CN109042335A - 一种快速生产葡萄脱毒种苗的培养基及组培量产方法 - Google Patents

一种快速生产葡萄脱毒种苗的培养基及组培量产方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种快速生产葡萄脱毒种苗的组织培养方法，该培养方法主要利用初代培养基、继代培养基和生根培养基进行培养。本申请通过优化培养基中生长激素组合及其浓度，同时通过优化组培方法，有效缩短了脱毒苗快速繁殖流程，提高了单位时间的繁殖系数，缩短移栽时间，使得从生根到移栽由原来的40d减少到30d左右，繁殖系数稳定在4.5，总体生根率稳定在100％左右，移栽成活率达到90％左右，表现出较好的组培生产效果。

Description

一种快速生产葡萄脱毒种苗的培养基及组培量产方法
技术领域
本发明涉及一种培养基及其组培方法，具体涉及一种快速生产葡萄脱毒种苗的培养基及组培量产方法。
背景技术
葡萄是水果中的珍品，是世界四大水果之一。截至2011年我国葡萄种植面积达828万亩，总产量843万吨。以现有的发展势头，再过7至10年，中国的葡萄“赤霞珠”面积将达到1000万亩，产量将突破1000万吨，总产量将位居世界第一。
赤霞珠(Cabernet Sauvignon)是世界著名的红葡萄酒品种之一。赤霞珠属欧亚种，别名：解百纳、解百纳索维浓，和蛇龙珠、品丽珠同姐妹系。赤霞珠葡萄是晚熟品种，皮厚而黑，果粒小，果皮和果汁比例比别的葡萄都高，所以它能酿造出颜色深、浓郁、单宁重的红葡萄酒。由它酿制的高档干红葡萄酒，淡宝石红，澄清透明，具青梗香，滋味醇厚，回味好，品质上等，是法国栽培最广的古老而传统的高档酿酒葡萄品种。
在实际生产中，葡萄“赤霞珠”易遭受多种真菌、细菌、病毒的侵染，易感霜霉病、白粉病、炭疽病等病害，严重影响葡萄“赤霞珠”的产量和质量，影响种植者的利益。
利用组织培养技术进行脱毒种苗的生产是生产优良葡萄“赤霞珠”种苗的重要手段。但是长期以来，脱毒苗生产受到了流程繁琐、周期长、技术难度大等因素的影响，导致了在生产中难于推广。同时，现有组培化生产研究中，由于不同物种组培条件不一，缺乏较为统一性的规律可以遵循，多侧重于针对不同物种、不同品种的培养基成分和培养条件的试验研究。
因此，对于葡萄“赤霞珠”脱毒苗快速繁殖组培体系，尚需进一步对培养基及对应的组织培养方法进行优化调整，以建立稳定的量产技术体系。
发明内容
本发明提供一种快速生产葡萄脱毒种苗的培养基，包括初代培养基、继代培养基和生根培养基，其特征在于,所述初代培养基以1/2MS为基本培养基，附加有：6-BA 0～0.4mg/L、IBA 0.2～1.3mg/L、蔗糖20～40g/L、琼脂5～7g/L；所述继代培养基以1/2MS为基本培养基，附加有蔗糖30～50g/L、琼脂5～7g/L，NAA 0.03～0.07mg/L、IBA0.2～0.5mg/L；所述生根培养基以1/2MS为基本培养基，附加有NAA 0.02～0.2mg/L，IBA 0.2～0.5mg/L、蔗糖20～40g/L、琼脂5～7g/L。
进一步，所述初代培养基具体为1/2MS培养基、6-BA 0.2mg/L、IBA0.5mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L；所述继代培养基具体为1/2MS培养基、蔗糖40g/L、琼脂6g/L、NAA 0.05mg/L、IBA0.5mg/L；所述生根培养基具体为1/2MS培养基、NAA 0.2mg/L、IBA 0.5mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L。
本发明还提供了一种葡萄脱毒苗快繁组织培养量产方法，其特征在于，该方法具体包括如下步骤：
(1)初代培养：以葡萄脱毒苗带腋芽茎段为外植体，灭菌后利用初代培养基进行初代培养，培养25～35天左右至形成若干不定芽丛；
(2)继代培养：切取步骤(1)中初代培养后的茎段，转接至继代培养基上，进行继代扩繁培养；
(3)生根、炼苗：切取步骤(2)中继代培养后生长健壮的单芽幼苗，接种到生根培养基上，诱导生根并进行生根炼苗培养；
