WO2019098598A1 - 콩과식물 배양근을 이용한 쿠메스트롤 생산 방법 - Google Patents

콩과식물 배양근을 이용한 쿠메스트롤 생산 방법 Download PDF

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WO2019098598A1
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이은정
강영규
박준성
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(주)아모레퍼시픽
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    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/181—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system, e.g. Salinomycin, Septamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01015—Polygalacturonase (3.2.1.15)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing cumestrol using a soybean plant cultivating muscle and a method for producing a soybean plant extract having enhanced cumestrol content.
  • Coumestrol is the most potent of vegetable estrogens to date and is found primarily in the seeds, roots and leaves of leguminosae and compositae plants, a type of isoflavonoid It is generally classified as a coumestan-based compound. Cumestrol is a substance attracted attention because it is known to play a role of antimicrobial, antifungal and antiviral action by antioxidant, anti-inflammatory and antitoxic action and secretion to the wound area when the plant is traumatized . This is because various bacterial, fungal, and viral infections induce the synthesis of various aromatic compounds including cumestrol.
  • cumestrol has a phenolic structure which is a chemical basic skeleton as an antioxidant and inhibits the inflow of free radicals oxidizing agent to inhibit generation of peroxide in vivo .
  • cumestrol is known to have an estrogenic effect.
  • estrogenic effects were evaluated on the basis of changes in the weight of the uterus after oral administration to premature rats.
  • quercetrol has effective estrogenic effect on young rats, but has no activity on mature males and no toxicity.
  • the present invention provides a method for producing a bioreactor, comprising the steps of: (1) placing a soybean plant growth muscle in a medium in a bioreactor, (2) obtaining an extract from the cultured muscle through the step (1); And (3) treating the extract with an enzyme or a microorganism producing the enzyme.
  • the present invention provides a method for producing soybean and plant extracts with enhanced kemesterol content, which comprises the steps (1) to (3) above.
  • the method for producing cumestrol is based on soybean plants and enzymes, and can produce homogeneously high amounts of cumestrol. Therefore, cost and time can be saved, Since it is a cummestrol produced using a natural product rather than a synthetic product, the produced cummestrol can be safely used in various fields such as pharmacy, food or cosmetics.
  • FIG. 1 is a view showing the cultivation of a soybean culturing muscle for 4 weeks using the X-planting technique according to one aspect of the present invention.
  • FIGS. 2A and 2B show the results of HPLC analysis of coumestrel and cumestrol in soybean cultured root extract before and after the enzyme reaction.
  • explantation is also referred to as “explantation” or “in vitro culture”, and is mainly a technique for separating a part of plants and animals and culturing them in vitro. It mainly involves culturing over time for a certain period of time to survive in vitro and gradually show any developmental change.
  • General tissue culture tissue culture is also a method of in vitro culture.
  • In vitro culture according to one aspect of the present invention is also included in the in vitro culture.
  • the x-plantation technique includes raising at least one member selected from the group consisting of protoplasts, cells, tissues, organs, belly, seeds, cultivated muscles and parts of plants in an artificial incubator such as a medium supplemented with a specific component .
  • " enzyme preparation " as used herein refers to a preparation containing one or more types of active enzymes, excipients, additives, etc., and may be commercially available or may be prepared in a laboratory.
  • An example of an enzyme preparation in the present specification is an enzyme preparation comprising a polygalacturonase, a pectinase derived from Aspergillus aculeatus , and preferably an enzyme preparation containing Pectinex Ultra SP-L ( Pectinex Ultra SP-L, Novozyme, Denmark).
  • the present invention provides a method for producing a bioreactor, comprising the steps of: (1) placing a soybean plant culture muscle in a medium in a bioreactor, and maintaining the air supply constant in the bioreactor; (2) obtaining an extract from the cultured muscle through the step (1); And (3) adding an enzyme preparation, an enzyme or a microorganism producing the enzyme preparation, to the extract.
  • the present invention may be a method for producing a soybean plant extract having enhanced content of quercetrol, comprising the steps (1) to (3), and a method for enhancing the content of quimestrol in a soybean plant extract .
  • the legumes may be beans.
  • the soybeans may be soybeans, flat soybeans, frostbite, western blot, black fungus, mung bean, yellow fungus, fenugreek, kidney bean, stinged kidney bean, red tongue, reed or bean sprout bean, .
  • the soybean varieties are not limited, but may be varieties for soy sauce, tofu, herb, rice or peanut in one aspect.
  • the rice varieties include Cheongjakong (breed protection application - 2001-38), Heugcheong (breeding protection application - 2000-27), Grami (breed protection application - 2000-25), Seonheukkong Application for varieties protection application -1999-20), black soybean and one kind black soybean (application for varieties protection application -1998-158).
  • the soybean is preferably a variety capable of germination and resistant to pests and diseases.
  • Such beans include, for example, myths, wishes, anpyeong, southeastern, colorful, alok, soho, calligraphy, tea ceremony, Poongsan herb, Iksan herb, Sobaek herb, Gwangan, monoplane and galaxy.
  • the soybean according to one aspect of the present invention is not limited to the soybean variety.
  • the flaked soybean is variously referred to as a flocked soybeans, a lobster soybeans, a hibiscus legume bean, a lead drage bean, and a flat soybeans.
  • the method may include germinating legumes in the medium prior to step (1). In another aspect, the method may also include the step of inducing the soybean plant cultivar from the plant of the legume plant prior to step (1).
  • the soybean and plant extracts extracted by a general method cultivated in a non-aged plant are not uniform in composition, so it is very difficult to uniformly mass-produce a composition for achieving a specific purpose.
  • the method according to one aspect of the present invention it is possible to uniformly and massively produce cumestrol by using the x-planting technique in which external influence factors are minimized.
  • the enzyme in the enzyme preparation of step (3) or the enzyme of step (3) may be pectinase.
  • the enzyme in the enzyme preparation of step (3) or the enzyme of step (3) may be polygalacturonase.
  • the amount of enzyme in the enzyme preparation of step (3) may be 0.5 to 10% by weight based on the total weight of the enzyme preparation.
  • the microorganism in step (3) may be Aspergillus aculeatus . Since the enzyme or enzyme preparation is derived from Aspergillus aculeatus, the same effect as that of using the enzyme or the enzyme preparation can be obtained through the treatment with the microorganism or fermentation.
  • the amount of the enzyme preparation added in step (3) is at least 50 wt%, at least 60 wt%, at least 70 wt%, at least 80 wt%, at least 90 wt% 100 wt% or more, or 110 wt% or more.
  • the amount of the enzyme preparation added may be up to 120 wt%, up to 110 wt%, up to 100 wt%, up to 90 wt%, up to 80 wt%, up to 70 wt% or up to 60 wt%.
  • the amount of the enzyme preparation added in step (3) may be 90 to 110% by weight based on the weight of the extract obtained in step (2).
  • the amount of the enzyme added in step (3) may be 0.8 to 8 parts by weight based on 100 parts by weight of the extract obtained in step (2).
  • the amount of the enzyme added is at least 0.8 part by weight, at least 0.9 part by weight, at least 1 part by weight, at least 1.2 parts by weight, at least 1.5 parts by weight, at least 2 parts by weight At least 2.5 parts by weight, at least 3 parts by weight, at least 3.5 parts by weight, at least 4 parts by weight, at least 4.5 parts by weight, at least 5 parts by weight, at least 5.5 parts by weight, at least 6 parts by weight, at least 6.5 parts by weight, at least 7 parts by weight Or 7.5 parts by weight or more.
  • the amount of the enzyme added is not more than 8 parts by weight, not more than 7.5 parts by weight, not more than 7 parts by weight, not more than 6.5 parts by weight, not more than 6 parts by weight, not more than 5.5 parts by weight, based on 100 parts by weight of the extract obtained in the step (2) Not more than 4.5 parts by weight, not more than 4 parts by weight, not more than 3.5 parts by weight, not more than 3 parts by weight, not more than 2.5 parts by weight, not more than 2 parts by weight, not more than 1.8 parts by weight, not more than 1.5 parts by weight, Or 1 part by weight or less.
  • the enzyme of the enzyme preparation may be an enzyme that degrades pectin in plant tissue.
  • the enzyme preparation may be one comprising as an enzyme Polygalacturonase, a pectinase derived from Aspergillus aculeatus .
  • the enzyme preparation may further comprise an enzyme pectin transseliminase, pectinesterase, hemicellulase, and cellulases.
  • the enzyme preparation may be pectinex ultra SP-L (Novozymes, Denmark).
  • the amount of polygalacturonase contained in the enzyme preparation is greater than or equal to 2000 units / mL, greater than 2200 units / mL, greater than 2400 units / mL, greater than 2600 units / mL, greater than 2800 units / mL based on Enzymatic Activity , Greater than or equal to 3000 units / mL, greater than or equal to 3200 units / mL, greater than or equal to 3400 units / mL, greater than or equal to 3600 units / mL, greater than or equal to 3800 units / mL, greater than or equal to 4000 units / mL, greater than or equal to 4200 units / mL, greater than or equal to 4400 units / mL, Or more.
  • the amount may be less than or equal to 5000 units / mL, less than or equal to 4800 units / mL, less than or equal to 4600 units / mL, less than or equal to 4400 units / mL, less than or equal to 4200 units / mL, less than or equal to 4000 units / mL, less than or equal to 3800 units / mL, / mL, less than or equal to 3000 units / mL, less than or equal to 2500 units / mL, or less than or equal to 2400 units / mL.
  • the amount of polygalacturonase contained in the enzyme preparation may be greater than or equal to 3800 units / mL.
  • the amount of the enzyme added in step (3) may be 2000 to 5000 units based on 1 g of the extract obtained in step (2) based on enzyme activity.
