PT996327E - Sistema de regeneração para uvas e sua utilização - Google Patents

Description

ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Sistema de regeneração para a videira e suas utilizações"

ANTECEDENTES DO INVENTO O presente invento refere-se a métodos para regeneração de videiras e ao germoplasma da videira produzido utilizando tais métodos. A videiras são uma cultura de fruto temperada caduca de origem ancestral. A produção de uva (65xl06 toneladas) excede a de qualquer outra cultura de fruto temperada e classifica-se em terceiro lugar atrás da produção de Citrus e de banana. Adicionalmente, devido às suas utilizações como fruta fresca, sumo, geleia, passas e vinho, as uvas ultrapassam em valor todas as outras culturas fruticolas. Por essa razão, é provável que esforços bem sucedidos para melhorar as videiras tenham um grande impacto na viticultura comercial.

Os métodos actuais para melhoramento de videiras são demorados e de trabalho intensivo. Por exemplo, o melhoramento genético em videiras através de reprodução convencional é grandemente limitado por vários factores tais como a idade até à maturação sexual e os niveis variáveis de ploidia. As videiras cultivadas são também altamente heterozigóticas e geralmente não se criam como variedades puras a partir de sementes. Para além disso, os programas de melhoramento de videiras são projectos dispendiosos de longo prazo. Embora a biotecnologia de plantas seja uma alternativa atractiva para o melhoramento genético em videiras (Kuksova et al., Plant Cell Tiss. Org. Cult. 49: 17-27, 1997), a manipulação genética in vitro apenas pode ser considerada se houver um sistema de regeneração eficaz. Assim, métodos que reduzam qualquer um destes problemas representariam um significativo avanço na arte. WO 93/23529 descreve uma cultura estabilizada de agregados celulares pró-embriogénicos de porta-enxertos de videiras 41B arquivada como PL92042917 na colecção ECACC, suas variantes e culturas derivadas, um processo para multiplicação desta cultura permitindo-lhe conservar o seu poder 2 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ embriogénico e ο seu estado estabilizado, um processo para o desenvolvimento de embriões a partir de uma estirpe pró-embriogénica para utilizar em técnicas de regeneração de cepas e uma cepa regenerada e utilização da cultura estabilizada, especialmente para a transformação de células pró-embriogénicas através de um vector adequado.

Coutos-Thevenot et al. {Plant Cell Tissue and Organ Culture 29: 125-133, 1992) relatam embriogénese somática a partir de células de videira e melhoramento do desenvolvimento embrionário através de mudanças nas condições de cultura.

Jayasankar et al. {“In vitro Celular and Developmental Biology", vol. 34, Março de 1998, pág. 51A) relatam a selecção in vitro de videiras pela resistência ao fungo da antracnose, Elsinoê ampelina.

Gray & Beneton {Hortscience 26(6): 156, 1991) relatam culturas celulares embriogénicas perenes de videiras e Gray (American Journal of Botany 79(5): 542-546, 1992) relatam embriogénese somática e regeneração de plantas a partir embriões zigóticos imaturos de cultivares de videira Muscadine (Vitis rotundifolia).

SUMÁRIO DO INVENTO

Estabelecemos métodos para criação de culturas embriogénicas perenes de videira e para criação de grandes quantidades de embriões somáticos de videira a partir de tais culturas embriogénicas perenes num período relativamente curto. Várias vantagens são proporcionadas pelos presentes métodos. Estas abordagens, por exemplo, facilitam uma frequência extraordinariamente elevada de formação de embriões somáticos e regeneração de plantas. Tais frequências não foram anteriormente relatadas para a regeneração de videira de qualquer cultivar conhecida e tornam o método útil para a produção em larga escala de reservas de plantação clonal de videiras. Adicionalmente, os métodos produzem embriões livres de anomalias comuns tais como fusão e fasciações de embriões somáticos. Os métodos do presente invento resultam também em maior frequência de iniciação de cultura embriogénica, permitindo a produção de culturas altamente embriogénicas que 3 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ podem então prosseguir com sucesso para estádios subsequentes do processo de regeneração até ao nível da planta inteira. Devido a estas vantagens, os métodos do presente invento são especialmente úteis na aplicação da biotecnologia para o melhoramento genético desta cultura.

Num primeiro aspecto o presente invento é dirigido a um método de produção de uma cultura embriogénica perene de videira, compreendendo o referido método os passos de: a) cultivar um tecido de explante de videira num meio de iniciação de cultura, em que o referido meio inclui pelo menos 0,01 mg/1 de uma citocinina; pelo menos 0,1 mg/1 de um hidrato de carbono; e pelo menos 0,1 mg de um composto azotado, b) identificar visualmente uma célula embriogénica ou uma massa celular embriogénica a partir de uma primeira cultura do explante de videira em que as referidas célula ou células embriogénicas da referida massa celular embriogénica identificadas visualmente são identificadas como tendo uma cor branco a amarelo pálido, uma aparência granular friável e sendo compactas e ricas em citoplasma, c) transferir a referida célula embriogénica ou massa celular embriogénica identificada visualmente do passo (b) para uma segunda cultura; d) permitir que a referida célula embriogénica ou massa celular embriogénica transferidas do passo (c) se dividam em mais células embriogénicas ou massas celulares embriogénicas; e) identificar visualmente uma célula embriogénica ou massa celular embriogénica do passo (d), em que as referidas célula ou células embriogénicas visualmente identificadas da referida massa celular embriogénica do passo (d) são identificadas como tendo uma cor branco a amarelo pálido e uma aparência granular friável, e f) transferir a referida célula embriogénica ou massa celular embriogénica identificadas e seleccionadas do passo (e) para uma terceira cultura, produzindo deste modo uma cultura embriogénica perene de videira, em que o referido explante é obtido a partir de anteras, tecido vegetativo, gavinhas, folhas, raízes, tecido nucelar, 4 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ caules, protoplastos, periciclo, tecido do meristema apical e embriões somáticos.

Noutra concretização o método é dirigido à produção de um embrião somático de videira e compreende ainda os passos de: g) recuperar uma célula embriogénica a partir da referida cultura embriogénica perene de videira; h) transferir a referida célula embriogénica para uma nova cultura; e i) criar um embrião somático de videira a partir da referida célula embriogénica.

Noutra concretização o método é dirigido à selecção de um embrião somático de videira possuindo resistência a um patogénio de plantas e compreende ainda os passos de: g) cultivar a cultura celular embriogénica perene do passo (f) num primeiro meio de cultura líquido para produzir uma cultura celular em suspensão, compreendendo o referido primeiro meio de cultura líquido um regulador do crescimento vegetal e um filtrado de uma cultura de patogénio de plantas, em que o referido filtrado ou uma toxina purificada é obtido a partir de um virus, nematode, insecto, fungo, micoplasma ou bactéria; h) recuperar uma célula de videira ou um grupo de células de videira a partir da referida cultura celular em suspensão; i) cultivar a referida célula de videira ou grupo de células de videira num segundo meio de cultura liquido para produzir um embrião somático de videira; e j) recuperar o referido embrião somático de videira possuindo resistência ao referido patogénio de plantas.

Outras concretizações do presente invento são divulgadas nas reivindicações.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura IA é uma fotografia de uma placa de cultura de plantas mostrando a massa embriogénica de "Chardonnay" obtida a partir de um meio de cultura líquido. Esta fotografia foi 5 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ tirada aproximadamente dez semanas após o início de uma cultura celular líquida. A Figura 1B é uma fotografia de uma placa de cultura de plantas mostrando embriões somáticos no estádio de cotilédones. Esta fotografia foi tirada aproximadamente doze semanas após o início do desenvolvimento embrionário. A Figura 1C é uma fotografia de uma placa de cultura de plantas mostrando embriões somáticos a começarem a germinar precocemente em cultura líquida. Note-se o alongamento das raízes em muitos embriões. Esta fotografia foi tirada aproximadamente vinte semanas após o início do desenvolvimento embrionário. A Figura 1D é uma fotografia de uma placa de cultura de plantas mostrando os estádios iniciais da diferenciação de embriões somáticos num meio sólido após cinco semanas de cultura. Estes embriões somáticos foram obtidos a partir de massas celulares embriogénicas que foram cultivadas num meio líquido (da Figura IA). A Figura 1E é uma fotografia de uma placa de cultura de plantas mostrando os estádios iniciais do desenvolvimento de embriões somáticos num meio sólido. Os embriões somáticos muito iniciais são hialinos e começam a tornar-se opacos após alguns dias. A Figura 1F é uma fotografia de uma placa de cultura de plantas mostrando embriões somáticos maduros que germinam num meio basal MS com sacarose a 3%.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Desenvolvemos um método para a criação de culturas embriogénicas perenes de videira que é útil para a regeneração de videiras. Observou-se que o germoplasma único resultante do nosso sistema de cultura produz plantas de videiras com uma maior capacidade para recriar culturas embriogénicas. Para além disso, desenvolvemos um processo para criação de grandes quantidades de embriões somáticos de videira a partir de tais 6 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ culturas embriogénicas perenes num período relativamente curto utilizando uma cultura em suspensão líquida.

Os termos aqui utilizados são definidos como se segue:

Por "cultura embriogénica perene de videira" entenda-se uma cultura embriogénica na qual as células ou massas celulares embriogénicas foram repetidamente seleccionadas, subcultivadas e mantidas como uma cultura in vitro. Tais culturas embriogénicas perenes de videira são mantidas durante pelo menos meio ano, de preferência três anos e de maior preferência quatro ou mais anos.

Por "célula embriogénica", "massa celular embriogénica" ou "culturas embriogénicas" entenda-se uma célula ou colecção de células possuindo o potencial intrínseco de se desenvolver num embrião somático e, finalmente, numa planta. Tipicamente tais células possuem um núcleo grande e um citoplasma denso. Adicionalmente, tais células são totipotentes por possuírem todo o potencial genético e estrutural para se tornarem finalmente uma planta inteira.

Por "maior nível de embriogénese" entenda-se uma maior capacidade para produzir uma célula embriogénica ou uma massa celular embriogénica numa cultura embriogénica perene de videira que o nível de uma cultura embriogénica não perene de videira de controlo. Em geral, um tal maior nível de embriogénese é de pelo menos 20%, de preferência 50%, sendo preferível 100% e de maior preferência 250% ou mais do nível de uma cultura embriogénica de controlo. O nível de embriogénese é medido utilizando métodos convencionais.

Por "explante" entenda-se um órgão, tecido ou célula derivado de uma planta e cultivado in vitro com o fim de iniciar uma cultura de células vegetais ou uma cultura de tecidos vegetais. Por exemplo, o tecido de explante da videira pode ser obtido a partir de virtualmente qualquer parte da videira incluindo, sem limitação, anteras, ovários, óvulos, tecido floral, tecido vegetativo, gavinhas, folhas, raízes, tecido nucelar, caules, sementes, protoplastos, periciclo, tecido do meristema apical, tecido embriogénico, embriões somáticos e embriões zigóticos. 7 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ

Por "regulador do crescimento vegetal" entenda-se um composto que afecta o crescimento e a divisão das células vegetais. Reguladores do crescimento vegetal preferidos incluem auxinas ou citocininas naturais ou sintéticas. Auxinas exemplares incluem, mas não se limitam a, NOA, 2,4-D, NAA, IAA, dicamba e picloram. Citocininas exemplares incluem, mas não se limitam a, BA e zeatina.

