ES2154626T3 - Sistema de regeneracion para vides y sus usos. - Google Patents
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Abstract
Un método para producir un embrión de vid somático maduro, comprendiendo dicho método las etapas de: (a) proporcionar un cultivo líquido que comprende una célula embriogénica; (b) recuperar dicha célula embriogénica de dicho cultivo; (c) transferir dicha célula embriogénica a un segundo cultivo; y (d) hacer crecer un embrión de vid somáticomaduro a partir de dicha célula embriogénica.
Description
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Sistema de regeneración para vides y sus
usos.
La invención se refiere a métodos para regenerar
plantas de vid y a germoplasma de vid producido usando tales
métodos.
Las vides son un cultivo caducifolio de frutos
de clima templado de origen antiguo. La producción de uvas (65 x
10^{6} toneladas métricas) supera la de cualquier otro cultivo de
frutos de clima templado y está en tercer lugar después de la
producción de cítricos y plátanos. Además, debido a sus usos para
fruta fresca, zumo, mermelada, pasas y vino, las uvas sobrepasan a
todos los otros cultivos frutales en valor. Por lo tanto, es
probable que los esfuerzos satisfactorios para mejorar las vides
tengan un impacto principal sobre la viticultura comercial.
Los métodos actuales para mejorar las vides
consumen mucho tiempo y exigen mucho trabajo. Por ejemplo, la
mejora genética en las uvas a través de reproducción convencional
está muy limitada por un número de factores tales como la
prolongada edad prefructificación y los niveles de ploidía
variables. Las vides cultivadas también son altamente
heterocigóticas y generalmente no se reproducen verdaderamente a
partir de semillas. Por otra parte, los programas de reproducción
de vides son proyectos costosos a largo plazo. Aunque la
biotecnología vegetal es una alternativa atractiva para la mejora
genética en vides (Kuksova y otros, Plant Cell Tiss. Org. Cult.
49:17-27, 1997), la manipulación genética in
vitro puede tratarse solo si existe un sistema de regeneración
eficaz. De acuerdo con esto, métodos que redujeran cualquiera de
estos problemas representarían un avance significativo en la
técnica.
WO 93/23529 describe un cultivo estabilizado de
agregados celulares proembriogénicos de rizoma de vid 41B archivado
bajo el Nº PL92042917 en la colección ECACC, sus variantes y
cultivos derivados, un procedimiento para la multiplicación de este
cultivo que le permite conservar su poder embriogénico y su estado
estabilizado, un procedimiento para el desarrollo de embriones a
partir de una cepa proembriogénica para el uso en técnicas de
regeneración de vides y una vid regenerada y el uso del cultivo
estabilizado, especialmente para la transformación de células
proembriogénicas mediante un vector adecuado.
Coutos-Thevenot y otros (PLANT
CELL, TISSUE AND ORGAN CULTURE, vol. 29, 1992, páginas
125-133) presentan la embriogénesis somática a
partir de células de vid y la mejora del desarrollo embrionario
mediante cambios en las condiciones de cultivo. Jayasankar y otros
(IN VITRO CELLULAR AND DEVELOPMENTAL BIOLOGY, vol. 34, marzo
de 1998 (1998-03), página 51A) presentan la
selección in vitro de vid para la resistencia al hongo de la
antracnosis, Elsinoe ampelina. Gray y Beneton (HORTSCIENCE,
vol. 26, Nº 6, 1991, página 156) presentan cultivos celulares
embriogénicos perennes de vid y Gray (AMERICAN JOURNAL OF BOTANY,
vol. 79, Nº 5, 1992, páginas 542-546) presenta
embriogénesis somática y regeneración de plantas a partir de
embriones cigóticos inmaduros de variedades de cultivo de uva
muscadina (Vitis rotundifolia).
Se han descubierto métodos para desarrollar
cultivos embriogénicos perennes de vid y para desarrollar grandes
cantidades de embriones somáticos de vid a partir de tales cultivos
embriogénicos perennes en un período relativamente corto usando un
cultivo en suspensión líquido. Se proporcionan varias ventajas
mediante los presentes métodos. Estos sistemas, por ejemplo,
facilitan una frecuencia extraordinariamente alta de formación de
embriones somáticos y regeneración de plantas. Tales frecuencias no
se han presentado previamente para la regeneración de vides de
ninguna variedad de cultivo conocida, y hacen al método útil para la
producción a gran escala de un pie de plantación clonal de plantas
de vid. Además, los métodos producen embriones libres de
anormalidades comunes tales como la fusión y las fasciaciones de
embriones somáticos. Los métodos de la invención también dan como
resultado una frecuencia de iniciación del cultivo embriogénico
potenciada, permitiendo la producción de cultivos altamente
embriogénicos que a continuación pueden llevarse satisfactoriamente
a través de las fases subsiguientes del proceso de regeneración
hasta el nivel de la planta entera. Debido a estas ventajas, los
métodos de la invención son especialmente útiles en la aplicación
de biotecnología para la mejora genética de este cultivo.
En un primer aspecto, la presente invención se
dirige a un método para producir un cultivo embriogénico perenne de
vid, comprendiendo dicho método las etapas de:
- (a)
- cultivar un tejido de explante de vid sobre medio de iniciación de cultivo, dicho medio incluye al menos 0,01 mg/l de una citoquinina, al menos 0,1 mg/l de un carbohidrato y al menos 0,1 mg de un compuesto nitrogenado,
- (b)
- identificar visualmente una célula embriogénica o una masa de células embriogénicas a partir de un primer cultivo de explante de vid, en donde dichas célula embriogénica o células de dicha masa de células embriogénicas identificadas visualmente se identifican por tener un color de blanco a amarillo claro, una apariencia granular friable y ser compactas y ricas en citoplasma,
- (c)
- transferir dicha célula embriogénica o masa de células embriogénicas identificada visualmente de la etapa (b) a un segundo cultivo;
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- (d)
- dejar que dicha célula embriogénica o masa de células embriogénicas transferida de la etapa (c) se divida en células embriogénicas o masas de células embriogénicas adicionales;
- (e)
- identificar visualmente una célula embriogénica o masa de células embriogénicas de la etapa (d), en donde dichas célula embriogénica o células de dicha masa de células embriogénicas identificadas visualmente de la etapa (d) se identifican por tener un color de blanco a amarillo claro y una apariencia granular friable, y
- (f)
- transferir dicha célula embriogénica o masa de células embriogénicas seleccionada identificada de la etapa (e) a un tercer cultivo, produciendo de ese modo un cultivo embriogénico perenne de vid,
en donde dicho explante se obtiene
de anteras, tejido vegetativo, zarcillos, hojas, raíces, tejido
nucelar, tallos, protoplastos, periciclo, tejido meristemático
apical y embriones
somáticos.
En otra modalidad el método se dirige a producir
un embrión somático de vid y comprende además las etapas de
- (g)
- recuperar una célula embriogénica de dicho cultivo embriogénico perenne de vid;
- (h)
- transferir dicha célula embriogénica a un nuevo cultivo; y
- (i)
- desarrollar un embrión somático de vid a partir de dicha célula embriogénica.
En una modalidad adicional el método se dirige a
seleccionar un embrión somático de vid que tenga resistencia a un
patógeno de planta, y comprende además las etapas:
- (g)
- cultivar el cultivo de células embriogénicas perenne de la etapa (f) en un primer medio de cultivo líquido para producir un cultivo en suspensión de células, comprendiendo dicho primer medio de cultivo líquido un regulador del crecimiento de las plantas y un filtrado procedente de un cultivo de patógenos de plantas, en donde dicho filtrado o una toxina purificada se obtiene de un virus, un nematodo, un insecto, un hongo, un micoplasma o una bacteria;
- (h)
- recuperar una célula de vid o un aglomerado de células de vid de dicho cultivo en suspensión de células;
- (i)
- cultivar dicha célula de vid o dicho aglomerado de células de vid en un segundo medio de cultivo líquido para producir un embrión somático de vid; y
- (j)
- recuperar dicho embrión somático de vid que tiene resistencia a dicho patógeno de planta.
Modalidades adicionales de la invención se
describen en las reivindicaciones.
La Figura 1A es una fotografía de una placa de
cultivo de planta que muestra la masa embriogénica de
"Chardonnay" obtenida de un medio de cultivo líquido. Esta
fotografía se tomó aproximadamente diez semanas después de la
iniciación de un cultivo de células líquido.
La Figura 1B es una fotografía de una placa de
cultivo de planta que muestra embriones somáticos en fase
cotiledónea. Esta fotografía se tomó aproximadamente doce semanas
después de la iniciación del desarrollo del embrión.
La Figura 1C es una fotografía de una placa de
cultivo de planta que muestra embriones somáticos maduros partiendo
de germinación precoz en cultivo líquido. Nótese el alargamiento de
las raíces en muchos embriones. Esta fotografía se tomó
aproximadamente veinte semanas después de la iniciación del
desarrollo del embrión.
La Figura 1D es una fotografía de una placa de
cultivo de planta que muestra fases iniciales de diferenciación de
embriones somáticos en un medio sólido después de cinco semanas de
cultivo. Estos embriones somáticos se obtuvieron a partir de masas
de células embriogénicas que se cultivaron en un medio líquido (de
la Figura 1A).
La Figura 1E es una fotografía de una placa de
cultivo de planta que muestra las fases iniciales del desarrollo de
embriones somáticos en un medio sólido. Los embriones somáticos muy
iniciales son transparentes y empiezan a volverse opacos después de
unos pocos días.
La Figura 1F es una fotografía de una placa de
cultivo de planta que muestra embriones somáticos maduros que
germinan en un medio basal MS con sacarosa al 3%.
Se ha desarrollado un método para hacer crecer
cultivos embriogénicos perennes de vid que es útil para la
regeneración de vides. Se ha observado que el germoplasma único
resultante del presente sistema de cultivo produce plantas de vid
con una capacidad potenciada para recrear cultivos embriogénicos.
Por otra parte, se ha desarrollado un procedimiento para hacer
crecer grandes cantidades de embriones somáticos de vid a partir de
tales cultivos embriogénicos perennes en un período relativamente
corto usando un cultivo en suspensión líquido.
Los términos usados en la presente memoria se
definen como sigue:
Por "cultivo embriogénico perenne de vid"
se entiende un cultivo embriogénico en el que células o masas de
células embriogénicas se han seleccionado, subcultivado y mantenido
repetidamente como un cultivo in vitro. Tales cultivos
embriogénicos perennes de vid se mantienen durante al menos medio
año, preferiblemente tres años y lo más preferiblemente cuatro o
más años.
Por "célula embriogénica", "masa de
células embriogénicas" o "cultivos embriogénicos" se
entiende una célula o colección de células que tiene el potencial
inherente de desarrollarse en un embrión somático y, finalmente, en
una planta. Típicamente, tales células tienen núcleos grandes y
citoplasma denso. Adicionalmente, tales células son totipotentes ya
que poseen todo el potencial genético y estructural para convertirse
finalmente en una planta
entera.
entera.
Por "nivel incrementado de embriogénesis"
se entiende una mayor capacidad para producir una célula
embriogénica o una masa de células embriogénicas en un cultivo
embriogénico perenne de vid que el nivel de un cultivo embriogénico
de vid no perenne de control. En general, tal nivel incrementado de
embriogénesis es al menos 20%, preferiblemente 50%, más
preferiblemente 100% y lo más preferiblemente 250% o más que el
nivel de un cultivo embriogénico de control. El nivel de
embriogénesis se mide usando métodos convencionales.