  • the amount of the enzyme added in step (3) is not less than 2000units, not less than 2200units, not less than 2400units, not less than 2600units, not less than 2800units, not less than 3000units, not less than 3200units, More than 3400units, more than 3600units, more than 3800units, more than 4000units, more than 4200units, more than 4400units, more than 4600units, or more than 4800units.
  • the added amount is not more than 5000units, not more than 4800units, not more than 4600units, not more than 4400units, not more than 4200units, not more than 4000units, not more than 3800units, not more than 3600units, not more than 3400units, not more than 3200units, 3000units or less, 2500units or less, or 2400units or less.
  • the addition amount may be 3500-4,200 units based on 1 g of the extract obtained through the step (2) based on the enzyme activity.
  • the amount of polygalacturonase in the enzyme preparation is 0.1% or more, 0.5% or more, 0.8% or more, 1% or more, 1.2% or more, 1.4% Or more, 1.6 wt% or more, 1.8 wt% or more, 2 wt% or more, 2.2 wt% or more, 2.6 wt% or more, 2.8 wt% or more, 3 wt% or more, 3.2 wt% or more, 3.4 wt% or more, 3.6 wt% , At least 4 wt%, at least 4.2 wt%, at least 4.4 wt%, at least 4.6 wt%, at least 4.8 wt%, at least 5 wt%, at least 5.2 wt%, at least 5.4 wt% , At least 6 wt%, at least 6.5 wt%, or at least 7 wt%.
  • the amount of the polygalacturonase is 8 wt% or less, 7.5 wt% or less, 7 wt% or less, 6.5 wt% or less, 6 wt% or less, 5.8 wt% or less, 5.6 wt% or less, 5.4 wt% , 5.2% or less, 5% or less, 4.8% or less, 4.6% or less, 4.4% or less, 4.2% or less, 4% or less, 3.8% or less, 3.6% or less, 3.4% Not more than 3.2% by weight, not more than 3% by weight, not more than 2.8% by weight, 2.6% by weight or less, 2.4% by weight or less, 2.2% by weight or less, 2% by weight or less, 1.8% by weight or less, 1.6% , 1.2 wt% or less, 1 wt% or less, 0.8 wt% or less, 0.6 wt% or less, 0.4 wt% or less, or 0.2 wt% or less.
  • the function and role of the enzyme preparation is to enable the conversion of cumestrin to cumestrol by eliminating sugars from the extracts of the extract, maintaining the quality of the bean and vegetable cultivating muscles uniformly,
  • the yield of quimestrol can be significantly improved and maintained uniform.
  • the soybean plants in step (1) may be beans.
  • the soybean plant in step (1) may be soybeans or flat beans.
  • the extract of step (2) may be extracted with water, C1 to C6 lower alcohols, or a mixture thereof as a solvent.
  • the alcohol concentration of the mixture may be between 60 and 100% (w / v). In one aspect, the alcohol concentration is greater than 60% (w / v), greater than 70% (w / v), greater than 75% (w / v), greater than 80% ) Or more, 90% (w / v) or more, or 95% (w / v) or more. In another aspect, the alcohol concentration is less than 95% (w / v), less than 90% (w / v), less than 85% (w / v), less than 80% ) Or less, 75% (w / v) or less, 70% (w / v) or less, or 65% (w / v) or less.
  • the lower alcohol may be ethanol.
  • the step (2) may be a step of drying the cultured muscle through the step (1), and then extracting the dried cultured muscle with the solvent.
  • the extract of step (2) may be an extract obtained by extracting the culture medium with the weight ratio of the culture medium to the extraction solvent, which is dried, to 1:10 to 1:70.
  • the weight ratio is 1:10 or more, 1:15 or more, 1:20 or more, 1:25 or more, 1:30 or more, 1:35 or more, 1:40 or more, 1:45 or more, 1:50 or more, 1 : 55 or more, 1:60 or more, or 1:65 or more.
  • the weight ratio is 1:70 or less, 1:65 or less, 1:60 or less, 1:58 or less, 1:55 or less, 1:52 or less, 1:50 or less, 1:48 or less, 1:45 or less, 1:42 or less, 1:40 or less, 1:38 or less, 1:36 or less, 1:35 or less, 1:30 or less, 1:25 or less, 1:20 or less, or 1:15 or less.
  • the bioreactor in step (1) may be a Stirred Tank Reactor, a Bubble Column Reactor, an Air Lift Reactor, a Fludized Bed Reactor, Reactor, a Fixed / Packed Bed Reactor, or a Tower Fermenter, and may preferably be a Bulb Type bubble bioreactor.
  • the medium of step (1) may be indole-3-butyric acid (IBA) and carbon source added.
  • the carbon source is selected from the group consisting of glucose, fructose, mannose, ribose, arabinose, xylose, galactose, sucrose, cellobiose, trehalose, lactose, raffinose, amylose, starch, sorbitol, mannitol, and glycerol It may be more than one selected.
  • the culture medium of step (1) has a concentration of ammonium nitrate (NH 4 NO 3 ) of at least 650 mg / l, at least 660 mg / l, at least 700 mg / l, at least 740 mg / , More than 800 mg / l, more than 825 mg / l, more than 850 mg / l, more than 900 mg / l, more than 1000 mg / l, more than 1200 mg / l or more than 1400 mg / l.
  • NH 4 NO 3 ammonium nitrate
  • the concentration of ammonium nitrate is less than or equal to 1500 mg / l, less than or equal to 1400 mg / l, less than or equal to 1200 mg / l, less than or equal to 1000 mg / l, less than or equal to 990 mg / , Not more than 800 mg / l, not more than 760 mg / l, not more than 740 mg / l, not more than 700 mg / l or not more than 660 mg / l.
  • the culture medium of step (1) is cultured in a medium containing calcium chloride (CaCl 2 .2H 2 O) at a concentration of 175 mg / l, 176 mg / l, 190 mg / l, 200 mg / More than 240 mg / l, more than 260 mg / l, more than 264 mg / l, more than 270 mg / l, more than 280 mg / l, more than 300 mg / l, more than 350 mg / l or more than 380 mg / l.
  • CaCl 2 .2H 2 O calcium chloride
  • the concentration of calcium chloride is less than or equal to 400 mg / l, less than or equal to 380 mg / l, less than or equal to 350 mg / l, less than or equal to 300 mg / Less than or equal to 240 mg / l, less than or equal to 220 mg / l, less than or equal to 200 mg / l, less than or equal to 190 mg / l or less than or equal to 176 mg / l.
  • the medium of step (1) has a concentration of magnesium sulfate (MgSO 4 .7H 2 O) of 145 mg / l, 148 mg / l, 150 mg / l, 160 mg / L, at least 185 mg / l, at least 190 mg / l, at least 200 mg / l, at least 215 mg / l, at least 222 mg / l, at least 240 mg / l, at least 280 mg / l or at least 300 mg / l.
  • MgSO 4 .7H 2 O magnesium sulfate
  • the concentration of magnesium sulfate is less than or equal to 320 mg / l, less than or equal to 300 mg / l, less than or equal to 280 mg / l, less than or equal to 240 mg / L, not more than 180 mg / l, not more than 160 mg / l, not more than 150 mg / l or not more than 148 mg / l.
  • the culture medium of step (1) is cultured in a medium containing potassium phosphate (KH 2 PO 4 ) at a concentration of 65 mg / l or more, 68 mg / l, 70 mg / l, 75 mg / L, more than 90 mg / l, more than 95 mg / l, more than 100 mg / l, more than 102 mg / l, more than 120 mg / l or more than 140 mg / l.
  • KH 2 PO 4 potassium phosphate
  • the concentration of potassium phosphate is not more than 150 mg / l, not more than 140 mg / l, not more than 120 mg / l, not more than 110 mg / l, not more than 102 mg / Less than or equal to 85 mg / l, less than or equal to 80 mg / l, less than or equal to 75 mg / l, less than or equal to 70 mg / l, or less than or equal to 68 mg /
  • the culture medium of step (1) has a concentration of potassium nitrate (KNO 3 ) of at least 750 mg / l, at least 760 mg / l, at least 800 mg / l, at least 850 mg / Or more, 1000 mg / l or more, 1140 mg / l or more, 120 mg / l or more, or 1400 mg / l or more.
  • KNO 3 potassium nitrate
  • the potassium nitrate is present in an amount of less than or equal to 1500 mg / l, less than or equal to 1400 mg / l, less than or equal to 1300 mg / l, less than or equal to 1140 mg / l or less, 800 mg / l or less, or 760 mg / l or less.
  • the medium of step (1) may be Murashige and Skoog medium.
  • the kind of the component in the medium of step (1) is the same as that of the component in the Murashige and Skoog medium, and the concentration of the component is 40% of the component concentration in the Murakage / , At least 45%, at least 50%, at least 55%, or at least 58%.
  • the concentration of the component in the medium of step (1) above may be no more than 60%, no more than 55%, no more than 50%, or no more than 45% of the component concentration in the unstained / cooked medium.
  • the pH of the culture medium when the culture medium is placed in the culture medium in the step (1), the pH of the culture medium may be 4.8 to 6.8.
  • the pH may be at least 4.8, at least 5, at least 5.2, at least 5.4, at least 5.6, at least 5.8, at least 6.0, at least 6.2, at least 6.4, or at least 6.6.
  • the pH may be less than 6.8, less than 6.6, less than 6.4, less than 6.2, less than 6.0, less than 5.8, less than 5.6, less than 5.4, less than 5.2, less than 5.0.
