CN109105256A - 甘薯茎尖脱毒方法 - Google Patents

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CN109105256A CN201810853480.4A CN201810853480A CN109105256A CN 109105256 A CN109105256 A CN 109105256A CN 201810853480 A CN201810853480 A CN 201810853480A CN 109105256 A CN109105256 A CN 109105256A
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Abstract

本发明公开了一种甘薯茎尖脱毒方法，包括以下步骤：剥取无菌苗上的1～2mm长的茎尖分生组织；将茎尖分生组织接种到预培养基上进行培养；将所得的预培养后茎尖放入加载液中，于室温下加载；将所得的加载后茎尖转至玻璃化液中，于室温下处理，得脱水后茎尖；将脱水后茎尖放入位于载体上的玻璃化液的液滴中进行液氮处理，然后对茎尖进行洗涤；将洗涤后茎尖转入再生培养基中培养成苗；得脱毒后甘薯。采用本发明的方法对甘薯茎尖脱毒，具有培养效率高、成苗率高、脱毒率高的技术优势。

Description

甘薯茎尖脱毒方法
技术领域
本发明属于作物脱毒健康种苗培育技术领域，具体涉及一种超低温小滴玻璃化法脱除甘薯病毒的方法。
背景技术
甘薯(Ipomoea batatas.Lam)，又名红薯、地瓜等，为旋花科薯蓣属植物。甘薯种植广泛，是全球性的重要粮食作物，也是轻工业和饲料的重要原料。甘薯富含可溶性糖、维生素C和食用纤维等各种营养物质，具有降低胆固醇、防治心脑血管疾病等保健功能。因此，被世界卫生组织列为13种最佳蔬菜之首。
中国是世界上最大的甘薯生产国，总种植面积达338万公顷，产量达0.72亿吨。据山东、安徽、北京、江苏等省市的调查表明，病毒病造成的甘薯产量损失严重可达50％以上，造成的经济损失约40亿元。由于甘薯主要靠扦插枝条种植，多种病毒可通过昆虫和汁液传播，复合侵染率很高，马铃薯Y病毒属的甘薯羽状斑驳病毒、甘薯G病毒、甘薯C病毒等在田间多为复合侵染。甘薯褪绿矮缩病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)和甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)协同侵染导致的甘薯病毒病(Sweet potato virus disease，SPVD)是甘薯的毁灭性病害，严重时可造成70％-100％的产量损失。
由于连年的自留种无性繁殖，使种薯病毒积累，病情逐年加重。在苗床期，甘薯苗已出现大面积矮缩萎蔫，叶片畸形，花叶明脉，叶缘内卷等典型的病毒病症状，严重影响甘薯产量和品质，造成严重的经济损失。为明确杭州市甘薯病毒病发生现状，在杭州市甘薯七个主栽区调查采样，检测结果表明杭州市主要的甘薯病毒为SPFMV和SPCSV。
较为常见的脱毒方法就是将茎尖培养或是嫩梢嫁接与热处理，低温处理以及化学处理相结合。然而这些方法与超低温冷冻疗法相比，存在操作困难，脱毒效率低等劣势，目前超低温疗法已经在马铃薯，菊花，葡萄等植物上取得了显著的效果。将超低温疗法应用在甘薯上以高效脱除常见的甘薯病毒SPFMV和SPCSV势在必行。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种培养效率高、且成苗率和脱毒率都比较高的甘薯茎尖脱毒方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种甘薯茎尖脱毒方法(茎尖小滴玻璃化法超低温脱除甘薯病毒的方法)，包括以下步骤：
1)、剥取无菌苗上的1～2mm长的茎尖分生组织；
2)、将茎尖分生组织接种到预培养基上进行培养，培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmol m-2·s-1，温度为27±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行；培养时间为1～2天；
