CN113907006B - 脱除猕猴桃褪绿环斑相关病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种脱除猕猴桃褪绿环斑相关病毒的方法，包括：取感染病毒的猕猴桃外植体，将猕猴桃外植体置于继代培养基中进行继代培养，以得到猕猴桃组培苗；将猕猴桃组培苗转移至光照培养箱进行热处理；切取经热处理后的猕猴桃组培苗的茎尖，将茎尖置于猕猴桃培养基中；对位于猕猴桃培养基中的茎尖置于培养间进行预培养；将预培养后的茎尖转入未使用的继代培养基中进行植株再生，以得到再生植株；取再生植株的叶片进行病毒检测；切取未感染病毒的再生植株的茎段进行继代培养，以得到未感染病毒的猕猴桃组培苗；对未感染病毒的猕猴桃组培苗进行生根移栽。本发明具有操作简单、脱毒率高、再生率高的优点，具有较好的技术效果和应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及猕猴桃脱毒技术领域，特别是涉及一种脱除猕猴桃褪绿环斑相关病毒的方法。
背景技术
近年来，随着猕猴桃种植面积的不断扩大以及猕猴桃的大范围连片种植，造成猕猴桃易于发生多种病害。猕猴桃是多年生果树，一旦被病毒(尤其是猕猴桃褪绿环斑相关病毒)侵染便会终生带毒，并且会通过不同的途径向周围的植株传播病毒。多年来，人们常常关注溃疡病对猕猴桃的危害，确忽略了病毒病对猕猴桃的潜在危害，造成田间大量猕猴桃植株被多种病毒混合侵染，严重影响了猕猴桃的产量和品质。
猕猴桃一旦被病毒感染便会终生带毒，没有较好的治疗方法，推广使用脱毒苗是解决猕猴桃病毒危害最经济有效的方法；然而，目前没有关于脱除猕猴桃病毒的方法。
发明内容
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种脱除猕猴桃褪绿环斑相关病毒的方法，包括如下步骤：取感染病毒的猕猴桃外植体，将所述猕猴桃外植体置于继代培养基中进行继代培养，以得到猕猴桃组培苗；将所述猕猴桃组培苗转移至光照培养箱进行热处理；切取经热处理后的所述猕猴桃组培苗的茎尖，将所述茎尖置于猕猴桃培养基中；对位于所述猕猴桃培养基中的所述茎尖置于培养间进行预培养；将预培养后的所述茎尖转入未使用的继代培养基中进行植株再生，以得到再生植株；取所述再生植株的叶片进行病毒检测；切取未感染病毒的所述再生植株的茎段进行继代培养，以得到未感染病毒的猕猴桃组培苗；对所述未感染病毒的猕猴桃组培苗进行生根移栽。
可选地，所述取感染病毒的猕猴桃外植体包括：从感染病毒的猕猴桃母株上切取长度为1-5㎝，且带有2～5个腋芽的茎段作为所述猕猴桃外植体。
可选地，所述继代培养基包括：MS、浓度为30g/L的蔗糖、浓度为7.5g/L的琼脂、浓度为0.5mg/L的6-BA及浓度为0.1mg/L的NAA，所述继代培养基的pH为5.8。
可选地，将所述猕猴桃组培苗转移至光照培养箱进行热处理的过程中，所述光照培养箱的光周期为15～20h，所述光照培养箱白天的温度为30～38℃，所述光照培养箱夜晚的温度为30～35℃，所述热处理的时间为20～30天。
可选地，所述切取经热处理后的所述猕猴桃组培苗的茎尖包括：将经热处理后的所述猕猴桃组培苗置于显微镜下，分别切取不同长度的所述茎尖。
可选地，所述对位于所述猕猴桃培养基中的所述茎尖置于培养间进行预培养包括：将位于所述猕猴桃培养基中的所述茎尖置于培养间黑暗处理1～5天后进行弱光培养。