  • the density may be 2 to 6 g / L when the culturing muscle is placed in the medium in step (1). In one aspect, the density may be greater than or equal to 2 g / L, greater than or equal to 3 g / L, greater than or equal to 4 g / L, or greater than or equal to 5 g / L. In another aspect, the density may be 6 g / L or less, 5 g / L or less, 4 g / L or less, or 3 g / L or less.
  • step (1) may be carried out under a dark condition.
  • the step (1) may be carried out at 19 to 25 ° C.
  • the temperature may be at least 19 ° C, at least 20 ° C, at least 21 ° C, at least 22 ° C, at least 23 ° C, or at least 24 ° C.
  • the temperature may be less than or equal to 25 ° C, less than or equal to 24 ° C, less than or equal to 23 ° C, less than or equal to 22 ° C, less than or equal to 21 ° C, or less than or equal to 20 ° C.
  • the air supply amount in the step (1) may be 0.05 to 0.4 vvm (air volume / culture volume per min).
  • the air supply is at least 0.05 vvm, at least 0.08 vvm, at least 0.1 vvm, at least 0.12 vvm, at least 0.14 vvm, at least 0.16 vvm, at least 0.18 vvm, at least 0.2 vvm, at least 0.22 vvm, at least 0.24 vvm, at least 0.26 vvm Or more, 0.28 vvm or more, 0.3 vvm or more, 0.32 vvm or more, 0.34 vvm or more, 0.36 vvm or more, or 0.38 vvm or more.
  • the air supply amount is less than or equal to 0.4 vvm, less than 0.38 vvm, less than 0.36 vvm, less than 0.34 vvm, less than 0.32 vvm, less than 0.3 vvm, less than 0.28 vvm, less than 0.26 vvm, less than 0.24 vvm, less than 0.22 vvm 0.18 vvm or less, 0.16 vvm or less, 0.14 vvm or less, 0.12 vvm or less, 0.1 vvm or less, 0.08 vvm or less, or 0.06 vvm or less.
  • the step (1) may be carried out for 2 to 5 weeks. In one aspect, the step (1) may be carried out for more than two weeks, three weeks or four weeks or more. In another aspect, the proliferation of step (1) may be performed for 5 weeks or less, 4 weeks or 3 weeks or less.
  • the extraction time of step (2) may be 20 to 28 hours. In one aspect, the extraction time may be at least 20 hours, at least 22 hours, at least 24 hours, at least 25 hours, or at least 26 hours. In another aspect, the extraction time may be less than or equal to 28 hours, less than or equal to 26 hours, less than or equal to 25 hours, less than or equal to 24 hours, less than or equal to 22 hours, or less than or equal to 21 hours.
  • the method further comprises adding distilled water to the resultant product of step (3) so that the concentration of the resultant is at least 0.5%, at least 1%, at least 1.5%, at least 2%, at least 2.5% (4) to prepare a reaction product having a concentration of 3 wt% or more, 5 wt% or more, or 8 wt% or more.
  • the concentration is 10 wt% or less, 8 wt% or less, 5 wt% or less, 3 wt% or less, 2.5 wt% or less, 2 wt% or less, 1.5 wt% or less, 1 wt% or less, or 0.8 wt% .
  • the method further comprises the step of retaining the solution at 40 to 50 degrees Celsius and 60 to 100 rpm for 38 to 58 hours after the step (3) or (4), and then centrifuging to recover the precipitate Lt; / RTI >
  • the temperature may be at least 40 degrees, at least 42 degrees, at least 44 degrees, at least 46 degrees, or at least 48 degrees.
  • the temperature may be less than 50 degrees Celsius, less than 48 degrees Celsius, less than 46 degrees Celsius, less than 44 degrees Celsius, or less than 42 degrees Celsius.
  • the rpm may be at least 60, at least 70, at least 80, at least 90, or at least 95.
  • the rpm may be less than or equal to 100, less than or equal to 95, less than or equal to 90, less than or equal to 85, less than or equal to 80, less than or equal to 75, less than or equal to 70,
  • the time may be at least 38 hours, at least 40 hours, at least 42 hours, at least 44 hours, at least 46 hours, at least 48 hours, at least 50 hours, at least 52 hours, at least 54 hours, or at least 56 hours.
  • the time may be 58 hours or less, 56 hours or less, 54 hours or less, 52 hours or less, 50 hours or less, 48 hours or less, 46 hours or less, 44 hours or less, 42 hours or less or 40 hours or less.
  • the content of quimestrol in the precipitate may be at least 100 mg relative to 1 g of the precipitate.
  • the content is at least 100 mg, at least 110 mg, at least 120 mg, at least 130 mg, at least 140 mg, at least 142 mg, at least 143 mg, at least 144 mg, at least 144.27 mg, at least 145 mg, at least 145.5 mg, At least 146.4 mg, at least 147 mg, at least 147.5 mg, at least 148 mg, at least 148.5 mg, at least 148.53 mg, at least 149 mg, at least 150 mg, at least 155 mg, at least 160 mg, or at least 170 mg.
  • the content is less than or equal to 180 mg, less than 170 mg, less than 160 mg, less than 155 mg, less than 150 mg, less than 149 mg, less than 148.6 mg, less than 148.53 mg, less than 148.5 mg, less than 148 mg, less than 147.5 mg, 145.4 mg or less, 144.5 mg or less, 144.27 mg or less, 144 mg or less, 143 mg or less, 142 mg or less, 140 mg or less, 130 mg or less, 120 mg or less or 110 mg or less.
  • the above preferred content may be 140 to 150 mg relative to 1 g of the precipitate.
  • the above content is significantly increased to about 100 times as compared with the case of the non-enzyme-treated common soybean root extract grown in the open field (1.7 to 1.9 mg or less per 1 g of the extract). In addition, the content is about 3 times higher than that in the case of using a conventional Murakshige / Screw medium.
  • the soybean seeds ( Glycine max, preferably a mythic soybean variety) and the flat soybeans were sterilized with an aqueous solution of 2% by weight sodium hypochlorite for 20 minutes and then washed three times with sterilized water. After that, germination of the plants for 2 weeks was carried out under the condition that 25 ⁇ 1 °C was maintained in the cabin using 0.5 ⁇ 1.0 MS medium (Murashige and Skoog Medium, Haarlem, Netherlands) with 30 g / Respectively.
  • the IBA indole-3-butyric acid, IBA
  • a bulb type bioreactor commercially available in the market, (Murashige and Skoog medium, Duchefa, Netherlands) supplemented with 4 mg / L of sucrose, 30 g / L of sucrose, and 4 mg / L of Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Germany. Further, the culture medium was grown for 4 weeks using the above-described conditions and 1.0 MS medium.
  • the 0.5 MS medium is a medium prepared by reducing the concentration of raw materials such as minerals used in the medium to 1/2 of the normal MS medium, and the 1.0 MS medium refers to a medium in which the concentration of the raw material is the same as that of a normal MS medium.
  • the medium was adjusted to pH 5.8 with 1N NaOH and sterilized at 121 ⁇ and 1.2 atm for 35 minutes.
  • the cultured muscle was cut to 1-1.5 cm and inoculated on the medium at a seeding density of 4 g / L based on live weight, and then cultured under the dark condition maintained at 22 ⁇ 1 ° C. In this process, pesticides and fertilizers were not used at all.
  • the air supply was constantly adjusted to 0.1 vvm (air volume / culture volume per min) using air flow meters (RMA series; Dwyer Instruments, Inc., USA)
  • RMA series air flow meters
  • the supplied air is passed through an air condenser capable of condensing compressed air, a filter capable of removing impurities and an air drier in sequence, and then introduced into the bioreactor Respectively.
  • the soybean cultured muscle obtained and dried according to Examples 1 and 2 was immersed in an aqueous 80% (w / v) ethanol solution so that the weight ratio of aqueous solution of the ethanol to the ethanol solution was 1:30 to 1:50 (preferably 1:30) And extracted at room temperature for 24 hours.
  • the extract was filtered using a filter paper, and then the solvent was evaporated to dryness to obtain a powder (extract).
  • extract was confirmed that when the extract was prepared using the cultured muscle produced in Example 1, the components in the extract were kept uniform, and it was confirmed that the extract produced by mass production .
  • a liquid pectinase enzyme preparation (pectinex ultra SP-L, Novozymes, Denmark) having the same weight as that of the soybean cultured root extract powder obtained above was treated with the extract powder,
  • the reaction product was maintained at 45 ° C and 80 rpm for 48 hours, and the precipitate was recovered using a centrifuge. The recovered precipitate was lyophilized and powdered.
  • the content of quimestrol in the soybean cultured root extract was determined by filtering the extract before the enzymatic reaction (the extract of Example 1) and after (the precipitate of Example 3) with a 0.45 ⁇ m filter and then using a UV detector Were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the column used was Mightysil RP-18 GP 250-4.6 (5 ⁇ m, KANTO CHEMICALS, JAPAN) and the content of quimestrol in the extract was measured at the wavelength of 342 nm.
  • Table 1 below compares the content of quimestrol in soybean cultured root extract before and after the enzyme reaction.
  • yield refers to the weight of the extract according to item 1 of Experimental Example 3 and the weight of the precipitate according to Item 2 of Experimental Example 3 in terms of percentage (%) .
  • MS stands for Murashige / Screw medium.
  • the 0.5 MS medium is a medium prepared by reducing the concentration of raw materials such as minerals used in the medium to 1/2 of the normal MS medium, and 1.0 MS medium The concentration of the raw material refers to a medium such as a normal MS medium)
  • FIGS. 2A and 2B show results of HPLC analysis of cumestrin and cumestrol in soybean cultured root extract before and after the enzyme reaction.