Por "embriogénese somática" entenda-se o processo de iniciação e desenvolvimento de embriões in vitro a partir de células e tecidos vegetais sem reprodução sexual.

Por "embrião somático" entenda-se um embrião formado in vitro a partir de células somáticas ou células embriogénicas através de divisão celular mitótica.

Por "embrião somático maduro" entenda-se um embrião completamente desenvolvido com evidências de ápices de raízes e rebentos e exibindo uma estrutura bipolar. Os embriões somáticos maduros preferidos são aqueles com cotilédones bem definidos.

Por "plântula" entenda-se uma pequena planta em germinação derivada de um embrião somático.

Por "regeneração" entenda-se a produção de um órgão, embrião, ou planta inteira em cultura de tecidos vegetais.

Por "patogénio" entenda-se um organismo cuja infecção de tecido vegetal viável desencadeia uma resposta de doença no tecido vegetal. Tais patogénios incluem, sem limitação, bactérias, micoplasmas, fungos, insectos, nematodes, vírus e viróides. As doenças de plantas causadas por estes patogénios estão descritas nos Capítulos 11-16 de "Agrios, Plant Pathology", 3a ed., Academic Press, Inc., New York, 1988. Exemplos de patogénios bacterianos incluem, sem limitação, Agrobacterium vitis, Agrobacterium tumefaciens, Xylella fastidosa e Xanthomonas ampelina. Exemplos de patogénios fúngicos incluem, sem limitação, Uncinula necator, Plasmopara vitícola, Botrytis cinerea, Guignardia bidwellii, Phomophsis vitícola, Elsinoê ampelina, Eutypa lata, Armillaria mellea e Verticllium dahliae. Exemplos de nematodes patogénicos 8 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ incluem, sem limitação, nematodes de nódulos da raiz (por exemplo, Meloidogyne sp.), nematodes de quistos (por exemplo, Heterodera sp.), nematodes de ataque à raiz (por exemplo, Rotylenchulus reniformis), e nematodes da superfície do solo (por exemplo, Anguina funesta). Exemplos de pragas patogénicas (p. ex., insectos) incluem, sem limitação, Phylloxera, Coleoptera, Lepidoptera, Homoptera, Dermptera e Diptera. Exemplos de patogénios virais incluem, sem limitação, o virus da degenerescência infecciosa da videira e o virus do enrolamento clorótico da videira.

Por "maior nivel de resistência" entenda-se um maior nivel de resistência ou tolerância a um patogénio ou praga causador de doença numa videira resistente (ou garfo, porta-enxerto, célula ou semente desta) que o nivel de resistência ou tolerância ou ambos relativamente a uma planta de controlo (i.e., uma videira que não foi sujeita a selecção in vitro a qualquer patogénio de plantas ou filtrado contendo uma toxina deste) . Em concretizações preferidas, o nivel de resistência numa planta resistente do presente invento é pelo menos 5-10% (e de preferência 30% ou 40%) superior à resistência de uma planta de controlo. Noutras concretizações preferidas, o nível de resistência a um patogénio causador de doença é 50% superior, 60% superior e de preferência mesmo 75% ou 90% superior ao nivel de resistência de uma planta de controlo; sendo preferível até 100% acima do nivel de resistência em comparação com o nível de resistência de uma planta de controlo. O nivel de resistência ou tolerância é medido utilizando métodos convencionais. Por exemplo, o nível de resistência a um patogénio pode ser determinado através da comparação dos traços e caracteristicas fisicas (por exemplo, altura e peso da planta, ou através da comparação de sintomas de doença, por exemplo, desenvolvimento atrasado da lesão, tamanho reduzido da lesão, emurchecimento, enrugamento e encaracolamento das folhas, declínio dos cachos de fruta, manchas saturadas de água, queimaduras da folha e queimaduras marginais, e descoloração das células) das videiras resistentes com as videiras de controlo.

Por "transformada" entenda-se qualquer célula que inclua uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, uma sequência de ADN) que é inserida através de um artifício numa célula e se 9 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ torna parte do genoma do organismo (de um modo integrado ou extracromossómico, por exemplo, uma construção de expressão virai que inclua um promotor subgenómico) que se desenvolve a partir dessa célula. Tal como é aqui utilizado, os organismos ou células transformados são geralmente videiras ou componentes de videiras transformados e a molécula de ácido nucleico (por exemplo, um transgene) é inserida através de um artificio nos compartimentos nuclear ou plastidico da célula vegetal.

Por "transgene" entenda-se qualquer peça de uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, ADN) que é inserida através de um artificio numa célula, e se torna parte do organismo (integrada no genoma ou mantida extracromossomicamente) que se desenvolve a partir dessa célula. Um tal transgene pode incluir um gene que seja parcialmente ou inteiramente heterólogo (i.e., estranho) ao organismo transgénico ou possa representar um gene homólogo a um gene endógeno do organismo.

Os métodos de regeneração aqui descritos foram utilizados para a regeneração com sucesso através de embriogénese somática de uma variedade de cultivares de porta-enxertos e de garfos de videira, incluindo Autumn Seedless, Blanc du Bois, Cabernet Franc, Cabernet Sauvignon, Chardonnay (p. ex., CH 01 e CH 02), Dolcetto, Merlot, Pinot Noir (p. ex., PN e PN Dijon), Semillon, White Riesling, Lambrusco, Stover, Thompson Seedless, Niagrara Seedless, Seval Blanc, Zinfindel, Vitis rupestris St. George, Vitis rotundifolia Carlos, Vitis rotundifolia Dixie, Vitis rotundifolia Fry e Vitis rotundifolia Welder.

Utilizando os métodos de cultura de tecidos vegetais aqui descritos, desenvolvemos também métodos de selecção in vitro que permitem aos peritos na arte desenvolver videiras resistentes a plantas. Uma dessas aplicações é a selecção de mutações nas culturas celulares de videira. Neste pedido, as células que são resistentes ou susceptíveis a uma determinada condição são seleccionadas com base num crescimento maior ou selectivo. As células podem ainda ser expostas a um mutagénio que resulta em mudanças no ADN das células expostas. O ADN mutado pode então ser identificado utilizando técnicas padrão. Uma segunda aplicação relacionada é a selecção de células 10 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ resistentes a patogénios. As células são cultivadas na presença de um patogénio. As células que apresentam resistência podem então ser utilizadas para regenerar uma planta resistente ao patogénio. Uma terceira aplicação é a transferência de informação genética para células de videira. A informação genética pode incluir uma sequência de ácido nucleico codificando um marcador seleccionável. A cultura de células na presença da pressão selectiva resulta na proliferação ou sobrevivência apenas das células que possuem a informação genética desejada. Os métodos aqui descritos permitem também aos peritos na arte desenvolver, seleccionar e propagar variantes de videira possuindo características novas ou úteis.

Os métodos do presente invento são geralmente aplicáveis a várias videiras (por exemplo, Vitis sps., híbridos de Vitis sps. e todos os membros dos subgéneros Euvitis e Muscadinia), incluindo cultivares de garfos ou porta-enxertos. Cultivares de garfos exemplares incluem, sem limitação, as que são referidas como uvas de mesa ou passas Alden, Almeria, Anab-E-Shahi, Autumn Black, Beauty Seedless, Black Corinth, Black Damascus, Black Malvoisie, Black Prince, Blackrose, Bronx Seedless, Burgrave, Calmeria, Campbell Early, Canner, Cardinal, Catawba, Christmas, Concord, Dattier, Delight, Diamond, Dizmar, Duchess, Early Muscat, Emerald Seedless, Emperor, Exotic, Ferdinand de Lesseps, Fiesta, Flame seedless, Flame Tokay, Gasconade, Gold, Himrod, Hunisa, Hussiene, Isabella, Italia, July Muscat, Khandahar, Katta, Kourgane, Kishmishi, Loose Perlette, Malaga, Monukka, Muscat de Alexandria, Muscat Flame, Muscat Hamburg, New York Muscat, Niabell, Niagara, Olivette blanche, Ontario, Pierce, Queen, Red Malaga, Ribier, Rish Baba, Romulus, Ruby Seedless, Schuyler, Seneca, Suavis (IP 365), Thompson seedless e Thomuscat. Incluem também as utilizadas na produção de vinho, tais como Aleatico, Alicante Bouschet, Aligote, Alvarelhao, Aramon, Baco blanc (22A), Burger, Cabernet franc, Cabernet, Sauvignon, Calzin, Carignane, Charbono, Chardonnay (p. ex., CH 01, CH 02, CH Dijon), Chasselas dore, Chenin blanc, Clairette blanche, Early Burgundy, Emerald Riesling, Feher Szagos, Fernao Pires, Flora, French Colombard, Fresia, Furmint, Gamay, Gewurztraminer, Grand noir, Gray Riesling, Green Hungarian, Green Veltliner, Grenache, Grillo, Helena, Inzolia, Lagrein, 11 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ

Lambrusco de Salamino, Malbec, Malvasia bianca, Mataro, Melon, Merlot, Meunier, Mission, Montua de Pilas, Muscadelle du Bordelais, Muscat blanc, Muscat Ottonel, Muscat Saint-Vallier, Nebbiolo, Nebbiolo fino, Nebbiolo Lampia, Orange Muscat, Palomino, Pedro Ximenes, Petit Bouschet, Petite Sirah, Peverella, Pinot noir, Pinot Saint-George, Primitivo di Gioa, Red Veltliner, Refosco, Rkatsiteli, Royalty, Rubired, Ruby Cabernet, Saint-Emilion, Saint Macaire, Salvador, Sangiovese, Sauvignon blanc, Sauvignon gris, Sauvignon vert, Scarlet, Seibel 5279, Seibel 9110, Seibel 13053, Semillon, Servant, Shiraz, Souzao, Sultana Crimson, Sylvaner, Tannat, Teroldico, Tinta Madeira, Tinto cao, Touriga, Traminer, Trebbiano Toscano, Trousseau, Valdepenas, Viognier, Walschriesling, White Riesling e Zinfandel. As cultivares de porta-enxertos incluem Couderc 1202, Couderc 1613, Couderc 1616, Couderc 3309 (Vitis riparia X rupestris), Dog Ridge, Foex 33 EM, Freedom, Ganzin 1 (A x R #1), Harmony, Kober 5BB, LN33, Millardet & de Grasset 41B (Vitis vinifera X berlandieri), Millardet & de Grasset 420A, Millardet & de Grasset 101-14 (vitis riparia X rupestris), Oppenheim 4 (S04), Paulsen 775, Paulsen 1045, Paulsen 1103, Richter 99, Richter 110, Riparia Gloire, Ruggeri 225, Saint-George, Salt Creek, Teleki 5A, Vitis rupestris Constantia, Vitis california e Vitis girdiana, Vitis rotundifolia, Vitis rotundifolia Carlos, Teleki 5C (Vitis berlandieri X riparia), 5BB Teleki (selecção Kober, Vitis berlandieri X riparia), S04 (Vitis berlandieri X rupestris) e 039-16 (Vitis vinifera X Muscadinia) .

