WO2018012827A1 - 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과식물 배양근의 배양 방법 - Google Patents

쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과식물 배양근의 배양 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2018012827A1
WO2018012827A1 PCT/KR2017/007356 KR2017007356W WO2018012827A1 WO 2018012827 A1 WO2018012827 A1 WO 2018012827A1 KR 2017007356 W KR2017007356 W KR 2017007356W WO 2018012827 A1 WO2018012827 A1 WO 2018012827A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
culture
culture medium
medium
root
concentration
Prior art date
Application number
PCT/KR2017/007356
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이은정
강영규
박준성
박소영
김영은
Original Assignee
(주)아모레퍼시픽
충북대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020170082586A external-priority patent/KR102287587B1/ko
Application filed by (주)아모레퍼시픽, 충북대학교 산학협력단 filed Critical (주)아모레퍼시픽
Priority to EP17827898.2A priority Critical patent/EP3485726A4/en
Priority to US16/317,414 priority patent/US20190289805A1/en
Priority to CN201780056761.0A priority patent/CN109714953A/zh
Publication of WO2018012827A1 publication Critical patent/WO2018012827A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues

Definitions

  • the present specification relates to a cultivation method of legumes culture root with increased cumestrol content and a legumes culture root with increased cumestrol content prepared by the culturing method.
  • Coumestrol is one of the most powerful phytoestrogens known to date and is found mainly in the seeds, roots and leaves of legumes, compositae plants, and isoflavonoids. In general, it is classified as a comumestan-based compound.
  • Kumestrol is a substance that has been noticed when it is known to play a role in preventing infection by antibacterial, antifungal and antiviral activity through antioxidation, anti-inflammatory and anti-toxin action by secreting a dark concentration at the wound site when the plant is injured. . This is because various bacterial, fungal and viral infections induce the synthesis of various aromatic compounds, including cumestrol.
  • cumestrol The origin of the antibiotic action of cumestrol is known to have a phenolic structure, which is a chemical basic skeleton as an antioxidant, to inhibit free radicals oxidizing agent to inhibit the production of peroxide compounds in vivo. .
  • cumestrol is known to have an estrogen effect. Experiments on the effects of estrogen were assessed based on weight changes in the uterus after oral administration to immature rats. Notable from these experiments, cumestrol was effective in young females, but was not active in mature male animals and was not toxic.
  • the inventors of the present invention have led to the present invention by studying a method for mass production of cumestrol naturally.
  • the inventors of the present invention have led to the present invention by studying the cultivation method of legumes culture roots with increased cumestrol content and the legumes culture roots with increased cumestrol content.
  • One aspect of the present invention is to provide a method for culturing legume culture root with increased cumestrol content.
  • One aspect of the present invention is to provide a method for culturing legume culture roots with increased cumetrol content, which enables uniform cumetrol production throughout the year.
  • One aspect of the present invention is to provide a method for culturing legume culture roots with increased cumestrol content capable of mass production of cumestrol.
  • Another aspect of the present invention is to provide a legume culture root with increased cumestrol content.
  • One aspect of the present invention provides a method for culturing legume culture roots with increased cumestrol content, comprising the following steps:
  • the culture medium is NH 4 NO 3, CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O and KH 2 PO 4, The method of culture medium containing nutrients of KNO 3.
  • the concentration of NH 4 NO 3 of the culture medium is 1,500 to 2,000 mg / L
  • the concentration of CaCl 2 ⁇ 2H 2 O is 300 to 500 mg / L
  • the concentration of O is 300 to 500 mg / L
  • the concentration of KH 2 PO 4 is 100 to 200 mg / L
  • the concentration of KNO 3 may be 1,700 to 2,100 mg / L.
  • the culture medium may be MS medium (Murashige and Skoog medium).
  • the legume in the step (a) is a soybean (Phynchosia nulubilis Loureiro), Glycine max Merr., Glycine Max Merr. And Glycine gracillis It is a method which is more than one.
  • the culture medium in step (a) is a culture medium containing 10-100 g / L sucrose, based on the total volume of the medium.