Por "explante" se entiende un órgano, un
tejido o una célula derivados de una planta y cultivados in
vitro con el propósito de iniciar un cultivo de células de
planta o un cultivo de tejido de planta. Por ejemplo, tejido de vid
de explante puede obtenerse virtualmente de cualquier parte de la
vid, incluyendo, sin limitación, anteras, ovarios, óvulos, tejido
floral, tejido vegetativo, zarcillos, hojas, raíces, tejido nucelar,
tallos, semillas, protoplastos, periciclo, tejido meristemático
apical, tejido embriogénico, embriones somáticos y embriones
cigóticos.
Por "regulador del crecimiento de las
plantas" se entiende un compuesto que afecta al crecimiento y la
división de las células de la planta. Reguladores del crecimiento
de las plantas preferidos incluyen auxinas o citoquininas naturales
o sintéticas. Auxinas ejemplares incluyen, pero no se limitan a,
NOA, 2,4-D, NAA, IAA, dicamba y picloram.
Citoquininas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, BA y
zeatina.
Por "embriogénesis somática" se entiende el
proceso de iniciación y desarrollo de embriones in vitro a
partir de células y tejidos de planta ausentes de reproducción
sexual.
Por "embrión somático" se entiende un
embrión formado in vitro a partir de células somáticas o
células embriogénicas mediante división celular mitótica.
Por "embrión somático maduro" se entiende
un embrión completamente desarrollado con evidencia de ápices de
raíz y vástago y que exhibe una estructura bipolar. Embriones
somáticos maduros preferidos son aquellos con cotiledones bien
definidos.
Por "plántula" se entiende una planta
pequeña en germinación derivada de un embrión somático.
Por "regeneración" se entiende la
producción de un órgano, un embrión o una planta entera en cultivo
de tejido de planta.
Por "patógeno" se entiende un organismo
cuya infección de tejido de planta viable provoca una respuesta de
enfermedad en el tejido de la planta. Tales patógenos incluyen, sin
limitación, bacterias, micoplasmas, hongos, insectos, nematodos,
virus y viroides. Enfermedades de plantas provocadas por estos
patógenos se describe en los Capítulos 11-16 de
Agrios, Plant Pathology, 3ª ed., Academic Press, Inc., Nueva York,
1988. Ejemplos de patógenos bacterianos incluyen, sin limitación,
Agrobacterium vitis, Agrobacterium tumefaciens,
Xylella fastidosa y Xanthomonas ampelina. Ejemplos de
patógenos fúngicos incluyen, sin limitación, Uncinula
necator, Plasmopara viticola, Botrytis cinerea,
Guignardia bidwellii, Phomophsis viticola, Elsinoë
ampelina, Eutypa lata, Armillaria mellea y
Verticllium dahliae. Ejemplos de nematodos patógenos
incluyen, sin limitación, nematodos de los nudos de las raíces (por
ejemplo, especies de Meloidogyne), nematodos quísticos (por
ejemplo, especies de Heterodera), nematodos que atacan las
raíces (por ejemplo, Rotylenchulus reniformis) y nematodos de
las partes aéreas (por ejemplo, Anguina funesta). Ejemplos
de plagas patógenas (por ejemplo, insectos) incluyen, sin
limitación, Phylloxera, Coleoptera,
Lepidoptera, Homoptera, Dermptera y
Diptera. Ejemplos de patógenos virales incluyen, sin
limitación, virus de la hoja en abanico de la vid y virus enrollador
de la hoja de la vid.
Por "nivel de resistencia incrementado" se
entiende un mayor nivel de resistencia o tolerancia a un patógeno o
una plaga que provoca una enfermedad en una vid resistente (o su
renuevo, rizoma, célula o semilla) que el nivel de resistencia o
tolerancia o ambos con relación a una planta de control (es decir,
una vid que no se ha sometido a selección in vivo para
ningún patógeno de planta o su filtrado que contiene toxinas). En
modalidades preferidas, el nivel de resistencia en una planta
resistente de la invención es al menos 5-10% (y
preferiblemente 30% o 40%) mayor que la resistencia de una planta de
control. En otras modalidades preferidas, el nivel de resistencia a
un patógeno que provoca enfermedad es 50% mayor, 60% mayor y más
preferiblemente incluso 75% o 90% mayor que el nivel de resistencia
de una planta de control; siendo lo más preferido hasta 100% por
encima del nivel de resistencia en comparación con el nivel de
resistencia de una planta de control. El nivel de resistencia o
tolerancia se mide usando métodos convencionales. Por ejemplo, el
nivel de resistencia a un patógeno puede determinarse comparando
rasgos y características físicos (por ejemplo, altura y peso de la
planta, o comparando síntomas de enfermedad, por ejemplo desarrollo
de lesiones retardado, tamaño de lesiones reducido, marchitado,
arrugamiento y rizado de las hojas, putrefacción de racimos de
frutos, manchas impregnadas de agua, escaldado y quemado marginal
de las hojas y decoloración de células) de plantas de vid
resistentes con plantas de vid de control.
Por "transformada" se entiende cualquier
célula que incluya una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una
secuencia de DNA) que esté insertada artificialmente en una célula y
forme parte del genoma del organismo (de un modo bien integrado o
bien extracromosómico, por ejemplo, un constructo de expresión viral
que incluye un promotor subgenómico) que se desarrolla a partir de
esa célula. Según se usa en la presente memoria, los organismos o
las células transformados son generalmente vides o componentes de
vid transformados y la molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un
transgén) se inserta artificialmente en los compartimentos nuclear o
plastídico de la célula de
planta.
planta.
Por "transgén" se entiende cualquier
fragmento de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, DNA) que
se inserte artificialmente en una célula y forme parte del
organismo (integrado en el genoma o mantenido extracromosómicamente)
que se desarrolla a partir de esa célula. Tal transgén puede
incluir un gen que es parcialmente o totalmente heterólogo (es
decir, extraño) para el organismo transgénico, o puede representar
un gen homólogo a un gen endógeno del organismo.
Los métodos de regeneración descritos en la
presente memoria se han usado para la regeneración satisfactoria
mediante embriogénesis somática de una variedad de variedades de
cultivo de rizoma y renuevo de vid, incluyendo Autumn Seedless,
Blanc du Bois, Cabernet Franc, Cabernet Sauvignon, Chardonnay (por
ejemplo, CH 01 y CH 02), Dolcetto, Merlot, Pinot Noir (por
ejemplo., PN y PN Dijon), Semillon, White Riesling, Lambrusco,
Stover, Thompson Seedless, Niagrara Seedless. Seval Blanc,
Zinfindel, Vitis rupestris St. George, Vitis
rotundifolia Carlos, Vitis rotundifolia Dixie, Vitis
rotundifolia Fry y Vitis rotundifolia Welder.
Usando métodos de cultivo tisular de plantas
descritos en la presente memoria, también se han desarrollado
métodos de selección in vitro que permiten a los expertos en
la técnica desarrollar vides resistentes a patógenos. Una de tales
aplicaciones es la selección de mutaciones en cultivos de células de
vid. En esta aplicación, las células que son resistentes a o
susceptibles de un estado particular se seleccionan basándose en el
crecimiento incrementado o selectivo. Las células pueden exponerse
además a un mutágeno que da como resultado cambios en el DNA de las
células expuestas. El DNA mutagenizado puede identificarse a
continuación usando técnicas estándar. Una segunda aplicación
relacionada es la selección de células resistentes a patógenos. Las
células se cultivan en presencia de un patógeno. Las células que
muestran resistencia pueden usarse a continuación para regenerar
una planta resistente al patógeno. Una tercera aplicación es la
transferencia de información genética a células de vid. La
información genética puede incluir una secuencia de ácido nucleico
que codifica un marcador seleccionable. Cultivar células en
presencia de la presión selectiva da como resultado la proliferación
o la supervivencia solo de las células que tienen la información
genética deseada. Los métodos descritos en la presente memoria
también permiten a los expertos en la técnica desarrollar,
seleccionar y propagar variantes de vid que tienen características
nuevas o útiles.
Los métodos de la invención son aplicables
generalmente a una variedad de plantas de vid (por ejemplo, especies
de Vitis, híbridos de especies de Vitis y todos los
miembros de los subgéneros Euvitis y Muscadinia),
incluyendo variedades de cultivo de renuevo y rizoma. Variedades de
cultivo de renuevo incluyen, sin limitación, las que se denominan
uvas de mesa o para pasas Alden, Almería,
Anab-E-Shahi, Autumn Black, Beauty
Seedless, Black Corinth, Black Damascus, Black Malvoisie, Black
Prince, Blackrose, Bronx Seedless, Burgrave, Calmeria, Campbell
Early, Canner, Cardinal, Catawba, Christmas, Concord, Dattier,
Delight, Diamond, Dizmar, Duchess, Early Muscat, Emerald Seedless,
Emperor, Exotic, Ferdinand de Lesseps, Fiesta, Flame seedless, Flame
Tokay, Gasconade, Gold, Himrod, Hunisa, Hussiene, Isabella, Italia,
July Muscat, Khandahar, Katta, Kourgane, Kishmishi, Loose Perlette,
Málaga, Monukka, Muscat of Alexandria, Muscat Flame, Muscat Hamburg,
New York Muscat, Niabell, Niagara, Olivette blanche, Ontario,
Pierce, Queen, Red Málaga, Ribier, Rish Baba, Romulus, Ruby
Seedless, Schuyler, Seneca, Suavis (IP 365), Thompson seedless y
Thomuscat. También incluyen las usadas en producción de vinos,
tales como Aleatico, Alicante Bouschet, Aligote, Alvarelhao, Aramon,
Baco blanc (22A), Burger, Cabernet franc, Cabernet Sauvignon,
Calzin, Carignane, Charbono, Chardonnay (por ejemplo, CH 01, CH 02,
CH Dijon), Chasselas dore, Chenin blanc, Clairette blanche, Early
Burgundy, Emerald Riesling, Feher Szagos, Femao Pires, Flora,
French Colombard, Fresia, Furmint, Gamay, Gewurztraminer, Grand
noir, Gray Riesling, Green Hungarian, Green Veltliner, Grenache,
Grillo, Helena, Inzolia, Lagrein, Lambrusco de Salamino, Malbec,
Malvasia bianca, Mataro, Melon, Merlot, Meunier, Mission, Montua de
Pilas, Muscadelle du Bordelais, Muscat blanc, Muscat Ottonel,
Muscat Saint-Vallier, Nebbiolo, Nebbiolo fino,
Nebbiolo Lampia, Orange Muscat, Palomino. Pedro Ximénez, Petit
Bouschet, Petite Sirah, Peverella, Pinot noir, Pinot
Saint-George, Primitivo di Gioa, Red Veltliner,
Refosco, Rkatsiteli, Royalty, Rubired, Ruby Cabernet,
Saint-Emilion, Saint Macaire, Salvador, Sangiovese,
Sauvignon blanc, Sauvignon gris, Sauvignon vert, Scarlet, Seibel
5279, Seibel 9110, Seibel 13053, Semillon, Servant, Shiraz, Souzao,
Sultana Crimson, Sylvaner, Tannat, Teroldico, Tinta Madeira, Tinto
cao, Touriga, Traminer, Trebbiano Toscano, Trousseau, Valdepeñas,
Viognier, Walschriesling, White Riesling y Zinfandel. Variedades de
cultivo de rizomas incluyen Couderc 1202, Couderc 1613, Couderc
1616, Couderc 3309 (Vitis riparia X rupestris), Dog
Ridge, Foex 33 EM, Freedom, Ganzin 1 (A x R #1), Harmony, Kober 5BB,
LN33, Millardet & de Grasset 41B (Vitis vinifera X
berlandieri), Millardet & de Grasset 420A, Millardet
& de Grasset 101-14 (Vitis riparia X
rupestris), Oppenheim 4 (SO4), Paulsen 775, Paulsen 1045,
Paulsen 1103, Richter 99, Richter 110, Riparia Gloire, Ruggeri 225,
Saint-George, Salt Creek, Teleki 5A, Vitis
rupestris Constantia, Vitis california y Vitis
girdiana, Vitis rotundifolia, Vitis rotundifolia
Carlos, Teleki 5C (Vitis berlandieri X riparia), 5BB
Teleki (selección Kober, Vitis berlandieri X riparia),
SO_{4} (Vitis berlandieri X rupestris) y
039-16 (Vitis vinifera X
Muscadinia).