Segue-se agora uma descrição para cada um dos métodos acima mencionados. Estes exemplos são proporcionados com o fim de ilustrar o presente invento e não devem ser entendidos como limitantes. 12 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ

Sistema de Cultura Embriogénica Perene de Videira O seguinte método provou ser eficaz para a produção de culturas de videiras embriogénicas perenes e para a regeneração de videira através de embriogénese somática.

Tecido de Explante e Iniciação da Cultura

No passo de iniciação da cultura, o material do explante foi colhido no campo, na estufa ou em culturas de micropropagação in vitro de rebentos de videira e colocado numa cultura in vitro. Este material do explante foi tipicamente colhido de folhas, anteras ou gavinhas, mas foi também obtido a partir de outros tecidos vegetativos ou reprodutivos de videira. Uma vez colhido, o tecido de explante, se desejado, foi esterilizado à superfície de acordo com métodos padrão e depois colocado num meio de iniciação de cultura sólido adequado numa caixa de Petri.

Qualquer um de vários meios conhecidos, p. ex., Murashige e Skoog (MS) e meio de Nitsch, pode ser utilizado. Tais meios incluem tipicamente sais inorgânicos, vitaminas, micronutrientes, uma fonte de azoto e uma fonte de carbono tal como sacarose, maltose, glicose, glicerol, inositol e semelhantes. Por exemplo, a sacarose pode ser adicionada a uma concentração de entre cerca de 1 g/1 a cerca de 200 g/1; e de preferência a uma concentração de entre cerca de 30 g/1 a cerca de 90 g/1. Para além disso, a composição de tais meios de cultura de tecidos vegetais pode ser modificada para optimizar o crescimento da célula vegetal empregue em particular. Por exemplo, o meio de iniciação da cultura pode ser preparado a partir de qualquer um dos meios basais verificados na Tabela 1. 13 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ

Tabela 1

COMPOSIÇÃO DOS MEIOS VULGARMENTE UTILIZADOS NOS EXEMPLOS

Componente (mg/1 se não especificado em contrário) MS MS Modificado Nitsch kno3 1900,0 3033,3 950, 0 NH4NO3 1650,0 - 720, 0 NH4CI - 363, 7 - MgS04.7H20 370,0 370, 0 185, 0 CaCl2 440,0 440, 0 166,0 KH2PO4 170,0 170, 0 68, 0 Na2EDTA 37,23 37,23 37,3 FeS04.7H20 27, 95 27, 95 27, 95 MnS04.H20 16,9 16,9 18, 9 Kl 0, 83 0, 83 - H3BO3 6,2 6,2 10, 0 ZnS04.7H20 8,6 8,6 10, 0 Νθ.2^ο04 · 2H2O 0,25 0,25 0, 25 CuS04.5H20 0, 025 0, 025 0, 025 CoC12.6H20 0, 025 0, 025 0, 025 Glicina 2, 0 2,0 - Ácido nicotínico 0,5 0,5 1,0 Piridoxina-HCl 0,5 0,5 1,0 Tiamina-HCl 0,1 0,1 1,0 Inositol 0,1 g/L 1,0 g/1 0,1 g/L Sacarose 30.0 g/1; 60.0 g/1 30.0 g/1; 60.0 g/1; 90.0 g/1 20,0 g/L Carvão Activado 0,5 g/1; 1.0 g/1; 2.0 g/1 Ágar 7,0 g/1 7,0 g/1 8,0 g/L pH 5,5 5,5 5,5

Se desejado, o meio de iniciação pode conter uma auxina ou uma mistura de auxinas a uma concentração de cerca de 0,01 mg/1 a cerca de 100 mg/1, dependendo da cultivar de interesse, que é eficaz para a indução da produção de células embriogénicas ou de massas celulares embriogénicas no tecido de explante. Por exemplo, o tecido de explante pode ser mantido num meio de tipo Nitsch solidificado com ágar suplementado com, p. ex., entre cerca de 0,01 mg/1 e cerca de 10 mg/1 de 2,4-d, e de preferência entre cerca de 0,5 mg/1 e cerca de 3,0 mg/1 de 2,4-D. O 2,4-D é apenas um exemplo de uma 14 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ auxina que é útil nos métodos do presente invento. Outras auxinas incluem, por exemplo, NAA, NOA, IAA, dicamba e picloram. Adicionalmente, se desejado, podem ser incluídos no meio outros reguladores do crescimento vegetal a concentrações padrão. Por exemplo, citocininas (p. ex., uma citocinina de ocorrência natural ou sintética, tal como BA ou zeatina), se presente, pode ser utilizada a uma concentração de cerca de 0,1 mg/1 a cerca de 10 mg/1, e de preferência de cerca de 0,3 mg/1, dependendo da cultivar de interesse. Nalguns casos, podem ser incluídos outras classes de reguladores do crescimento, tais como ABA ou GA, nas concentrações padrão apropriadas. Por exemplo, pode ser adicionado ABA a uma concentração de cerca de 0,5 mg/1 a cerca de 20 mg/1 e de preferência a uma concentração de cerca de 5 mg/1; o GA pode ser adicionado a uma concentração de cerca de 0,1 mg/1 a cerca de 30 mg/1, e de preferência a uma concentração de cerca de 5 mg/1. A adição de reguladores do crescimento vegetal neste estádio não é necessária para a indução de embriogénese. Adicionalmente, o meio de iniciação pode também incluir carvão activado (0,1-2,0 g/1) ou um adsorvente semelhante conhecidos dos peritos na arte. A cultura do tecido do explante durante este estádio é de preferência realizada no escuro a 22-30°C, embora possa também ser realizada sob condições de luz muito reduzida, ou de luz total. Após aproximadamente uma a quatro semanas em cultura, as cultura de tecido do explante são então colocadas em luz total com um fotoperíodo de 16 h. As culturas são pesquisadas semanalmente quanto à presença de células embriogénicas ou massas celulares embriogénicas emergentes. As células ou massas celulares embriogénicas são identificadas com base na morfologia. As massas embriogénicas, em geral, tendem a ser brancas a amarelas pálidas e são frequentemente hialinas. Podem ser reconhecidas a partir de um estádio pequeno, muito inicial (10-20 agregados celulares), com base na sua cor e aparência friável, granular. As culturas embriogénicas são também identificadas através da sua natureza compacta com células que são ricas em citoplasma (tal como observado ao microscópio). As culturas embriogénicas surgem a frequências variáveis dependendo de uma variedade de factores incluindo, mas não se limitando ao genótipo, à natureza e ao tipo de explante, à composição do meio e época de colheita. Para 15 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ manutenção das culturas é necessária uma selecção visual cuidadosa para assegurar a transferência das estruturas semelhantes a embriões apropriadas. Uma vez identificadas, as células ou massas celulares embriogénicas são então transferidas para meio de manutenção de culturas, tal como aqui descrito.

Manutenção das Culturas

As células embriogénicas ou massas celulares embriogénicas são cuidadosamente removidas e transferidas para um meio de manutenção de culturas. Novamente, pode ser utilizado qualquer um de vários meios bem conhecidos, p. ex., meio MS e de Nitsch. Embora não seja geralmente necessário, reguladores do crescimento vegetal podem ser adicionados tal como descrito acima.

Em geral, o tecido embriogénico pode ser mantido através da subcultura a intervalos regulares (p. ex., cada semana a quatro semanas ou cada quatro a oito semanas) para meio de manutenção novo, tal como aqui descrito. Alternativamente, o tecido embriogénico pode ser colocado num meio de cultura liquido (p. ex., MS, B-5 ou de Nitsch) e criado como uma suspensão embriogénica liquida tal como aqui descrito. As massas celulares embriogénicas são criadas para aumentar a biomassa celular embriogénica conforme necessário através de divisão das culturas em expansão durante a transferência. As culturas podem ser preparadas para se desenvolverem na direcção de uma maior embriogénese ou de uma menor embriogénese e para crescimento celular embriogénico mais desorganizado através da manipulação repetida da cultura, que inclui a selecção cuidadosa das células e massas celulares embriogénicas durante a transferência. Verificou-se que a transferência repetida das células ou massas celulares embriogénicas não só enriquece o crescimento do tecido embriogénico como também facilita o processo da embriogénese somática. As culturas são perenes por persistirem tipicamente durante mais de dois anos.

Um componente chave da presente abordagem envolve a selecção cuidadosa de células embriogénicas a partir do tecido do explante, seguido de selecção recorrente e subcultura do 16 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ tecido embriogénico seleccionado. Verificou-se que este material era não só útil na regeneração de videiras completas a partir de embriões somáticos, como também tinha uma capacidade significativamente maior de embriogénese, incluindo a produção de embriões somáticos. Através da realização deste procedimento, o crescimento de células embriogénicas é enriquecido, acelerando o processo de formação de embriões somáticos e a subsequente regeneração de plantas.

Observou-se que o material do explante tirado das plantas que foram criadas a partir de embriões somáticos exibe um maior potencial embriogénico em comparação com o material do explante tirado de tecido do explante clonal que não tinha sido cultivado para a produção de células embriogénicas. Observou-se que este aumento no potencial embriogénico aumentava após dois ou mais ciclos sucessivos de iniciação, cultura e regeneração de plantas (p. ex., planta clonal -explante -> iniciação de cultura embriogénica -> embrião somático -> planta derivada de embrião somático -> explante) . Não é necessário utilizar uma planta derivada de um embrião somático como fonte do explante; os embriões somáticos ou mesmo as culturas embriogénicas que foram transferidas para meio novo produzirão também embriões somáticos novos com maior potencial embriogénico. Tal material do explante é convenientemente mantido como culturas in vitro de rebentos axilares, que servem como fonte para explantes vegetativos; no entanto, outros métodos de manutenção de plantas são também aceitáveis.

Germinação e Crescimento das Plântulas

Os embriões somáticos obtidos a partir das culturas acima descritas são subsequentemente germinados em plântulas de videira de acordo com métodos padrão. Por exemplo, os embriões somáticos são colocados na superfície de um meio de germinação (p. ex., meio MS) em caixas de Petri estéreis. As culturas contendo os embriões são incubadas numa câmara de crescimento sob condições de iluminação (fotoperiodo de 16 h) . Durante a germinação a raiz emerge e o epicótilo começa a crescer. Quando as plântulas de videira que foram criadas em meio de germinação alcançam um tamanho suficiente (1 cm, com pelo menos duas folhas), podem ser removidas das caixas de cultura 17 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ e plantadas numa mistura de envasamento esterilizada. As plântulas são tipicamente transferidas para contentores de criação numa mistura de envasamento sem solo (p. ex., Vermiculite, Perlite ou ProMix”, v.j. Growers, Apopka, FL). Se desejado, as plântulas podem ser colocadas numa câmara de crescimento ou numa câmara de estufa húmida e incubadas sob condições de elevada humidade (humidade a 90%) para crescimento e aclimatização das plântulas. Subsequentemente, as plântulas aclimatizadas podem ser transferidas para o exterior para uma vinha ou uma estufa.

