含有30％(v/v)的甘油、15％(v/v)的乙二醇、15％ (v/v)的二甲基亚砜(DMSO)和0.4M蔗糖的MS液体培养基。
具体的，在步骤(4)中，将经过步骤(3)中预培养基培养的茎尖在加 载液中处理30min，之后将茎尖取出，置于已在冰上预冷的冷冻保护剂中，并 继续在冰上放置50min，得到冷冻保护剂滴包裹的茎尖。
步骤(5)，将所述冷冻保护剂滴包裹的茎尖放入液氮中，之后转移到卸 载液中，进行解冻和卸载；其中，所述卸载液含有1.2M蔗糖。
具体的，将冷冻保护剂滴包裹的茎尖分别转移至0.6cm×1.5cm铝箔条上， 并装入冷冻管中，然后将冷冻管放入液氮中5min。之后迅速将冷冻管中携带 有茎尖的铝箔条转移至含有1.2M蔗糖的卸载液中进行解冻和卸载30min。卸 载液的温度为室温。
步骤(6)，将解冻后的茎尖移栽到恢复培养基上进行黑暗培养，得到不 带葡萄卷叶病毒-3的茎尖；其中，所述恢复培养基的基础培养基为培养 基，且含有0.6M蔗糖。
具体的，解冻后的茎尖迅速转移到含有0.6M蔗糖和7g/L的琼脂的培养基中黑暗培养1天。黑暗培养的条件同(3)。
接着，将步骤(6)黑暗培养后的茎尖移栽到PTM培养基上进行黑暗培养 3天(条件同步骤(3))，观察茎尖的成活率；之后，转移至光照培养(条 件同步骤(1))，4周后观察茎尖的再生率；其中，PTM培养基的基础培养 基为培养基，且添加有0.5mg/L的苄氨基腺嘌呤。
观察到的成活率为78％，再生率为62％。
然后，将再生的茎尖，即试管苗移栽到培养基进行继代培养，每5 周继代培养一次，不进行扩繁操作。5周后检测继代培养的植株是否带有葡萄 卷叶病毒-3。不带病毒的植株移栽到穴盘中，7个月后复检葡萄卷叶病毒-3 的带毒情况，如果不带毒则为无葡萄卷叶病毒-3的植株。
对于葡萄卷叶病毒-3的检测可通过以下方式进行。
提取待检测植株的总RNA；具体可以采取待检测植株的部分组织，然后提 取总RNA。
接着，以植株的总RNA为模板进行反转录合成cDNA。
然后，以cDNA为模板，采用葡萄卷叶病毒-3特异性引物进行PCR扩增， 得到PCR产物。
之后，根据所述PCR产物判断待检测植株是否带有葡萄卷叶病毒-3。具 体的，对所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析；根据琼脂糖凝胶电泳分析 结果判断待检测植株是否带有葡萄卷叶病毒-3。
检测结果发现，脱毒率达100％，即所有待检测植株均为不带病毒的植株。
对葡萄卷叶病毒-3的检测的各步骤的实施，可以参考现有技术介绍，此 处不在赘述。
本说明书实施例提供的超低温脱除葡萄卷叶病毒-3方法可以有效脱除巨 峰植株中的葡萄卷叶病毒-3，培育中的葡萄幼苗不带葡萄卷叶病毒-3，从而 可以减轻或避免葡萄卷叶病对葡萄种植的影响，提高葡萄产量；并本说明书 实施例提供的超低温脱除葡萄卷叶病毒-3方法实验周期短、操作简单，具有 高度产业利用价值。
对比例1
在本对比例中，介绍另一种脱除阳光玫瑰的葡萄卷叶病毒-3的方法。
采用阳光玫瑰6周苗龄的组培养物，取单茎段，在培养基培养2周， 剥取大小为1.0mm的带有5-6片叶原基的顶芽，转移至含0.3M蔗糖、0.16 μM谷胱甘肽和0.14μM抗坏血酸的预培养基(GAPM)中遮光培养3d。经预 培养的顶芽在室温下用加载液处理20min。之后将顶芽放入到50％的PVS2中， 冰上处理30min。再将顶芽放入到PVS2中，冰上处理75min，制成PVS2小 滴，转移至0.8×2.0cm的铝箔条上，直接投入液氮中至少5min，之后迅 速将携带顶芽的铝箔条转移至卸载液中进行解冻和卸载20min。解冻后的顶 芽转移至恢复培养基上遮光培养24h，恢复培养基含0.6M蔗糖和7g/l 琼脂，再转移至后培养基(PTM)上，后培养基含30g/l蔗糖、7g/l琼 脂，另外添加0.5mg/l苄氨基腺嘌呤，pH调节至5.7，遮光培养3d后观察 成活率。
观察到的成活率为20％，再生率为23％。
然后转至光照下培养，6周后观察再生率。将再生苗转移至培养基上， 每8周继代培养一次，不扩繁。
5周后检测继代培养的植株是否带有葡萄卷叶病毒-3。不带病毒的植株移 栽到穴盘中，7个月后复检葡萄卷叶病毒-3的带毒情况，如果不带毒则为无 葡萄卷叶病毒-3的植株。
对于葡萄卷叶病毒-3的检测可通过以下方式进行。
提取待检测植株的总RNA；具体可以采取待检测植株的部分组织，然后提 取总RNA。
接着，以植株的总RNA为模板进行反转录合成cDNA。
然后，以cDNA为模板，采用葡萄卷叶病毒-3特异性引物进行PCR扩增， 得到PCR产物。
之后，根据所述PCR产物判断待检测植株是否带有葡萄卷叶病毒-3。具 体的，对所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析；根据琼脂糖凝胶电泳分析 结果判断待检测植株是否带有葡萄卷叶病毒-3。
