CN103262793A - 一种江西铅山红芽芋玻璃化法超低温保存脱毒的方法 - Google Patents
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Abstract
江西铅山红芽芋玻璃化法超低温保存脱毒的方法：(1)在显微镜下切取红芽芋单芽长约1mm的茎尖；(2）茎尖在MS+KT2mg/L+NAA0.5mg/L+0.75M蔗糖的固体培养基上预培养3d；(3)茎尖预培养后，采用60％PVS2在25℃脱水60min，再用100％PVS2在0℃脱水90min，更换新的PVS2后直接投入液氮；(4)保存后，茎尖在37℃水浴中化冻。化冻后用MS+KT2mg/L+NAA0.5mg/L+1.2M蔗糖的液体培养基洗涤3次，每次10min。洗涤后的茎尖先暗培养5d(温度为25℃)再转入正常的光周期下(光照时间14h/d，光强约1500-2000lx，培养温度25℃)培养，15d左右茎尖可发育成正常的芽；(5)将萌发的芽转入生根培养基1/2MS+NAA0.1～0.5mg/L中培养，即可得到红芽芋脱毒苗。本发明与现有技术比较，红芽芋试管苗的脱毒率高，而且茎尖取材大、操作简单方便。
Description
技术领域：
本发明涉及一种植物种苗繁育方法，确切地说是江西铅山红芽芋玻璃化法超低温保存脱毒的一种方法。
背景技术：
红芽芋是江西省铅山县传统优势产品，种植历史悠久。近十余年来，这一优势产业发展迅速，已成为铅山县农民增收致富的主导产业，铅山县也成为江西省最大的红芽芋生产基地，2007年3月被中国绿色食品委员会和农业部命名为“红芽芋全国绿色食品标准化生产基地县”。然而，由于生产上的长期无性繁殖致使病毒日益积累，种性退化，产量、品质连年下降，给红芽芋生产造成较大损失。超低温保存是指在-80℃以下的超低温条件下保存植物种质的一整套生物技术。由于液氮温度可达-196℃，且经济方便，目前普遍用于植物的超低温保存。目前，超低温保存作为一种新的脱毒技术而备受人们关注，并已经在多种植物中得到证实。1997年，Brison等用超低温保存结合茎尖离体培养，成功去除了李属根状茎上的李痘病毒，脱毒率达到50％，比单纯的茎尖培养的脱毒率多了2倍多。2003年，Wang QC(王乔春)教授等用包埋-玻璃化法超低温保存成功去除了葡萄A病毒(GVA)，成功率高达97％，而单独的分生组织培养脱毒率仅为12％。2011年，Wang QC(王乔春)教授及其团队又用超低温保存成功脱除了甘薯病毒。2011年，王子成等也用超低温保存成功脱除了马铃薯病毒PVY和PVS，病毒脱除率分别达83％和47％。2012年，栾爱萍发现，非洲菊2.0mm茎尖超低温保存后，可完全脱除黄瓜花叶病毒(CMY)和烟草花叶病毒(TMV)。本研究以江西铅山红芽芋为试材，通过茎尖的玻璃化法超低温保存技术，获得红芽芋脱毒试管苗，并利用RT-PCR技术对其进行鉴定，对充分发挥和利用我国地方红芽芋资源优势，保护、开发我国道地蔬菜和丰富特色蔬菜种类有重要意义。
发明内容：
本发明的目的是提供一种简单方便脱毒率高的一种江西铅山红芽芋玻璃化法超低温保存脱毒的方法。实现本发明目的的技术方案是，一种江西铅山红芽芋玻璃化法超低温保存脱毒的方法，其特征在于有以下步骤：(1)在体视显微镜下切取江西铅山红芽芋单芽长约1mm的茎尖；(2)红芽芋茎尖在附加0.75M蔗糖的MS+KT2mg/L+NAA0.5mg/L固体培养基上预培养3d，培养条件为：光照时间14h/d，光强约1500-2000lx，培养温度25±2℃；(3)红芽芋茎尖预培养后，采用60％的冰冻保护剂PVS2(30％(w/v)甘油+15％(w/v)乙二醇+15％(w/v)二甲基亚砜+0.4M蔗糖，PH5.8)在25±2℃脱水60min，再用100％PVS2在0℃脱水90min，更换新的PVS2后，直接投入液氮1d；(4)从液氮中取出后，茎尖在37℃水浴中化冻。化冻后用附加1.2M蔗糖的MS+KT2mg/L+NAA0.5mg/L液体培养基在25±2℃下洗涤3次，每次10min。洗涤后的茎尖先暗培养5d(温度为25±2℃)再转入正常的光周期下(光照时间14h/d，光强约1500-2000lx，温培养度25±2℃)培养，半个月左右茎尖可发育成正常的芽；(5)将萌发的芽转入生根培养基1/2MS+NAA0.1～0.5mg/L中培养，即可得到江西铅山红芽芋脱毒苗，培养条件为：光照时间14h/d，光强约1500-2000lx，培养温度25±2℃。本发明与现有技术比较，红芽芋试管苗的脱毒率高，而且茎尖取材大、操作简单方便。