可选地，将预培养后所述茎尖转入未使用的继代培养基中进行植株再生的时间为1～3个月。
可选地，所述切取未感染病毒的所述再生植株的茎段进行继代培养，以得到未感染病毒的猕猴桃组培苗包括：每间隔1～3个月切取未感染病毒的所述再生植株的茎段进行继代培养，以得到不同的未感染病毒的猕猴桃组培苗。
可选地，所述对所述未感染病毒的猕猴桃组培苗进行生根移栽包括：所述未感染病毒的猕猴桃组培苗生长至3～8cm后转移至1/2MS培养基中生根生长，生根生长1～3个月后转移至基质土中。
如上所述，本发明的脱除猕猴桃褪绿环斑相关病毒的方法，具有以下有益效果：本发明的脱除猕猴桃褪绿斑相关病毒的方法具有脱毒率高、再生率高、操作简单的优点，具有较好的技术效果和应用前景。
附图说明
图1为本发明的脱除猕猴桃褪绿环斑相关病毒的方法流程图。
图2为本发明的脱除猕猴桃褪绿环斑相关病毒的方法得到的再生植株的叶片的部分RT-PCR(Transcriptio-Polymerase Chain Reaction，反转录酶-聚合酶连锁反应)检测结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。在以下描述中界定的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案以及没有背离本发明的精神和范围的其他技术方案。
请参阅图1所示，本发明提供一种脱除猕猴桃褪绿环斑相关病毒的方法，所述脱除猕猴桃褪绿环斑相关病毒的方法包括如下步骤：
S1:取感染病毒的猕猴桃外植体，将所述猕猴桃外植体置于继代培养基中进行继代培养，以得到猕猴桃组培苗；
S2:将所述猕猴桃组培苗转移至光照培养箱进行热处理；
S3:切取经热处理后的所述猕猴桃组培苗的茎尖，将所述茎尖置于猕猴桃培养基中；
S4:对位于所述猕猴桃培养基中的所述茎尖置于培养间进行预培养；
S5:将预培养后的所述茎尖转入未使用的继代培养基中进行植株再生，以得到再生植株；
S6:取所述再生植株的叶片进行病毒检测；
S7:切取未感染病毒的所述再生植株的茎段进行继代培养，以得到未感染病毒的猕猴桃组培苗；
S8:对所述未感染病毒的猕猴桃组培苗进行生根移栽。
本发明的脱除猕猴桃褪绿斑相关病毒的方法具有脱毒率高、再生率高、操作简单的优点，具有较好的技术效果和应用前景。
在一个示例中，所述取感染病毒的猕猴桃外植体包括：从感染病毒的猕猴桃母株上切取长度为1-5㎝，且带有2～5个腋芽的茎段作为所述猕猴桃外植体。
具体的，所述猕猴桃外植体为从感染病毒的猕猴桃母株上切取的长度可以为2cm、3cm或4㎝等等，且带有3个、4个或5个腋芽的茎段，优先地，在本实施例中，所述猕猴桃外植体为从感染病毒的猕猴桃母株上切取的长度1～2cm，且带2～3个腋芽的茎段；具体的，所述猕猴桃外植体可以为从感染病毒的猕猴桃母株上切取的长度1cm，且带2个腋芽的茎段，也可以为从感染病毒的猕猴桃母株上切取的长度1cm，且带3个腋芽的茎段，还可以为从感染病毒的猕猴桃母株上切取的长度2cm，且带2个腋芽的茎段，还可以为从感染病毒的猕猴桃母株上切取的长度2cm，且带2个腋芽的茎段。
作为示例，所述继代培养基包括：MS(Murashige Skoog)、浓度为30g/L的蔗糖、浓度为7.5g/L的琼脂、浓度为0.5mg/L的6-BA(6-苄氨基嘌呤)及浓度为0.1mg/L的NAA(1-naphthlcetic acid，萘乙酸)，所述继代培养基的pH为5.8。