Num exemplo, descrevemos a produção de uma cultura perene embriogénica de Vitis vinifera cv. "Thompson Seedless". As culturas derivadas da planta mãe foram obtidas a partir de uma folha que foi desinfectada à superfície e inoculada para o meio de cultura de iniciação descrito por Nitsch (1968) e modificado por Gray D.J. ("Somatic Embryogenesis in Grape", Em: Somatic embryogenesis in woody perennials, Vol. 2, Gupta P.K., Jain S.M. e Newton r.j. (Eds.), Kluwer Academic, Dordrecht, Holanda, págs. 191-217, 1995). Este meio continha cerca de 1,1 mg/ml de 2,4-D e cerca de 0,05 mg/1 de BA. Após o explante do tecido, os vasos de cultura foram incubados em completa escuridão durante seis semanas. Observou-se que a maior parte do tecido explantado formava uma massa de células altamente vacuoladas indiferenciadas dentro deste período de seis semanas. As culturas embriogénicas, identificadas pela sua natureza compacta e a presença de células que eram ricas em citoplasma, foram subclonadas repetidamente. A cultura resultante foi obtida através do método de selecção descrito acima, seguido de subcultura (durante cerca de 6 semanas) até estar disponível uma cultura embriogénica suficiente. Um embrião somático originalmente obtido a partir da planta mãe (i.e., embrião da primeira geração) foi germinado e a extremidade do seu rebento utilizada para criar uma cultura de micropropagação in vitro. As folhas da planta derivadas dessa cultura foram então utilizadas para produzir uma nova cultura embriogénica (2a geração). Um embrião somático obtido a partir dessa cultura foi utilizado de modo semelhante para criar a terceira geração. A resposta embriogénica de Vitis vinifera cv. "Thompson Seedless" das folhas derivadas da cultura de micropropagação in vitro é apresentada na Tabela 2 (abaixo). Estes resultados mostram a comparação de folhas de culturas 18 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ derivadas da planta mãe envasada com folhas de plantas derivadas de culturas obtidas de embriões somáticos germinados da terceira geração.

Tabela 2

Derivação da cultura N° de folhas cultivadas N° de culturas embriogénicas % de resposta por folha Planta mãe 195 0* 0 Embrião somático da 3a geração 200 14 7#

Outras experiências renderam uma cultura embriogénica. # Verificou-se que a resposta percentual por folha era tão elevada como 30%.

Adicionalmente, foram também produzidas culturas embriogénicas perenes de outras videiras utilizando os métodos aqui descritos, incluindo Viris longii, Vitis rotundi folia (cv. Cario and Dixie), Vitis rupestris, Vitis vinifera (cv. Autumn Seedless, Cabernet Sauvignon, Cabernet Franc, Chardonnay, Dolcetto, Gamay Beaujolais, Lambrusco, Pinot Noir, Semillon, Tokay, White Riesling, Zinfindel, e semelhantes), e vários hibridos de Vitis (cv. Blanc du Bois, Niagara Seedless, Seyval Blanc, Stover, Southern Home e semelhantes).

Produção de Células de Videira Altamente Embriogénicas Utilizando uma Suspensão Líquida ou Culturas Sólidas

Foi também desenvolvido um método para a produção de grandes quantidades de embriões somáticos de videira utilizando um sistema de cultura de suspensão celular líquida ou de cultura sólida. Estes métodos são particularmente úteis para a produção de células altamente embriogénicas que são capazes de se regenerar em plantas inteiras. Abaixo, é apresentado um protocolo simples para uma embriogénese somática eficiente de videira utilizando um sistema de cultura de suspensão celular líquida ou de cultura sólida.

Em geral, o método inclui um processo de cultura de múltiplas etapas envolvendo tipicamente (i) a iniciação da cultura; (ii) a identificação e o isolamento de células embriogénicas ou massas celulares embriogénicas; (iii) a 19 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ produção de culturas embriogénicas perenes; e (iv) a concentração de grupos de células altamente embriogénicos. 0 método envolve os seguintes passos. 0 tecido do explante é colocado num meio de iniciação de cultura adequado, tal como aqui descrito. Após aproximadamente seis semanas no meio de iniciação da cultura, as células embriogénicas e massas celulares embriogénicas são identificadas. Uma vez identificadas as culturas embriogénicas, que podem ter menos de 1 mm de diâmetro, são isoladas e cultivadas em meio de iniciação fresco para encorajar o crescimento, tal como aqui descrito. A subcultura das culturas embriogénicas resulta tipicamente na formação de embriões somáticos. As culturas embriogénicas e os embriões somáticos em estádios iniciais obtidos a partir destas culturas são então novamente cultivados num meio de crescimento vegetal liquido. Por exemplo, o meio de nutrientes de cultura de tecidos vegetais, consistindo em meio B-5 (Gamborg et al., Exp. Cell. Res. 50: 151-158, 1968; Sigma Chemicals, St. Louis, MO), que foi modificado tal como descrito por DeWald et al. (J. Amer. Soc. Hort. Sei. 114: 712-716, 1989) e Litz et al. ("Somatic embryogenesis in mango", 1995, supra). Este meio modificado consiste nos principais sais de B-5, nos sais menores e nas vitaminas de MS, glutamina (cerca de 400 mg/1), e sacarose ou açúcar de mesa comercial (cerca de 60 g/1) . Antes da autoclavagem, o pH do meio é ajustado para cerca de 5,8. Embora 2,4-D (cerca de 0,5-2,0 mg/1) seja o regulador do crescimento preferido utilizado neste meio, outros reguladores do crescimento, tais como, por exemplo, dicamba, picloram, NOA ou ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético, podem também ser utilizados nas concentrações apropriadas, por exemplo, as descritas acima. Os balões contendo as culturas celulares embriogénicas, os embriões somáticos ou ambos são subsequentemente incubados a cerca de 26°C num agitador de rotação a 125 rpm no escuro ou com luz difusa. As culturas são então subcultivadas tal como aqui descrito, tipicamente uma vez de dez em dez a de catorze em catorze dias, mas os regímenes de subcultura podem variar dependendo do crescimento e da proliferação dos grupos de células embriogénicas. 20 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ

Em cerca de seis a oito semanas, é produzida uma cultura de suspensão celular fina, que consiste em células alongadas altamente vacuoladas (células não embriogénicas) e também num número menor de células pequenas isodiamétricas ricas em citoplasma (células embriogénicas). Uma vez produzida cultura suficiente, os embriões diferenciados podem ser removidos da cultura através de crivagem e os embriões diferenciados são descartados. Verificou-se que a manutenção continuada da cultura de suspensão de células embriogénicas crivadas em meio liquido B-5 modificado, com subculturas periódicas, aumenta a biomassa dos grupos de células embriogénicas.

Após aproximadamente doze a dezasseis semanas, observa-se uma grande massa de células de videira embriogénicas altamente concentradas. O tempo necessário para a concentração de células embriogénicas ou massas celulares embriogénicas pode variar dependendo de vários factores, incluindo a cultivar, o genótipo e as condições de cultura. As células embriogénicas neste estádio são especialmente úteis em virtualmente qualquer tipo de método de transformação genética. Estas células embriogénicas podem também ser induzidas a diferenciar-se em embriões somáticos de acordo com qualquer método padrão, p. ex., através de subcultura das células em meio liquido B-5 modificado desprovido de reguladores de crescimento durante um período de cerca de quatro a seis semanas. Alternativamente, os embriões somáticos de estádios iniciais podem ser plaqueados em meio solidificado através da adição de um agente gelificante adequado tal como goma gelana, agarose, ágar ou qualquer outro agente semelhante, para mais diferenciação dos embriões somáticos em completa escuridão. Se desejado, os embriões no estádio de torpedo/cotilédones podem ser subcultivados individualmente num meio de maturação padrão, p. ex., um meio de maturação consistindo em formulações de nutrientes de MS. Os embriões somáticos maduros são então transferidos para uma câmara de crescimento para germinação e regeneração em plantas num recipiente apropriado. A frequência de formação de embriões somáticos utilizando este procedimento é tipicamente elevada.

Segue-se agora uma descrição dos resultados para a produção de células e massas celulares embriogénicas obtidas a partir de culturas de suspensão liquida e sólidas de "Thompson 21 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ

Seedless" e dois clones diferentes de Chardonnay, CH 01 e CH 02.

Embriões somáticos assíncronos de vítís vinifera cv. "Thompson Seedless" e Chardonnay CH 01 e CH 02 obtidos de tecidos embriogénicos perenes foram ainda cultivados num meio liquido para produzir uma cultura de suspensão de tecido caloso. Após cerca de catorze dias e após cerca de duas a três subculturas (uma subcultura foi efectuada a cerca de cada catorze dias), foi produzido um calo amorfo com uma cor amarelado a branco cremoso. Como resultado da produção do tecido caloso, o meio de cultura liquido no balão de cultura de tecidos surgiu como uma suspensão densa. O exame microscópico revelou que as células do calo eram alongadas e altamente vacuoladas e não exibiam sinais de capacidade embriogénica. O calo amorfo continuou a proliferar, mesmo quando os embriões somáticos utilizados para iniciar a cultura eram removidos da cultura.

Após aproximadamente seis semanas em meio liquido B-5 modificado, observámos a produção de pequenos grupos de células ricas em citoplasma como tiras brancas (Figura IA) . Observou-se que estas massas embriogénicas proliferavam exponencialmente e cresciam até a capacidade do balão em cerca de dez a doze semanas. A manutenção continuada destas massas embriogénicas como uma unidade única (i.e., num único balão) é frequentemente prejudicial, uma vez que se verificou que a qualidade das culturas se deteriora e eventualmente se tornam castanhas. A divisão destas culturas embriogénicas em unidades mais pequenas durante a subcultura ajuda a proliferar e aumentar a biomassa das culturas divididas. Entre as duas cultivares testadas, verificou-se que ambos os clones de "Chardonnay" eram de crescimento igualmente rápido e ultrapassavam em crescimento "Thompson Seedless". Enquanto as massas embriogénicas de "Chardonnay" eram de cor branco cremoso a amarelado, as de "Thompson Seedless" eram brancas baças ou acastanhadas. Adicionalmente, "Thompson Seedless" parecia ser mais sensivel à densidade da cultura, uma vez que se observou que as células se tornavam escuras se a densidade da cultura não fosse corrigida. A densidade da cultura preferida era de 22 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ aproximadamente 400 mg de células embriogénicas por 40 ml de meio líquido B5 modificado num balão de 125 ml.

Produção de embriões somáticos em cultura líquida

As massas embriogénicas foram passadas através de um crivo de nylon de 960 micrómetros e colhidas num copo estéril. Verificou-se que a crivagem das massas embriogénicas para iniciar a embriogénese em cultura líquida servia dois propósitos. Primeiro, obtia-se um bom grau de sincronização da diferenciação dos embriões. Segundo, a formação de anomalias nos embriões somáticos durante a diferenciação, tais como fasciação ou fusão, era reduzida. Após quatro a seis semanas em meio líquido, observavam-se embriões somáticos brancos pequenos no estádio globular ou de coração inicial. A crivagem das culturas neste estádio não facilitou um aumento na diferenciação do embrião.