  • the culture medium in step (b) comprises at least one of IBA (Indole Butyric Acid) and NAA (Naphthalene Acetic Acid) of 0.1 to 10 mg / L based on the total volume of the culture medium ,
  • the culture medium is a method containing 10-100g / L sucrose, based on the total volume of the culture medium.
  • the culture medium in the step (b) is IBA (Indole Butyric Acid) is a method containing 2 to 8 mg / L based on the total volume of the culture medium.
  • IBA Indole Butyric Acid
  • the leguminous plant in step (a) is any one or more of mythological beans and flat beans
  • the induced site in step (b) is any one or more of embryonic axis and roots
  • the culture medium in step (b) is IBA (Indole Butyric Acid) is a method, containing 3 to 5 mg / L based on the total volume of the culture medium.
  • the culture medium in step (c) is IBA (Indole Butyric Acid) is a medium containing 3 to 5 mg / L and 10-100 g / L sucrose based on the total volume of the culture medium, Way.
  • IBA Indole Butyric Acid
  • the culture medium in step (c) is 0.5-1.5 MS medium, a medium containing 30-60 g / L sucrose, the method.
  • Another aspect of the present invention provides a legume culture root having an increased cumestrol content prepared by any one of the above methods.
  • Culture method according to an aspect of the present invention is capable of producing a large amount of cumestrol.
  • the culture method according to an aspect of the present invention is capable of producing uniform cumestrol throughout the year.
  • Culture method according to an aspect of the present invention is capable of producing a large amount of cumestrol in a short time.
  • Legume culture root according to another aspect of the present invention has an increased cumestrol content.
  • Legume culture root according to another aspect of the present invention shows a uniform amount of cumestrol content.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of inducing germination and in-flight plants of soybean seed according to Preparation Example 1-1.
  • 2 to 3 shows the induction pattern after two weeks of culture according to the type of soybean, preparation site of the in-flight plant according to Preparation Example 1-2, type and concentration of auxin.
  • 4 and 5 are the results of the growth pattern of the soybean culture root according to the type and induction site of soybean according to Experimental Example 1 and the results of the analysis of the cumestrol content in the soybean culture root.
  • Figure 6 is the result of measuring the optimal cumestrol growth medium composition in the growth stage of the culture root in Preparation Example 1-3 by the DOE technique.
  • Kumestrol changes in the content of soybean plants according to the change of the external natural environment, and the content difference is large according to the same genus / species / varieties.
  • cumestrol by using the legume culture root derived from the cultivation method of the present invention, it is possible to produce the raw material uniformly throughout the year, and to mass-produce in-flight cumetrol by controlling the incubation process.
  • One aspect of the present invention provides a method for culturing legume culture roots with increased cumestrol content, comprising the following steps:
  • the culture medium is a medium containing nutrients of NH 4 NO 3 , CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, and KH 2 PO 4 , KNO 3 .
  • legumes capable of producing cumestrol may be used.
  • Seeds of legumes herein are seeds (seeds) derived from legumes.
  • the seed of the legume may be “bean”.
  • the legume in the step (a) is a soybean (Phynchosia nulubilis Loureiro), Glycine max Merr., Glycine Max Merr. And Glycine gracillis It may be any one or more.
  • a method for culturing legumes of legumes is aseptic using a culture medium containing nutrients in-vitro by extracting any one or more of specific cells, tissues, and organs of legumes. It is a technology that regenerates callus or single cell populations into organic or fully functional plants by culturing.
  • the method of culturing the plant or legume culture root as described above may also be referred to as plant or legume plant explantation, tissue culture, in-flight culture, aseptic culture or plant stem cell culture.
  • the concentration of NH 4 NO 3 of the culture medium is 1,500 to 2,000 mg / L
  • the concentration of CaCl 2 ⁇ 2H 2 O is 300 to 500 mg / L
  • the MgSO 4 ⁇ 7H 2 the concentration of O is 300 to 500 mg / L
  • the concentration of KH 2 PO 4 is from 100 to 200 mg / L
  • the concentration of the KNO 3 may be 17 to 2,100mg / L.
  • the culture medium may be MS medium (Murashige and Skoog medium).
