CN110800734A - 一种野生稻茎尖的超低温保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种疣粒野生稻带根幼芽超低温保存及再生植株方法，具体的说，涉及一种疣粒野生稻带根幼芽的超低温保存方法，属植物细胞工程技术领域，超低温保存及再生植株的方法包括如下步骤：1.种子破休眠处理及胚性愈伤诱导；2.丛生芽的诱导；3.丛生芽的生根培养；4.带根幼芽的预培养；5.带根幼芽的包埋；6.带幼根芽的装载及玻璃化的处理；7.冷冻及解冻洗涤；8.恢复培养。本发明首次提出对疣粒野生稻带根幼芽成功进行超低温保存，保存后野生稻恢复生长状况良好。对野生稻及禾本科植物的超低温保存具有很好的参考价值。

Description

一种野生稻茎尖的超低温保存方法
技术领域
本发明涉及一种疣粒野生稻的保存方法，具体的说，涉及一种疣粒野生稻带根幼芽的超低温保存方法，属植物细胞工程技术领域。
背景技术
疣粒野生稻是原产中国的3种野生稻之一，是水稻育种和改良的重要遗传资源，具有极高的科学研究价值。当前迅速恶化的环境和不利的气候条件及人类现代急速扩张的经济活动导致了野生稻生境丧失及恶化、栖息地急剧减少；此外野生稻又具有柱头外露、异交结实率较高、种子休眠性强、落粒性强、发芽率低的生物学特性。这些因素使疣粒野生稻种面临灭绝的危险, 对野生稻遗传多样性的保护刻不容缓。目前，对疣粒野生稻的保护措施主要有就地保护和迁地保护（即以种子保存的种质厍、以种茎保存的种质圃）。
植物组织与细胞的培养为植物的种质保存开辟了新的途径。组织培养物能迅速大量繁殖, 再生植株可保持原有的遗传特性。而超低温保存（-196℃）下，植物的生物化学活性近乎停止，贮藏过程中的生理和遗传变化能够控制在最低限度内，避免了田间保存易受自然灾害影响而导致种质变异或毁灭，以及组织培养保存中因多次继代引起遗传性状变异或污染的危险，被认为是植物遗传资源长期保存的最优选择。
关于植物超低温保存的研究，保存技术的多样化与简易化方面不断取得进步，能够保存的植物物种数也在不断地增长，但多数集中在苹果、樱桃、柑桔、香蕉、木薯等木本植物以及马铃薯、红薯、草莓等经济植物为主的植物遗传资源的超低温保存。水稻的超低温保存自1979年Sala等首先报道水稻悬浮细胞的超低温保存后，相关研究多集中在组织培养物如悬浮细胞系、愈伤组织、原生质体及胚状体上，关于水稻完整器官（如茎尖）冻存的报道仅见章志宏等2000年采用程序降温法对水稻单倍体幼穗离体培养诱导的不定芽进行超低温保存，得到再生植株。野生稻的超低温保存技术相关报道更少且集中于国内，如殷晓辉等1996年等首次通过程序降温法对疣粒愈伤组织的超低温保藏，有效地提高了疣粒野生稻体外培养细胞的胚性。谭光轩等采用程序降温法对野生稻幼穗离体培养诱导植株，直接进行超低温保存，避开愈伤组织阶段减少遗传变异的危险，但产生的绿芽一周后白化死亡。
野生稻完整器官的冻存，将是今后研究的重点，便由于野生稻茎尖分生组织体积小、生理状态脆弱，保存中难以成活。林田等首次采取一系列措施，以提高茎尖的抗性，减少各步骤中的损伤，并采用液氮直投而非依赖程序降温仪的冷冻步骤，首次建立了普通野生稻的茎尖超低温保存体系，并于2018年获得专利（专利号：ZL 201610131944.1），其后，通过对方法的改进，通过田间样本预培养，组培脱菌培养及用丛生芽作为冻存材料，克服了原专利 1.内生菌污染严重。 2.茎尖剥取步骤技术要求高，难度大。 3.难以获得大量整齐一致的材料的问题，有效降低了内生菌污染率，简化了操作流程。在此基础上，又申请了药用野生稻专利：（申请号：201811280227.0）。但是，与普通野生稻不同，疣粒野生稻与栽培稻的亲缘关系较远，是一种典型的难培养植物，难以在短时间内获得大量整齐一致的材料。此外，虽然通过切取芽来简化操作步骤，但在切取过程中常由于操作不慎将芽的基盘切除，从而伤害附近的茎尖生长点，影响成活率。