Após aproximadamente oito semanas, os embriões somáticos eram claramente visíveis e verificou-se que alguns embriões tinham alcançado o estádio de cotilédones do desenvolvimento embrionário. A crivagem dos embriões diferenciados e a sua cultura num balão separado, no entanto, facilitou uma diferenciação mais rápida bem como a sincronização do desenvolvimento embrionário.

Verificou-se que ambos os clones de "Chardonnay", CH 01 e CH 02, se diferenciavam rapidamente em embriões somáticos. A crivagem apropriada e o ajustamento da densidade (efectuado através de cultura de cerca de 1000 mg de embriões somáticos por 40 ml de meio) asseguraram uma maior sincronização e individualização, bem como diferenciação do embrião (Figura 1B) . Em aproximadamente doze a catorze semanas após a subcultura em meio de embriogénese liquido, os embriões somáticos individualizados começaram a tornar-se verdes e as radiculas a alongar-se, mostrando o aparecimento de germinação precoce (Figura 1C).

Verificou-se que as culturas de "Thompson Seedless" não avançavam inicialmente para além do estádio de coração em cultura liquida. Adicionalmente, verificou-se que os embriões se agrupavam mais, resultando frequentemente na formação de 23 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ embriões somáticos fundidos. A remoção dos embriões anormais e o abaixamento da densidade da cultura para metade resultou em embriogénese somática normal em cultura liquida. Estes embriões somáticos alcançaram a maturidade em cerca de catorze a dezoito semanas.

Produção de embriões somáticos em meio sólido

Observou-se que as células embriogénicas ou massas celulares embriogénicas obtidas a partir de culturas liquidas se diferenciavam em embriões somáticos apenas três semanas após a iniciação da cultura. Após quatro semanas de cultura, o exame microscópico revelou também a formação de embriões somáticos globulares e em forma de coração no tecido caloso (Figura 1D) . Os embriões somáticos eram hialinos e pareciam-se com aqueles num estado hiper-hidrico (Figura 1E) ; no entanto, os embriões continuaram a diferenciar-se e verificou-se que se desenvolviam em embriões somáticos maduros em mais três ou quatro semanas. Observou-se que estes embriões somáticos desenvolviam um suspensor (Figura 1E) . Adicionalmente, observou-se que as células embriogénicas se desenvolviam numa massa de embriões somáticos assíncronos.

Uma das observações interessantes destas experiências foi que a maioria dos embriões somáticos surgiu como unidades individuais e não como pequenos agregados, embora houvesse alguns agregados de embriões somáticos. Em tais casos, o número de embriões somáticos variava de seis a dez em cada agregado e estes embriões eram facilmente separados do tecido caloso. Os embriões que se encontravam no estádio de cotilédones foram isolados numa base semanal e subcultivados para maturação. Cada agregado de massa embriogénica continuou a produzir embriões durante pelo menos doze semanas. As massas celulares embriogénicas tendiam a tornar-se castanhas em meio sólido, contendo Gel-Gro (ICN Biochemicals), mas esta descoloração não afectou adversamente a viabilidade da cultura. Cerca de quatro ou cinco semanas depois, começaram a surgir à superfície das células embriogénicas castanhas ou das massas celulares embriogénicas grupos de embriões somáticos. 24 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ

Maturação e germinação dos embriões somáticos e regeneração de plantas

Três meios de maturação - meio de maturação de manga (Litz et al., "Somatic embryogenesis in mango", 1995, supra); meio de maturação de manga solidificado com ágar (7 g/1); e meio basal MS com sacarose a 3% - foram estudados para avaliar a capacidade para promover a germinação de embriões somáticos e a regeneração de plantas. Os nossos resultados indicam que um meio basal MS contendo sacarose a 3% era o mais eficaz na promoção da maturação e germinação dos embriões e na regeneração de plantas, para ambos os embriões derivados de meio sólido e para os embriões germinados precocemente que eram obtidos a partir de culturas de meio liquido (Figura 1D). Embora houvesse uma boa germinação no meio de maturação de manga com ágar, a qualidade dos regenerantes não era tão boa como com sais de MS com sacarose a 3%. Os embriões dos dois sistemas estudados (i.e., meios liquido e sólido) apresentaram uma variação entre eles próprios na germinação e regeneração. Embora os embriões tenham germinado precocemente em culturas liquidas, não foi observada germinação continuada nestas culturas. No entanto, na transferência para meio sólido verificou-se que os embriões continuavam o processo de germinação e resultou na formação de videiras com um denso sistema radicular. A manutenção continuada em meio liquido após a emergência das radículas conduziu a hiper-hidricidade e eventualmente a regeneração de plantas a partir destes embriões foi reduzida. Assim, é preferível que os embriões somáticos sejam removidos do líquido logo que germinem precocemente e sejam transferidos para meio sólido.

Conservação a longo prazo de embriões somáticos de videira derivados de suspensão e regeneração de plantas

Estabelecemos um método para o armazenamento a longo prazo de embriões somáticos. Os embriões somáticos maduros de culturas em suspensão de "Chardonnay" foram secos sobre papel de filtro estéril numa câmara de fluxo laminar e depois armazenados em caixas de Petri estéreis a 6°C. Periodicamente foram retiradas amostras destas caixas e germinadas em meio MS com sacarose a 3%. A germinação (i.e., a emergência de raízes do embrião somático) e a regeneração de plantas foram 25 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ registadas. A Tabela 3 mostra os dados do clone CH 02 após 22 meses de armazenamento e a Tabela 4 mostra os dados do clone CH 01 após 5 meses de armazenamento.

Tabela 3 Número do Ensaio Número de Embriões Número de Germinados (Percentagem de Germinados) Número de Plantas Rendimento Percentual 1 87 81 (93,1) 69 79,3 2 42 40 (95,2) 35 83,3 3 41 41 (100,0) 30 73,2 Total 170 162 (95,3) 134 78, 8

Tabela 4 Número do Ensaio Número de Embriões Número de Germinados (Percentagem de Germinados) Número de Plantas Rendimento Percentual 1 15 15 (100,0) 13 86,7 2 15 15 (100,0) 13 86,7 3 15 13 (86,7) 9 60, 0 4 15 12 (80,0) 7 46,7 5 15 13 (86,7) 9 60, 0 6 15 11 (73,3) 9 60, 0 7 15 15 (100,0) 14 93,3 8 15 13 (86,7) 9 60, 0 Total 120 107 (89,2) 83 69,2

Sementeira directa de embriões somáticos de videira derivados de cultura em suspensão

Embriões somáticos de videira "Chardonnay" e "Thompson Seedless" foram produzidos a partir de culturas liquidas tal como aqui descrito. Os embriões somáticos maduros derivados de suspensão foram rapidamente secos sobre papel de filtro na câmara de fluxo laminar e germinados directamente em vasos Magenta contendo um dos seguintes meios de envasamento: i) areia; ii) mistura comercial de envasamento ProMix™ (CPM); ou CPM vertida sobre areia. Cada vaso contendo 20 ml de água destilada e o meio de envasamento foi esterilizado através de autoclavagem durante 30 minutos e arrefecido de um dia para o outro antes de inocular com os embriões somáticos. Foram 26 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ colocados três embriões somáticos em cada vaso. A sementeira foi realizada sob condições assépticas e os recipientes foram fechados e incubados a 26°C com um fotoperíodo de 16 h a uma intensidade luminosa de 75 pmol s_1 rrf2. Os resultados revelaram que a CPM vertida sobre areia era ideal para o desenvolvimento das plantas. Embora a areia tenha promovido mais germinação, as plantas resultantes eram cloróticas e a sua taxa de sobrevivência era fraca. Houve mais contaminação dos embriões somáticos em CPM pura. 0 presente estudo oferece perspectivas de multiplicação em larga escala de videiras utilizando culturas em suspensão e estabelece a plataforma para criação de embriões somáticos de videira em biorreactores.

Os resultados experimentais descritos acima foram realizados utilizando as seguintes técnicas.

Iniciação da cultura

As culturas embriogénicas foram iniciadas a partir de anteras e ovários da cultivar "Chardonnay" (Clones CH 01 e CH 02), e a partir das folhas da cultivar "Thompson Seedless" de acordo com métodos padrão, p. ex., os aqui descritos. Os embriões somáticos destas culturas, iniciados e mantidos em meio MS modificado, foram utilizados para iniciar culturas liquidas de células em suspensão. Tipicamente estas culturas são altamente assíncronas no desenvolvimento embrionário e na diferenciação e, portanto, cada inoculo consistiu em embriões somáticos a vários estádios de desenvolvimento.

Estabelecimento de culturas líquidas a partir de embriões somáticos diferenciados A composição do meio líquido foi adaptada a partir do meio descrito por Litz et ai., supra tal como se segue. A indução de calos foi alcançada através da adição de 1 mg/1 de 2,4-D no meio. O pH do meio foi ajustado para cerca de 5,8, e dispensado como aliquotas de 40 ml em balões Erlenmeyer de 125 ml. Os balões foram bem tapados com folha de alumínio resistente antes da autoclavagem. Após arrefecimento, foi transferido aproximadamente um grama dos embriões somáticos para o meio líquido utilizando uma espátula esterilizada sob 27 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ condições assépticas. A boca do balão foi selada com Parafilm e as culturas foram então incubadas em semi-escuridão (luz difusa) num agitador rotativo a cerca de 120 rpm. As culturas foram subcultivadas pelo menos uma vez de duas em duas semanas.

Os balões contendo as culturas em suspensão foram removidos do agitador orbital e as culturas foram deixadas a assentar durante cerca de 15 minutos. O sobrenadante foi suavemente decantado para um balão estéril, deixando as células embriogénicas num volume mínimo (aproximadamente 5 ml). Foram adicionados aproximadamente 35 ml de meio líquido fresco às células embriogénicas e agitou-se rapidamente. Todo o conteúdo do balão foi então transferido para um balão de 125 ml. Este segundo balão, contendo as células embriogénicas foi então selado com Parafilm e voltou para o agitador orbital. O calo amorfo gerado a partir dos embriões somáticos foi colhido como se segue. A suspensão embriogénica, incluindo embriões somáticos diferenciados e calo, foi deixada a assentar nos balões. Cerca de metade do meio sobrenadante foi decantado e o restante foi agitado e rapidamente filtrado através de uma rede (960 micrómetros) de nylon pré- esterilizada colocada sobre um copo de 150 ml. Enquanto os embriões somáticos diferenciados ficavam retidos na rede, os calos finos que passavam através desta com o meio líquido foram recolhidos no copo. O calo que foi recolhido no copo foi depois filtrado através de um lenço de papel estéril dobrado duas vezes colocado sobre um funil estéril. O calo amorfo que aderiu ao lenço de papel foi subsequentemente removido do lenço de papel utilizando uma espátula esterilizada e ressuspenso em meio de cultura líquido fresco. Aproximadamente 100 mg de calo foram suspensos em cada balão. Estas culturas líquidas foram subcultivadas tal como aqui descrito aproximadamente uma vez de catorze em catorze dias em meio líquido B-5 modificado contendo 2,4-D.