Sigue ahora una descripción de cada uno de los
métodos mencionados anteriormente. Estos ejemplos se proporcionan
con el propósito de ilustrar la invención y no deben considerarse
limitativos.
El siguiente método ha resultado eficaz para la
producción de cultivos embrionarios perennes de vid y para la
regeneración de la vid mediante embriogénesis somática.
En la etapa de iniciación del cultivo, se
recogió un material de explante del campo, el invernadero o cultivos
de micropropagación de vástagos de vid y se puso en el cultivo
in vitro. Este material de explante se recogió típicamente
de hojas, anteras o zarcillos, pero también se obtiene de otros
tejidos vegetativos o reproductores de vid. Una vez recogido, el
tejido de explante, si se desea, se esterilizó superficialmente de
acuerdo con métodos estándar y a continuación se puso sobre un
medio de iniciación del cultivo sólido adecuado en una placa
Petri.
Puede usarse cualquiera de un número de medios
bien conocidos, por ejemplo medio de Murashige y Skoog (MS) y de
Nitsch. Tales medios incluyen típicamente sales inorgánicas,
vitaminas, micronutrientes, una fuente de nitrógeno y una fuente de
carbono tal como sacarosa, maltosa, glucosa, glicerol, inositol y
similares. Por ejemplo, puede añadirse sacarosa en una
concentración de entre aproximadamente 1 g/l y aproximadamente 200
g/l, y preferiblemente en una concentración de entre aproximadamente
30 g/l y aproximadamente 90 g/l. Por otra parte, la composición de
tales medios de cultivo de tejido de planta puede modificarse para
optimizar el crecimiento de la célula de planta particular
empleada. Por ejemplo, el medio de iniciación del cultivo puede
prepararse a partir de cualquiera de los medios basales encontrados
en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Si se desea, el medio de iniciación puede
contener una auxina o una mezcla de auxinas en una concentración de
aproximadamente 0,01 mg/l a aproximadamente 100 mg/l, dependiendo de
la variedad de cultivo de interés, lo que es eficaz para inducir la
producción de células embriogénicas o masas de células embriogénicas
en el tejido de explante. Por ejemplo, el tejido de explante puede
mantenerse sobre un medio tipo Nitsch solidificado en agar
complementado con, por ejemplo, entre aproximadamente 0,01 mg/l y
aproximadamente 10 mg/l de 2,4-D, y preferiblemente
entre aproximadamente 0,5 mg/l y aproximadamente 3,0 mg/l de
2,4-D. 2,4-D es solo un ejemplo de
una auxina que es útil en los métodos de la invención. Otras auxinas
incluyen, por ejemplo, NAA, NOA, IAA, dicamba y picloram.
Adicionalmente, si se desea, pueden incluirse otros reguladores del
crecimiento de las plantas en el medio a concentraciones estándar.
Por ejemplo, las citoquininas (por ejemplo, una citoquinina
presente en la naturaleza o sintética, tal como BA o zeatina), si
están presentes, pueden usarse en una concentración de
aproximadamente 0,01 mg/l a aproximadamente 10 mg/l, y
preferiblemente aproximadamente 0,3 mg/l, dependiendo de la
variedad de cultivo de interés. En algunos casos, pueden incluirse
otras clases de reguladores del crecimiento, tales como ABA o GA,
en concentraciones estándar apropiadas. Por ejemplo, puede añadirse
ABA en una concentración de aproximadamente 0,5 mg/l a
aproximadamente 20 mg/l y preferiblemente en una concentración de
aproximadamente 5 mg/l; y puede añadirse GA en una concentración de
aproximadamente 0,1 mg/l a aproximadamente 30 mg/l, y
preferiblemente en una concentración de aproximadamente 5 mg/l. La
adición de reguladores del crecimiento de las plantas en esta fase
no es necesaria para la inducción de embriogénesis. Adicionalmente,
el medio de iniciación también puede incluir carbón vegetal
activado (0,1-2,0 g/l) o un adsorbente similar
conocido por los expertos en la técnica.
El cultivo de tejido de explante durante esta
fase se lleva a cabo preferiblemente en la oscuridad a
22-23ºC, aunque también puede llevarse a cabo bajo
condiciones de luz muy baja o en luz completa. Después de
aproximadamente una a cuatro semanas en cultivo, los cultivos de
tejido de explante se ponen a continuación a la luz completa con un
fotoperíodo de 16 h. Los cultivos se exploran semanalmente con
respecto a la presencia de células embriogénicas o masas de células
embriogénicas emergentes. Las células o masas de células
embriogénicas se identifican basándose en la morfología. Las masas
de células embriogénicas, en general, tienden a ser de color blanco
a amarillo claro y a menudo son transparentes. Pueden reconocerse
desde una fase pequeña muy temprana (agregados de
10-20 células), basándose en su color y apariencia
granular friable. Los cultivos embriogénicos también se identifican
por su naturaleza compacta con células que son ricas en citoplasma
(según se observa bajo el microscopio). Los cultivos embriogénicos
aparecen con frecuencias variables dependiendo de una multitud de
factores incluyendo, pero no limitados a, el genotipo, la
naturaleza y el tipo de explante, la composición del medio y la
estación de recolección. La selección visual cuidadosa para
asegurar la transferencia de estructuras similares a embriones
apropiadas se requiere para el mantenimiento del cultivo. Una vez
identificadas, las células o masas de células embriogénicas se
transfieren a continuación a medio de mantenimiento de cultivo,
según se describe en la presente memoria.
Las células embriogénicas o las masas de células
embriogénicas se retiran cuidadosamente y se transfieren a un medio
de mantenimiento de cultivo. De nuevo, puede usarse cualquiera de un
número de medios bien conocidos, por ejemplo medio de MS y Nitsch.
Aunque no se requieren generalmente, pueden añadirse reguladores del
crecimiento de las plantas como los descritos anteriormente.
En general, el tejido embriogénico puede
mantenerse subcultivando a intervalos regulares (por ejemplo, cada
una a cuatro semanas o cada cuatro a ocho semanas) hasta nuevo medio
de mantenimiento, según se describe en la presente memoria.
Alternativamente, el tejido embriogénico puede ponerse en un medio
de cultivo líquido (por ejemplo, MS, B-5 o Nitsch)
y hacerse crecer como una suspensión embriogénica líquida según se
describe en la presente memoria. Las masas de células embriogénicas
se hacen crecer para incrementar la biomasa de células
embriogénicas según se requiera mediante división de cultivos en
expansión durante la transferencia. Puede incitarse a los cultivos
a desarrollarse hacia embriogénesis creciente o hacia menos
embriogénesis y más crecimiento de células embriogénicas
desorganizadas mediante manipulación repetida del cultivo, que
incluye selección cuidadosa de células y masas de células
embriogénicas durante la transferencia. No solo se ha encontrado
que la transferencia repetida de células o masas de células
embriogénicas enriquezca el crecimiento de tejido embriogénico,
sino que también facilita el proceso de embriogénesis somática. Los
cultivos son perennes ya que típicamente persisten durante más de
dos años.
Un componente clave del presente sistema implica
la selección cuidadosa de células embriogénicas de tejido
explantado, seguido por la selección recurrente y el subcultivo del
tejido embriogénico seleccionado. No solo se ha encontrado que este
material es útil en la regeneración de plantas de vid enteras a
partir de embriones somáticos, sino que también se ha encontrado
que tiene una capacidad significativamente incrementada para la
embriogénesis, incluyendo la producción de embriones somáticos.
Llevando a cabo este procedimiento, el crecimiento de células
embriogénicas se enriquece, acelerando el proceso de la formación de
embriones somáticos y la regeneración de plantas subsiguiente.
Se observó que el material de explante tomado de
las plantas que se hacían crecer a partir de embriones somáticos
exhibía un potencial embriogénico aumentado, cuando se comparaba con
material de explante tomado de tejido de explante clonal que no se
había cultivado para la producción de células embriogénicas. Se
observó que este incremento en el potencial embriogénico se
incrementaba después de dos o más ciclos sucesivos de iniciación,
cultivo y regeneración de plantas (por ejemplo, planta clonal
\rightarrow explante \rightarrow iniciación de cultivo
embriogénico \rightarrow embrión somático \rightarrow planta
derivada de embrión somático \rightarrow explante). No es
necesario usar una planta derivada de embrión somático como la
fuente del explante. Embriones somáticos o incluso cultivos
embriogénicos que se han transferido a medio nuevo también
producirán nuevos embriones somáticos con potencial embriogénico
incrementado. Tal material de explante se mantiene convenientemente
como cultivos de vástagos axilares in vitro, lo que sirve
como la fuente de explantes vegetativos; sin embargo, también son
aceptables otros métodos de mantenimiento de plantas.
Embriones somáticos obtenidos de los cultivos
descritos anteriormente se germinan subsiguientemente como plántulas
de vid de acuerdo con métodos estándar. Por ejemplo, los embriones
somáticos se ponen sobre la superficie de un medio de germinación
(por ejemplo, medio MS) en placas Petri estériles. Los cultivos que
contienen los embriones se incuban en una cámara de crecimiento
bajo condiciones iluminadas (fotoperíodo de 16 h). Durante la
germinación la raíz emerge y el epicotilo empieza a crecer. Cuando
las plantas de vid que están creciendo sobre medio de germinación
alcanzan un tamaño suficiente (1 cm, con al menos dos hojas), pueden
retirarse de las cápsulas de cultivo y plantarse en una mezcla para
macetas esterilizada. Las plántulas se transfieren típicamente a
semilleros en una mezcla para macetas sin suelo (por ejemplo,
vermiculita, perlita o ProMix^{TM}, V.J. Growers, Apopka, FL). Si
se desea, las plántulas pueden ponerse en una cámara de crecimiento
o en una cámara húmeda de invernadero e incubarse bajo condiciones
de alta humedad (90% de humedad) para el crecimiento y la
aclimatación de las plántulas. Subsiguientemente, las plántulas
aclimatadas pueden transferirse al exterior a un viñedo o a un
invernadero.