发明内容
本发明的目的是提供一种疣粒野生稻带根幼芽的超低温保存方法及超低温保存后的恢复培养方法。
为了实现本发明的目的，本发明一种疣粒野生稻带根幼芽超低温保存方法，包括如下步骤：
步骤一. 种子破休眠处理及胚性愈伤体系建立：种子常规消毒后，用含5-10%PEG，200-500 mgL-1GA3的MS液体培养基浸种1-3天，接种含6-BA0.5-1mgL-1，2,4-D 0.5-2mgL-1 的MS培养基中诱导愈伤组织，每10-20天继代1次;
步骤二. 丛生芽诱导：取继代20天的胚性愈伤块，放入含6-BA0.5-2mgL-1，NAA0.1-0.5mgL-1 的MS 培养基中，约10-15天诱导出含2-3mm丛生芽的愈伤组织;
步骤三.丛生芽生根培养：取2-3mm的丛生芽，切除基盘愈伤组织，逐个芽接种到含NAA0.1-0.5mgL-1 的MS 培养基中，约3-5天诱导出1-2mm的新根；
步骤四.带根幼芽预培养：将带根部的芽整个转入含蔗糖0.3molL-1培养基上培养1-3天后，转入0.7molL-1及ABA0.5-5mgL-1的培养基上预培养1-3天;
步骤五.带根幼芽包埋：解剖镜下将芽的上部切除至2-3mm，保留根部，在2-4%的无钙离子海藻酸钠溶液中轻蘸，整齐放在5mm×20mm金属网状装载条上，每条装载条上5-10个芽，将装载条浸入含有0.1-0.3%氯化钙、0.4 molL-1蔗糖及2moL-1甘油的MS液体培养基（不含NH4 +）中，经10-30min固定后，将装载条在无菌滤纸上吸去多余液体；
步骤六. 带根幼芽装载及玻璃化处理：将固定好的带芽的装载条放于预处理溶液中装载16hr后转入玻璃化保护剂PVS2（不含NH4 +）中进行2-5hr的冰浴处理；
步骤七.冷冻及解冻洗涤：将带芽的装载条迅速投入液氮中保存。
本发明首次对疣粒野生稻带根幼芽成功进行超低温保存，保存后野生稻恢复生长状况良好。
由于野生稻外植体为田间采样，存在如下缺点，（1）.内生菌污染难以控制，（2）野生稻的茎尖组织具有细小、幼嫩的特点，且被外部护叶层层紧密包裹，在茎尖剥取、预培养及玻璃化冻存操作中易折断及受到伤害，在其后的恢复培养中也不易再生或产生白化苗。（3）从田间采样到适宜冻存的材料获得周期太长，难以获得大量整齐一致的材料，不利于冻存的数量及质量控制。
根据上述的技术缺陷，本发明采取的措施有：（1）通过种子破休眠处理，获得大量胚性愈伤组织，从而诱导丛生幼芽，获得大量整齐一致的无菌材料；（2）将带根的幼芽整体作为冻存材料，省去了野生稻茎尖剥取的繁琐技术手段，由于保留了根部组织，进一步避免由于切取操作中对于茎尖生长点的破坏；（3）根部由于对高渗透压的预培养条件及玻璃化试剂耐受性更强，进一步提高了成活率，从而最终得到疣粒野生稻的再生植株。这一方法对建立便捷稳定高效的野生稻超低温保存体系，从而有利于野生稻资源规模保存，构建野生资源库，具有很好的参考价值。
本发明采用种子胚性愈伤组织诱导出的疣粒野生稻带根幼芽作为冻存材料，省去了进一步降低了操作难度，简化了操作流程及处理时间，便捷高效，有利于规模化保存，为建立野生稻低温保存资源库作了技术储备。
附图说明
图1 疣粒野生稻超低温保存流程图；
图2 野生稻丛生芽诱导与冷冻复苏；
图2中：a: 疣粒野生稻胚性愈伤及诱导的丛生芽；b：疣粒野生稻带根幼芽及细部；c：固定野生稻装载条；d: 冻后恢复培养再生芽。
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。
实施例1、野生稻的消毒及破休眠处理
取野生稻种子,用70%酒精消毒1 min，0.1%的次氯酸钠消毒15 min，无菌水冲洗若干次后，用含5%PEG，200 mgL-1GA3的MS液体培养基室温黑暗条件中浸种2天。
实施例2、野生稻的胚性愈伤诱导