Produção de embriões somáticos em culturas de suspensão

As células ou massas celulares embriogénicas que foram iniciadas em culturas líquidas em suspensão foram crivadas 28 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ utilizando um crivo de 960 micrómetros e a fracção mais fina foi colhida em meio liquido de embriogénese, sob condições assépticas. A composição do meio era a mesma que a do meio de iniciação; no entanto, foi omitido o 2,4-D do meio e foram adicionados cerca de 0,05 mg/1 de BA. Após ajustamento do pH para 5,8, o meio foi dispensado como aliquotas de 40 ml em balões Erlenmeyer de 125 ml, tapado com folha de alumínio e autoclavado. Foram cultivados aproximadamente 100 mg de calo em cada balão. As culturas foram mantidas em semi-escuridão a 25°C num agitador rotativo a 120 rpm e subcultivadas uma vez de 14 em 14 dias. A crivagem de culturas foi feita conforme necessário, para sincronizar os embriões somáticos diferenciados. Se necessário, podem também ser empregues crivos de rede mais fina (p. ex., crivos de 529 micrómetros).

Germinação de embriões somáticos a partir de culturas de suspensão e regeneração

Os embriões somáticos esverdeados possuindo radículas alongadas foram crivados das culturas de suspensão. Os embriões somáticos foram apanhados individualmente e cultivados. Três meios diferentes - meio de maturação de manga (Litz et al., "Somatic embryogenesis in mango", 1995, supra); meio de maturação de manga solidificado com ágar (7 g/1) em vez de Gel-Pro e meio basal MS com sacarose a 3% - foram testados quanto à germinação e à regeneração de plantas. Os reguladores de crescimento vegetal foram omitidos destas preparações de meio. Vinte e cinco embriões foram cultivados em cada caixa de Petri padrão e foram testadas oito placas de cada meio. Após selagem com Parafilm as culturas foram incubadas numa câmara de crescimento sob um fotoperíodo de 16 horas. As plântulas com quatro folhas verdadeiras foram subsequentemente transferidas para solo.

Produção de embriões somáticos em meio sólido

As células embriogénicas e as massas celulares embriogénicas produzidas em culturas em suspensão foram colhidas tal como descrito acima e depois transferidas para meio de embriogénese sólido. O meio consistiu nos mesmos compostos que o meio de embriogénese líquido e foi solidificado com 2,0 g/1 de Gel-Pro ou 7 g/1 de ágar. 29 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ

Aproximadamente 50 mg de calo foram colocados como um agregado numa caixa de Petri contendo meio e cada placa ficou com dois desses agregados. Após inoculação, as caixas de Petri foram seladas com Parafilm e incubadas em completa escuridão. A subcultura foi efectuada após ser observada diferenciação dos embriões somáticos. Os embriões somáticos produzidos a partir das células embriogénicas ou das massas celulares embriogénicas foram contados numa base semanal, a começar a partir de seis semanas após a cultura. Os embriões de estádio de cotilédones foram contados e subcultivados para maturação.

Maturação e germinação de embriões somáticos a partir de meio sólido

Os embriões somáticos maduros que tinham aproximadamente 5 mm de comprimento foram isolados da massa assíncrona e cultivados em meio de maturação. Vinte e cinco embriões somáticos maduros foram cultivados em cada caixa de Petri padrão em meio MS com sacarose a 3%. As culturas foram mantidas no escuro até germinarem. Após alongamento das radículas, foram transferidos para luz sob um fotoperíodo de 16 horas. As plântulas com pelo menos quatro folhas verdadeiras foram subsequentemente transferidas para solo.

Selecção de Células Embriogénicas e Plantas de Videira Resistentes a Doença

As culturas embriogénicas perenes de videira do presente invento podem ser utilizadas para a selecção ou pesquisa de células de videira possuindo resistência a substâncias tóxicas, tais como substâncias produzidas por patogénios de plantas. Tais patogénios incluem, sem limitação, bactérias, micoplasmas, fungos, insectos, nematodes, vírus e viróides. As doenças de plantas causadas por estes patogénios estão descritas nos Capítulos 11-16 de "Agrios, Plant Pathology", 3a ed., Academic Press, Inc., New York, 1988. Exemplos de patogénios bacterianos incluem, sem limitação, Agrobacterium vitis, Agrobacterium tumefaciens, Xylella fastidosa e Xanthomonas ampelina. Exemplos de patogénios fúngicos incluem, sem limitação, Uncinula necator, Plasmopara vitícola, Botrytis cinerea, Guignardia bidwellii, Phomophsis vitícola, Elsinoê ampelina, Eutypa lata, Armillaria mellea e Verticllium 30 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ dahliae. Exemplos de nematodes patogénicos incluem, sem limitação, nematodes de nódulos da raiz (por exemplo,

Meloidogyne sp.)r nematodes de quistos (por exemplo, Heterodera sp), nematodes de ataque à raiz (por exemplo,

Rotylenchulus reniformis), e nematodes da superfície do solo (por exemplo, Anguina funesta). Exemplos de pragas patogénicas (p. ex., insectos) incluem, sem limitação, Phylloxera, Coleoptera, Lepidoptera, Homoptera, Dermptera e Diptera. Exemplos de patogénios virais incluem, sem limitação, o vírus da degenerescência infecciosa da videira e o vírus do enrolamento clorótico da videira.

Através da exposição das culturas embriogénicas a um filtrado bruto da cultura ou a uma toxina purificada obtida a partir de um patogénio de plantas, células de videira resistentes podem ser seleccionadas e propagadas. Espera-se que as células de videira que sobrevivem à pressão selectiva resistam não só à toxina da selecção como também ao micróbio original que produz a toxina. Para além disso devido à dinâmica do processo de selecção, a resistência induzida pode funcionar também contra uma variedade de organismos causadores de doença para além do micróbio original utilizado para selecção. Como a selecção é realizada ao nível celular, é provável que as videiras regeneradas a partir das células mostrem a característica seleccionada. Em particular, este sistema permite que um perito na arte seleccione ou pesquise as características desejadas de entre milhares de células num único balão de cultura ou caixa de Petri.

Doenças das videira Vários micróbios atacam as videira e causam várias doenças. Estas doenças incluem doenças fúngicas das folhas e dos frutos (tais como podridão negra e antracnose), doenças fúngicas do sistema vascular e das raízes (tais como esca, rubéola negra, "Black Dead Arm" e eutipiose degenerativa), doenças bacterianas (tais como tumor da raiz e doença de Pierce), doenças causadas por vírus e agentes semelhantes a vírus (tais como doença do lenho rugoso de Rupestris, enrolamento clorótico da videira e degenerescência infecciosa da videira) bem como doenças causadas por nematodes e micoplasma. 31 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ

Uma doença que afecta a videira é a antracnose, também conhecida como doença das manchas de olho de pássaro, que é causada pelo fungo, Elsinoe ampelina. Sob condições favoráveis, este fungo ataca quase todas as partes aéreas da videira, incluindo os frutos, causando danos extensos na colheita. A antracnose causa o aparecimento de lesões circulares com margens castanhas ou pretas e bordos redondos ou angulosos na planta da videira. 0 centro das lesões torna-se branco acinzentado e eventualmente morre e cai, deixando um aspecto de "buraco de bala". A doença afecta especialmente as folhas jovens, impedindo o desenvolvimento normal. Os novos rebentos são também afectados e adquirem uma óbvia aparência queimada. Os cachos de fruta são também susceptiveis à infecção fúngica ao longo do seu desenvolvimento; as lesões na bagas estendem-se até à polpa, induzindo frequentemente gretas (Pearson e Goheen, "Compendium of Grape Disease", APS Press, St.Paul, MN, 1988).

Filtrado de Patogénio

Um filtrado de cultura de Elsinoe ampelina possuindo actividade tóxica foi preparado como se segue. Foi preparado meio de caldo de Czapekk-Dox com a força inteira (Fisher Scientific, Springfield, NJ) através da dissolução da quantidade necessária da mistura do caldo em água desionizada (Dl) . 0 meio foi dispensado como aliquotas de 50 ml em balões Erlenmeyer de 125 ml. Após autoclavagem e arrefecimento, foram adicionados 100 μΐ de uma suspensão de esporos de Elsinoe ampelina a cada balão (Dia 1); o balão foi então incubado num agitador de rotação a 120 rpm durante uma semana no escuro. Após uma semana, o conteúdo de cada balão foi transferido para Czapekk-Dox com a força inteira num balão Erlenmeyer de 250 ml e a incubação foi continuada durante mais duas semanas. No final deste periodo (i.e., três semanas depois do Dia 1), o filtrado da cultura fúngica foi colhido através de filtração do conteúdo de cada balão através de uma pano de queijo de múltiplas camadas estéril. O filtrado bruto da cultura foi armazenado a -4°C até outras utilizações tal como anteriormente descrito (Subramanian, J., "Selection and characterization of resistance in mango (Mangifera indica L.) embryogenic cultures to the phytotoxin produced by 32 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ

Colletotrichum gloeosporioides, Penz.", Dissertação de Doutoramento, Universidade da Florida, Gainesville, 1995).

Antes da adição ao meio de cultura para selecção in vítro, o filtrado da cultura congelado foi descongelado (sem aquecimento) à temperatura ambiente, o pH foi ajustado para 5,8 e esterilizado por filtração através de um filtro de 0,2 micrómetros (Nalgene, Rochester, NY). Verificou-se que este filtrado de patogénio esterilizado por filtração mantinha a sua actividade tóxica.

Selecção O filtrado da cultura de Elsinoê ampelina foi depois adicionado a culturas liquidas em suspensão de células embriogénicas e massas celulares embriogénicas de V. vinifera cv. "Chardonnay" em meio B-5 modificado para seleccionar as células que possuiam resistência ao filtrado da cultura fúngica tóxica. As células embriogénicas e as massas celulares embriogénicas de videira foram criadas tal como descrito acima; no entanto, nesta selecção in vitro, o meio no qual as células foram criadas foi suplementado com volumes conhecidos de filtrado de cultura de Elsinoê ampelina. As diluições apropriadas de filtrado de patogénio foram determinadas através do exame da toxicidade do filtrado utilizando uma análise de diluição em série. Estas experiências demonstraram que para a selecção in vitro era útil um filtrado da cultura a 40% (v/v).

As culturas de células embriogénicas e massas celulares embriogénicas de "Chardonnay" foram mantidas em meio liquido contendo filtrado de cultura fúngica a 40% (v/v) a cerca de 26°C num agitador rotativo (125 rpm) em luz difusa. A subcultura foi feita uma vez em dez dias; durante cada subcultura, o filtrado da cultura esterilizado por filtração foi utilizado para diluir o meio. A selecção com o filtrado da cultura foi continuada durante quatro ou cinco ciclos (cada ciclo = dez dias) de subcultura. Embora a maioria das células embriogénicas tenha morrido, muito poucas células, frequentemente menos de 1%, sobreviveram à pressão selectiva. Foram estabelecidas linhas de cultura resistentes através da retirada da pressão selectiva após quatro ou cinco ciclos e 33 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ deixando as células sobreviventes crescer em meio B-5 modificado sem filtrado de cultura. Estas linhas resistentes foram proliferadas e os embriões somáticos foram produzidos utilizando os métodos aqui descritos.