检测结果发现，脱毒率达40％。对葡萄卷叶病毒-3的检测的各步骤的实 施，可以参考现有技术介绍，此处不在赘述。
对比例2
在本对比例中，介绍另一种脱除巨峰的葡萄卷叶病毒-3的方法。
采用巨峰6周苗龄的组培养物，取单茎段，在培养基培养2周，剥 取大小为1.0mm的带有5-6片叶原基的顶芽，转移至含0.3M蔗糖、0.16μM 谷胱甘肽和0.14μM抗坏血酸的预培养基(GAPM)中遮光培养3d。经预培 养的顶芽在室温下用加载液处理20min。之后将顶芽放入到50％的PVS2中， 冰上处理30min。再将顶芽放入到PVS2中，冰上处理75min，制成PVS2小 滴，转移至0.8×2.0cm的铝箔条上，直接投入液氮中至少5min，之后迅 速将携带顶芽的铝箔条转移至卸载液中进行解冻和卸载20min。解冻后的顶 芽转移至恢复培养基上遮光培养24h，恢复培养基含0.6M蔗糖和7g/l 琼脂，再转移至后培养基(PTM)上，后培养基含30g/l蔗糖、7g/l琼 脂，另外添加0.5mg/l苄氨基腺嘌呤，pH调节至5.7，遮光培养3d后观察 成活率。
观察到的成活率为16％，再生率为28％。
然后转至光照下培养，6周后观察再生率。将再生苗转移至培养基上， 每8周继代培养一次，不扩繁。
5周后检测继代培养的植株是否带有葡萄卷叶病毒-3。不带病毒的植株移 栽到穴盘中，7个月后复检葡萄卷叶病毒-3的带毒情况，如果不带毒则为无 葡萄卷叶病毒-3的植株。
对于葡萄卷叶病毒-3的检测可通过以下方式进行。
提取待检测植株的总RNA；具体可以采取待检测植株的部分组织，然后提 取总RNA。
接着，以植株的总RNA为模板进行反转录合成cDNA。
然后，以cDNA为模板，采用葡萄卷叶病毒-3特异性引物进行PCR扩增， 得到PCR产物。
之后，根据所述PCR产物判断待检测植株是否带有葡萄卷叶病毒-3。具 体的，对所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析；根据琼脂糖凝胶电泳分析 结果判断待检测植株是否带有葡萄卷叶病毒-3。
检测结果发现，脱毒率达45％。对葡萄卷叶病毒-3的检测的各步骤的实 施，可以参考现有技术介绍，此处不在赘述。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。 任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例 进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发 明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明 的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种超低温脱除葡萄卷叶病毒-3方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)，取葡萄枝条单茎段，消毒杀菌后，移栽到初代培养基上培养，得到腋芽萌发的茎段；其中，所述初代培养基的基础培养基为MS培养基，且在每升MS培养基添加25-35g蔗糖；所述葡萄枝条为感染有葡萄卷叶病毒-3的葡萄枝条；
步骤(2)，将腋芽萌发的茎段栽种到增殖培养基上培养，取含有5-6片叶原基的茎尖；其中，所述增殖培养基为培养基；
步骤(3)，将含有叶原基的茎尖移栽到预培养基上，黑暗培养；其中，所述预培养基的配方包括0.4M蔗糖、0.2μM谷胱甘肽和0.16μM抗坏血酸；
步骤(4)，将经过步骤(3)中预培养基培养的茎尖在加载液中处理，之后，置于冰上，得到冷冻保护剂滴包裹的茎尖；所述加载液的配方包括2M蔗糖和0.4M甘油；
步骤(5)，将所述冷冻保护剂滴包裹的茎尖放入液氮中，之后转移到卸载液中，进行解冻和卸载；其中，所述卸载液含有1.2M蔗糖；
步骤(6)，将解冻后的茎尖移栽到恢复培养基上进行黑暗培养，得到不带葡萄卷叶病毒-3的茎尖；其中，所述恢复培养基的基础培养基为培养基，且含有0.6M蔗糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(6)之后，所述方法还包括：
步骤(7)，将步骤(6)黑暗培养后的茎尖移栽到培养基进行继代培养，并检测继代培养的植株是否带有葡萄卷叶病毒-3。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(6)和步骤(7)之间，所述方法还包括：
步骤(6’)，将步骤(6)黑暗培养后的茎尖移栽到PTM培养基上进行黑暗培养，并观察茎尖的成活率；之后，转移至光照培养，并观察茎尖的再生率；其中，PTM培养基的基础培养基为培养基，且添加有0.5mg/L的苄氨基腺嘌呤。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述检测继代培养的植株是否带有葡萄卷叶病毒-3包括：