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Abstract

본 명세서는 콩과식물 배양근을 이용한 쿠메스트롤 생산 방법 및 쿠메스트롤 함량이 증진된 콩과식물 추출물 제조 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 일 측면에 따른 방법은 콩과 식물 및 효소를 이용하여, 생성되는 쿠메스트롤을 균일하게 고함량으로 얻을 수 있으므로, 기존 방법 보다 비용 및 시간을 절약할 수 있으며, 천연물을 이용하여 생산된 쿠메스트롤이므로 약학, 식품 또는 화장품을 예로 들 수 있는 다양한 분야에 안전하게 활용 가능하다.

Description

콩과식물 배양근을 이용한 쿠메스트롤 생산 방법
본 명세서는 콩과식물 배양근을 이용한 쿠메스트롤 생산 방법 및 쿠메스트롤 함량이 증진된 콩과식물 추출물 제조 방법에 관한 것이다.
갱년기 여성들을 위한 에스트로겐 요법에서 강력한 에스트로겐 효과를 갖고 있는 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol; DES) 등의 저렴한 합성 에스트로겐의 사용이 미국 FDA에 의해 전면 금지된 이후로 여성호르몬을 대체해 줄 수 있는 천연의 식물성 에스트로겐(phytoestrogen)에 관심이 모아지고 있다. 그러나 이러한 물질들은 천연에 극미량으로 존재하기 때문에 대량 확보가 매우 어려운 실정이다. 또한 과거 반세기에 걸쳐 이러한 물질들의 대량 합성 기술개발에 미온적이었기 때문에 두드러진 성과는 없었으며 비록 간헐적으로나마 합성법 개발에 대한 보고가 있기는 하나 이 역시 실험실적 수준에 그치고 있기 때문에 현재까지 이렇다 할 만한 손쉬운 대량 제조방법이 전무한 상태이다.
쿠메스트롤(coumestrol)은 식물성 에스트로겐 중에서 현재까지 가장 강력한 것으로 알려져 있는 물질로서 주로 콩과(leguminosae), 국화과(compositae) 식물의 씨앗, 뿌리 그리고 잎에서 발견되는 물질로써 이소플라보노이드(isoflavonoid)의 일종으로 일반적으로는 쿠메스탄(coumestan) 계열 화합물로 분류되고 있다. 쿠메스트롤은 식물이 외상을 입었을 때 상처 부위에 짙은 농도로 분비되어 항산화, 항염 및 항독소 작용을 통해 항균, 항진균 및 항바이러스 작용을 하여 감염을 방지하는 역할을 하는 것이 알려지면서 주목을 받았던 물질이다. 이러한 현상은 다양한 박테리아 및 곰팡이류, 바이러스 등의 감염이 쿠메스트롤을 포함한 다양한 방향족 화합물(aromatic compounds)의 합성을 유도하기 때문이다. 이러한 쿠메스트롤의 항생 작용의 근원은 항산화제로서의 화학적 기본 골격인 페놀성 구조를 보유하고 있어 프리 라디칼성(free radicals) 산화제의 유입을 억제하여 생체 내 과산화 화합물 생성을 저지하기 때문으로 알려지고 있다. 또한 다양한 천연 쿠메스탄 계열의 유도체들 중에서 오직 쿠메스트롤만이 에스트로겐 효과를 갖고 있는 것으로 알려지고 있다. 에스트로겐 효과에 대한 실험은 미숙한 쥐에게 경구 투여한 후 자궁의 무게 변화에 기초하여 평가되었다. 이러한 실험 결과에서 특기할 만한 사항으로 쿠메스트롤은 어린 암쥐에서는 효과적으로 에스트로겐 효과가 나타났지만 성숙한 숫컷 동물들에게는 활성을 나타내지 않았으며 독성이 전혀 없는 것으로 나타났다.
그러나, 쿠메스트롤은 일부 식물체에 극미량으로 존재하므로 현재 상용되는 천연 쿠메스트롤은 고가로 시판되고 있다. 이러한 이유로 합성을 통해 쿠메스트롤을 얻으려는 연구가 간헐적으로 시도되어 왔으나 여러 개의 방향족 고리가 융합되어 있는 다소 복잡한 화학 구조 때문에 손쉬운 합성법 개발에 대한 접근법이 소개되지 않고 있으며, 비록 몇 가지의 합성법이 보고되고 있으나 각 합성법들은 아래에 설명하는 다양한 문제점을 내포하고 있어 상용화에 많은 어려움이 따르고 있다. 또한 최근에 화학적 합성법에 의해 생산한 성분 보다는 천연에서 생산한 성분이 안전성 측면에서 좋은 이미지를 가지고 있기 때문에 천연 물질에서 대량으로 생산 할 수 있는 방법에 대한 연구가 필요한 실정이다.
본 명세서는 천연 원료를 이용하여 효율적이면서도 균일하게 쿠메스트롤을 고함량으로 생산하는 방법을 제공하는 것을 과제로 하고 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 명세서는 (1) 콩과식물 배양근을 생물반응기 내의 배지에 위치시켜 상기 생물반응기 내에서 공기공급량을 일정하게 유지하며 증식시키는 단계; (2) 상기 (1) 단계를 거친 배양근으로부터 추출물을 얻는 단계; 및 (3) 상기 추출물에 효소 또는 이를 생산하는 미생물을 처리하는 단계를 포함하는, 쿠메스트롤 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 명세서는 상기 단계 (1) 내지 단계 (3)을 포함하는, 쿠메스트롤 함량이 증진된 콩과식물 추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따른, 쿠메스트롤 생산방법은 콩과 식물 및 효소를 이용한 것으로서, 생성되는 쿠메스트롤을 균일하게 고함량으로 얻을 수 있으므로, 기존 방법 보다 비용 및 시간을 절약할 수 있으며, 합성이 아닌 천연물을 이용하여 생산된 쿠메스트롤이므로 이렇게 생산한 쿠메스트롤은 약학, 식품 또는 화장품을 예로 들 수 있는 다양한 분야에 안전하게 활용 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 측면에 따른 엑스플랜테이션 기술을 이용하여, 4주간 콩 배양근을 배양한 모습을 나타낸 것이다.
도 2a 및 도 2b는 효소 반응 전후의 콩 배양근 추출물 내 쿠메스트린과 쿠메스트롤을 HPLC 크로마토그램으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
본 명세서에서, 엑스플랜테이션(explantation)이란, 외식(外植) 또는 체외배양이라고도 하고, 주로 동식물 개체의 일부를 분리하여 체외에서 배양하는 기술이다. 주로 일정 기간에 걸쳐 체외에서 생존하며 차차 어떤 발생적 변화가 보일 정도로 시간을 두고 배양을 하는 것을 포함한다. 일반적인 조직배양(組織培養)도 체외배양의 한 방법이다. 또한, 본 발명의 일 측면에 따른 기내 배양도 체외배양에 포함된다.
본 명세서에서 엑스플랜테이션 기술은, 원형질체, 세포, 조직, 기관, 배, 종자, 배양근 및 식물체의 일부를 포함하는 군에서 선택된 하나 이상을 특정 성분이 첨가된 배지 등의 인공 배양 기구에서 키우는 것을 포함한다.
본 명세서에서 “효소 제제(enzyme preparation)”란, 단일 또는 여러 종류의 활성 효소와 부형제, 첨가제 등을 포함하는 제제로서, 시판되는 것은 물론 연구실에서 임의 제조한 것일 수도 있다. 본 명세서 내의 효소 제제의 일 예는, 아스퍼질러스 아큘레아투스(Aspergillus aculeatus)로부터 유래한 펙티나아제 일종인 폴리갈락투로나제를 포함하는 효소 제제로서, 바람직하게는 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex Ultra SP-L, Novozyme사, 덴마크)일 수 있다.
본 발명은 일 측면에서, (1) 콩과식물 배양근을 생물반응기 내의 배지에 위치시켜 상기 생물반응기 내에서 공기공급량을 일정하게 유지하며 증식시키는 단계; (2) 상기 (1) 단계를 거친 배양근으로부터 추출물을 얻는 단계; 및 (3) 상기 추출물에 효소 제제, 효소 또는 이를 생산하는 미생물을 첨가하는 단계를 포함하는, 쿠메스트롤 생산 방법일 수 있다.
본 발명은 다른 측면에서, 상기 단계 (1) 내지 단계 (3)을 포함하는, 쿠메스트롤 함량이 증진된 콩과식물 추출물의 제조방법, 콩과식물 추출물 내의 쿠메스트롤 함량 증진방법일 수 있다.