As culturas de células embriogénicas obtidas a partir do processo de selecção foram subsequentemente testadas quanto à resistência a Elsinoe ampelina utilizando vários bioensaios in vitro. Analisámos primeiro se as linhas resistentes de videiras estavam a produzir uma actividade que pudesse inibir o crescimento do fungo. Para este fim, o meio de cultura (i.e., meio de cultura condicionado) de uma linha de cultura resistente foi testado quanto a uma actividade inibidora contra o fungo. 0 meio condicionado foi colhido a partir de diferentes culturas celulares possuindo resistência a Elsinoe, e utilizado em várias concentrações para preparar o meio de crescimento fúngico. Uma colónia de micelas em crescimento activo foi colocada no centro de uma caixa de Petri contendo um meio de crescimento fúngico preparado com ou sem (controlo) meio condicionado de uma linha de cultura resistente de videira e incubou-se sob condições padrão. Os resultados destas experiências mostraram que o crescimento do fungo era inibido pelo meio de crescimento fúngico contendo 25% ou mais do meio condicionado.

Para demonstrar melhor a presença de uma actividade antifúngica nas culturas resistentes de videira, as linhas resistentes, bem como as linhas de controlo, foram colocadas em meio de crescimento de plantas sólido nas posições de seis e doze horas em caixas de Petri, e incubadas no escuro durante quatro semanas. Após este periodo, foi colocado um tampão de micelas de uma colónia de Elsinoe em crescimento activo no centro das caixas de Petri e incubou-se sob condições padrão. Observou-se que o fungo crescia rapidamente e infectava as culturas de controlo. Inversamente, o crescimento fúngico foi inibido nas caixas contendo culturas de células de videira possuindo resistência ao filtrado de cultura de Elsinoe. As hifas não cresceram livremente pelo meio nas placas contendo estas culturas resistentes em comparação com o crescimento de hifas do fungo pelo meio nas placas contendo as culturas de controlo (i.e., não resistentes). Um tapete espesso de micélio, tal como observado nas caixas contendo as culturas de 34 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ controlo, nunca se formou nas caixas contendo culturas resistentes a Elsinoê ampelina. Esta capacidade das culturas resistentes para inibirem o crescimento de Elsinoê ampelina foi mantida nove meses após a selecção, demonstrando que as alterações genéticas nas culturas resistentes eram estáveis.

Adicionalmente, as culturas de videira que eram resistentes a Elsinoê ampelina foram testadas quanto à resistência a um segundo patogénio fúngico, Fusarium oxysporum. As linhas resistentes, bem como as linhas de controlo, foram colocadas em meio de crescimento de plantas sólido nas posições de seis e doze horas nas caixas de Petri e incubadas no escuro durante quatro semanas. Após este periodo, foi colocado um tampão de micelas de uma colónia de Fusarium oxysporum em crescimento activo no centro das caixas de Petri e incubou-se à temperatura ambiente sob um fotoperíodo de 16 horas. Observou-se que o fungo crescia rapidamente e infectava as culturas de controlo. Inversamente, o crescimento de Fusarium oxysporum foi inibido nas caixas contendo culturas de células de videira possuindo resistência ao filtrado de cultura de Elsinoê. As hifas não cresceram livremente pelo meio nas placas contendo estas culturas resistentes em comparação com o crescimento de hifas do fungo pelo meio nas placas contendo as culturas de controlo (i.e., não resistentes) . Um tapete espesso de micelas de Fusarium, tal como observado nas caixas contendo as culturas de controlo, nunca se formou nas caixas contendo culturas resistentes a Elsinoê ampelina. Esta experiência demonstrou que as culturas de videira resistentes eram não só resistentes a Elsinoê ampelina, como eram também resistentes a Fusarium oxysporum.

Foram feitas outras análises para determinar se as culturas de videira resistentes ao fungo podiam dar origem a embriões somáticos que fossem também resistentes a Elsinoê ampelina. Os embriões somáticos derivados de culturas resistentes e de controlo (i.e., não resistentes) foram criados em meio contendo filtrado de cultura fúngica a 40% (v/v) ou em meio de controlo não contendo filtrado de cultura fúngica. Embora os embriões somáticos derivados das culturas resistentes se tivessem formado e germinado normalmente tanto em meio contendo filtrado de cultura fúngica como em meio de controlo, os embriões somáticos derivados de 35 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ culturas de controlo tornavam-se necróticos e eventualmente morriam no meio contendo filtrado de cultura fúngica, mas não morriam no meio de controlo. A necrose dos controlos no meio contendo filtrado de cultura fúngica foi suficientemente rápida para tornar os embriões somáticos de controlo escuros dentro de setenta e duas horas desde a iniciação da cultura. Os resultados destas experiências demonstraram que os embriões somáticos obtidos a partir das culturas celulares resistentes eram também resistentes ao filtrado fúngico. Para além disso, observou-se que estes embriões somáticos resistentes suportavam uma concentração de filtrado de cultura de Elsinoê ampelina que era igual à suportada pelas células embriogénicas e massas celulares embriogénicas suas progenitoras.

Plantas resistentes a doenças

As culturas embriogénicas foram seleccionadas in vitro contra o filtrado de cultura fúngica produzido por Elsinoê ampelina. Foram regeneradas plantas a partir das culturas seleccionadas e aclimatizadas na estufa. As plantas das linhas seleccionadas e dos controlos não seleccionados foram vaporizadas com uma suspensão de esporos (lxlO6 esporos/ml) até escorrer. As plantas foram ensacadas individualmente para manter a humidade (uma condição óptima para o patogénio causar a doença antracnose) durante 3 dias. Os sacos foram então removidos e as plantas foram registadas quanto a sintomas de antracnose. Todos os controlos não seleccionados exibiram um grau muito elevado de susceptibilidade e na maioria dos casos houve desfolhação devido à doença em 3 dias. Entre as 40 plantas diferentes das duas linhas seleccionadas, apenas uma planta mostrou sintomas suaves de antracnose. Estes dados mostram que a resistência adquirida pelas células embriogénicas durante a selecção in vitro pode ser traduzida em resistência da planta inteira contra o patogénio.

As plantas regeneradas podem ser testadas quanto à resistência a antracnose de acordo com métodos padrão. Por exemplo, as suspensões de esporos de Elsinoê ampelina são preparadas através de suspensão de massas de esporos de colónias frescas do fungo em água desionizada (Dl) estéril e a densidade de esporos é ajustada a 100 000 esporos/ml utilizando um hemocitómetro. As folhas jovens dos rebentos ou 36 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ plantas criados em estufa são colhidos e lavados suavemente com água Dl. Na lâmina da folha, 100 μΐ da suspensão de esporos são colocados num ponto e, para facilitar a inoculação do fungo, é feito um golpe fino no centro da gota. São feitas pelo menos duas dessas gotas em cada folha. As folhas são incubadas em condições de humidade (i.e., condições ideais para o desenvolvimento de sintomas) durante pelo menos 72 horas e depois observadas quanto ao desenvolvimento da lesão tal como anteriormente descrito (Subramanian, J., Dissertação de Doutoramento, Universidade da Florida, Gainesville, 1995, supra). Testes semelhantes com água Dl servem apenas como controlo. Adicionalmente, as folhas das cultivares que se sabe serem susceptiveis ou resistentes a antracnose são inoculadas e as lesões destas folhas servem como padrão para avaliação da susceptibilidade/resistência das plantas regeneradas derivadas de células embriogénicas seleccionadas in vitro. A partir de uma análise estatística destes dados, são determinados os níveis de resistência a Elsinoê ampelina e a antracnose. As videiras possuindo um maior nível de resistência a Elsinoê ampelina e a antracnose ou a ambas relativamente às plantas de controlo são tomadas como sendo úteis no presente invento.

Transformação de videira O método aqui descrito pode ser utilizado para produzir plantas transformadas. As células podem ser transformadas em qualquer passo do processo de produção de um embrião somático derivado. Assim, os tecidos ou células adequados para transformação incluem tecido explantado, células embriogénicas, massas celulares embriogénicas e embriões somáticos (incluindo embriões somáticos maduros).

Culturas celulares produzidas de acordo com os métodos do presente invento podem ser transformadas com ADN compreendendo um transgene desejado. Tais células, por exemplo, podem ser transformadas com genes que conferem resistência a patogénios, doenças ou pragas ou qualquer combinação destes. Por exemplo, vários genes de Bacillus thurigiensis que codificam proteínas que são tóxicas para várias pragas são bem conhecidas e úteis no método do presente invento. Vários métodos padrão estão disponíveis para a introdução de um transgene numa planta hospedeira, gerando deste modo uma planta transgénica. 37 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ

Após construção do vector de expressão de plantas, vários métodos padrão estão disponíveis para a introdução do vector numa planta hospedeira, gerando deste modo uma planta transgénica. Estes métodos incluem (1) transformação mediada por Agrobacterium {A. tumefaciens ou A. rhízogenes) (ver, p. ex., Lichtenstein e Fuller em: "Genetic Engineering", vol 6, PWJ Rigby, ed., London, Academic Press, 1987; e Lichtenstein, C.P. e Draper, J., em: "DNA Cloning", Vol II, D.M. Glover, ed., Oxford. IRI Press, 1985); (2) o sistema de distribuição de partículas (ver, p. ex., Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603, 1990); ou BioRad Technical Bulletin 1687, supra); (3) protocolos de micro-injecção (ver, p. ex., Green et al., supra); (4) procedimentos de polietilenoglicol (PEG) (ver, p. ex., Draper et al., Plant Cell Physiol. 23: 451, 1982; ou p. ex., Zhang e Wu, Theor. Appl. Genet. 76: 835, 1988); (5) tomada de ADN mediada por lipossomas (ver, p. ex., Freeman et al., Plant Cell Physiol. 25: 1353, 1984); (6) protocolos de electroporação (ver, p. ex., Gelvin et al., supra; Dekeyser et al., supra; Fromm et al., Nature 319: 791, 1986; Sheen, Plant

Cell 2: 1027, 1990; ou Jang e Sheen, Plant Cell 6: 1665, 1994; e (7) o método de vórtice (ver, p. ex., Kindle, supra). O método de transformação não é crítico para o presente invento. Qualquer método que proporcione uma transformação eficiente pode ser empregue. À medida que ficam disponíveis métodos mais novos para transformação de colheitas ou outras células hospedeiras, estes podem ser directamente aplicados. O seguinte é um exemplo delineando uma técnica particular, uma transformação de plantas mediada por

Agrobacterium. Através desta técnica, o processo geral para manipulação de genes a transferir para o genoma de células vegetais é realizado em duas fases. Primeiro, os passos de clonagem e modificação do ADN são realizados em E. coli, e o plasmídeo contendo a construção do gene de interesse é transferido através de conjugação ou electroporação para Agrobacterium. Segundo, a Agrobacterium resultante é utilizada para transformar células vegetais. Assim, para o vector de expressão de plantas generalizado, o plasmídeo contém uma origem de replicação que permite que se replique em Agrobacterium e uma origem de replicação de elevado número de cópias funcional em E. coli. Isto permite a produção fácil e o teste dos transgenes em E. coli antes da transferência para 38 ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ

Agrobacterium para subsequente introdução em plantas. Podem ser transportados genes de resistência no vector, um para selecção em bactérias, por exemplo, estreptomicina, e outro que funcionará em plantas, por exemplo, um gene codificando resistência à canamicina ou resistência a um herbicida. Estão também presentes no vector locais de endonucleases de restrição para a adição de um ou mais transgenes e sequências flanqueadoras de ADN-T direccionais que, quando reconhecidas pelas funções de transferência do Agrobacterium, delimitam a região de ADN que será transferida para a planta.