取实施例1处理过的种子，接种含6-BA0.5mgL-1，2,4-D 2mgL-1 的MS培养基中诱导愈伤组织，培养温度为25±2℃, 黑暗培养。约20天可见白色粒状愈伤组织，将其由种子剥离，转移到新培养基上，每10-20天继代1次;
实施例3、野生稻丛生芽诱导及生根培养
取实施例2获得的胚性愈伤组织，放入含6-BA0.5mgL-1，NAA0.1mgL-1 的MS 培养基中，培养温度为25±2℃, 光照12 h·d-1，光照强度36 µmol m-2 s-1，约10-15天诱导出含2-3mm丛生芽的愈伤组织。取2-3mm的丛生芽，切除基盘愈伤组织，逐个芽接种到含NAA0.1mgL-1 的MS 培养基中，约3-5天诱导出1-2mm的新根。

Claims (4)

1.一种疣粒野生稻带根幼芽的超低温保存方法，包括如下步骤：
步骤一. 种子破休眠处理及胚性愈伤体系建立：种子常规消毒后，用含5-10%PEG，200-500 mgL-1GA3的MS液体培养基浸种1-3天，接种含6-BA0.5-1mgL-1，2,4-D 0.5-2mgL-1 的MS培养基中诱导愈伤组织，每10-20天继代1次;
步骤二.丛生芽诱导：取继代20天的胚性愈伤块，放入含6-BA0.5-2mgL-1，NAA0.1-0.5mgL-1 的MS 培养基中，约10-15天诱导出含2-3mm丛生芽的愈伤组织;
步骤三.丛生芽生根培养：取2-3mm的丛生芽，切除基盘愈伤组织，逐个芽接种到含NAA0.1-0.5mgL-1 的MS 培养基中，约3-5天诱导出1-2mm的新根；
步骤四.带根幼芽预培养：将带根部的芽整个转入含蔗糖0.3molL-1培养基上培养1-3天后，转入0.7molL-1及ABA0.5-5mgL-1的培养基上预培养1-3天；
步骤五.带根幼芽包埋：解剖镜下将芽的上部切除至2-3mm，保留根部，在2-4%的无钙离子海藻酸钠溶液中轻蘸，整齐放在5mm×20mm金属网状装载条上，每条装载条上5-10个芽，将装载条浸入含有0.1-0.3%氯化钙、0.4 molL-1蔗糖及2moL-1甘油的MS液体培养基（不含NH4 +）中，经10-30min固定后，将装载条在无菌滤纸上吸去多余液体；
步骤六. 带根幼芽装载及玻璃化处理：将固定好的带芽的装载条放于预处理溶液中装载16hr后转入玻璃化保护剂PVS2（不含NH4+）中进行2-5hr的冰浴处理；
步骤七.冷冻及解冻洗涤：将带芽的装载条迅速投入液氮中保存。
2.一种疣粒野生稻带根幼芽的超低温保存的恢复培养方法，其特征在于，消毒后种子常规用含5-10%PEG，200-500 mgL-1GA3的MS液体培养基浸种1-3天进行破休眠处理。
3.根据权利要求2所述的疣粒野生稻带根幼芽的超低温保存方法的恢复培养方法，其特征在于，冻存材料为带1-2mm新根的2-3mm的幼芽。
4.根据权利要求2所述的一种疣粒野生稻带根幼芽的超低温保存的恢复培养方法，其特征在于，冻存材料的恢复培养方法包括：
（1）胚性愈伤块诱导出含2-3mm丛生芽的愈伤组织；
（2）切除基盘愈伤组织，逐个芽接种到含NAA的MS 培养基的新根；（3）将带根部芽转入含蔗糖0.3molL-1培养基上培养1-3天后，转入0.7molL-1及ABA0.5-5mgL-1的培养基上预培养1-3天。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111887154A (zh) * 2020-06-12 2020-11-06 江苏省中国科学院植物研究所 一种德国鸢尾胚性愈伤组织低温保存的方法
CN115490662A (zh) * 2022-09-16 2022-12-20 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所 一种疣粒野生稻中黄酮类化合物的提取方法