3)、将步骤2)所得的预培养后茎尖放入加载液中，室温下加载0～60min(较佳为30～60min)；所述加载液为MS+1.8～2.2mol/L甘油+0.3～0.5mol/L蔗糖，pH5.8；
4)、将步骤3)所得的加载后茎尖转至玻璃化液(以甘油为主)中，室温下处理0～90min(较佳为30～90min)，得脱水后茎尖；
5)、先将步骤4)所得的脱水后茎尖放入位于载体上的玻璃化液的液滴中，然后将整个载体装入盛满液氮的冷冻管中，再将整个冷冻管投入液氮保持50～70min(较佳为60min)；
6)、从液氮中取出位于冷冻管内的载体，室温下将载体迅速浸入洗涤液中，从而使茎尖从载体上脱落下来；然后再将茎尖转入洗涤液(新的洗涤液)中洗涤20～40min(较佳为30min)；
7)、将步骤6)所得的洗涤后茎尖转入再生培养基中培养成苗；培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmol m-2·s-1，温度为27±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；光照和暗培养交替进行；
培养时间为40～44天(约六周)，得植株Ⅰ(脱毒后植株)。
备注说明：切取植株Ⅰ上的叶片(约1cm左右叶片)，提取汁液，进行甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)和甘薯褪绿矮化病(Sweet potatochlorotic stunt virus,SPCSV)颗粒检测；当不能检测到此2种病毒颗粒时，判定所得植株Ⅰ为脱毒后甘薯。
作为本发明的甘薯茎尖脱毒方法的改进：
所述玻璃化液(步骤4、步骤5)为以下任一：
PVS2玻璃化溶液：[MS+28～32％(w/v)甘油+14～16％(w/v)乙二醇+14～16％(w/v)二甲基亚砜]+0.35～0.45mol/L蔗糖，pH5.8±0.2；
PVS3玻璃化溶液：[MS+45～55％(w/v)甘油]+45～55％(w/v)蔗糖，pH5.8±0.2；
DMSO溶液：[MS+9～11％(w/v)二甲基亚砜]+28～32g/L蔗糖，pH5.8±0.2。
PVS2玻璃化溶液的制备方法：在280～320g甘油、140～160g乙二醇和140～160g二甲基亚砜中加入MS基本培养基定容至1L，调节pH至5.8±0.2；再加入0.35～0.45mol蔗糖；
PVS3玻璃化溶液的制备方法：450～550g甘油中加入MS基本培养基定容至1L，调节pH至5.8±0.2；再加入450～550g蔗糖；
DMSO溶液的制备方法：90～110g二甲基亚砜中加入MS基本培养基定容至1L，调节pH至5.8±0.2；再加入28～32g蔗糖。
作为本发明的甘薯茎尖脱毒方法的进一步改进：
所述步骤2)中的预培养基为：MS+0.3～0.75mol/L蔗糖，pH5.8±0.2；
所述步骤6)中的洗涤液为：MS+1.0～1.4mol/L蔗糖，pH5.8±0.2；
所述步骤7)中的再生培养基为：
MS+0.4～0.6mg/LBA+0.08～0.12mg/LNAA+7～9mg/LGA3+7～9g/L琼脂+28～32g/L蔗糖，pH5.8±0.2。
预培养基的制备方法为：1L MS基本培养基中加入0.3～0.75mol蔗糖，调节pH至5.8±0.2；
洗涤液的制备方法为：1L MS基本培养基中加入1.0～1.4mol蔗糖，调节pH至5.8±0.2；
再生培养基的制备方法为：1L MS基本培养基中加入0.4～0.6mgBA、0.08～0.12mgNAA、7～9mg GA3、7～9g琼脂、28～32g蔗糖，调节pH至5.8±0.2。
作为本发明的甘薯茎尖脱毒方法的进一步改进，步骤5)：
载片为0.03mm厚，0.8cm×4cm大小的铝箔纸，吸取(用吸管吸取)玻璃化液滴加在铝箔条上形成玻璃化液滴，每个玻璃化液滴为13～18μL玻璃化液，每个玻璃化液滴内放入5个脱水后茎尖，将粘有茎尖的铝箔纸先在液氮里蘸一下，然后装入盛满液氮的2～10mL冷冻管中，再将整个冷冻管投入液氮50～70min(较佳为60min)。