(4)移栽：将步骤(3)中生根、炼苗后组培幼苗，进行移栽育苗。
进一步，所述步骤(2)中继代培养周期为2-4个周期，每个周期的时长为25～35天；
进一步，所述步骤(3)中，具体生根、炼苗培养时，根诱导的培养条件为：光照强度1500～4000Lx，光照时间6～12h/d，生根、炼苗时环境条件为：温度25～30℃，光照强度为5000～10000Lx，光照时间为自然光照时长。
进一步，所述步骤(3)中，接种生根培养基后，先培养8～20d进行诱导生根培养，然后将诱导后的幼苗置于外界环境中培养10～22d继续生长。
进一步，所述葡萄具体品种为“赤霞珠”。
本发明通过培养基配方的优化，较好解决了葡萄“赤霞珠”脱毒苗量产中流程繁、周期长、技术难度大等问题，在适宜的增殖和生根培养基上，经过优化继代培养方法、生根炼苗等技术细节，可较好提高生产效率，降低组培周期和组培成本，形成了较为稳定的组织培养量产新方法，具有较好的生产应用价值。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
一种快速生产葡萄脱毒种苗的培养基，包括初代培养基、继代培养基和生根培养基，所述初代培养基以1/2MS为基本培养基，附加有：6-BA 0mg/L、IBA 0.2mg/L、蔗糖20g/L、琼脂5g/L；所述继代培养基以1/2MS为基本培养基，附加有蔗糖30g/L、琼脂5g/L，NAA0.03mg/L、IBA0.2mg/L；所述生根培养基以1/2MS为基本培养基，附加有NAA 0.02mg/L，IBA0.2mg/L、蔗糖20g/L、琼脂5g/L。
采用上述培养基进行葡萄脱毒苗快繁组织培养量产方法，具体包括如下步骤：
(1)初代培养：以葡萄脱毒苗带腋芽茎段为外植体，灭菌后利用初代培养基进行初代培养，培养25～35天左右至形成若干不定芽丛；具体灭菌步骤可为：先初步清洗茎段(用肥皂水浸泡1～2min，自来水冲洗30min)；再拿至超净工作台上：先用无菌水冲洗2遍；再用75％酒精浸泡10s，然后无菌水冲洗2次；0.1％升汞(加入一滴吐温80)灭菌6～8min，无菌水冲洗6次(每遍1～2min)；最后取出茎段放在无菌滤纸上吸干水分，切去茎段基部及叶柄上端和受伤叶片，然后即可接种于使用；
(2)继代培养：切取步骤(1)中初代培养后的茎段，转接至继代培养基上，进行继代扩繁培养，继代培养周期为3个周期，每个周期的时长为30天；
(3)生根、炼苗：切取步骤(2)中继代培养后生长健壮的单芽幼苗，接种到生根培养基上，诱导生根并进行生根炼苗培养，具体生根、炼苗过程为：接种生根培养基后，在如下条件下：光照强度1500Lx，光照时间12h/d，温度25～30℃，先培养8d进行诱导生根培养，然后将诱导后的幼苗置于外界环境中培养10d继续生长，以适应外界环境；
(4)移栽：将步骤(3)中生根、炼苗后组培幼苗，进行移栽育苗。中生根炼苗后幼苗从培养瓶中取出，清水洗掉苗基部培养基，用800～1000倍多菌灵消毒2～3min，移入栽培基质(体积比，草炭：珍珠岩＝1:1)中，移栽初期扣小拱棚保温保湿，一周后逐渐掀开棚膜通风。
实施例2
一种快速生产葡萄脱毒种苗的培养基，包括初代培养基、继代培养基和生根培养基，所述初代培养基以1/2MS为基本培养基，附加有：6-BA0.4mg/L、IBA 1.3mg/L、蔗糖40g/L、琼脂7g/L；所述继代培养基以1/2MS为基本培养基，附加有蔗糖50g/L、琼脂7g/L，NAA0.07mg/L、IBA0.5mg/L；所述生根培养基以1/2MS为基本培养基，附加有NAA0.2mg/L，IBA0.5mg/L、蔗糖40g/L、琼脂7g/L。
采用上述培养基进行葡萄脱毒苗快繁组织培养量产方法，具体包括如下步骤：
(1)初代培养：以葡萄脱毒苗带腋芽茎段为外植体，灭菌后利用初代培养基进行初代培养，培养25～35天左右至形成若干不定芽丛；具体灭菌步骤可为：先初步清洗茎段(用肥皂水浸泡1～2min，自来水冲洗30min)；再拿至超净工作台上：先用无菌水冲洗2遍；再用75％酒精浸泡10s，然后无菌水冲洗2次；0.1％升汞(加入一滴吐温80)灭菌6～8min，无菌水冲洗6次(每遍1～2min)；最后取出茎段放在无菌滤纸上吸干水分，切去茎段基部及叶柄上端和受伤叶片，然后即可接种于使用；