CN116098027A (zh) * 2022-12-14 2023-05-12 广东省农业科学院水稻研究所 一种野生稻异位盆栽保存方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101642052A (zh) * 2009-09-02 2010-02-10 浙江省农业科学院 一种快速繁育疣粒野生稻的方法
CN105393916A (zh) * 2015-10-22 2016-03-16 广西壮族自治区农业科学院水稻研究所 一种疣粒野生稻离体幼胚培养基
CN105746351A (zh) * 2016-03-09 2016-07-13 上海市农业生物基因中心 一种野生稻茎尖的超低温保存及恢复培养方法
CN106305420A (zh) * 2016-08-19 2017-01-11 宁波市农业科学研究院 药用野生稻胚拯救后代快速繁殖的培养基及方法
CN109380216A (zh) * 2018-10-30 2019-02-26 上海市农业生物基因中心 一种药用野生稻茎尖的超低温保存及恢复培养方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101642052A (zh) * 2009-09-02 2010-02-10 浙江省农业科学院 一种快速繁育疣粒野生稻的方法
CN105393916A (zh) * 2015-10-22 2016-03-16 广西壮族自治区农业科学院水稻研究所 一种疣粒野生稻离体幼胚培养基
CN105746351A (zh) * 2016-03-09 2016-07-13 上海市农业生物基因中心 一种野生稻茎尖的超低温保存及恢复培养方法
CN106305420A (zh) * 2016-08-19 2017-01-11 宁波市农业科学研究院 药用野生稻胚拯救后代快速繁殖的培养基及方法
CN109380216A (zh) * 2018-10-30 2019-02-26 上海市农业生物基因中心 一种药用野生稻茎尖的超低温保存及恢复培养方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Y. GONG, T. BORROMEO AND B.-R. LU: "A biosystematic study of the Oryza meyeriana complex (Poaceae)", 《PLANT SYSTEMATICS AND EVOLUTION》 *
王亦菲等: "普通野生稻和疣粒野生稻离体无性系的建立(简报)", 《上海农业学报》 *
章志宏等: "水稻单倍体不定芽超低温保存和植株再生及其遗传稳定性研究", 《武汉植物学研究》 *
陈家裘等: "几种作物种子破休眠法试验", 《广西农业科学》 *
陈成斌: "野生稻资源安全保存技术", 《种子世界》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111887154A (zh) * 2020-06-12 2020-11-06 江苏省中国科学院植物研究所 一种德国鸢尾胚性愈伤组织低温保存的方法
CN115490662A (zh) * 2022-09-16 2022-12-20 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所 一种疣粒野生稻中黄酮类化合物的提取方法
CN115490662B (zh) * 2022-09-16 2023-06-23 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所 一种疣粒野生稻中黄酮类化合物的提取方法
CN116098027A (zh) * 2022-12-14 2023-05-12 广东省农业科学院水稻研究所 一种野生稻异位盆栽保存方法

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