일 구현 예로서, 상기 콩과식물은 콩일 수 있다. 다른 구현 예로서, 상기 콩은 대두, 납작콩, 서리태, 서목태, 흑태, 청태, 황태, 울타리콩, 강낭콩, 얼룩강낭콩, 적두, 거두, 또는 콩나물콩일 수 있고, 바람직하게는 대두 또는 납작콩일 수 있다. 상기 콩의 품종은 제한이 없으나, 일 측면에서 장류 및 두부용, 나물용, 밥밑용 또는 풋콩용 품종일 수 있다. 장류 및 두부용 품종으로는, 대풍(Daepung, 품종보호출원 출원-2003-152), 호장(Hojang, 품종보호출원 출원-2003-155), 장원(Jangwon, 품종보호출원 출원-2001-34), 대황(품종보호출원 출원-2000-19), 소담(Sodamkong, 품종보호출원 출원-1999-19), 송학(품종보호출원 출원-1999-22), 대원(Daewonkong, 품종명칭등록번호 제01-0003-38호), 진품(Jinpumkong, 품종보호출원 출원-1998-204), 단백(Danbaegkong, 품종보호출원 출원-1998-201), 두유(Duyoukong, 품종보호출원 출원-1998-151), 신팔달(Shinpaldalkong, 품종보호출원 출원-1998-199), 태광(Taekwangkong, 품종보호출원 출원-1998-198), 만리(Mallikong, 품종명칭등록번호 제01-0003-11호), 장수(Jangsukong, 품종명칭등록번호 제01-0003-9호), 무한(Muhankong, 품종명칭등록번호 제01-0003-7호), 백운(Baegunkong, 품종보호출원 출원-1998-193), 새알(Saealkong, 품종보호출원 출원-1998-143), 황금(품종명칭등록번호 제01-0003-1호) 및 장엽(품종명칭등록번호 제01-0003-41호) 등이 있다. 나물용 품종으로는, 신화(Shinhwa, 품종명칭등록번호 제01-0003-134호), 소원(Sowon, 품종보호출원 출원-2000-16), 안평(Anpyeong, 품종보호출원 출원-2003-151), 서남(Sunam, 품종보호출원 출원-2003-153), 다채(Dachae, 품종보호출원 출원-2003-148), 소록(품종보호출원 출원-2002-116), 소호(Sohokong, 품종보호출원 출원-2001-36), 소명(Somyeongkong, 품종보호출원 출원-1998-18), 다원(품종보호출원 출원-1998-209), 풍산나물(Pungsannamul, 품종보호출원 출원-1998-140), 익산나물(Iksannamul, 품종보호출원 출원-1998-139), 소백나물(품종명칭등록번호 제01-0003-31호), 광안(Kwangankong, 품종보호출원 출원-1998-202), 단엽 및 은하(Eunhakong, 품종명칭등록번호 제01-0003-6호) 등이 있다. 밥밑용 품종으로는, 청자(Cheongjakong, 품종보호출원 출원-2001-38), 흑청(Heugcheong, 품종보호출원 출원-2000-27), 갈미(품종보호출원 출원-2000-25), 선흑(Seonheukkong, 품종보호출원 출원-1999-20), 검정콩 및 일품검정콩(품종보호출원 출원-1998-158) 등이 있다. 또한, 풋콩용 품종으로는, 다올(Daol, 품종보호출원 출원-2003-149), 신록(품종보호출원 출원-2001-35), 새을, 검정을, 석량풋콩, 화엄풋콩(품종명칭등록번호 제01-0003-21호) 및 큰을 등이 있다. 본 발명의 다른 일 측면에서, 콩은 발아가 가능하고 병충해에 강한 품종인 것이 바람직하다. 그와 같은 콩으로는, 예를 들어 신화, 소원, 안평, 서남, 다채, 소록, 소호, 소명, 다원, 풍산나물, 익산나물, 소백나물, 광안, 단엽 및 은하 등이 있다. 그러나 본 발명의 일 측면에 따른 콩이 상기 콩 품종에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 측면에 따른 납작콩은 납떼기콩, 납데기콩, 납쪼레기콩, 납드레콩, 납작콩 등으로 다양하게 불린다.
일 측면에서 상기 방법은 (1) 단계 이전에 배지 내에서 콩과식물을 발아시키는 단계를 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 상기 방법은 (1) 단계 이전에 콩과식물의 식물체로부터 콩과식물 배양근을 유도하는 단계도 포함할 수 있다.
일반적으로 노지에서 재배하여 일반적인 방법으로 추출한 콩과식물 추출물은 성분 등이 일정하지 않으므로 특정 목적 달성을 위한 조성물의 균일한 대량생산이 매우 어렵다. 그러나, 본 발명의 일 측면에 따른 방법에 의하면, 외부 영향 요인 등을 최소화한 엑스플랜테이션 기술을 이용하여 쿠메스트롤을 균일하게 대량으로 생산할 수 있다.
일 구현 예로서, (3) 단계의 상기 효소 제제 내의 효소 또는 (3) 단계의 상기 효소는 펙티나아제(pectinase)일 수 있다.
다른 구현 예로서, (3) 단계의 상기 효소 제제 내의 효소 또는 (3) 단계의 상기 효소는 폴리갈락투로나제(Polygalacturonase)일 수 있다.
다른 구현 예로서, (3) 단계의 상기 효소 제제 내 효소의 양은 효소 제제 총 중량을 기준으로 0.5 내지 10 중량%일 수 있다. 일 측면에서, (3) 단계의 상기 미생물은 아스퍼질러스 아큘레아투스(Aspergillus aculeatus)일 수 있다. 상기 효소 또는 효소 제제는 상기 아스퍼질러스 아큘레아투스에서 유래된 것이기 때문에, 상기 미생물을 이용한 처리 또는 발효를 통해 상기 효소 또는 효소 제제를 사용한 것과 같은 효과를 얻을 수 있다.
다른 구현 예로서, (3) 단계의 상기 효소 제제의 첨가량은 상기 (2) 단계를 거친 추출물 대비 50 중량% 이상, 60중량% 이상, 70중량% 이상, 80중량% 이상, 90중량% 이상, 100중량% 이상 또는 110중량% 이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 효소 제제의 첨가량은 120중량% 이하, 110중량% 이하, 100중량% 이하, 90중량% 이하, 80중량% 이하, 70중량% 이하 또는 60중량% 이하일 수 있다. 바람직하게는, 상기 (3) 단계의 상기 효소 제제의 첨가량은 상기 (2) 단계를 거친 추출물 대비 90 내지 110중량%일 수 있다.
일 구현 예로서, (3) 단계의 상기 효소의 첨가량은 상기 (2) 단계를 거친 추출물 100중량부 대비 0.8 내지 8중량부일 수 있다. 일 측면에서, 상기 효소의 첨가량은 상기 (2) 단계를 거친 추출물 100중량부 대비 0.8 중량부 이상, 0.9 중량부 이상, 1중량부 이상, 1.2중량부 이상, 1.5중량부 이상, 2중량부 이상, 2.5중량부 이상, 3중량부 이상, 3.5중량부 이상, 4중량부 이상, 4.5중량부 이상, 5중량부 이상, 5.5중량부 이상, 6중량부 이상, 6.5중량부 이상, 7중량부 이상 또는 7.5중량부 이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 효소의 첨가량은 상기 (2) 단계를 거친 추출물 100중량부 대비 8중량부 이하, 7.5중량부 이하, 7중량부 이하, 6.5중량부 이하, 6중량부 이하, 5.5중량부 이하, 5중량부 이하, 4.5중량부 이하, 4중량부 이하, 3.5중량부 이하, 3중량부 이하, 2.5중량부 이하, 2중량부 이하, 1.8중량부 이하, 1.5중량부 이하, 1.2중량부 이하 또는 1중량부 이하일 수 있다.
일 측면에서 상기 효소 제제의 효소는 식물 조직에서 펙틴을 분해하는 효소일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 효소 제제는 아스퍼질러스 아큘레아투스(Aspergillus aculeatus)로부터 유래한 펙티나아제 일종인 폴리갈락투로나제(Polygalacturonase)를 효소로서 포함하는 것일 수 있다. 또 다른 측면에서, 상기 효소 제제는 효소로서 펙틴트랜셀리미나제(pectintranseliminase), 펙티네스터라제(pectinesterase), 헤미셀룰라제(hemicellulase) 및 셀룰라제(cellulases)를 더 포함하는 것일 수 있다. 또 다른 측면에서, 상기 효소 제제는 pectinex ultra SP-L(노보자임사, 덴마크)일 수 있다.
일 구현 예로서, 상기 효소 제제 내에 포함된 폴리갈락투로나제의 양은 효소 활성(Enzymatic Activity) 기준으로 2000units/mL 이상, 2200units/mL 이상, 2400units/mL 이상, 2600units/mL 이상, 2800units/mL 이상, 3000units/mL 이상, 3200units/mL 이상, 3400units/mL 이상, 3600units/mL 이상, 3800 units/mL 이상, 4000units/mL 이상, 4200units/mL 이상, 4400units/mL 이상, 4600units/mL 이상 또는 4800units/mL 이상일 수 있다. 또한, 상기 양은 5000units/mL 이하, 4800units/mL 이하, 4600units/mL 이하, 4400units/mL 이하, 4200units/mL 이하, 4000units/mL 이하, 3800units/mL 이하, 3600units/mL 이하, 3400units/mL 이하, 3200units/mL 이하, 3000units/mL 이하, 2500units/mL 이하 또는 2400units/mL 이하일 수 있다. 바람직하게는 상기 효소 제제 내에 포함된 폴리갈락투로나제의 양이 3800 units/mL 이상일 수 있다.
일 구현 예에서, (3) 단계의 상기 효소의 첨가량은 효소 활성을 기준으로 상기 (2) 단계를 거친 추출물 1g 대비 2000 내지 5000 units일 수 있다. 일 측면에서, (3) 단계의 상기 효소의 첨가량은 효소 활성을 기준으로 상기 (2) 단계를 거친 추출물 1g 대비 2000units 이상, 2200units 이상, 2400units 이상, 2600units 이상, 2800units 이상, 3000units 이상, 3200units 이상, 3400units 이상, 3600units 이상, 3800 units 이상, 4000units 이상, 4200units 이상, 4400units 이상, 4600units 이상 또는 4800units 이상일 수 있다. 또한, 상기 첨가량은 효소 활성을 기준으로 상기 (2) 단계를 거친 추출물 1g 대비 5000units 이하, 4800units 이하, 4600units 이하, 4400units 이하, 4200units 이하, 4000units 이하, 3800units 이하, 3600units 이하, 3400units 이하, 3200units 이하, 3000units 이하, 2500units 이하 또는 2400units 이하일 수 있다. 바람직하게는 또한, 상기 첨가량은 효소 활성을 기준으로 상기 (2) 단계를 거친 추출물 1g 대비 3500 내지 4200 units일 수 있다.