作为本发明的甘薯茎尖脱毒方法的进一步改进，步骤7)：
将洗涤后茎尖先放入恢复培养基中黑暗培养2.5～3.5d(较佳为3d)；培养条件为：21±1℃；所述恢复培养基为：MS+0.45～0.55mg/LBA+7～9g/L琼脂+28～32g/L蔗糖，pH5.8±0.2；得恢复处理后茎尖(此为存活后的茎尖，茎尖三天后转绿则为存活)；
再将恢复处理后茎尖转入再生培养基中培养成苗。
恢复培养基的制备方法为：1L MS基本培养基中加入0.45～0.55mg BA、7～9g琼脂、28～32g蔗糖，调节pH至5.8±0.2。
备注说明：在本发明中，pH值的调节均用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl进行调节，此为常规技术。
作为本发明的甘薯茎尖脱毒方法的进一步改进，步骤2)：
将茎尖分生组织先放入预培养基Ⅰ中预培养1天，再放入预培养基Ⅱ中预培养1天；
所述预培养基Ⅰ为：MS+0.3mol/L蔗糖，pH5.8，
所述预培养基Ⅱ为：MS+0.5mol/L蔗糖，pH5.8。
作为本发明的甘薯茎尖脱毒方法的进一步改进，步骤3)中：
加载时间为30～60min；
所述加载液为MS+2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖，pH5.8。
作为本发明的甘薯茎尖脱毒方法的进一步改进，步骤4)中：
玻璃化溶液处理时间为30～90min(优选为60min)；
玻璃化溶液为以下任一：
PVS2玻璃化溶液(优选)：[MS+30％(w/v)甘油+15％(w/v)乙二醇+15％(w/v)二甲基亚砜]+0.4mol/L蔗糖，pH5.8；
PVS3玻璃化溶液：[MS+50％(w/v)甘油]+50％(w/v)蔗糖，pH5.8；
DMSO溶液：[MS+10％(w/v)二甲基亚砜]+30g/L蔗糖，pH5.8。
作为本发明的甘薯茎尖脱毒方法的进一步改进，
所述洗涤液为：MS+1.2mol/L蔗糖，pH5.8；
所述再生培养基为MS+0.5mg/LBA+0.1mg/LNAA+8mg/LGA3+8g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8；
恢复培养基为：MS+0.5mg/LBA+8g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8。
在本发明中：
本发明采用液氮冷冻的方式脱除病毒与茎尖大小无关，与传统的通过剥除越小的茎尖、脱毒率越高、再生率越低相比，本发明的优势明显，并且耗费的时间周期更短。
本发明采用铝箔纸作为载体，与茎尖在玻璃化溶液中形成的小液滴一起放入液氮中，保证了更高的存活率，而且铝箔纸具有更快化冻的特点，避免繁琐的解冻的过程。
本发明采用恢复培养基的过程，减少了处理过程中对茎尖的伤害作用。得到了更高的再生率。
本发明试验了各种影响甘薯茎尖再生率和脱毒率的参数，得到了最优化的脱毒方法步骤。
本发明具有如下技术优势：
(1)、茎尖小滴玻璃化法既避免了传统脱毒方法比如热处理脱毒的效率低，耗时长，抗病毒剂对植物遗传稳定性的潜在影响以及毒害作用，又避免了超低温疗法中比如包埋玻璃化法的操作繁琐；使脱毒效率大大提高，操作简单快速高效。
(2)、展现了很好的实践应用推广效果，脱毒率达到了100％。最优选方案中甘薯茎尖再生率为80％，脱毒率为100％。而运用传统的茎尖脱毒方法直接剥茎尖培养，只得到了38％的脱毒率。
再生率＝存活后的茎尖成苗个数/所有成活的茎尖个数×100％，
脱毒率＝检测苗的个数/检测无SPFMV和SPCSV病毒的苗个数×100％。
(3)、该发明对甘薯主要病毒甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottlevirus，SPFMV)和甘薯褪绿矮缩病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV)有很好的脱除效果。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为小滴玻璃化法脱除病毒图；