(2)继代培养：切取步骤(1)中初代培养后的茎段，转接至继代培养基上，进行继代扩繁培养，继代培养周期为4个周期，每个周期的时长为25天；
(3)生根、炼苗：切取步骤(2)中继代培养后生长健壮的单芽幼苗，接种到生根培养基上，诱导生根并进行生根炼苗培养，具体生根、炼苗过程为：接种生根培养基后，在如下条件下：光照强度4000Lx，光照时间6h/d，温度25～30℃，先培养20d进行诱导生根培养，然后将诱导后的幼苗置于外界环境中培养22d继续生长，以适应外界环境；
(4)移栽：将步骤(3)中生根、炼苗后组培幼苗，进行移栽育苗。中生根炼苗后幼苗从培养瓶中取出，清水洗掉苗基部培养基，用800～1000倍多菌灵消毒2～3min，移入栽培基质(体积比，草炭：珍珠岩＝1:1)中，移栽初期扣小拱棚保温保湿，一周后逐渐掀开棚膜通风。
实施例3
一种快速生产葡萄脱毒种苗的培养基，包括初代培养基、继代培养基和生根培养基，所述初代培养基具体为1/2MS培养基、6-BA 0.2mg/L、IBA0.5mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L；所述继代培养基具体为1/2MS培养基、蔗糖40g/L、琼脂6g/L、NAA 0.05mg/L、IBA0.5mg/L；所述生根培养基具体为1/2MS培养基、NAA 0.2mg/L、IBA 0.5mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L。
采用上述培养基进行葡萄脱毒苗快繁组织培养量产方法，具体包括如下步骤：
(1)初代培养：以葡萄脱毒苗带腋芽茎段为外植体，灭菌后利用初代培养基进行初代培养，培养25～35天左右至形成若干不定芽丛；具体灭菌步骤可为：先初步清洗茎段(用肥皂水浸泡1～2min，自来水冲洗30min)；再拿至超净工作台上：先用无菌水冲洗2遍；再用75％酒精浸泡10s，然后无菌水冲洗2次；0.1％升汞(加入一滴吐温80)灭菌6～8min，无菌水冲洗6次(每遍1～2min)；最后取出茎段放在无菌滤纸上吸干水分，切去茎段基部及叶柄上端和受伤叶片，然后即可接种于使用；
(2)继代培养：切取步骤(1)中初代培养后的茎段，转接至继代培养基上，进行继代扩繁培养，继代培养周期为2个周期，每个周期的时长为35天；
(3)生根、炼苗：切取步骤(2)中继代培养后生长健壮的单芽幼苗，接种到生根培养基上，诱导生根并进行生根炼苗培养，具体生根、炼苗过程为：接种生根培养基后，在如下条件下：光照强度3000Lx，光照时间10h/d，温度25～30℃，先培养15d进行诱导生根培养，然后将诱导后的幼苗置于外界环境中培养15d继续生长，以适应外界环境；
(4)移栽：将步骤(3)中生根、炼苗后组培幼苗，进行移栽育苗。中生根炼苗后幼苗从培养瓶中取出，清水洗掉苗基部培养基，用800～1000倍多菌灵消毒2～3min，移入栽培基质(草炭：珍珠岩＝1:1)中，移栽初期扣小拱棚保温保湿，一周后逐渐掀开棚膜通风。
实施例4 6-BA浓度的确定
表1继代培养基A中不同6-BA浓度处理对苗的增殖影响
(实验处理组对应培养基配方中的IBA均为0.4mg/L)
需要说明的是，6-BA浓度确定原则应当是：确保继代增殖效果的稳定性，同时避免玻璃化现象的发生。基于此，对上表1结果分析可以看出，随着6-BA浓度的增加，增殖系数也逐渐增加，苗高也逐步增加，但总体而言，在6-BA浓度超过0.2mg/L时，继续增加时组培苗逐渐变弱，不利于继代或生根培养，因而综合确定6-BA浓度0.2mg/L为宜，此时更适于后续增根培养。
实施例5NAA浓度确定
需要明确和解释的是，NAA浓度对于种苗的发根率、增值系数和成苗率有显著的相关性，因此确定生根培养基NAA的浓度是关键内容之一。
对于不同生长激素NAA浓度下种苗的发根率、增值系数和成苗率进行观察统计，具体统计列表如下。
表2不同生长激素NAA浓度对种苗生根率、增值系数和成苗率的影响