En un ejemplo, se describe la producción de un
cultivo perenne embriogénico de Vitis vinifera cv.
"Thompson Seedless". Se obtuvieron cultivos derivados de
plantas madre de una hoja que se desinfectó superficialmente y se
inoculó sobre medio de iniciación de cultivo descrito por Nitsch
(1968) y modificado por Gray D.J. ("Somatic Embryogenesis in
Grape". En: Somatic embryogenesis in woody perennials, Vol. 2,
Gupta P.K., Jain S.M., y Newton R.J. (Eds.), Kluwer Academic.
Dordrecht, Países Bajos, pp. 191-217, 1995). Este
medio contenía aproximadamente 1,1 mg/l de 2,4-D y
aproximadamente 0,05 mg/l de BA. Después de explantar el tejido, los
recipientes de cultivo se incubaron en oscuridad completa durante
seis semanas. Se observó que la mayoría del tejido explantado
formaba una masa de células altamente vacuoladas no diferenciadas
dentro de este período de seis semanas. Los cultivos embriogénicos,
identificados por su naturaleza compacta y la presencia de células
que eran ricas en citoplasma, se subcultivaron repetidamente. El
cultivo resultante se obtuvo mediante el método de selección
descrito anteriormente, seguido por subcultivo (durante
aproximadamente 6 semanas) hasta que estaba disponible suficiente
cultivo embriogénico. Un embrión somático originalmente obtenido de
la planta madre (es decir, embrión de 1ª generación) se germinó y
la punta de su vástago se usó para crear un cultivo de
micropropagación in vitro. Hojas procedentes de la planta
derivada de ese cultivo se usaron a continuación para producir un
nuevo cultivo embriogénico (2ª generación). Un embrión somático
obtenido de ese cultivo se usó de forma similar para crear la
tercera generación. La respuesta embriogénica de Vitis
vinifera cv. "Thompson Seedless" a partir de hojas
derivadas de cultivo de micropropagación in vitro se
presenta en la Tabla 2 (posteriormente). Estos resultados muestran
la comparación de hojas procedentes de cultivos derivados de planta
madre en maceta con hojas de plantas derivadas de cultivos
obtenidos a partir de embriones somáticos germinados de tercera
generación.
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Además, también se han producido cultivos
embriogénicos perennes de otras vides usando los métodos descritos
en la presente memoria, incluyendo Viris longii, Vitis
rotundifolia (cv. Carlo y Dixie), Vitis rupestris,
Vitis vinifera (cv. Autumn Seedless, Cabernet Sauvignon,
Cabernet Franc, Chardonnay, Dolcetto, Gamay Beaujolais, Lambrusco,
Pinot Noir, Semillon, Tokay, White Riesling, Zinfindel, y
similares), y varios híbridos de Vitis (cv. Blanc du Bois, Niagara
Seedless, Seyval Blanc, Stover, Southern Home y similares).
También se ha desarrollado un método para la
producción de grandes cantidades de embriones somáticos de vid
usando bien un cultivo en suspensión de células líquido o un sistema
de cultivo sólido. Estos métodos son particularmente útiles para
producir células altamente embriogénicas que son capaces de
regenerarse en plantas enteras. Posteriormente, se presenta un
protocolo simple para la embriogénesis somática eficaz de vid usando
bien un cultivo en suspensión de células líquido o bien un sistema
de cultivo sólido.
En general, el método incluye un procedimiento
de cultivo multifásico que implica típicamente (i) iniciación de
cultivo; (ii) identificación y aislamiento de células embriogénicas
o masas de células embriogénicas; (iii) producción de cultivos
embriogénicos perennes; y (iv) concentración de aglomerados de
células altamente embriogénicos. El método implica las siguientes
etapas.
Se pone tejido de explante sobre un medio de
iniciación de cultivo adecuado, según se describe en la presente
memoria. Después de aproximadamente seis semanas en el medio de
iniciación de cultivo, se identifican células embriogénicas y masas
de células embriogénicas. Una vez identificados, los cultivos
embriogénicos, que pueden tener menos de 1 mm de diámetro, se
aíslan y se cultivan sobre medio de iniciación reciente para
promover el crecimiento, según se describe en la presente memoria.
El subcultivo de los cultivos embriogénicos da como resultado
típicamente la formación de embriones somáticos. Los cultivos
embriogénicos y los embriones somáticos en fase inicial obtenidos a
partir de estos cultivos se cultivan a continuación adicionalmente
en un medio de crecimiento de plantas líquido adecuado, por
ejemplo, el medio nutritivo de cultivo tisular de plantas, que
consiste en medio B-5 (Gamborg y otros, Exp. Cell.
Res. 50:151-158, 1968; Sigma Chemicals, St. Louis,
MO), que se ha modificado según se describe por DeWald y otros (J.
Amer. Soc. Hort. Sci. 114:712-716, 1989) y Litz y
otros ("Somatic embryogenesis in mango", 1995, anteriormente).
Este medio modificado consiste en sales principales de
B-5, sales secundarias de MS y vitaminas, glutamina
(aproximadamente 400 mg/l) y sacarosa o azúcar de mesa comercial
(aproximadamente 60 g/l). Antes del tratamiento en autoclave, el pH
del medio se ajusta hasta aproximadamente 5,8. Aunque
2,4-D (aproximadamente 0,5-2,0 mg/l)
es el regulador del crecimiento preferido usado en este medio,
otros reguladores del crecimiento, tales como, por ejemplo, dicamba,
picloram, NOA o ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético,
también pueden usarse en concentraciones apropiadas, por ejemplo,
las descritas anteriormente. Los matraces que contienen los cultivos
celulares embriogénicos, embriones somáticos o ambos se incuban
subsiguientemente a aproximadamente 26ºC en un agitador giratorio a
125 rpm en la oscuridad o con luz difusa. Los cultivos se
subcultivan a continuación como se describe en la presente memoria,
típicamente una vez cada diez a catorce días, pero los regímenes de
subcultivo pueden variar dependiendo del recipiente y la
proliferación de aglomerados de células embriogénicas.
En de aproximadamente seis a ocho semanas, se
produce un cultivo en suspensión de células fino, que consiste en
células alargadas altamente vacuoladas (células no embriogénicas) y
también un número menor de células isodiamétricas pequeñas ricas en
citoplasma (células embriogénicas). Una vez que se produce
suficiente cultivo, los embriones diferenciados pueden retirarse
del cultivo tamizando, y los embriones diferenciados se descartan.
Se ha encontrado que el mantenimiento continuado del cultivo en
suspensión de células embriogénicas tamizado en medio líquido
B-5 modificado, con subcultivos periódicos,
incrementa la biomasa de aglomerados de células embriogénicas.
Después de aproximadamente doce a dieciséis
semanas, se observa típicamente una gran masa de células de vid
embriogénicas altamente concentradas. El tiempo empleado para la
concentración de células embriogénicas o masas de células
embriogénicas puede variar dependiendo de varios factores,
incluyendo la variedad de cultivo, el genotipo y las condiciones de
cultivo. Las células embriogénicas en esta fase son especialmente
útiles virtualmente en cualquier tipo de método de transformación
genética. Estas células embriogénicas también pueden inducirse para
diferenciarse en embriones somáticos de acuerdo con cualquier método
estándar, por ejemplo, cultivando las células en medio líquido
B-5 modificado carente de reguladores del
crecimiento durante un período de aproximadamente cuatro a seis
semanas. Alternativamente, los embriones somáticos en fase inicial
pueden cultivarse en placa en medio solidificado mediante la
adición de un agente gelificante adecuado tal como goma de gelano,
agarosa, agar o cualquier otro agente similar, para la
diferenciación completa de embriones somáticos en completa
oscuridad. Si se desea, embriones en fase de torpedo/cotiledónea
pueden subcultivarse individualmente en un medio de maduración
estándar, por ejemplo un medio de maduración que consiste en
formulaciones nutritivas de MS. Los embriones somáticos maduros se
transfieren a continuación a una cámara de crecimiento para la
germinación y la regeneración en plantas en un recipiente
apropiado. La frecuencia de formación de embriones somáticos usando
este procedimiento es típicamente
alta.
alta.
Sigue ahora una descripción de los resultados
para la producción de células y masas de células embriogénicas
obtenidas a partir de cultivos en suspensión líquidos y sólidos de
"Thompson Seedless" y dos clones diferentes de Chardonnay, CH
01 y CH 02.
Embriones asíncronos de Vitis vinifera
cv. "Thompson Seedless" y Chardonnay CH 01 y CH 02 obtenidos de
tejido embriogénico perenne se cultivaron adicionalmente en un
medio líquido para producir un cultivo en suspensión de tejido
calloso. Después de aproximadamente catorce días y después de
aproximadamente dos a tres subcultivos (un subcultivo se realizaba
aproximadamente cada catorce días), se produjo un callo amorfo de
color amarillento a blanco cremoso. Como resultado de la producción
de tejido calloso, el medio de cultivo líquido en el matraz de
cultivo tisular aparecía como una suspensión densa. El examen
microscópico revelaba que las células de ensayo eran alargadas y
estaban altamente vacuoladas, y no existen signos de capacidad
embriogénica. El callo amorfo continuaba proliferando, incluso
cuando los embriones somáticos usados para iniciar el cultivo se
retiraban del
cultivo.
cultivo.
Después de aproximadamente seis semanas en medio
líquido B-5 modificado, se observó la producción de
pequeños aglomerados de células ricas en citoplasma como agregados
blancos (Figura 1A). Se observó que estas masas embriogénicas
proliferaban espontáneamente y crecían hasta la capacidad del matraz
en aproximadamente diez a doce semanas.
El mantenimiento continuado de estas masas
embriogénicas como una sola unidad (es decir, en un matraz) a menudo
es perjudicial, ya que se ha encontrado que los cultivos se
deterioran en calidad y finalmente se vuelven pardos. Dividir estos
cultivos embriogénicos en unidades más pequeñas durante el
subcultivo ayuda a proliferar e incrementar la biomasa de los
cultivos divididos. Entre las dos variedades de cultivo probadas, se
encontró que ambos clones de "Chardonnay" crecían de forma
igualmente rápida y crecían más que "Thompson Seedless".
Mientras que las masas embriogénicas de "Chardonnay" eran de
color blanco cremoso a amarillento, las de "Thompson Seedless"
eran blanco apagado o pardusco. "Thompson Seedless" parecían
ser más sensibles a la densidad de cultivo, ya que se observaba que
las células se volvían oscuras si la densidad de cultivo no se
corregía. La densidad de cultivo preferida era aproximadamente 400
mg de células embriogénicas por 40 ml de medio B5 líquido
modificado en un matraz de 125 ml.
Las masas embriogénicas se hicieron pasar a
través de un tamiz de nailon de 960 micras y se recogieron en un
vaso de precipitados estéril. Se encontró que el tamizado de las
masas embriogénicas para iniciar la embriogénesis en cultivo
líquido servía para dos propósitos. En primer lugar, se obtenía un
buen grado de sincronización de diferenciación de embriones. En
segundo lugar, se reducía la formación de anormalidades de embriones
somáticos durante la diferenciación, tales como fasciación o
fusión. Después de cuatro a seis semanas en medio líquido, se
observaban embriones somáticos blancos pequeños en la fase globular
o de corazón temprana. Tamizar los cultivos en esta fase no
facilitaba un incremento en la diferenciación de embriones.