A：切取的1.5mm左右的茎尖；B：预培养的茎尖；C：装载处理的茎尖；D：小滴玻璃化处理的茎尖；E：洗脱的茎尖；F：再生植株；
图2为脱毒甘薯生长状况图；
G：二周左右的小苗；H：4周左右的苗；I：六周左右的苗。
图3为脱毒甘薯SPFMV RT-PCR检测图；M：marker；1：未脱毒的对照甘薯；2，3，4，5，6，7，8均为脱毒甘薯；
图4为脱毒甘薯SPCSV RT-PCR检测图；M：marker；1：未脱毒的对照甘薯；2，3，4，5，6，7，8均为脱毒甘薯。
具体实施方式
实施例1-1、一种甘薯茎尖脱毒方法，依次进行以下步骤：
1)、剥取无菌苗上的1mm茎尖分生组织，如图1-A所示。
备注说明：将甘薯苗剪去叶片，切成1.0cm的茎段，流水下冲洗1h，75％(V/V)酒精浸泡10s，0.1％升汞溶液消毒10min，无菌水冲洗5次后，得无菌苗。无菌苗的获取方式属于常规技术。
2)、将茎尖分生组织先接种至预培养基Ⅰ中预培养1天，再接种至预培养基Ⅱ中预培养1天；所述预培养基Ⅰ为：MS+0.3mol/L蔗糖，pH5.8，所述预培养基Ⅱ为：MS+0.5mol/L蔗糖，pH5.8。
培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmol m-2·s-1，温度为27±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行。如图1-B所示。
3)、将步骤2)所得的预培养后茎尖放入加载液中，室温下加载60min。所述加载液为MS+2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖，pH5.8。如图1-C所示。
4)、将步骤3)所得的加载后茎尖转至PVS2玻璃化溶液中，室温下处理60min；得脱水后茎尖；如图1-D所示。
PVS2玻璃化溶液为：[MS+30％(w/v)甘油+15％(w/v)乙二醇+15％(w/v)二甲基亚砜]+0.4mol/L蔗糖，pH5.8。
5)、选用0.03mm厚，0.8cm×4cm大小的铝箔纸作为载片；
将步骤4)所得的脱水后茎尖放在铝箔纸纸上，用吸管吸取PVS2玻璃化溶液滴加在铝箔条上形成玻璃化液滴，每个玻璃化液滴为约15μL PVS2玻璃化溶液，每个玻璃化液滴内放置5个脱水后茎尖，将粘有茎尖的铝箔纸在液氮里蘸一下，然后装入盛满液氮的2mL冷冻管中，再将整个冷冻管投入液氮60min。
6)、从液氮中取出位于冷冻管内的载体，室温下迅速浸入洗涤液中，从而使茎尖从载体上脱落下来，然后再将茎尖转入洗涤液(新的洗涤液)中洗涤30min；所述洗涤液为：MS+1.2mol/L蔗糖，pH5.8。如图1-E所示。
7)、将步骤6)所得的洗涤后茎尖先放入恢复培养基中黑暗培养3d；所述恢复培养基为：MS+0.5mg/LBA+8g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8；培养条件为：21±1℃；得恢复处理后茎尖(此为存活后的茎尖，茎尖三天后转绿则为存活)。
再将上述恢复处理后茎尖放入再生培养基中培养成苗；再生培养基为MS+0.5mg/LBA+0.1mg/LNAA+8mg/LGA3+8g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8；培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmol m-2·s-1，温度为27±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；光照和暗培养交替进行。培养时间为42天(六周)，得植株Ⅰ，如图2所示。