从上表数据可以看出，最佳激素浓度及配比为第2组，NAA浓度为0.05mg/L时更有利于组培苗生长，此时组培苗生根率达到100％，繁殖系数4.5，成苗率达到60％，且生长速度较为一致、增殖和生长协调，因此选择生长激素NAA配比为0.05mg/L。
实施例6IBA浓度及激素配比的确定
需要明确和解释的是，IBA的浓度及IBA与NAA的配比对于种苗的发根率、增值系数和成苗率有显著的相关性，因此确定IBA的浓度及IBA与NAA的配比是关键内容之一。
对于不同生长激素浓度及配比下种苗的发根率、增值系数和成苗率进行观察统计，具体统计列表如下。
表3不同生长激素浓度及配比对种苗生根率、增值系数和成苗率的影响
从上表数据可以看出，最佳激素浓度及配比为第L8组，NAA浓度为0.05mg/L，IBA浓度为0.5mg/L时更有利于组培苗生长，此时平均增殖系数4.5，且生长速度较为一致、增殖和生长协调，因此选择生长激素NAA浓度为0.05mg/L，IBA浓度为0.5mg/L。
初步试验结果表明，本申请通过优化培养基中生长激素组合及其浓度，使得从生根到移栽由原来的40d左右减少到30d左右，使增殖系数稳定在4.5倍，总体生根率稳定在100％左右，移栽成活率达到90％左右，表现出较好的组培生产效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种快速生产葡萄脱毒种苗的培养基，包括初代培养基、继代培养基和生根培养基，其特征在于,所述初代培养基以1/2MS为基本培养基，附加有：6-BA 0～0.4mg/L、IBA 0.2～1.3mg/L、蔗糖20～40g/L、琼脂5～7g/L；所述继代培养基以1/2MS为基本培养基，附加有蔗糖30～50g/L、琼脂5～7g/L，NAA 0.03～0.07mg/L、IBA0.2～0.5mg/L；所述生根培养基以1/2MS为基本培养基，附加有NAA 0.02～0.2mg/L，IBA 0.2～0.5mg/L、蔗糖20～40g/L、琼脂5～7g/L。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述初代培养基具体为1/2MS培养基、6-BA 0.2mg/L、IBA0.5mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L；所述继代培养基具体为1/2MS培养基、蔗糖40g/L、琼脂6g/L、NAA 0.05mg/L、IBA0.5mg/L；所述生根培养基具体为1/2MS培养基、NAA0.2mg/L、IBA 0.5mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L。
3.利用权利要求1-2所述的培养基进行葡萄脱毒苗快繁组织培养量产方法，其特征在于，该方法具体包括如下步骤：
(1)初代培养：以葡萄脱毒苗带腋芽茎段为外植体，灭菌后利用初代培养基进行初代培养，培养25～35天左右至形成若干不定芽丛；
(2)继代培养：切取步骤(1)中初代培养后的茎段，转接至继代培养基上，进行继代扩繁培养；
(3)生根、炼苗：切取步骤(2)中继代培养后生长健壮的单芽幼苗，接种到生根培养基上，诱导生根并进行生根炼苗培养；
(4)移栽：将步骤(3)中生根、炼苗后组培幼苗，进行移栽育苗。
4.根据权利要求3所述的葡萄脱毒苗快繁组织培养量产方法，其特征在于，所述步骤(2)中继代培养周期为2-4个周期，每个周期的时长为25～35天。
5.根据权利要求3所述的葡萄脱毒苗快繁组织培养量产方法，其特征在于，所述步骤(3)中，具体生根、炼苗培养时，根诱导的培养条件为：光照强度1500～4000Lx，光照时间6～12h/d，生根、炼苗时环境条件为：温度25～30℃，光照强度为5000～10000Lx，光照时间为自然光照时长。
6.根据权利要求3所述的葡萄脱毒苗快繁组织培养量产方法，其特征在于，步骤(3)中，接种生根培养基后，先培养8～20d进行诱导生根培养，然后将诱导后的幼苗置于外界环境中培养10～22d继续生长。
7.根据权利要求3所述的葡萄脱毒苗快繁组织培养量产方法，其特征在于，所述葡萄具体品种为“赤霞珠”。
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