Después de aproximadamente ocho semanas, los
embriones somáticos eran claramente visibles, y se encontró que
unos pocos embriones habían alcanzado la fase cotiledónea de
desarrollo embrionario. Sin embargo, tamizar los embriones
diferenciados y cultivarlos en un matraz separado facilitaba la
diferenciación más rápida, así como la sincronización del
desarrollo embrionario.
Se encontró que ambos clones de
"Chardonnay" CH 01 y CH 02 se diferenciaban fácilmente de
embriones somáticos. El tamizado y el ajuste de densidad (realizado
cultivando aproximadamente 100 mg de embriones somáticos por 40 ml
de medio) apropiados aseguraban mayor sincronización y
singularización, así como diferenciación embrionaria (Figura 1B).
En aproximadamente doce a catorce semanas después del subcultivo en
medio de embriogénesis líquido, los embriones somáticos
singularizados empezaban a volverse verdes y las radículas se
alargaban, mostrando el comienzo de germinación precoz (Figura
1C).
Se encontró inicialmente que los cultivos de
"Thompson Seedless" no avanzaban más allá de la fase de corazón
en cultivo líquido. Además, se encontró que los embriones estaban
más aglomerados, dando como resultado a menudo la formación de
embriones somáticos fusionados. La retirada de los embriones
anormales y la distribución de la densidad de cultivo a la mitad
daban como resultado embriogénesis somática normal en medio de
cultivo. Estos embriones somáticos alcanzaban la madurez en
aproximadamente catorce a dieciocho semanas.
Se observó que las células embriogénicas o las
masas de células embriogénicas obtenidas de cultivos líquidos se
diferenciaban en embriones somáticos tan pronto como tres semanas
después de la iniciación del cultivo. Después de cuatro semanas de
cultivo, el examen microscópico también revelaba la formación de
embriones somáticos globulares y acorazonados sobre el tejido
calloso (Figura 1D). Los embriones somáticos eran translúcidos y se
asemejaban a los de un estado hiperhídrico (Figura 1E); sin embargo,
los embriones continuaba diferenciándose y se encontró que se
desarrollaban en embriones somáticos maduros en otras tres a cuatro
semanas. Se observó que estos embriones somáticos desarrollaban un
suspensor (Figura 1E). Además, se observó que las células
embriogénicas se desarrollaban en una masa de embriones somáticos
asíncronos.
Una de las observaciones interesantes de estos
experimentos era que la mayoría de los embriones somáticos surgían
como unidades individuales, y no como agregados pequeños, aunque
había unos pocos agregados de embriones somáticos. En tales casos,
el número de embriones variaba de seis a diez en cada agregado, y
estos embriones se separaban fácilmente del tejido calloso. Los
embriones encontrados en la fase cotiledónea se aislaron con una
base semanal y se subcultivaron para la maduración. Cada agregado de
masa embriogénica continuaba produciendo embriones somáticos
durante al menos doce semanas. Las masas de células embriogénicas
tendían a volverse pardas en medio sólido, que contenía
Gel-Gro (ICN Biochemicals), pero la decoloración no
afectaba adversamente a la viabilidad del cultivo. Aproximadamente
cuatro o cinco semanas más tarde, agregados de embriones somáticos
empezaban a aparecer sobre la superficie de las células
embriogénicas o las masas de células embriogénicas pardas.
Tres medios de maduración - medio de maduración
para mango (Litz y otros, "Somatic embryogenesis in mango",
1995, anteriormente); medio de maduración para mango solidificado
con agar (7 g/l) y medio basal de MS con sacarosa al 3% - se
estudiaron para evaluar la capacidad para promover la germinación de
embriones somáticos y la regeneración de plantas. Los resultados
indicaban que un medio basal de MS que contenía 3% de sacarosa era
el más eficaz para promover la maduración y la germinación de
embriones y la regeneración de plantas, para ambos embriones
derivados de medio sólido y para los embriones precozmente
germinados que se obtenían de cultivos en medio líquido (Figura
1D). Aunque existía buena germinación sobre medio de maduración para
mango con agar, la calidad de los regenerantes no era tan buena
como con sales de MS con sacarosa al 3%. Embriones de los dos
sistemas estudiados (es decir, medio líquido y sólido) mostraban
variación entre ellos mismos en la germinación y la regeneración.
Aunque los embriones se han germinado precozmente en cultivos
líquidos, no se observaba germinación continuada en estos cultivos.
Durante la transferencia a medio sólido, sin embargo, se encontró
que los embriones continuaban el proceso de germinación y daban como
resultado la formación de plantas de vid con un sistema radicular
denso. El mantenimiento continuado en medio líquido después de la
emergencia radicular conducía a hiperhidricidad y finalmente la
regeneración de plantas se reducía a partir de estos embriones. De
acuerdo con esto, se prefiere que los embriones somáticos se retiren
del medio tan pronto como germinen precozmente y se transfieran a
medio
sólido.
sólido.
Se ha establecido un método para el
almacenamiento a largo plazo de embriones somáticos. Embriones
somáticos maduros procedentes de cultivos en suspensión de
"Chardonnay" se secaron sobre papel de filtro estéril en una
cabina de flujo laminar y a continuación se almacenaron en placas de
Petri estériles a 6ºC. Se extrajeron periódicamente muestras de
estas placas y se germinaron sobre medio MS con sacarosa al 3%. Se
registraron la germinación (es decir, la emergencia de raíces del
embrión somático) y la regeneración de plantas. La Tabla 3 muestra
los datos del clon CH 02 después de 22 meses en almacenamiento y la
Tabla 4 muestra lo datos del clon CH 01 después de 5 meses en
almacenamiento.
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Se produjeron embriones somáticos de vid
"Chardonnay" y "Thompson Seedless" a partir de cultivos
líquidos según se describe en la presente memoria. Los embriones
somáticos maduros derivados de suspensión se secaron brevemente en
la cabina de flujo laminar y se germinaron directamente en
recipientes Magenta que contenían uno de los siguientes medios para
macetas: i) arena; ii) mezcla para macetas comercial ProMix^{TM}
(CPM); o CPM con arena superpuesta. Cada recipiente que contenía 20
ml de agua destilada y el medio para macetas se esterilizó tratando
en autoclave durante 30 min y se enfrió durante la noche antes de
inocular los embriones somáticos. Tres embriones somáticos se
pusieron en cada recipiente. La siembra se llevó a cabo bajo
condiciones asépticas y los recipientes se cerraron y se incubaron
a 26ºC con un fotoperíodo de 16 h a 75 \mumol s^{-1} m^{-2}
de intensidad luminosa. Los resultados revelaban que el CMP con
arena superpuesta era ideal para el desarrollo de las plantas.
Aunque la arena promovía más germinación, las plantas resultantes
eran cloróticas y su grado de supervivencia era escaso. Existía más
contaminación de embriones somáticos sobre CPM puro. El presente
estudio ofrece el alcance para la multiplicación a gran escala de
vides usando cultivos en suspensión y fija las bases para hacer
crecer embriones somáticos de vid en
biorreactores.
biorreactores.
Los resultados experimentales descritos
anteriormente se lograron usando las siguientes técnicas.
Los cultivos embriogénicos se iniciaron a partir
de anteras y ovarios de la variedad de cultivo "Chardonnay"
(Clones CH 01 y CH 02) y a partir de las hojas de la variedad de
cultivo "Thompson Seedless" de acuerdo con métodos estándar,
por ejemplo los descritos en la presente memoria. Los embriones
somáticos de estos cultivos, iniciados y mantenidos en medio de MS
modificado, se usaron para iniciar cultivos en suspensión de células
líquidos. Típicamente, estos cultivos son altamente asíncronos en
el desarrollo y la diferenciación embrionarios y, por lo tanto,
cada inóculo consistía en embriones somáticos en diversas fases de
desarrollo.
La composición del medio líquido se adaptó a
partir del medio descrito por Litz y otros, anteriormente, como
sigue. La inducción del callo se alcanzó mediante la adición de 1
mg/l de 2,4-D al medio. El pH del medio se ajustó
hasta aproximadamente 5,8 y se aportó como partes alícuotas de 40 ml
en matraces Erlenmeyer de 125 ml. Los matraces se cubrieron
herméticamente con papel de aluminio de alto rendimiento antes del
tratamiento en autoclave. Después del enfriamiento, aproximadamente
1 gramo de los embriones somáticos se transfirió al medio líquido
usando una espátula esterilizada bajo condiciones asépticas. La boca
del matraz se selló con Parafilm y los cultivos se incubaron a
continuación en semioscuridad (luz difusa) en un agitador giratorio
a aproximadamente 120 rpm. Los cultivos se subcultivaron al menos
una vez cada dos semanas.
Matraces que contenían los cultivos en
suspensión se retiraron del agitador orbital y los cultivos se
dejaron sedimentar durante aproximadamente 15 minutos. El
sobrenadante se decantó suavemente en un matraz estéril, dejando
las células embriogénicas en un volumen mínimo (aproximadamente 5
ml). Aproximadamente 35 ml de medio líquido reciente se añadieron a
las células embriogénicas y se arremolinaron suavemente. Todo el
contenido del matraz se transfirió a continuación a un matraz
estéril de 125 ml. Este segundo matraz, que contenía las células
embriogénicas, se selló a continuación con Parafilm y se devolvió al
agitador orbital.
El callo amorfo generado a partir de los
embriones somáticos se recogió como sigue. La suspensión
embriogénica, que incluía embriones somáticos diferenciados y
callo, se dejó sedimentar en los matraces. Aproximadamente la mitad
del medio sobrenadante se decantó y el resto se arremolinó y se
filtró rápidamente a través de una malla de nailon preesterilizada
(960 micras), y se puso sobre un vaso de precipitados de 150 ml.
Mientras que los embriones somáticos diferenciados se retenían en
la malla, el callo fino que pasaba a su través junto con el medio
líquido se recogía en el vaso de precipitados. El callo se recogía
en el vaso de precipitados y se filtraba a continuación a través de
un Kimwipe estéril de doble pliegue colocado sobre un embudo
estéril. El callo amorfo que se adhería al Kimwipe se retiró
subsiguientemente del Kimwipe usando una espátula esterilizada, y
se resuspendió en medio de cultivo líquido reciente. Aproximadamente
100 mg del callo se suspendieron en cada matraz. Estos cultivos
líquidos se subcultivaron como se describe en la presente memoria
aproximadamente una vez cada catorce días en medio líquido
B-5 modificado que contenía
2,4-D.
Células o masas de células embriogénicas que se
iniciaban en cultivos en suspensión líquidos se tamizaron usando un
tamiz de 960 micras y la fracción más fina se recogió en medio de
embriogénesis líquido, bajo condiciones asépticas. La composición
del medio era la misma que la del medio de iniciación; sin embargo,
se omitió 2,4-D del medio y se añadieron
aproximadamente 0,05 mg/l de BA. Después de ajustar el pH hasta 5,8,
el medio se aportó como partes alícuotas de 40 ml en matraces
Erlenmeyer de 125 ml, se cubrió con papel de aluminio y se trató en
autoclave. Aproximadamente 100 mg de callo se cultivaron en cada
matraz. Los cultivos se mantuvieron en semioscuridad a 25ºC en un
agitador giratorio a 120 rpm y se subcultivaron una vez cada catorce
días. El tamizado de los cultivos se realizaba según fuera
necesario, para sincronizar embriones somáticos diferenciados.