作为示例，将所述猕猴桃组培苗转移至光照培养箱进行热处理的过程中，所述光照培养箱的光周期为15～20h，所述光照培养箱白天的温度为30～38℃，所述光照培养箱夜晚的温度为30～35℃，所述热处理的时间为20～30天。
具体的，所述光照培养箱的光周期可以为16h、17h、18h或19h等等；优选地，在本实施例中，所述光照培养箱的光周期为16h。
具体的，所述光照培养箱白天的温度可以为32℃、34℃或36℃；优选地，在本实施例中，所述光照培养箱白天的温度为34℃。
具体的，所述光照培养箱夜晚的温度可以为32℃、33℃或34℃等等；优选地，在本实施例中，所述光照培养箱夜晚的温度为32℃。
具体的，所述热处理的时间可以为23天、25天或28天等等；优选地，在本实施例中，所述热处理的时间为25天。
作为示例，所述切取经热处理后的所述猕猴桃组培苗的茎尖包括：将经热处理后的所述猕猴桃组培苗置于显微镜下，分别切取不同长度的所述茎尖。
在一示例中，在超净工作台中，利用显微镜分别取长度为1.5mm，1.0mm及0.5mm的所述经热处理后的所述猕猴桃组培苗的茎尖置于所述猕猴桃培养基中。
作为示例，所述对位于所述猕猴桃培养基中的所述茎尖置于培养间进行预培养包括：将位于所述猕猴桃培养基中的所述茎尖置于培养间黑暗处理1～5天后进行弱光培养。
具体的，所述将位于所述猕猴桃培养基中的所述茎尖置于培养间黑暗处理的时间可以为2天、3天或4天后进行弱光培养；优选地，在本实施例中，所述将位于所述猕猴桃培养基中的所述茎尖置于培养间黑暗处理3天后进行弱光培养。
作为示例，将位于所述猕猴桃培养基中的所述茎尖置于培养间黑暗处理后进行弱光培养的时间可以为0.5周～1.5周；具体的，将位于所述猕猴桃培养基中的所述茎尖置于培养间黑暗处理后进行弱光培养的时间可以为4天、7天或10天等等。
作为示例，将预培养后所述茎尖转入未使用的继代培养基中进行植株再生的时间为1～3个月。
具体的，所述将预培养后所述茎尖转入未使用的继代培养基中进行植株再生的时间可以为1个月、2个月或3个月；优选地，在本实施例中，将预培养后所述茎尖转入未使用的继代培养基中进行植株再生的时间为2个月。
作为示例，所述切取未感染病毒的所述再生植株的茎段进行继代培养，以得到未感染病毒的猕猴桃组培苗包括：每间隔1～3个月切取未感染病毒的所述再生植株的茎段进行继代培养，以得到不同的未感染病毒的猕猴桃组培苗。
具体的，所述切取未感染病毒的所述再生植株的茎段的间隔的时间可以1个月、2个月或3个月进行继代培养，以得到不同的未感染病毒的猕猴桃组培苗；优选地，在本实施例中，所述切取未感染病毒的所述再生植株的茎段的间隔的时间为2个月进行继代培养，以得到不同的未感染病毒的猕猴桃组培苗。
作为示例，所述对所述未感染病毒的猕猴桃组培苗进行生根移栽包括：所述未感染病毒的猕猴桃组培苗生长至3～8cm后转移至1/2MS培养基中生根生长，生根生长1～3个月后转移至基质土中。
具体的，所述未感染病毒的猕猴桃组培苗生长的高度可以4cm、5cm、6cm或7cm后转移至1/2MS培养基中生根生长，生根生长可以为1个月、2个月或3个月后转移至基质土中；优选地，在本实施例中，所述未感染病毒的猕猴桃组培苗生长的高度为5cm后转移至1/2MS培养基中生根生长，生根生长为2个月转移至基质土中。