일 측면에서, 상기 효소 제제 내의 폴리갈락투로나제의 양은 상기 효소 제제 총중량을 기준으로 0.1 중량% 이상, 0.5 중량% 이상, 0.8 중량% 이상, 1 중량% 이상, 1.2 중량% 이상, 1.4 중량% 이상, 1.6 중량% 이상, 1.8 중량% 이상, 2 중량% 이상, 2.2 중량% 이상, 2.6 중량% 이상, 2.8 중량% 이상, 3 중량% 이상, 3.2 중량% 이상, 3.4 중량% 이상, 3.6 중량% 이상, 3.8 중량% 이상, 4 중량% 이상, 4.2 중량% 이상, 4.4 중량% 이상, 4.6 중량% 이상, 4.8 중량% 이상, 5 중량% 이상, 5.2 중량% 이상, 5.4 중량% 이상, 5.6 중량% 이상, 6 중량% 이상, 6.5 중량% 이상 또는 7 중량% 이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 폴리갈락투로나제의 양은 8 중량% 이하, 7.5 중량% 이하, 7중량% 이하, 6.5중량% 이하, 6중량% 이하, 5.8중량% 이하, 5.6중량% 이하, 5.4중량% 이하, 5.2중량% 이하, 5중량% 이하, 4.8중량% 이하, 4.6중량% 이하, 4.4중량% 이하, 4.2중량% 이하, 4중량% 이하, 3.8중량% 이하, 3.6중량% 이하, 3.4중량% 이하, 3.2중량% 이하, 3중량% 이하, 2.8중량% 이하, 2.6중량% 이하, 2.4중량% 이하, 2.2중량% 이하, 2중량% 이하, 1.8중량% 이하, 1.6중량% 이하, 1.4중량% 이하, 1.2중량% 이하, 1중량% 이하, 0.8중량% 이하, 0.6중량% 이하, 0.4중량% 이하 또는 0.2중량% 이하일 수 있다. 상기 효소 제제 내의 폴리갈락투로나제의 바람직한 양은 1 내지 5 중량%일 수 있다.
일 측면에서, 상기 효소 제제의 기능 및 역할은 추출물 내 쿠메스트린으로부터 당을 제거함으로써 쿠메스트린이 쿠메스트롤로 전환될 수 있도록 하는 것이며, 콩과식물 배양근의 품질을 균일하게 유지하며 대량 생산하는 엑스플랜테이션 방법과 이러한 효소 제제의 기술적 특징을 접목함으로써, 쿠메스트롤의 수율이 현저히 향상되면서도 균일하게 유지될 수 있는 것이다.
다른 구현 예로서, (1) 단계의 상기 콩과식물은 콩일 수 있다.
다른 구현 예로서, (1) 단계의 상기 콩과식물은 대두 또는 납작콩일 수 있다.
다른 구현 예로서, (2) 단계의 상기 추출물은 물, C1 내지 C6의 저급 알코올, 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출한 것일 수 있다.
일 측면에서, 상기 혼합물의 알코올 농도는 60 내지 100%(w/v)일 수 있다. 일 측면에서, 상기 알코올 농도는 60%(w/v)이상, 70%(w/v)이상, 75%(w/v)이상, 80%(w/v)이상, 85%(w/v)이상, 90%(w/v)이상, 또는 95%(w/v)이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 알코올 농도는 100%(w/v)이하, 95%(w/v)이하, 90%(w/v)이하, 85%(w/v)이하, 80%(w/v)이하, 75%(w/v)이하, 70%(w/v)이하, 또는 65%(w/v)이하일 수 있다.
다른 측면에서, 상기 저급 알코올은 에탄올일 수 있다.
다른 측면에서, 상기 (2) 단계는 상기 (1) 단계를 거친 배양근을 건조시킨 후 그 건조된 배양근에 상기 용매를 이용하여 추출물을 얻는 단계일 수 있다.
또 다른 측면에서, (2) 단계의 상기 추출물은 상기 배양근을 건조시킨 배양근 : 추출용매의 중량비율을 1:10 내지 1:70으로 하여 추출한 추출물일 수 있다. 상기 중량비율은 1:10이상, 1:15이상, 1:20이상, 1:25이상, 1:30이상, 1:35이상, 1:40이상, 1:45이상, 1:50이상, 1:55이상, 1:60이상 또는 1:65이상일 수 있다. 또한 상기 중량비율은 1:70이하, 1:65이하, 1:60이하, 1:58이하, 1:55이하, 1:52이하, 1:50이하, 1:48이하, 1:45이하, 1:42이하, 1:40이하, 1:38이하, 1:36이하, 1:35이하, 1:30이하, 1:25이하, 1:20이하 또는 1:15이하일 수 있다.
일 구현 예로서, (1) 단계의 상기 생물반응기는 스터드 탱크 리액터(Stirred Tank Reactor), 버블 컬럼 리액터(Bubble Column Reactor), 에어 리프트 리액터(Air Lift Reactor), 플루다이즈드 베드 리액터(Fludized Bed Reactor), 픽스트/팩드 베드 리액터(Fixed/Packed Bed Reactor), 또는 타워 퍼멘터(Tower Fermenter)일 수 있고, 바람직하게는 벌브형 기포 생물반응기(Bulb Type bubble bioreactor)일 수 있다.
다른 구현 예로서, 상기 (1) 단계의 배지는 IBA(indole-3-butyric acid) 및 탄소원이 첨가된 것일 수 있다. 일 측면에서 상기 탄소원은 포도당, 프럭토스, 만노스, 리보스, 아라비노스, 자일로스, 갈락토스, 수크로스, 셀로비오스, 트레할로스, 락토스, 라피노스, 아밀로스, 스타치, 소르비톨, 만니톨, 및 글리세롤로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
일 구현 예로서, 상기 (1) 단계의 배지는 질산암모늄(NH4NO3)의 농도가 650 mg/l 이상, 660 mg/l 이상, 700mg/l 이상, 740mg/l 이상, 760mg/l 이상, 800mg/l 이상, 825mg/l 이상, 850mg/l 이상, 900mg/l 이상, 1000mg/l 이상, 1200mg/l 이상 또는 1400mg/l 이상일 수 있다. 다른 구현 예로서, 상기 질산암모늄의 농도는 1500mg/l 이하, 1400mg/l 이하, 1200mg/l 이하, 1000mg/l 이하, 990mg/l 이하, 900mg/l 이하, 850mg/l 이하, 825mg/l 이하, 800mg/l 이하, 760mg/l 이하, 740mg/l 이하, 700mg/l 이하 또는 660mg/l 이하일 수 있다.
일 구현 예로서, 상기 (1) 단계의 배지는 염화칼슘(CaCl2·2H2O)의 농도가 175mg/l 이상, 176mg/l 이상, 190mg/l 이상, 200mg/l 이상, 220mg/l 이상, 240mg/l 이상, 260mg/l 이상, 264mg/l 이상, 270mg/l 이상, 280mg/l 이상, 300mg/l 이상, 350mg/l 이상 또는 380mg/l 이상일 수 있다. 다른 구현 예로서, 상기 염화칼슘의 농도는 400mg/l 이하, 380mg/l 이하, 350mg/l 이하, 300mg/l 이하, 280mg/l 이하, 270mg/l 이하, 264mg/l 이하, 260mg/l 이하, 240mg/l 이하, 220mg/l 이하, 200mg/l 이하, 190mg/l 이하 또는 176mg/l 이하일 수 있다.
일 구현 예로서, 상기 (1) 단계의 배지는 황산마그네슘(MgSO4·7H2O)의 농도가 145mg/l 이상, 148mg/l 이상, 150mg/l 이상, 160mg/l 이상, 180mg/l 이상, 185mg/l 이상, 190mg/l 이상, 200mg/l 이상, 215mg/l 이상, 222mg/l 이상, 240mg/l 이상, 280mg/l 이상 또는 300mg/l 이상일 수 있다. 다른 구현 예로서, 상기 황산마그네슘의 농도는 320mg/l 이하, 300mg/l 이하, 280mg/l 이하, 240mg/l 이하, 222mg/l 이하, 215mg/l 이하, 200mg/l 이하, 190mg/l 이하, 185mg/l 이하, 180mg/l 이하, 160mg/l 이하, 150mg/l 이하 또는 148mg/l 이하일 수 있다.
일 구현 예로서, 상기 (1) 단계의 배지는 인산칼륨(KH2PO4)의 농도가 65 mg/l 이상, 68mg/l 이상, 70mg/l 이상, 75mg/l 이상, 80mg/l 이상, 85mg/l 이상, 90mg/l 이상, 95mg/l 이상, 100mg/l 이상, 102mg/l 이상, 120mg/l 이상 또는 140mg/l 이상일 수 있다. 다른 구현 예로서, 상기 인산칼륨의 농도는 150　mg/l 이하, 140mg/l 이하, 120mg/l 이하, 110mg/l 이하, 102mg/l 이하, 100mg/l 이하, 95mg/l 이하, 90mg/l 이하, 85mg/l 이하, 80mg/l 이하, 75mg/l 이하, 70mg/l 이하 또는 68mg/l 이하일 수 있다.
일 구현 예로서, 상기 (1) 단계의 배지는 질산칼륨(KNO3)의 농도가 750mg/l 이상, 760mg/l 이상, 800mg/l 이상, 850mg/l 이상, 900mg/l 이상, 950mg/l 이상, 1000mg/l 이상, 1140mg/l 이상, 120mg/l 이상 또는 1400mg/l 이상일 수 있다. 다른 구현 예로서 상기 질산칼륨은 1500mg/l 이하, 1400mg/l 이하, 1300mg/l 이하, 1140mg/l 이하, 1000mg/l 이하, 980mg/l 이하, 950mg/l 이하, 900mg/l 이하, 850mg/l 이하, 800mg/l 이하 또는 760mg/l 이하일 수 있다.