8)、切取植株Ⅰ上的叶片(约1cm左右叶片)，提取汁液，进行甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)和甘薯褪绿矮化病(Sweet potatochlorotic stunt virus,SPCSV)颗粒检测；当不能检测到此2种病毒颗粒时，判定所得植株Ⅰ为脱毒后甘薯。
备注说明：
甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)的颗粒检测可参照常规的RT-PCR法进行(如图3所示)；
甘薯褪绿矮化病(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)的颗粒检测可参照常规的RT-PCR法进行(如图4所示)。
备注：甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)的颗粒检测和甘薯褪绿矮化病(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)的颗粒检测可依据已经公开发表于《Plant Pathology Journal,》杂志的《The Current Incidence ofViral Disease in Korean Sweet Potatoes and Development of Multiplex RT-PCRAssays for Simultaneous Detection of Eight Sweet Potato Viruses》进行检测。
检测结果为：步骤7)，黑暗中培养三天后，可见茎尖泛绿，两周左右，有叶片生出，小苗成形。6周后进行脱毒苗的检测。再生率为73.33％，脱毒率为100％。
实施例1-2：将实施例1-1中的PVS2玻璃化溶液改为PVS3玻璃化溶液，其余等同于实施例1-1。
PVS3玻璃化溶液：[MS+50％(w/v)甘油]+50％(w/v)蔗糖，pH5.8。
检测结果为：步骤7)，黑暗中培养三天后，可见茎尖泛绿，两周左右，有叶片生出，小苗成形。6周后进行脱毒苗的检测。再生率为56.67％，脱毒率为100％。
实施例1-3：将实施例1-1中的PVS2玻璃化溶液改为DMSO溶液，其余等同于实施例1-1。
DMSO溶液：[MS+10％(w/v)二甲基亚砜]+30g/L蔗糖，pH5.8。
检测结果为：步骤7)，黑暗中培养三天后，可见茎尖泛绿，两周左右，有叶片生出，小苗成形。6周后进行脱毒苗的检测。再生率为30％，脱毒率为100％。
实施例1-4、将实施例1-1步骤1)中的茎尖分生组织由1mm改成2mm，其余等同于实施例1-1。
检测结果为：步骤7)，黑暗中培养三天后，可见茎尖泛绿，两周左右，有叶片生出，小苗成形。6周后进行脱毒苗的检测。再生率为73％，脱毒率为100％。
实施例2：将实施1-1步骤5)改成：将步骤4)所得的脱水后茎尖直接放入液氮中60min；其余等同于实施例1-1。
检测结果为：步骤7)，黑暗条件下恢复培养3天后，未见茎尖泛绿；即，茎尖没有存活，因此无法进行后续步骤。
实施例3：取消步骤7)中的“恢复培养基中黑暗培养”；
即，将实施1-1步骤7)改成：
7)、将步骤6)所得的洗涤后茎尖直接放入再生培养基中培养成苗；培养条件同实施例1-1。其余等同于实施例1-1。
检测结果为：步骤7)，再生培养两周后，茎尖成小苗。再生率为3.33％，脱毒率为100％。
实施例4-1：将实施例1-1的步骤2)改成：
2)、将茎尖分生组织接种到预培养基上进行培养2天，预培养基为：MS+0.4mol/L蔗糖，pH5.8，培养条件同实施例1-1；其余等同于实施例1-1。
检测结果为：步骤7)，黑暗中培养三天后，可见茎尖泛绿，两周左右，有叶片生出，小苗成形。6周后进行脱毒苗的检测。再生率为26.67％，脱毒率为100％。
实施例4-2：将实施例1-1的步骤2)改成：
2)、将茎尖分生组织接种到预培养基上进行培养2天，预培养基为：MS+0.5mol/L蔗糖，pH5.8，培养条件同实施例1-1；其余等同于实施例1-1。
检测结果为：步骤7)，黑暗中培养三天后，可见茎尖泛绿，两周左右，有叶片生出，小苗成形。6周后进行脱毒苗的检测。再生率为40％，脱毒率为100％。
实施例4-3：将实施例1-1的步骤2)改成：