提取待检测植株的总RNA；
以植株的总RNA为模板进行反转录合成cDNA；
以cDNA为模板，采用葡萄卷叶病毒-3特异性引物进行PCR扩增，得到PCR产物；
根据所述PCR产物判断待检测植株是否带有葡萄卷叶病毒-3。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所根据所述PCR产物判断待检测植株是否带有葡萄卷叶病毒-3包括：
对所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析；
根据琼脂糖凝胶电泳分析结果判断待检测植株是否带有葡萄卷叶病毒-3。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述葡萄枝条选自以下任一种：
阳光玫瑰葡萄枝条、巨峰葡萄枝条。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(5)中，将所述冷冻保护剂滴包裹的茎尖放入液氮中5min，立即转移到卸载液中，进行解冻和卸载30min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，将经过步骤(3)中预培养基培养的茎尖在加载液中处理，之后，置于冰上，得到冷冻保护剂滴包裹的茎尖，包括：
将经过步骤(3)中预培养基培养的茎尖在加载液中处理30min，之后，置于冰上50min，得到冷冻保护剂滴包裹的茎尖；
在步骤(5)中，所述将所述冷冻保护剂滴包裹的茎尖放入液氮中，之后转移到卸载液中，进行解冻和卸载，包括：
将冷冻保护剂滴包裹的茎尖转移至铝箔条上，并装入冷冻管中，然后将冷冻管放入液氮中5min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)，在初代培养基上培养，得到腋芽萌发的茎段的培养条件为：温度为20-24℃、光周期为16h、光照强度为50μmols-1m-2。
10.如权利要求1-9任一项所述的超低温脱除葡萄卷叶病毒-3方法在葡萄种植中的用途。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113907006A (zh) * 2021-11-08 2022-01-11 西北农林科技大学 脱除猕猴桃褪绿环斑相关病毒的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050050592A1 (en) * 1998-05-15 2005-03-03 Gray Dennis J. Regeneration system for grape and uses thereof
CN109042335A (zh) * 2018-09-25 2018-12-21 中国农业大学烟台研究院 一种快速生产葡萄脱毒种苗的培养基及组培量产方法
CN109105256A (zh) * 2018-07-30 2019-01-01 浙江大学 甘薯茎尖脱毒方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050050592A1 (en) * 1998-05-15 2005-03-03 Gray Dennis J. Regeneration system for grape and uses thereof
CN109105256A (zh) * 2018-07-30 2019-01-01 浙江大学 甘薯茎尖脱毒方法
CN109042335A (zh) * 2018-09-25 2018-12-21 中国农业大学烟台研究院 一种快速生产葡萄脱毒种苗的培养基及组培量产方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
毕文璐: ""葡萄茎尖超低温保存及超低温疗法脱毒研究"", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士) 农业科技辑》 *
郭西智等: ""葡萄脱毒及无毒苗木快速繁育技术"", 《中外葡萄与葡萄酒》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113907006A (zh) * 2021-11-08 2022-01-11 西北农林科技大学 脱除猕猴桃褪绿环斑相关病毒的方法
CN113907006B (zh) * 2021-11-08 2022-11-15 西北农林科技大学 脱除猕猴桃褪绿环斑相关病毒的方法

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