También pueden emplearse, si es necesario, tamices de malla más fina
(por ejemplo, tamices de 520 micras).
Embriones somáticos enverdecientes que tienen
radículas alargadas se tamizaron de los cultivos en suspensión. Los
embriones somáticos se cogieron individualmente y se cultivaron.
Tres medios diferentes - medio de maduración para mango (Litz y
otros, "Somatic embryogenesis in mango", 1995, anteriormente),
medio de maduración para mango solidificado con agar (7 g/l) en
lugar de Gel-Gro y medio basal de MS con sacarosa al
3% - se probaron con respecto a la germinación y la regeneración de
plantas. Se omitieron reguladores del crecimiento de plantas de
estas preparaciones de medios. Se cultivaron 35 embriones en cada
placa de Petri estándar, y se probaron ocho placas de cada medio.
Después de sellar con Parafilm, los cultivos se incubaron en una
cámara de crecimiento bajo un fotoperíodo de 16 horas. Las plantas
con cuatro hojas verdaderas se transfirieron subsiguientemente a
suelos.
Células embriogénicas y masas de células
embriogénicas producidas en cultivos en suspensión se recogieron
como se describe anteriormente y a continuación se transfirieron a
medio de embriogénesis sólido. El medio consistía en los mismos
compuestos que el medio de embriogénesis líquido y se solidificaba
con 2,0 g/l de Gel-Gro o 7 g/l de agar.
Aproximadamente 50 mg de callo se pusieron como un agregado sobre
una placa de Petri que contenía medio y cada placa tenía dos de
tales agregados. Después de inocular, las placas de Petri se
sellaron con Parafilm y se incubaron en oscuridad completa. El
subcultivo se realizó después de que se observara la diferenciación
de embriones somáticos. Los embriones somáticos producidos a partir
de las células embriogénicas o las masas de células embriogénicas
se contaron con una base semanal, partiendo de seis semanas después
del cultivo. Los embriones de la fase cotiledónea se contaron y se
subcultivaron para la maduración.
Embriones somáticos maduros que tenían
aproximadamente 5 mm de longitud se aislaron de la masa asíncrona y
se cultivaron en medio de maduración. Veinticinco embriones
somáticos maduros se cultivaron en cada placa de Petri estándar
sobre medio de MS con sacarosa al 3%. Los cultivos se mantuvieron en
la oscuridad hasta que germinaban. Después de la elongación de la
radícula, se transfirieron a luz bajo un fotoperíodo de 16 horas.
Las plántulas con al menos cuatro hojas verdaderas se transfirieron
subsiguientemente a suelo.
Los cultivos embriogénicos perennes de la
invención pueden usarse para la selección o el rastreo con respecto
a células de vid que tienen resistencia a substancias tóxicas, tales
como substancias producidas por patógenos de planta. Tales
patógenos incluyen, sin limitación, bacterias, micoplasmas, hongos,
insectos, nematodos, virus y viroides. Las enfermedades de plantas
provocadas por estos patógenos se describen en los Capítulos
11-16 de Agrios, Plant Pathology, 3ª ed., Academic
Press, Inc., Nueva York, 1988. Ejemplos de patógenos bacterianos
incluyen, sin limitación, Agrobacterium vitis,
Agrobacterium tumefaciens, Xylella fastidosa y
Xanthomonas ampelina. Ejemplos de patógenos fúngicos
incluyen, sin limitación, Uncinula necator, Plasmopara
viticola, Botrytis cinerea, Guignardia bidwellii,
Phomophsis viticola, Elsinoë ampelina, Eutypa
lata, Armillaria mellea y Verticllium dahliae.
Ejemplos de nematodos patógenos incluyen, sin limitación, nematodos
de los nudos de las raíces (por ejemplo, especie
Meloidogyne), nematodos quísticos (por ejemplo, especie
Heterodera), nematodos que atacan las raíces (por ejemplo,
Rotylenchulus reniformis) y nematodos de las partes aéreas
(por ejemplo, Anguina funesta). Ejemplos de plagas patógenas
(por ejemplo, insectos) incluyen, sin limitación,
Phylloxera, Coleoptera, Lepidoptera,
Homoptera, Dermptera y Diptera. Ejemplos de
patógenos virales incluyen, sin limitación, virus de la hoja en
abanico de la vid y virus enrollador de la hoja de la vid.
Exponiendo los cultivos embriogénicos a un
filtrado de cultivo en bruto o una toxina purificada obtenida de un
patógeno de planta, células de vid resistentes pueden seleccionarse
y propagarse. Se espera que las células de vid que sobreviven a la
presión de selección resistan no solo la toxina de selección, sino
también el microbio original que produce la toxina. Por otra parte,
debido a la dinámica del proceso de selección, la resistencia
inducida también puede funcionar contra una serie de organismos que
provocan enfermedad aparte del microbio original usado para la
selección. Debido a que la selección se lleva a cabo a nivel
celular, es probable que las plantas de vid regeneradas a partir de
las células muestren la característica seleccionada. En particular,
este sistema permite que un experto en la técnica seleccione o
rastree la característica deseada de entre miles de células en un
matraz de cultivo o una placa de Petri individual.
Diversos microbios atacan a la vid y provocan un
número de enfermedades. Estas enfermedades incluyen enfermedades
fúngicas de las hojas y los frutos (tales como podredumbre negra y
antracnosis), enfermedades fúngicas del sistema vascular y las
raíces (tales como Esca, Black Measles, Black Dead Arm y Eutypa
dieback), enfermedades bacterianas (tales como tumor bacteriano y
enfermedad de Pierce), enfermedades provocadas por virus y agentes
similares a virus (tales como punteado del tallo de rupestris,
enrollamiento foliar de la vid y degradación de la hoja en abanico
de la vid), así como enfermedades provocadas por nematodos y
micoplasmas.
Una enfermedad que afecta a la vid es la
antracnosis, también conocida como enfermedad de la mancha de ojo
de ave, que está provocada por el hongo Elsinoë ampelina.
Bajo condiciones favorables, este hongo ataca a casi todas las
partes aéreas de la vid, incluyendo los frutos, provocando un daño
intensivo al cultivo. La antracnosis provoca la aparición de
lesiones circulares con márgenes pardos o negros y bordes redondos
o angulares en la planta de la vid. El centro de las lesiones se
vuelve blanco grisáceo y finalmente se seca y cae, dejando una
apariencia de "agujero de bala". La enfermedad afecta
especialmente a hojas jóvenes, evitando el desarrollo normal. Los
vástagos nuevos también son afectados y adquieren una apariencia
quemada obvia. Los racimos de frutas también son susceptibles a la
infección fúngica a lo largo de su desarrollo; las lesiones en las
bayas se extienden a la pulpa, induciendo a menudo el agrietamiento.
(Pearson y Goheen, Compendium of Grape Disease, APS Press, St.
Paul, MN, 1988).
Un filtrado de cultivo de Elsinoë
ampelina que tiene actividad tóxica se preparó como sigue. Se
preparó medio de caldo de Czapek-Dox de intensidad
completa (Fisher Scientific, Springfield, NJ) disolviendo la
cantidad requerida de la mezcla de caldo en agua desionizada (DI).
El medio se aportó como partes alícuotas de 50 ml en matraces
Erlenmeyer de 125 ml. Después de tratar en autoclave y enfriar, 100
\mul de una suspensión de esporas de Elsinoë ampelina se
añadieron a cada matraz (Día 1); el matraz se incubó a continuación
en un agitador giratorio a 120 rpm durante una semana en la
oscuridad. Después de una semana, el contenido de cada matraz se
transfirió a 100 ml de Czapek-Dox de intensidad
completa en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y la incubación se
continuó durante dos semanas más. Al final de este período (es
decir, tres semanas desde el Día 1) el filtrado del cultivo fúngico
se recogió filtrando el contenido de cada matraz a través de una
gasa estéril de varias capas. El filtrado del cultivo en bruto se
almacenó a -4ºC hasta el uso adicional según se describe
previamente (Subramanian, J., "Selection and characterization of
resistance in mango (Mangifera indica L.) embryogenic cultures to
the phytotoxin produced by Colletotrichum gloeosporioides, Penz",
Ph.D. Dissertation, University of Florida, Gainesville, 1995).
Antes de la adición al medio de cultivo para la
selección in vitro, el filtrado de cultivo congelado se
descongeló (sin calentar) a temperatura ambiente, el pH se ajustó
hasta 5 y se filtró estérilmente a través de un filtro de 0,2
micras (Nalgene, Rochester, NY). Se encontró que este filtrado de
patógeno esterilizado por filtración retenía su actividad
tóxica.
El filtrado de cultivo de Elsinoë
ampelina se añadió a continuación a cultivos en suspensión
líquidos de células embriogénicas y masas de células embriogénicas
de V. vinifera cv. "Chardonnay" en medio
B-5 modificado para seleccionar células que tienen
resistencia al filtrado de cultivo fúngico tóxico. Las células
embriogénicas y las masas de células embriogénicas de vid se
hicieron crecer como se describe anteriormente; sin embargo, en
esta selección in vitro, el medio en el que las células se
desarrollaban se complementó con volúmenes conocidos de filtrado de
cultivo de Elsinoë ampelina. Se determinaron diluciones
apropiadas de filtrado de patógeno examinando la toxicidad del
filtrado usando análisis de dilución en serie. Estos experimentos
demostraban que un 40% (v/v) de filtrado de cultivo era útil para la
selección in vitro.
Cultivos de células embriogénicas y masas de
células embriogénicas de "Chardonnay" se mantuvieron en medio
líquido que contenía 40% (v/v) de filtrado de cultivo fúngico a
aproximadamente 26ºC en un agitador giratorio (125 rpm) en luz
difusa. El subcultivo se realizó una vez en diez días; durante cada
subcultivo, el filtrado de cultivo esterilizado por filtración se
usó para diluir el medio. La selección con filtrado de cultivo se
continuó durante cuatro o cinco ciclos (cada ciclo = diez días) de
subcultivo. Aunque la mayoría de las células embriogénicas moría,
muy pocas células, a menudo menos de 1%, sobrevivía a la presión de
selección. Se establecieron líneas de cultivo resistentes retirando
la presión de selección después de cuatro o cinco ciclos y dejando
crecer las células supervivientes en medio B-5
modificado carente de filtrado de cultivo. Estas líneas resistentes
se hicieron proliferar y se produjeron embriones somáticos usando
los métodos descritos en la presente memoria.
Cultivos de células embriogénicas obtenidos del
proceso de selección se probaron subsiguientemente con respecto a
la resistencia a Elsinoë ampelina usando un número de
bioensayos in vitro. En primer lugar, se analizó si las
líneas de vid resistentes estaban produciendo una actividad que
pudiera inhibir el crecimiento del hongo. A este fin, el medio de
cultivo (es decir, medio de cultivo acondicionado) procedente de una
línea de cultivo resistente se probó con respecto a una actividad
inhibidora contra el hongo. Se recogieron medios acondicionados de
diferentes cultivos celulares que tenían resistencia a
Elsinoë y se usaron en varias concentraciones para preparar
medios de crecimiento fúngicos. Una colonia micelial que crecía
activamente se puso en el centro de una placa de Petri que contenía
un medio de crecimiento fúngico preparado con o sin (control) medio
acondicionado a partir de una línea de cultivo de vid resistente y
se incubó bajo condiciones estándar. Los resultados de estos
experimentos mostraban que el crecimiento del hongo era inhibido por
un medio de crecimiento fúngico que contenía 25% o más del medio
acondicionado.