2)、将茎尖分生组织接种到预培养基上进行培养2天，预培养基为：MS+0.75mol/L蔗糖，pH5.8，培养条件同实施例1-1；其余等同于实施例1-1。
检测结果为：步骤7)，黑暗中培养三天后，可见茎尖泛绿，两周左右，有叶片生出，小苗成形。6周后进行脱毒苗的检测。再生率为16.67％，脱毒率为100％。
实施例5-1：将实施例1-1步骤3)中的加载时间由60min改成30min；其余等同于实施例1-1。
检测结果为：步骤7)，黑暗中培养三天后，可见茎尖泛绿，两周左右，有叶片生出，小苗成形。6周后进行脱毒苗的检测。再生率为66.66％，脱毒率为100％。
实施例5-2：将实施例1-1步骤3)中的加载时间由60min改成90min；其余等同于实施例1-1。
检测结果为：步骤7)，黑暗中培养三天后，可见茎尖泛绿，两周左右，有叶片生出，小苗成形。6周后进行脱毒苗的检测。再生率为70％，脱毒率为100％。
实施例6-1：将实施例1-1步骤4)的玻璃化溶液处理时间由60min改成30min；其余等同于实施例1-1。
检测结果为：步骤7)，黑暗中培养三天后，可见茎尖泛绿，两周左右，有叶片生出，小苗成形。6周后进行脱毒苗的检测。再生率为53.33％，脱毒率为100％。
实施例6-2：将实施例1-1步骤4)的玻璃化溶液处理时间由60min改成90min；其余等同于实施例1-1。
检测结果为：步骤7)，黑暗中培养三天后，可见茎尖泛绿，两周左右，有叶片生出，小苗成形。6周后进行脱毒苗的检测。再生率为63.33％，脱毒率为100％。
对比例1、一种甘薯茎尖脱毒方法：
将步骤1)中剥取的茎尖分生组织直接进入步骤7)培养。其余等同于实施例1-1。
检测结果为：黑暗中培养三天后，可见茎尖泛绿，两周左右，有叶片生出，小苗成形。6周后进行脱毒苗的检测。再生率为93.33％，脱毒率为38％。
对比例2，一种甘薯茎尖脱毒方法：
将步骤1)剥取的茎尖分生组织直接放入液氮中保持60min，其余等同于实施例1-1。
检测结果为：茎尖成褐色，全部死亡。
对比例3-1，一种甘薯茎尖脱毒方法：
将步骤1)中的茎尖直接放入步骤3)中的加载液中处理，即省去步骤2)，其余等同于
实施例1-1。
检测结果为：黑暗中培养三天后，可见极少数茎尖泛绿，两周左右，有叶片生出，小苗成形。6周后进行脱毒苗的检测。再生率为10％，脱毒率为38％。
对比例3-2，一种甘薯茎尖脱毒方法：
将步骤2)中预培养2天后的茎尖直接放入步骤4)中处理，即省去步骤3)，其余等同于实施例1-1。
检测结果为：黑暗中培养三天后，可见茎尖泛绿，两周左右，有叶片生出，小苗成形。6周后进行脱毒苗的检测。再生率为33.33％，脱毒率为38％。
对比例3-3，一种甘薯茎尖脱毒方法：
将步骤3)中加载后的茎尖直接放入步骤5)中处理，即省去步骤4)，其余等同于实施例1-1。
检测结果为：茎尖成褐色，全部死亡。
上述案例的对比结果如下表1所示。
表1
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (9)

1.甘薯茎尖脱毒方法，其特征在于包括以下步骤：
1)、剥取无菌苗上的1～2mm长的茎尖分生组织；
2)、将茎尖分生组织接种到预培养基上进行培养，培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmol m-2·s-1，温度为27±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行；培养时间为1～2天；
3)、将步骤2)所得的预培养后茎尖放入加载液中，室温下加载0～60min；所述加载液为MS+1.8～2.2mol/L甘油+0.3～0.5mol/L蔗糖，pH5.8；
4)、将步骤3)所得的加载后茎尖转至玻璃化液中，室温下处理0～90min，得脱水后茎尖；
5)、先将步骤4)所得的脱水后茎尖放入位于载体上的玻璃化液的液滴中，然后将整个载体装入盛满液氮的冷冻管中，再将整个冷冻管投入液氮保持50～70min；