为了进一步说明所述脱除猕猴桃褪绿环斑相关病毒方法，对上述脱除猕猴桃褪绿环斑相关病毒方法得到的再生植株的叶片进行病毒检测，检测结果显示：热处理温度白天34℃，夜晚32℃处理时间分别25天和30天，结果猕猴桃苗成活率均95％以上，但是脱毒率没有差异；热处理温度白天36℃，夜晚34℃处理25天，结果猕猴桃苗成活率70％，脱毒率没有显著提高，所以最终选择热处理温度白天34℃，夜晚32℃，热处理时间为25天，此时0.5mm、1.0mm茎尖均可以实现100％脱毒，1.5mm茎尖可部分脱毒，脱毒率52％。所有茎尖再生率均为100％。
如图2所示，1、标志，2-7：检测结果没有条带，为阴性，说明经过脱毒处理后0.5mm和1.0mm茎尖再生的苗子都不含病毒，都能实现脱毒；8：为阳性对照，有亮带说明是阳性的，含有病毒。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (7)
1.一种脱除猕猴桃褪绿环斑相关病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
取感染病毒的猕猴桃外植体，将所述猕猴桃外植体置于继代培养基中进行继代培养，以得到猕猴桃组培苗；
将所述猕猴桃组培苗转移至光照培养箱进行热处理，所述光照培养箱的光周期为15~20h，所述光照培养箱白天的温度为30~38℃，所述光照培养箱夜晚的温度为30~35℃，所述热处理的时间为20~30天；
切取经热处理后的所述猕猴桃组培苗的茎尖，将所述茎尖置于猕猴桃培养基中；
对位于所述猕猴桃培养基中的所述茎尖置于培养间进行预培养；
将预培养后的所述茎尖转入未使用的继代培养基中进行植株再生，以得到再生植株；
取所述再生植株的叶片进行病毒检测，为再生植株的叶片进行RT-PCR检测；
切取未感染病毒的所述再生植株的茎段进行继代培养，以得到未感染病毒的猕猴桃组培苗；
对所述未感染病毒的猕猴桃组培苗进行生根移栽。
2.根据权利要求1所述的脱除猕猴桃褪绿环斑相关病毒的方法，其特征在于：所述取感染病毒的猕猴桃外植体包括：从感染病毒的猕猴桃母株上切取长度为1-5㎝，且带有2~5个腋芽的茎段作为所述猕猴桃外植体。
3.根据权利要求1所述的脱除猕猴桃褪绿环斑相关病毒的方法，其特征在于：所述继代培养基包括：MS、浓度为30 g/L的蔗糖、浓度为7 .5 g/L的琼脂 、 浓度为0.5 mg/L的6-BA及浓度为0.1 mg/L 的NAA，所述继代培养基的pH为5. 8。
4.根据权利要求1所述的脱除猕猴桃褪绿环斑相关病毒的方法，其特征在于：所述对位于所述猕猴桃培养基中的所述茎尖置于培养间进行预培养包括：将位于所述猕猴桃培养基中的所述茎尖置于培养间黑暗处理1~5天后进行弱光培养。
5.根据权利要求1所述的脱除猕猴桃褪绿环斑相关病毒的方法，其特征在于：将预培养后所述茎尖转入未使用的继代培养基中进行植株再生的时间为1~3个月。
6.根据权利要求1所述的脱除猕猴桃褪绿环斑相关病毒的方法，其特征在于：所述切取未感染病毒的所述再生植株的茎段进行继代培养，以得到未感染病毒的猕猴桃组培苗包括：每间隔1~3个月切取未感染病毒的所述再生植株的茎段进行继代培养，以得到不同的未感染病毒的猕猴桃组培苗。
7.根据权利要求1所述的脱除猕猴桃褪绿环斑相关病毒的方法，其特征在于：所述对所述未感染病毒的猕猴桃组培苗进行生根移栽包括：所述未感染病毒的猕猴桃组培苗生长至3~8cm后转移至1/2 MS培养基中生根生长，生根生长1~3个月后转移至基质土中。
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