Para demostrar adicionalmente la presencia de
una actividad antifúngica en cultivos de vid resistentes, líneas
resistentes, así como líneas de control, se pusieron en medio de
crecimiento de planta sólido en las posiciones de las seis y las
doce en punto en placas de Petri y se incubaron en la oscuridad
durante cuatro semanas. Después de este período, un bloque de
micelio procedente de una colonia de Elsinoë que crecía
activamente se puso en el centro de las placas de Petri y se incubó
bajo condiciones estándar. Se observó que el hongo crecía
rápidamente e infectaba los cultivos de control. A la inversa, el
crecimiento fúngico era inhibido en las placas que contenían
cultivos de células de vid que tenían resistencia al filtrado de
cultivo de Elsinoë. Las hifas no crecían libremente a través
del medio en placas que contenían estos cultivos resistentes, en
comparación con hifas fúngicas que crecían a través del medio en
placas que contenían cultivos de control (es decir, no
resistentes). Una capa gruesa de micelio, como la observada en las
placas que contenían cultivos de control, no se formaba nunca en
las placas que contenían los cultivos resistentes a Elsinoë
ampelina. Esta capacidad de los cultivos resistentes para
inhibir el crecimiento de Elsinoë ampelina se retenía nueve
meses después de la selección, demostrando que los cambios genéticos
en los cultivos resistentes eran estables.
Además, los cultivos de vid que eran resistentes
a Elsinoë ampelina se probaron con respecto a la resistencia
a un segundo patógeno fúngico, Fusarium oxysporum. Líneas
resistentes, así como líneas de control, se pusieron en medio de
crecimiento de plantas sólido en las posiciones de las seis y las
doce en punto en placas de Petri y se incubaron en la oscuridad
durante cuatro semanas. Después de este período, un bloque de
micelio procedente de una colonia de Fusarium oxysporum que
crecía activamente se puso en el centro de las placas de Petri y se
incubó a temperatura ambiente bajo un fotoperíodo de 16 horas. Se
observó que el hongo crecía rápidamente e infectaba los cultivos de
control. A la inversa, el crecimiento de Fusarium oxysporum
era inhibido en las placas que contenían cultivos de células de vid
que tenían resistencia al filtrado de cultivo de Elsinoë.
Las hifas no crecían libremente a través del medio en placas que
contenían estos cultivos resistentes, en comparación con hifas
fúngicas que crecían a través del medio en placas que contenían
cultivos de control (es decir, no resistentes). Una capa gruesa de
micelios de Fusarium, como la observada en las placas que
contenían cultivos de control, no se formaba nunca en las placas que
contenían los cultivos resistentes a Elsinoë ampelina. Este
experimento demostraba que los cultivos de vid resistentes no solo
eran resistentes a Elsinoë ampelina sino que también eran
resistentes a Fusarium oxysporum.
Se realizó un análisis adicional para determinar
si los cultivos de vid resistentes a los hongos podían dar lugar a
embriones somáticos que también fueran resistentes a Elsinoë
ampelina. Embriones somáticos derivados de cultivos resistentes
y cultivos de control (es decir, no resistentes) se hicieron crecer
bien en medio que contenía 40% (v/v) de filtrado de cultivo fúngico
o bien en medio de control que no contenía filtrado de cultivo
fúngico. Mientras que los embriones somáticos derivados de los
cultivos resistentes se formaban y germinaba normalmente tanto en
el medio que contenía filtrado de cultivo fúngico como en el medio
de control, los embriones somáticos derivados de cultivos de
control se volvían necróticos y finalmente morían en el medio que
contenía filtrado de cultivo fúngico, pero no morían en el medio de
control. La necrosis de los controles en el medio que contenía
filtrado de cultivo fúngico era suficientemente rápida para volver a
los embriones somáticos oscuros en menos de setenta y dos horas
desde el inicio del cultivo. Los resultados de estos experimentos
demostraban que los embriones somáticos obtenidos a partir de
cultivos celulares resistentes también eran resistentes al filtrado
fúngico. Por otra parte, se observó que estos embriones somáticos
resistentes soportaban una concentración de filtrado de cultivo de
Elsinoë ampelina que era igual a la soportada por sus células
embriogénicas y masas de células embriogénicas resistentes
progenitoras.
Cultivos embriogénicos se seleccionaron in
vitro contra filtrado de cultivo fúngico producido por
Elsinoë ampelina. Se regeneraron plantas a partir de los
cultivos seleccionados y se aclimataron en el invernadero. Plantas
de las líneas seleccionadas y controles no seleccionados fueron
pulverizadas con una solución de esporas (1 x 10^{6} esporas/ml)
hasta dejar correr. Las plantas se cubrieron con bolsas
individualmente para mantener la humedad (una condición que es
óptima para que el patógeno provoque la enfermedad de la
antracnosis) durante tres días. Las bolsas se retiraron a
continuación y las plantas se puntuaron con respecto a los síntomas
de antracnosis. Todos los controles no seleccionados exhibían un
grado muy alto de susceptibilidad y en la mayoría de los casos
existía desfoliación debida a la enfermedad en menos de tres días.
Entre las 40 plantas diferentes procedentes de las dos líneas
seleccionadas, solo una planta mostraba síntomas de antracnosis
suave. Estos datos muestran que la resistencia adquirida por las
células embriogénicas durante la selección in vitro pueden
traducirse en resistencia de toda la planta contra el patógeno.
Plantas regeneradas pueden probarse con respecto
a la resistencia a antracnosis de acuerdo con métodos estándar. Por
ejemplo, suspensiones de esporas de Elsinoë ampelina se
preparan suspendiendo masas de esporas procedentes de colonias
recientes del hongo en agua desionizada (DI) estéril y la densidad
de esporas se ajusta hasta 100.000 esporas/ml usando un
hemocitómetro. Las hojas jóvenes de vástagos o plantas que crecen en
el invernadero se recogen y se lavan suavemente con agua DI. Sobre
el limbo de la hoja, 100 \mul de la suspensión de esporas se
ponen en una mancha y, para facilitar la inoculación del hongo, se
realiza una punzada aguda en el centro de la mancha. Al menos dos
de tales manchas se hacen en cada hoja. Las hojas se incuban en
condiciones húmedas (es decir, condiciones ideales para el
desarrollo de los síntomas) durante al menos 72 horas y a
continuación se observan con respecto al desarrollo de lesiones
según se describe previamente (Subramanian, J., Ph.D. Dissertation.
University of Florida, Gainesville, 1995, anteriormente). Pruebas
similares con agua DI sola sirven como un control. Además, hojas de
variedades de cultivo que se sabe que son susceptibles de o
resistentes a antracnosis se inoculan y las lesiones de estas hojas
sirven como patrón para determinar la susceptibilidad/resistencia
de las plantas regeneradas derivadas de células embriogénicas
seleccionadas in vitro. A partir de un análisis estadístico
de estos datos, se determinan niveles de resistencia a Elsinoë
ampelina y antracnosis. Plantas de vid que tienen un nivel
incrementado de resistencia a Elsinoë ampelina y antracnosis
o ambas con relación a plantas de control se toman como útiles en
la invención.
El método descrito en la presente memoria puede
usarse para producir plantas transformadas. Las células pueden
transformarse en cualquier etapa en el procedimiento para elaborar
una planta derivada de embrión somático. Así, tejido o células
adecuados para transformación incluyen tejido explantado, células
embriogénicas, masas de células embriogénicas y embriones somáticos
(incluyendo embriones somáticos maduros).
Cultivos celulares producidos de acuerdo con los
métodos de la invención pueden transformarse con DNA que comprende
un transgén deseado. Tales células, por ejemplo, pueden
transformarse con genes que confieren resistencia a patógenos,
enfermedades o plagas, o cualquiera de sus combinaciones. Por
ejemplo, un número de genes de Bacillus thurigiensis que
codifican proteínas que son tóxicas para un número de plagas son
bien conocidos y útiles en los métodos de la invención. Varios
métodos estándar están disponibles para la introducción de un
transgén en un huésped vegetal, generando de ese modo una planta
transgénica.
Durante la construcción del vector de expresión
vegetal, están disponibles varios métodos estándar para la
introducción del vector en un huésped vegetal, generando de ese modo
una planta transgénica. Estos métodos incluyen (1) transformación
mediada por Agrobacterium (A. tumefaciens o A.
rhizogenes) (véase, por ejemplo, Lichtenstein y Fuller En:
Genetic Engineering, vol 6, PWJ Rigby, ed, Londres, Academic Press,
1987; y Lichtenstein, C.P., y Draper, J,. En: DNA Cloning, Vol II,
D.M. Glover, ed, Oxford. IRI Press, 1985)); (2) el sistema de
aporte de partículas (véase, por ejemplo,
Gordon-Kamm y otros, Plant Cell 2:603 (1990); o
BioRad Technical Bulletin 1687, anteriormente); (3) protocolos de
microinyección (véase, por ejemplo, Green y otros, anteriormente);
(4) procedimientos con polietilenglicol (PEG) (véase, por ejemplo,
Draper y otros, Plant Cell Physiol. 23:451, 1982; o, por ejemplo,
Zhang y Wu, Theor. Appl. Genet. 76:835, 1988); (5) captación de DNA
mediada por liposomas (véase, por ejemplo, Freeman y otros, Plant
Cell Physiol. 25:1353, 1984); (6) protocolos de electroporación
(véase, por ejemplo, Gelvin y otros, anteriormente; Dekeyser y
otros, anteriormente; Fromm y otros, Nature 319:791, 1986; Sheen
Plant Cell 2:1027, 1990; o Jang y Sheen Plant Cell 6:1665, 1994); y
(7) el método de turbulencia (véase, por ejemplo, Kindle,
anteriormente). El método de transformación no es crítico para la
invención. Puede emplearse cualquier método que proporcione
transformación eficaz. Según estén disponibles métodos más nuevos
para transformar cultivos u otras células huésped, pueden aplicarse
directamente.
Lo siguiente es un ejemplo que esboza una
técnica particular, una transformación de plantas mediada por
Agrobacterium. Mediante esta técnica, el procedimiento
general para manipular genes que han de transferirse al genoma de
células vegetales se lleva a cabo en dos fases. En primer lugar, se
llevan a cabo etapas de clonación y modificación de DNA en E.
coli, y el plásmido que contiene el constructo génico de interés
se transfiere mediante conjugación o electroporación a
Agrobacterium. En segundo lugar, la cepa de
Agrobacterium resultante se usa para transformar células
vegetales. Así, para el vector de expresión de plantas generalizado,
el plásmido contiene un origen de replicación que le permite
replicarse en Agrobacterium y un origen de replicación de
alto número de copias funcional en E. coli. Esto permite la
producción y la prueba fáciles de transgenes en E. coli
antes de transferencia a Agrobacterium para la introducción
subsiguiente en plantas. Genes de resistencia pueden estar
soportados en el vector, uno para selección en bacterias, por
ejemplo, estreptomicina, y otro que funcionará en plantas, por
ejemplo, un gen que codifica resistencia a kanamicina o resistencia
a herbicidas. También están presentes en el vector sitios de
endonucleasas de restricción para la adición de uno o más
transgenes y secuencias límite de T-DNA
direccionales que, cuando son reconocidas por las funciones de
transferencia de Agrobacterium, delimitan la región de DNA
que se transferirá a la planta.