6)、从液氮中取出位于冷冻管内的载体，室温下将载体迅速浸入洗涤液中，从而使茎尖从载体上脱落下来；然后再将茎尖转入洗涤液中洗涤20～40min；
7)、将步骤6)所得的洗涤后茎尖转入再生培养基中培养成苗；培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmol m-2·s-1，温度为27±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；光照和暗培养交替进行；
培养时间为40～44天，得植株Ⅰ。
2.根据权利要求1中所述的甘薯茎尖脱毒方法，其特征在于：
所述玻璃化液为以下任一：
PVS2玻璃化溶液：[MS+28～32％(w/v)甘油+14～16％(w/v)乙二醇+14～16％(w/v)二甲基亚砜]+0.35～0.45mol/L蔗糖，pH5.8±0.2；
PVS3玻璃化溶液：[MS+45～55％(w/v)甘油]+45～55％(w/v)蔗糖，pH5.8±0.2；
DMSO溶液：[MS+9～11％(w/v)二甲基亚砜]+28～32g/L蔗糖，pH5.8±0.2。
3.根据权利要求2所述的甘薯茎尖脱毒方法，其特征在于：
所述步骤2)中的预培养基为：MS+0.3～0.75mol/L蔗糖，pH5.8±0.2；
所述步骤6)中的洗涤液为：MS+1.0～1.4mol/L蔗糖，pH5.8±0.2；
所述步骤7)中的再生培养基为：
MS+0.4～0.6mg/LBA+0.08～0.12mg/LNAA+7～9mg/LGA3+7～9g/L琼脂+28～32g/L蔗糖，pH5.8±0.2。
4.根据权利要求1～3任一所述的甘薯茎尖脱毒方法，其特征在于所述步骤5)：
载片为0.03mm厚，0.8cm×4cm大小的铝箔纸，吸取玻璃化液滴加在铝箔条上形成玻璃化液滴，每个玻璃化液滴为13～18μL玻璃化液，每个玻璃化液滴内放入5个脱水后茎尖，将粘有茎尖的铝箔纸先在液氮里蘸一下，然后装入盛满液氮的2～10mL冷冻管中，再将整个冷冻管投入液氮50～70min。
5.根据权利要求1～3任一所述的甘薯茎尖脱毒方法，其特征在于所述步骤7)：
将洗涤后茎尖先放入恢复培养基中黑暗培养2.5～3.5d；培养条件为：21±1℃；所述恢复培养基为：MS+0.45～0.55mg/LBA+7～9g/L琼脂+28～32g/L蔗糖，pH5.8±0.2；得恢复处理后茎尖；
再将恢复处理后茎尖转入再生培养基中培养成苗。
6.根据权利要求1～3任一所述的甘薯茎尖脱毒方法，其特征在于所述步骤2)：
将茎尖分生组织先放入预培养基Ⅰ中预培养1天，再放入预培养基Ⅱ中预培养1天；
所述预培养基Ⅰ为：MS+0.3mol/L蔗糖，pH5.8，
所述预培养基Ⅱ为：MS+0.5mol/L蔗糖，pH5.8。
7.根据权利要求1～3任一所述的甘薯茎尖脱毒方法，其特征在于所述步骤3)中：
加载时间为30～60min；
所述加载液为MS+2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖，pH5.8。
8.根据权利要求1～3任一所述的甘薯茎尖脱毒方法，其特征在于所述步骤4)中：
玻璃化溶液处理时间为30～90min；
玻璃化溶液为以下任一：
PVS2玻璃化溶液：[MS+30％(w/v)甘油+15％(w/v)乙二醇+15％(w/v)二甲基亚砜]+0.4mol/L蔗糖，pH5.8；
PVS3玻璃化溶液：[MS+50％(w/v)甘油]+50％(w/v)蔗糖，pH5.8；
DMSO溶液：[MS+10％(w/v)二甲基亚砜]+30g/L蔗糖，pH5.8。
9.根据权利要求1～3任一所述的甘薯茎尖脱毒方法，其特征在于：
所述洗涤液为：MS+1.2mol/L蔗糖，pH5.8；
所述再生培养基为MS+0.5mg/LBA+0.1mg/LNAA+8mg/LGA3+8g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8；
恢复培养基为：MS+0.5mg/LBA+8g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110024689A (zh) * 2019-03-27 2019-07-19 西北农林科技大学 超低温脱除葡萄卷叶病毒-3方法及用途