具体实施方式：
结合下述实施例对本发明作进一步说明：
(1)江西铅山红芽芋茎尖的切取
在体视显微镜下切取江西铅山红芽芋单芽长约1mm的茎尖。
(2)江西铅山红芽芋茎尖的预培养
红芽芋茎尖在附加0.75M蔗糖的MS+KT2mg/L+NAA0.5mg/L固体培养基上预培养3d，培养条件为：光照时间14h/d，光强约1500-2000lx，培养温度25±2℃。
(3)江西铅山红芽芋茎尖的脱水和液氮保存
红芽芋茎尖预培养后，采用60％的冰冻保护剂PVS2(30％(w/v)甘油+15％(w/v)乙二醇+15％(w/v)二甲基亚砜+0.4M蔗糖，pH5.8)在25±2℃脱水60min，再用100％PVS2在0℃脱水90min，更换新的PVS2后，直接投入液氮1d。
(4)江西铅山红芽芋茎尖的化冻和洗涤
从液氮中取出后，茎尖在37℃水浴中化冻。化冻后用附加1.2M蔗糖的MS+KT2mg/L+NAA0.5mg/L液体培养基在25±2℃下洗涤3次，每次10min。
(5)江西铅山红芽芋茎尖的冻后培养
洗涤后的茎尖先暗培养5d(温度为25±2℃)再转入正常的光周期下(光照时间14h/d，光强约1500-2000lx，温培养度25±2℃)培养，半个月左右茎尖可发育成正常的芽；将萌发的芽转入生根培养基1/2MS+NAA0.1～0.5mg/L中培养，即可得到江西铅山红芽芋脱毒苗，培养条件为：光照时间14h/d，光强约1500-2000lx，培养温度25±2℃。
(6)江西铅山红芽芋试管苗芋花叶病毒的检测
培养60d后对脱毒试管苗进行芋花叶病毒(DsMV)的RT-PCR检测，确定江西铅山红芽芋茎尖的玻璃化法超低温保存可脱除芋花叶病毒，脱毒率为89.6％。而常规的茎尖培养，脱毒率仅为62.5％。因此，采用本发明的玻璃化法超低温保存脱毒法对江西铅山红芽芋进行脱毒，不仅脱毒率高，而且茎尖取材大、操作简单方便。江西铅山红芽芋脱毒苗可直接驯化移栽，用于大田种植。
Claims (1)
1.江西铅山红芽芋玻璃化法超低温保存脱毒的方法，其特征在于有以下步骤：(1)在体视显微镜下切取江西铅山红芽芋单芽长约1mm的茎尖；(2)红芽芋茎尖在附加0.75M蔗糖的MS+KT2mg/L+NAA0.5mg/L固体培养基上预培养3d，培养条件为：光照时间14h/d，光强约1500-2000lx，培养温度25±2℃；(3)红芽芋茎尖预培养后，采用60％的冰冻保护剂PVS2(30％(w/v)甘油+15％(w/v)乙二醇+15％(w/v)二甲基亚砜+0.4M蔗糖，pH5.8)在25±2℃脱水60min，再用100％PVS2在0℃脱水90min，更换新的PVS2后，直接投入液氮1d；(4)从液氮中取出后，茎尖在37℃水浴中化冻。化冻后用附加1.2M蔗糖的MS+KT2mg/L+NAA0.5mg/L液体培养基在25±2℃下洗涤3次，每次10min。洗涤后的茎尖先暗培养5d(温度为25±2℃)再转入正常的光周期下(光照时间14h/d，光强约1500-2000lx，温培养度25±2℃)培养，半个月左右茎尖可发育成正常的芽；(5)将萌发的芽转入生根培养基1/2MS+NAA0.1～0.5mg/L中培养，即可得到江西铅山红芽芋脱毒苗，培养条件为：光照时间14h/d，光强约1500-2000lx，培养温度25±2℃。
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