다른 구현 예로서, 상기 (1) 단계의 배지는 무라시게/스쿡(Murashige and Skoog) 배지일 수 있다.
일 측면에서, 상기 (1) 단계의 배지 내 성분의 종류는 무라시게/스쿡(Murashige and Skoog) 배지 내 성분의 종류와 동일하고, 상기 성분의 농도는 무라시게/스쿡 배지 내 성분 농도의 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 또는 58% 이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 (1) 단계의 배지 내 성분의 농도는 무라시게/스쿡 배지 내 성분 농도의 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하 또는 45% 이하일 수 있다.
다른 구현 예로서, 상기 (1) 단계에서 상기 배양근을 배지에 위치시킬 때의 배지 pH는 4.8 내지 6.8일 수 있다. 일 측면에서 상기 pH는 4.8이상, 5이상, 5.2이상, 5.4이상, 5.6이상, 5.8이상, 6.0이상, 6.2이상, 6.4이상, 또는 6.6이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 pH는 6.8이하, 6.6이하, 6.4이하, 6.2이하, 6.0이하, 5.8이하, 5.6이하, 5.4이하, 5.2이하, 5.0이하일 수 있다.
다른 구현 예로서, 상기 (1) 단계에서 상기 배양근을 배지에 위치시킬 때 밀도는 2 내지 6 g/L일 수 있다. 일 측면에서 상기 밀도는 2g/L이상, 3g/L이상, 4g/L이상, 또는 5g/L이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 밀도는 6g/L이하, 5g/L이하, 4g/L이하, 또는 3g/L이하일 수 있다.
다른 구현 예로서, 상기 (1) 단계의 증식은 암조건에서 실시하는 것일 수 있다.
다른 구현 예로서, 상기 (1) 단계는 19 내지 25℃에서 실시하는 것일 수 있다. 일 측면에서 상기 온도는 19℃이상, 20℃이상, 21℃이상, 22℃이상, 23℃이상, 또는 24℃이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 온도는 25℃이하, 24℃이하, 23℃이하, 22℃이하, 21℃이하, 또는 20℃이하일 수 있다.
또 다른 구현 예로서, 상기 (1) 단계의 공기공급량은 0.05 내지 0.4 vvm(air volume/culture volume per min)일 수 있다. 일 구현 예로서 상기 공기공급량은 0.05vvm이상, 0.08vvm이상, 0.1vvm이상, 0.12vvm이상, 0.14vvm이상, 0.16vvm이상, 0.18vvm이상, 0.2vvm이상, 0.22vvm이상, 0.24vvm이상, 0.26vvm이상, 0.28vvm이상, 0.3vvm이상, 0.32vvm이상, 0.34vvm이상, 0.36vvm이상, 또는 0.38vvm이상 일 수 있다. 다른 구현 예로서 상기 공기공급량은 0.4vvm이하, 0.38vvm이하, 0.36vvm이하, 0.34vvm이하, 0.32vvm이하, 0.3vvm이하, 0.28vvm이하, 0.26vvm이하, 0.24vvm이하, 0.22vvm이하, 0.2vvm이하, 0.18vvm이하, 0.16vvm이하, 0.14vvm이하, 0.12vvm이하, 0.1vvm이하, 0.08vvm이하, 또는 0.06vvm이하일 수 있다.
다른 구현 예로서, 상기 (1) 단계의 증식은 2 내지 5주간 실시하는 것일 수 있다. 일 측면에서 상기 (1) 단계의 증식은 2주 이상, 3주 이상 또는 4주 이상 실시하는 것일 수 있다. 다른 측면에서 상기 (1) 단계의 증식은 5주 이하, 4주 이하 또는 3주 이하 실시하는 것일 수 있다.
다른 구현 예로서, 상기 (2) 단계의 추출 시간은 20 내지 28시간일 수 있다. 일 측면에서 상기 추출 시간은 20시간 이상, 22시간 이상, 24시간 이상, 25시간 이상, 또는 26시간 이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 추출 시간은 28시간 이하, 26시간 이하, 25시간 이하, 24시간 이하, 22시간 이하, 또는 21시간 이하일 수 있다.
또 다른 구현 예로서, 상기 방법은 상기 (3) 단계의 결과물에 증류수를 가하여 상기 결과물의 농도가 0.5중량%이상, 1중량%이상, 1.5중량%이상, 2 중량%이상, 2.5중량%이상, 3중량%이상, 5중량%이상 또는 8중량%이상인 반응물을 제조하는 (4) 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 일 측면에서 상기 농도는 10중량% 이하, 8중량% 이하, 5중량% 이하, 3중량% 이하, 2.5중량% 이하, 2중량% 이하, 1.5중량% 이하, 1중량% 이하 또는 0.8중량% 이하일 수 있다.
또 다른 구현 예로서, 상기 (3) 단계 또는 (4) 단계 이후에 40 내지 50도씨 및 60 내지 100 rpm의 조건에서 38 내지 58시간 동안 유지 후 원심분리하여 침전물을 회수하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 일 측면에서, 상기 온도는 40도씨 이상, 42도씨 이상, 44도씨 이상, 46도씨 이상 또는 48도씨 이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 온도는 50도씨 이하, 48도씨 이하, 46도씨 이하, 44도씨 이하 또는 42도씨 이하일 수 있다. 일 측면에서 상기 rpm은 60이상, 70이상, 80이상, 90이상 또는 95이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 rpm은 100이하, 95이하, 90이하, 85이하, 80이하, 75이하, 70이하 또는 65이하일 수 있다. 일 측면에서 상기 시간은 38시간 이상, 40시간 이상, 42시간 이상, 44시간 이상, 46시간 이상, 48시간 이상, 50시간 이상, 52시간 이상, 54시간 이상 또는 56시간 이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 시간은 58시간 이하, 56시간 이하, 54시간 이하, 52시간 이하, 50시간 이하, 48시간 이하, 46시간 이하, 44시간 이하, 42시간 이하 또는 40시간 이하일 수 있다.
상기 방법을 이용하여 성장촉진제나 비료, 농약 등의 사용 없이 친환경적이고도 균일하게 콩과식물 배양조직을 대량으로 수득하여, 친환경적이고도 균일한 효과를 발휘하는 상기 추출물 및 조성물을 대량으로 제조할 수 있다.
다른 구현 예로서, 상기 침전물 내 쿠메스트롤의 함량은 침전물 1g 대비 100 mg 이상일 수 있다. 일 측면에서, 상기 함량은 상기 침전물 1g 대비 100 mg 이상, 110mg 이상, 120mg 이상, 130mg 이상, 140mg 이상, 142mg 이상, 143mg 이상, 144mg 이상, 144.27mg 이상, 145mg 이상, 145.5mg 이상, 146mg 이상, 146.4mg 이상, 147mg 이상, 147.5mg 이상, 148mg 이상, 148.5mg 이상, 148.53mg 이상, 149mg 이상, 150mg 이상, 155mg 이상, 160mg 이상, 또는 170mg 이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 함량은 상기 침전물 1g 대비 180 mg 이하, 170mg 이하, 160mg 이하, 155mg 이하, 150mg 이하, 149mg 이하, 148.6mg 이하, 148.53mg 이하, 148.5mg 이하, 148mg 이하, 147.5mg 이하, 147mg 이하, 146.4mg 이하, 146mg 이하, 145.5mg 이하, 145mg 이하, 144.5mg 이하, 144.27mg 이하, 144mg 이하, 143mg 이하, 142mg 이하, 140mg 이하, 130mg 이하, 120mg 이하 또는 110mg 이하일 수 있다. 예시적으로 바람직한 상기 함량은 상기 침전물 1g 대비 140 내지 150 mg일 수 있다. 상기 함량은 노지에서 재배한 일반 콩뿌리 추출물에 효소 제제 처리를 하지 않은 경우(추출물 1g 당 1.7 내지 1.9 mg 이하)에 비해, 약 100배에 가깝도록 현저하게 증가된 함량이다. 또한, 통상의 무라시게/스쿡 배지를 사용한 경우보다 약 3배 이상 높은 함량이기도 하다.
이하, 실시예 등을 들어 본 발명 일측면의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 등은 본 발명의 일 측면에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1] 콩 종자발아 및 기내 식물체 유도
콩 종자(Glycine max, 바람직하게는 신화콩 품종) 및 납작콩 각각을 2중량% 차아염소산나트륨(Sodium Hypochlorite) 수용액으로 20분간 표면을 살균한 뒤 멸균수로 3회 세척하였다. 그 후 콩 종류별로 각각 수크로스 30g/L가 첨가된 0.5 ~ 1.0 MS 배지(Murashige and Skoog Medium, Haarlem, 네덜란드)을 이용하여 기내에서 25±1℃가 유지되는 명조건으로 2주간 식물체의 발아를 유도하였다.