Noutro exemplo, as células vegetais podem ser transformadas através de bombardeamento nas células de microprojécteis de tungsténio nos quais está precipitado ADN clonado. No aparelho Biolistic Apparatus (Bio-Rad) utilizado para o bombardeamento, uma carga de pólvora (Power Piston Tool Charge, calibre 22) ou um disparo de pressão de ar conduz um microprojéctil de plástico através de um canhão. Uma aliquota de uma suspensão de partículas de tungsténio sobre as quais foi precipitado ADN é colocada na frente do microprojéctil de plástico. 0 último é disparado contra uma placa acrílica de paragem que possui um furo que é demasiado pequeno para o microprojéctil passar através dele. Como resultado, o microprojéctil de plástico esmaga-se contra a placa de paragem e os microprojécteis de tungsténio continuam contra o seu alvo através do furo na placa. Para o presente invento o alvo pode ser qualquer célula ou tecido vegetal, semente ou embrião. 0 ADN introduzido na célula nos microprojécteis integra-se no núcleo ou nos cloroplastos.

Em geral, a transferência e a expressão de transgenes em células vegetais são agora práticas de rotina dos peritos na arte, e tornaram-se ferramentas principais para realizar estudos de expressão génica em plantas e para produzir variedades de plantas melhoradas de interesse agrícola ou comercial.

Lisboa,

Claims (19)

1. ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Método de produção de uma cultura embriogénica perene de videira, compreendendo o referido método os passos de: a) cultivar um tecido de explante de videira num meio de iniciação de cultura, em que o referido meio inclui pelo menos 0,01 mg/1 de uma citocinina; pelo menos 0,1 mg/1 de um hidrato de carbono; e pelo menos 0,1 mg de um composto azotado, b) identificar visualmente uma célula embriogénica ou uma massa celular embriogénica a partir de uma primeira cultura do explante de videira em que as referidas célula embriogénica ou células da referida massa celular embriogénica identificadas visualmente são identificadas como tendo uma cor branco a amarelo pálido, uma aparência granular friável e sendo compactas e ricas em citoplasma, c) transferir as referidas célula embriogénica ou massa celular embriogénica identificadas visualmente do passo (b) para uma segunda cultura; d) permitir que as referidas célula embriogénica ou a massa celular embriogénica transferidas do passo (c) se dividam em células embriogénicas ou massas celulares embriogénicas adicionais; e) identificar visualmente uma célula embriogénica ou uma massa celular embriogénica do passo (d), em que as referidas célula embriogénica ou células da referida massa celular embriogénica visualmente identificadas do passo (d) são identificadas como tendo uma cor branco a amarelo pálido e uma aparência granular friável, e f) transferir a referida célula embriogénica ou massa celular embriogénica identificadas e seleccionadas do passo (c) para uma terceira cultura, produzindo deste modo uma cultura embriogénica de videira perene, em que o referido explante é obtido a partir de anteras, tecido vegetativo, gavinhas, folhas, raízes, tecido nucelar, caules, protoplastos, periciclo, tecido do meristema apical e embriões somáticos. ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ 2/5
2. 2. Método da reivindicação 1, em que o referido explante é um explante de uma variedade seleccionada a partir do grupo que consiste em Alden, Almeria, Anab-E-Shahi, Autumn Black, Beauty Seedless, Black Corinth, Black Damascus, Black Malvoisie, Black Prince, Blackrose, Bronx Seedless, Burgrave, Calmeria, Campbell Early, Canner, Cardinal, Catawba, Christmas, Concord, Dattier, Delight, Diamond, Dizmar, Duchess, Early Muscat, Emerald Seedless, Emperor, Exotic, Ferdinand de Lesseps, Fiesta, Flame seedless, Flame Tokay, Gasconade, Gold, Himrod, Hunisa, Hussiene, Isabella, Italia, July Muscat, Khandahar, Katta, Kourgane, Kishmishi, Loose Perlette, Malaga, Monukka, Muscat de Alexandria, Muscat Flame, Muscat Hamburg, New York Muscat, Niabell, Niagara, Olivette blanche, Ontario, Pierce, Queen, Red Malaga, Ribier, Rish Baba, Romulus, Ruby Seedless, Schuyler, Seneca, Suavis (IP 365), Thompson seedless, Thomuscat, Aleatico, Alicante Bouschet, Aligote, Alvarelhao, Aramon, Baco blanc (22A), Burger, Cabernet franc, Cabernet Sauvignon, Calzin, Carignane, Charbono, Chardonnay CH 01, Chardonnay CH 02, Chardonnay CH Dijon, Chasselas dore, Chenin blanc, Clairette blanche, Early Burgundy, Emerald Riesling, Feher Szagos, Fernao Pires, Flora, French Colombard, Fresia, Furmint, Gamay, Gewurztraminer, Grand noir, Gray Riesling, Green Hungarian, Green Veltliner, Grenache, Grillo, Helena, Inzolia, Lagrein, Lambrusco de Salamino, Malbec, Malvasia bianca, Mataro, Melon, Merlot, Meunier, Mission, Montua de Pilas, Muscadelle du Bordelais, Muscat blanc, Muscat Ottonel, Muscat Saint-Vallier, Nebbiolo, Nebbiolo fino, Nebbiolo Lampia, Orange Muscat, Palomino, Pedro Ximenes, Petit Bouschet, Petite Sirah, Peverella, Pinot noir, Pinot Saint-George, Primitivo di Gioa, Red Veltliner, Refosco, Rkatsiteli, Royalty, Rubired, Ruby Cabernet, Saint-Emilion, Saint Macaire, Salvador, Sangiovese, Sauvignon blanc, Sauvignon gris, Sauvignon vert, Scarlet, Seibel 5279, Seibel 9110, Seibel 13053, Semillon, Servant, Shiraz, Souzao, Sultana Crimson, Sylvaner, Tannat, Teroldico, Tinta Madeira, Tinto cao, Touriga, Traminer, Trebbiano Toscano, Trousseau, Valdepenas, Viognier, Walschriesling, White Riesling, Zinfandel, Couderc 1202, Couderc 1613, Couderc 1616, Couderc 3309 (Vitis riparia X rupestris), Dog Ridge, Foex 33 EM, Freedom, Ganzin 1 (A x R #1), Harmony, Kober 5BB, LN33, Millardet & de Grasset 41B (Vitis vínífera X berlandieri), Millardet & de Grasset 420A, Millardet & de ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ 3/5 Grasset 101-14 (Vitis riparia X rupestris), Oppenheim 4 (S04), Paulsen 775, Paulsen 1045, Paulsen 1103, Richter 99, Richter 110, Riparia Gloire, Ruggeri 225, Saint-George, Salt Creek, Teleki 5A, vitis rupestris Constantia, vitis california e Vitis girdiana, Vitis rotundifolia, Vitis rotundifolia Carlos, Teleki 5C (Vitis herlandieri X riparia), 5BB Teleki (selecção Kober, Vitis berlandieri X riparia), SO4 (Vitis herlandieri X rupestris) e 039-16 (Vitis vinifera X Muscadinia).
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 para produção de um embrião somático de videira, compreendendo ainda os passos de: g) recuperar uma célula embriogénica a partir da referida cultura embriogénica perene de videira; h) transferir a referida célula embriogénica para uma nova cultura; e i) criar um embrião somático de videira a partir da referida célula embriogénica.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a referida cultura no passo (h) é um meio líquido.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que a referida cultura líquida compreende os sais principais de B-5 e os sais mais raros de MS.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a referida cultura no passo (h) compreende um meio sólido.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a referida cultura no passo (h) compreende um meio que contém um regulador do crescimento vegetal.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o referido regulador do crescimento vegetal é uma auxina, NOA, dicamba, picloram, NAA, IAA, 2,4-D, uma citocinina, benziladenina, zeatina, tidiazurão, ácido abcísico ou ácido giberélico. ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ 4/5
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a recuperação da referida célula embriogénica a partir da referida cultura no passo (g) compreende filtração, sedimentação ou selecção.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 4, em que a referida cultura liquida é crivada para sincronizar a formação de embriões somáticos de videira diferenciados.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a referida célula ou massa celular embriogénica é transformada com ADN.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 3, compreendendo ainda a criação de uma plântula de videira a partir de um embrião somático de videira.
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 1 para selecção de um embrião somático de videira possuindo resistência a um patogénio de plantas, compreendendo ainda os passos de: g) cultivar a cultura celular embriogénica perene do passo (f) num primeiro meio de cultura liquido para produzir uma cultura celular em suspensão, compreendendo o referido primeiro meio de cultura liquido um regulador de crescimento vegetal e um filtrado de uma cultura de patogénio de plantas, em que o referido filtrado ou uma toxina purificada é obtido a partir de um virus, um nematode, um insecto, um fungo, um micoplasma ou uma bactéria; h) recuperar uma célula de videira ou um grupo de células de videira a partir da referida cultura celular em suspensão; i) cultivar os referidos célula de videira ou grupo de células de videira num segundo meio de cultura liquido para produzir um embrião somático de videira; e j) recuperar o referido embrião somático de videira possuindo resistência ao referido patogénio de plantas.
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 13, compreendendo ainda a transferência do referido embrião somático de videira para um meio de germinação para criar uma plântula de videira. ΕΡ Ο 996 327/ΡΤ 5/5
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o referido vírus é seleccionado de entre o grupo que consiste em vírus da degenerescência infecciosa da videira, vírus da doença do lenho rugoso de Rupestris e vírus do enrolamento clorótico da videira.
16. 16. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o referido nematode é seleccionado de entre o grupo que consiste num nematode de nódulos da raiz, nematode de quistos, nematode de ataque à raiz e nematode da superfície do solo.
17. 17. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o referido insecto é seleccionado de entre o grupo que consiste em Phylloxera, Coleoptera, Lepidoptera, Homoptera, Dermptera e Diptera.
18. 18. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o referido fungo é seleccionado de entre o grupo que consiste em Uncinula necator, Plasmopara vitícola, Botrytis cinerea, Guignardia bidwellii, Phomophsis vitícola, Elsinoê ampelina, Eutypa lata, Armillaria mellea e Vertícllium dahliae.
19. 19. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a referida bactéria é seleccionada de entre o grupo que consiste em Agrobacterium vitis, Agrobacterium tumefaciens, Xylella fastidosa e Xanthomonas ampelina. Lisboa