CN113826546B (zh) * 2020-06-08 2024-01-16 西北农林科技大学 一种小滴玻璃化法猕猴桃茎尖超低温脱毒的方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101904305A (zh) * 2010-07-16 2010-12-08 山东省农业科学院作物研究所 甘薯茎尖的包埋玻璃化超低温保存方法
CN102860259A (zh) * 2012-09-26 2013-01-09 海南省农业科学院粮食作物研究所 一种高效产业化生产番薯脱毒组培苗的方法
CN103262793A (zh) * 2013-04-06 2013-08-28 上饶师范学院 一种江西铅山红芽芋玻璃化法超低温保存脱毒的方法
CN104067821A (zh) * 2014-06-26 2014-10-01 青岛农业大学 一种甘薯脱毒苗的制备方法
CN104604685A (zh) * 2015-01-31 2015-05-13 四川农业大学 一种草莓茎尖超低温脱毒的方法
CN108283065A (zh) * 2017-09-27 2018-07-17 福州市农业科学研究所 一种适合吐鲁番甘薯高产栽培的方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101904305A (zh) * 2010-07-16 2010-12-08 山东省农业科学院作物研究所 甘薯茎尖的包埋玻璃化超低温保存方法
CN102860259A (zh) * 2012-09-26 2013-01-09 海南省农业科学院粮食作物研究所 一种高效产业化生产番薯脱毒组培苗的方法
CN103202232A (zh) * 2012-09-26 2013-07-17 海南省农业科学院粮食作物研究所 一种高效产业化生产番薯脱毒组培苗的方法
CN103262793A (zh) * 2013-04-06 2013-08-28 上饶师范学院 一种江西铅山红芽芋玻璃化法超低温保存脱毒的方法
CN104067821A (zh) * 2014-06-26 2014-10-01 青岛农业大学 一种甘薯脱毒苗的制备方法
CN104604685A (zh) * 2015-01-31 2015-05-13 四川农业大学 一种草莓茎尖超低温脱毒的方法
CN108283065A (zh) * 2017-09-27 2018-07-17 福州市农业科学研究所 一种适合吐鲁番甘薯高产栽培的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Q. WANG等: ""Elimination of viruses and phytoplasma by cryotherapy of in vitro-grown shoot tips: Analysis of all cases"", 《ADVANCES IN HORTICULTURAL SCIENCE》 *
刘丽芳: ""甘薯种质遗传稳定性及超低温保存研究"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）农业科技辑》 *
刘丽芳等: ""甘薯种质超低温保存研究进展"", 《植物遗传资源学报》 *
吴昀等: ""超低温保存植物种质资源的新途径——小滴玻璃化法"", 《植物生理学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110024689A (zh) * 2019-03-27 2019-07-19 西北农林科技大学 超低温脱除葡萄卷叶病毒-3方法及用途
CN113826546B (zh) * 2020-06-08 2024-01-16 西北农林科技大学 一种小滴玻璃化法猕猴桃茎尖超低温脱毒的方法

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