En otro ejemplo, células de planta pueden
transformarse disparando en la célula microproyectiles de volframio
sobre los que está precipitado DNA clonado. En el Biolistic
Apparatus (Bio-Rad) usado para el disparo, una
carga de pólvora (Power Piston Tool Charge de calibre 22) o una
ráfaga conducida por aire conduce un macroproyectil de plástico a
través del cañón de una pistola. Una parte alícuota de una
suspensión de partículas de volframio sobre las que se ha
precipitado DNA se pone enfrente del macroproyectil de plástico. El
último se dispara a una placa acrílica de detención que tiene un
agujero a través de ella que es demasiado pequeña para que el
macroproyectil pase a su través. Como resultado, el macroproyectil
de plástico golpea contra la placa de detección y las
micropartículas de volframio continúan hacia su objetivo a través
del agujero de la placa. Para la presente invención, el objetivo
puede ser cualquier célula, tejido, semilla o embrión de planta. El
DNA introducido en la célula sobre los microproyectiles se integra
bien en el núcleo o bien en el cloroplasto.
En general, la transferencia y la expresión de
transgenes en células de planta son actualmente prácticas habituales
para los expertos en la técnica y se han convertido en herramientas
principales para llevar a cabo estudios de expresión génica en
plantas y para producir variedades de plantas mejoradas de interés
agrícola comercial.
Claims (19)
1. Un método para producir un cultivo
embriogénico perenne de vid, comprendiendo dicho método las etapas
de:
- (a)
- cultivar un tejido de explante de vid sobre medio de iniciación de cultivo, dicho medio incluye al menos 0,01 mg/l de una citoquinina, al menos 0,1 mg/l de un carbohidrato y al menos 0,1 mg de un compuesto nitrogenado,
- (b)
- identificar visualmente una célula embriogénica o una masa de células embriogénicas a partir de un primer cultivo de explante de vid, en donde dichas célula embriogénica o células embriogénicas de dicha masa de células embriogénicas identificadas visualmente se identifican por tener un color de blanco a amarillo claro, una apariencia granular friable y ser compactas y ricas en citoplasma,
- (c)
- transferir dicha célula embriogénica o masa de células embriogénicas identificada visualmente de la etapa (b) a un segundo cultivo;
- (d)
- dejar que dicha célula embriogénica o masa de células embriogénicas transferida de la etapa (c) se divida en células embriogénicas o masas de células embriogénicas adicionales;
- (e)
- identificar visualmente una célula embriogénica o masa de células embriogénicas de la etapa (d), en donde dichas célula embriogénica o células de dicha masa de células embriogénicas identificadas visualmente de la etapa (d) se identifican por tener un color de blanco a amarillo claro y una apariencia granular friable, y
- (f)
- transferir dicha célula embriogénica o masa de células embriogénicas seleccionada identificada de la etapa (e) a un tercer cultivo, produciendo de ese modo un cultivo embriogénico perenne de vid,
en donde dicho explante se obtiene
de anteras, tejido vegetativo, zarcillos, hojas, raíces, tejido
nucelar, tallos, protoplastos, periciclo, tejido meristemático
apical y embriones
somáticos.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que dicho explante es un explante de una variedad seleccionada
del grupo que consiste en Alden, Almería,
Anab-F-Shahi, Autumn Black, Beauty
Seedless, Black Corinth, Black Damascus, Black Malvoisie, Black
Prince, Blackrose, Bronx Seedless, Burgrave, Calmeria, Campbell
Early, Canner, Cardinal, Catawba, Christmas, Concord, Dattier,
Delight, Diamond, Dizmar, Duchess, Early Muscat, Emerald Seedless,
Emperor, Exotic, Ferdinand de Lesseps, Fiesta, Flame seedless, Flame
Tokay, Gasconade, Gold, Himrod, Hunisa, Hussiene, Isabella, Italia,
July Muscat, Khandahar, Katta, Kourgane, Kishmishi, Loose Perlette,
Málaga, Monukka, Muscat of Alexandria, Muscat Flame, Muscat
Hamburg, New York Muscat, Niabell, Niagara, Olivette blanche,
Ontario, Pierce, Queen, Red Málaga, Ribier, Rish Baba, Romulus,
Ruby Seedless, Schuyler, Seneca, Suavis (IP 365), Thompson
seedless, Thomuscat, Aleatico, Alicante Bouschet, Aligote,
Alvarelhao, Aramon, Baco blanc (22A), Burger, Cabernet franc,
Cabernet Sauvignon, Calzin, Carignane, Charbono, Chardonnay CH 01,
Chardonnay CH 02, Chardonnay CH Dijon, Chasselas dore, Chenin
blanc, Clairette blanche, Early Burgundy, Emerald Riesling, Feher
Szagos, Femao Pires, Flora, French Colombard, Fresia, Furmint,
Gamay, Gewurztraminer, Grand noir, Gray Riesling, Green Hungarian,
Green Veltliner, Grenache, Grillo, Helena, Inzolia, Lagrein,
Lambrusco de Salamino, Malbec, Malvasia bianca, Mataro, Melon,
Merlot, Meunier, Mission, Montua de Pilas, Muscadelle du Bordelais,
Muscat blanc, Muscat Ottonel, Muscat Saint-Vallier,
Nebbiolo, Nebbiolo fino, Nebbiolo Lampia, Orange Muscat, Palomino.
Pedro Ximénez, Petit Bouschet, Petite Sirah, Peverella, Pinot noir,
Pinot Saint-George, Primitivo di Gioa, Red
Veltliner, Refosco, Rkatsiteli, Royalty, Rubired, Ruby Cabernet,
Saint-Emilion, Saint Macaire, Salvador, Sangiovese,
Sauvignon blanc, Sauvignon gris, Sauvignon vert, Scarlet, Seibel
5279, Seibel 9110, Seibel 13053, Semillon, Servant, Shiraz, Souzao,
Sultana Crimson, Sylvaner, Tannat, Teroldico, Tinta Madeira, Tinto
cao, Touriga, Traminer, Trebbiano Toscano, Trousseau, Valdepeñas,
Viognier, Walschriesling, White Riesling, Zinfandel, Couderc 1202,
Couderc 1613, Couderc 1616, Couderc 3309 (Vitis riparia X
rupestris), Dog Ridge, Foex 33 EM, Freedom, Ganzin 1 (A x R
#1), Harmony, Kober 5BB, LN33, Millardet & de Grasset 41B
(Vitis vinifera X berlandieri), Millardet & de
Grasset 420A, Millardet & de Grasset 101-14
(Vitis riparia X rupestris), Oppenheim 4 (SO4),
Paulsen 775, Paulsen 1045, Paulsen 1103, Richter 99, Richter 110,
Riparia Gloire, Ruggeri 225, Saint-George, Salt
Creek, Teleki 5A, Vitis rupestris Constantia, Vitis
california y Vitis girdiana, Vitis rotundifolia,
Vitis rotundifolia Carlos, Teleki 5C (Vitis
berlandieri X riparia), 5BB Teleki (selección Kober,
Vitis berlandieri X riparia), SO_{4} (Vitis
berlandieri X rupestris) y 039-16
(Vitis vinifera X Muscadinia).
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
para producir un embrión somático de vid, que comprende además las
etapas de:
- (g)
- recuperar una célula embriogénica de dicho cultivo embriogénico perenne de vid;
- (h)
- transferir dicha célula embriogénica a un nuevo cultivo; y
- (i)
- desarrollar un embrión somático de vid a partir de dicha célula embriogénica.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3,
en el que dicho cultivo en la etapa (h) es un medio líquido.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4,
en el que dicho cultivo líquido comprende sales principales de
B-5 y sales secundarias de MS.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 3,
en el que dicho cultivo en la etapa (h) comprende un medio
sólido.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 3,
en el que dicho cultivo en la etapa (h) comprende un medio que
contiene un regulador del crecimiento de plantas.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7,
en el que dicho regulador del crecimiento de plantas es una auxina,
NOA, dicamba, picloram, NAA, IAA, 2,4-D, una
citoquinina, benciladenina, zeatina, tidiazurón, ácido abscísico o
ácido giberélico.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 3,
en el que la recuperación de dicha célula embriogénica de dicho
cultivo en la etapa (g) comprende filtración, sedimentación o
selección.
10. El método de acuerdo con la reivindicación
4, en el que dicho cultivo líquido se tamiza para sincronizar la
formación de embriones somáticos de vid diferenciados.
11. El método de acuerdo con la reivindicación
3, en el que dicha célula o masa de células embriogénicas se
transforma con DNA.
12. El método de acuerdo con la reivindicación
3, que comprende además hacer crecer una plántula de vid a partir
del embrión somático de vid.
13. Un método de acuerdo con la reivindicación
1, para seleccionar un embrión somático de vid que tiene resistencia
a un patógeno de planta, que comprende además las etapas de:
- (g)
- cultivar el cultivo de células embriogénicas perenne de la etapa (f) en un primer medio de cultivo líquido para producir un cultivo en suspensión de células, comprendiendo dicho primer medio de cultivo líquido un regulador del crecimiento de las plantas y un filtrado procedente de un cultivo de patógenos de plantas, en donde dicho filtrado o una toxina purificada se obtiene de un virus, un nematodo, un insecto, un hongo, un micoplasma o una bacteria;
- (h)
- recuperar una célula de vid o un aglomerado de células de vid de dicho cultivo en suspensión de células;
- (i)
- cultivar dicha célula de vid o dicho aglomerado de células de vid en un segundo medio de cultivo líquido para producir un embrión somático de vid; y
- (j)
- recuperar dicho embrión somático de vid que tiene resistencia a dicho patógeno de planta.
14. El método de acuerdo con la reivindicación
13, que comprende además transferir dicho embrión somático de vid a
un medio de germinación para hacer crecer una plántula de vid.
15. El método de acuerdo con la reivindicación
13, en el que dicho virus se selecciona del grupo que consiste en
virus de la hoja en abanico de la vid, virus del punteado del tallo
de rupestris y virus enrollador de la hoja de la vid.
16. El método de acuerdo con la reivindicación
13, en el que dicho nematodo se selecciona del grupo que consiste
en nematodo de los nudos de las raíces, un nematodo quístico, un
nematodo que ataca las raíces y un nematodo de las partes
aéreas.
17. El método de acuerdo con la reivindicación
13, en el que dicho insecto se selecciona del grupo que consiste en
Phylloxera, Coleoptera, Lepidoptera,
Homoptera, Dermptera y Diptera.
18. El método de acuerdo con la reivindicación
13, en el que dicho hongo se selecciona del grupo que consiste en
Uncinula necator, Plasmopara viticola, Botrytis
cinerea, Guignardia bidwellii, Phomophsis
viticola, Elsinoë ampelina, Eutypa lata,
Armillaria mellea y Verticllium dahliae.
19. El método de acuerdo con la reivindicación
13, en el que dicha bacteria se selecciona del grupo que consiste
en Agrobacterium vitis, Agrobacterium tumefaciens,
Xylella fastidosa y Xanthomonas ampelina.
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