[실시예 2] 콩 배양근 유도 및 증식
기내에서 발아된 식물체의 유근으로부터 배양근을 유도한 뒤, 공기용적이 3L인 벌브형(Bulb Type) 생물반응기(시중에서 일반적으로 입수 가능, 도 1 참조) 내에서 IBA(indole-3-butyric acid, Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, 독일) 4mg/L, 수크로스 30g/L가 첨가된 2L의 0.5 MS 배지(Murashige and Skoog medium, Duchefa, 네덜란드)를 이용하여 배양근을 4주간 증식시켰다. 또한, 상기와 같은 조건으로 및 1.0 MS 배지를 이용하여 배양근을 4주간 증식시켰다. 상기 0.5 MS 배지는 배지에 사용되는 무기질 등 원료의 농도를 통상의 MS 배지의 1/2로 하여 제조한 배지이고, 1.0 MS 배지는 상기 원료의 농도가 통상의 MS 배지와 같은 배지를 말한다. 배지는 1N NaOH를 이용하여 pH 5.8로 조정 후 121℃, 1.2기압에서 35분간 멸균한 것을 사용하였다. 상기 배양근은 1-1.5cm로 절단하여 생체중을 기준으로 4g/L 접종밀도로 상기 배지에 접종한 후 22±1℃가 유지되는 암조건에서 배양하였다. 이러한 과정에서, 농약, 비료 등은 일체 사용하지 않았다. 공기공급량은 배양 전 기간 동안 에어플로우 미터(air flow meters, RMA series; Dwyer Instruments, Inc., 미국)를 이용하여 0.1vvm(air volume/culture volume per min)으로 일정하게 조절하였으며, 생물반응기 내부로 공급하는 공기는 일정한 온도 유지를 위하여 압축공기를 응축시킬 수 있는 공기응축기와 불순물을 제거할 수 있는 필터 및 공기 건조기 등을 순차적으로 통과시킨 후 기름을 사용하지 않는 공기 압축기를 이용하여 생물반응기 내부로 공급하였다.
상기와 같은 생물반응기 등을 사용할 경우의 콩 배양근이 증식하는 모습은 도 1과 같고, 이 경우 노지나 야외에서 재배한 통상의 콩(종자, 식물체 유래) 추출물과는 달리, 연중 균일한 품질의 콩 배양근 추출물을 생산할 수 있음을 성분 분석 등을 통해 확인하였다
[실시예 3] 추출물 제조 및 효소 처리
　　1. 추출물 제조
상기 실시예 1 및 2에 따라 수득하여 건조시킨 콩 배양근을 80%(w/v) 에탄올 수용액에 배양근 : 에탄올 수용액 중량비율이 1:30 내지 1:50(바람직하게는 1:30)이 되도록 침지하여 상온에서 24시간 추출하였다. 추출액은 여과지를 이용하여 여과한 다음 용매를 증발 건조시켜 분말(추출물)을 수득하였다. 또한, 반복 추출 실험을 통해, 상기 실시예 1을 통해 생산된 배양근을 이용하여 추출물을 제조할 경우 추출물 내 성분들이 균일하게 유지됨을 확인할 수 있었고, 계대배양 등을 접목한 상기 추출물 제조방식으로 대량 양산이 가능함을 확인하였다.
2. 효소 처리
상기와 같은 방법으로, 수득한 콩 배양근 추출물 분말과 같은 중량의 액상 펙티나아제(pectinase) 효소 제제(pectinex ultra SP-L, 노보자임, 덴마크)를 상기 추출물 분말에 처리 후, 증류수를 이용하여 2중량% 농도(효소제제와 추출물 분말의 혼합물 2 중량% 및 증류수 98 중량%)로 반응물을 제조하였다(상기 효소 제제는 펙티나아제로서 폴리갈락투로나제를 1 내지 5 중량% 포함하는 것이고, 효소 활성 기준으로 폴리갈락투로나제를 3800 units/ml 이상 포함하는 것이다). 상기 반응물은　45℃, 80rpm 조건에서 48시간 유지(반응)시킨 후 원심분리기를 이용하여 침전물을 회수하였다. 회수한 침전물은 동결 건조시켜 분말화하였다.
[실험예 1] 쿠메스트롤 분석
콩 배양근 추출물 내 쿠메스트롤 함량은 효소 반응 전(상기 실시예 3의 1.의 추출물), 후(상기 실시예 3의 2.의 침전물) 추출물을 0.45μm Filter로 여과한 다음 UV Detector가 장착된 High Performance Liquid Chromatography(HPLC)에 10μL씩 주입하며 분석하였다. 컬럼은 Mightysil RP-18 GP 250-4.6 (5 μm, KANTO CHEMICALS, JAPAN)을 사용하였으며, 추출물 내 쿠메스트롤 함량은 342nm 파장에서 측정하였다.
하기 표 1은 효소 반응 전후의 콩 배양근 추출물 내 쿠메스트롤 함량을 비교한 것이다. 표 1에서 수율이라 함은 콩 배양근 투입 중량 대비 상기 실험예 3의 1.에 의한 추출물의 중량, 그리고 콩 배양근 투입 중량 대비 상기 실험예 3의 2.에 의한 침전물의 중량을 각각 백분율(%)로 나타낸 것이다.
Samples 효소 반응 전 효소 반응 후
수율(%) Coumestrol(mg/g extract) 수율(%) Coumestrol(mg/g extract)
0.5 MS 33.7±0.04 1.8±0.10 5.6±0.20 146.4±2.13
1.0 MS 35.6±0.33 1.0±0.07 3.4±0.04 51.0±0.79
(상기 표 1에서 MS는 무라시게/스쿡 배지의 약자이고, 상기 0.5 MS 배지는 배지에 사용되는 무기질 등 원료의 농도를 통상의 MS 배지의 1/2로 하여 제조한 배지이고, 1.0 MS 배지는 상기 원료의 농도가 통상의 MS 배지와 같은 배지를 말한다)
또한, 도 2a 및 도 2b는 효소 반응 전후의 콩 배양근 추출물 내 쿠메스트린과 쿠메스트롤에 대해 HPLC 크로마토그램으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
상기 표 1, 도 2a 및 도 2b로부터, 효소 처리에 의해 추출물 내 쿠메스트린의 당이 제거되어 쿠메스트롤로 전환됨을 알 수 있고, 쿠메스트롤로 변환되는 양이 기존의 방법에 의한 양보다 현저하게 증가하였음을 확인하였다. 아울러, 생물반응기 등을 사용할 경우, 노지나 야외에서 재배한 통상의 콩(종자, 식물체 유래) 추출물과는 달리, 연중 균일한 품질의 콩 배양근 추출물을 생산할 수 있으므로, 그러한 엑스플랜테이션 기술을 효소 반응과 접목시키면, 이러한 고함량의 쿠메스트롤을 균일하고도 지속적으로 생산할 수 있음을 알 수 있다.

Claims (25)

  1. (1) 콩과식물 배양근을 생물반응기 내의 배지에 위치시켜 상기 생물반응기 내에서 공기공급량을 일정하게 유지하며 증식시키는 단계;
    (2) 상기 (1) 단계를 거친 배양근으로부터 추출물을 얻는 단계; 및
    (3) 상기 추출물에 효소 또는 이를 생산하는 미생물을 첨가하는 단계
    를 포함하는, 쿠메스트롤 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, (3) 단계의 상기 효소는 펙티나아제(pectinase)인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  3. 제1항에 있어서, (3) 단계의 상기 효소는 폴리갈락투로나제(Polygalacturonase)인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  4. 제1항에 있어서, (3) 단계의 상기 미생물은 아스퍼질러스 아큘레아투스(Aspergillus aculeatus)인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  5. 제1항에 있어서, (3) 단계의 상기 효소의 첨가량은 상기 (2) 단계를 거친 추출물 100중량부 대비 0.8 내지 8중량부인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  6. 제1항에 있어서, (3) 단계의 상기 효소의 첨가량은 효소 활성을 기준으로 상기 (2) 단계를 거친 추출물 1g 대비 2000 내지 5000 units인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  7. 제1항에 있어서, (1) 단계의 상기 콩과식물은 콩인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  8. 제1항에 있어서, (1) 단계의 상기 콩과식물은 대두 또는 납작콩인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  9. 제1항에 있어서, (2) 단계의 상기 추출물은 물, C1 내지 C6의 저급 알코올, 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출한 것인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 혼합물의 알코올 농도는 60 내지 100%(w/v)인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 저급 알코올은 에탄올인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  12. 제1항에 있어서, (1) 단계의 상기 생물반응기는 벌브형 기포 생물반응기(Bulb Type bubble bioreactor)인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계의 배지 내 질산암모늄(NH4NO3)의 농도는 650 내지 1500 mg/l 이고, 염화칼슘(CaCl2·2H2O)의 농도는 175 내지 400 mg/l 이며, 황산마그네슘(MgSO4·7H2O)의 농도는 145 내지 320 mg/l 이고, 인산칼륨(KH2PO4)의 농도는 65 내지 150 mg/l 이며, 질산칼륨(KNO3)의 농도는 750 내지 1500 mg/l 인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계의 배지는 IBA(indole-3-butyric acid) 및 탄소원이 첨가된 것인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계의 배지는 무라시게/스쿡(Murashige and Skoog) 배지인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계의 배지 내 성분의 종류는 무라시게/스쿡(Murashige and Skoog) 배지 내 성분의 종류와 동일하고, 상기 성분의 농도는 무라시게/스쿡 배지 내 성분 농도의 40 내지 60%인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계에서 상기 배양근을 배지에 위치시킬 때의 배지 pH는 4.8 내지 6.8인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계에서 상기 배양근을 배지에 위치시킬 때 밀도는 2 내지 6 g/L인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계의 증식은 암조건에서 실시하는 것인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계는 19 내지 25℃에서 실시하는 것인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계의 공기공급량은 0.05 내지 0.4 vvm(air volume/culture volume per min)인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계의 증식은 3 내지 5주간 실시하는 것인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 (2) 단계의 추출 시간은 20 내지 28시간인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 (3) 단계 이후에 40 내지 50도씨 및 60 내지 100 rpm의 조건에서 38 내지 58시간 동안 유지 후 원심분리하여 침전물을 회수하는 단계를 더 포함하는, 쿠메스트롤 생산 방법.
  25. 제1항의 단계 (1) 내지 단계 (3)을 포함하는, 쿠메스트롤 함량이 증진된 콩과식물 추출물의 제조방법.
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