  • the culture medium may be MS medium (Murashige and Skoog medium). Specifically, depending on the concentration of the inorganic material in the medium, 1 / 4MS medium, 1 / 2MS medium, 3 / 4MS medium, 1MS medium, 3/2 MS medium or 2MS medium can be used.
  • the culture medium in step (a) is a culture medium containing 10-100 g / L sucrose, based on the total volume of the medium.
  • the concentration of sucrose is 10 g / L or more, 20 g / L or more, 21 g / L or more, 22 g / L or more, 23 g / L or more, 24 g / L or more, 25 g / L or more, 26 g / L or more, 27 g / L or more, 28 g / L or more, 29 g / L or more, or 30 g / L or more.
  • the concentration of sucrose is 100g / L or less, 80g / L or less, 60g / L or less, 50g / L or less, 40g / L or less, 39g / L or less, 38g / L or less, based on the total volume of the culture medium 37 g / L or less, 36 g / L or less, 35 g / L or less, 34 g / L or less, 33 g / L or less, 32 g / L or less, 31 g / L or less or 30 g / L or less.
  • step (a) when the concentration of sucrose is in the above range, the induction rate of the plant in the cabin is excellent.
  • the step of inducing the in-vehicle plant of step (a) may be induced until the cotyledon, hypocotyl and roots are generated in the seed.
  • In-flight plant induction of the above step (a) can be induced for 1 to 25 days.
  • in-flight plant induction of step (a) is at least 1 day, at least 1.5 days, at least 2 days, at least 2.5 days, at least 7 days, at least 8 days, at least 9 days, at least 10 days, at least 11 days, 12 days. At least 13 days, at least 14 days, or at least 15 days. It may also be up to 25 days, up to 24 days, up to 23 days, up to 22 days, up to 21 days, up to 20 days, up to 19 days, up to 18 days, up to 17 days or up to 16 days.
  • in-vehicle plant induction of step (a) may be induced until the length of the in-flight plant is 8 to 15 cm in length.
  • the “length of in-plant plants” is a straight length from the end of cotyledon to the end of roots. Specifically, 8 cm or more, 9 cm or more, 10 cm or more, or 11 cm or more, and 15 cm or less, 14 cm or less, or 13 cm or less.
  • in-vehicle plant induction of step (a) can be induced in bright conditions.
  • the culture medium in step (b) comprises at least one of IBA (Indole Butyric Acid) and NAA (Naphthalene Acetic Acid) of 0.1 to 10 mg / L based on the total volume of the culture medium ,
  • the culture medium is a method containing 10-100g / L sucrose, based on the total volume of the culture medium.
  • the concentration of IBA or NAA is 0.1 mg / L or more, 0.5 mg / L or more, 1 mg / L or more, 2 mg / L or more, 3 mg / L or more, 3.5 mg / L or more, 3.6 mg / L or more, 3.7 mg / L Or more, 3.8 mg / L or more, 3.9 mg / L or more, 4 mg / L or more, or 5 mg / L or more.
  • the concentration of the IBA or NAA is 10 mg / L or less, 9 mg / L or less, 8 mg / L or less, 7 mg / L or less, 6 mg / L or less, 5 mg / L or less, 4.5 mg / L or less, It may be up to 4.3 mg / L, up to 4.1 mg / L, up to 3.5 mg / L or up to 3 mg / L.
  • the culture medium in the step (b) is IBA (Indole Butyric Acid) is a method containing 2 to 8 mg / L based on the total volume of the culture medium. Specifically, 2 mg / L or more, 3 mg / L or more, 3.6 mg / L or more, 3.7 mg / L or more, 3.8 mg / L or more, 3.9 mg / L or more based on the total volume of the culture medium of IBA (Indole Butyric Acid) , 4 mg / L or more, or 5 mg / L or more, and also, 8 mg / L or less, 7 mg / L or less, 6 mg / L or less, 5 mg / L or less, 4.5 mg / L or less, 4.3 mg / L L or less, 4.1 mg / L or less, 3.5 mg / L or less, or 3 mg / L or less.
  • IBA Indole Butyric Acid
  • the leguminous plant in step (a) is any one or more of mythological beans and flat beans
  • the induced site in step (b) is any one or more of embryonic axis and roots
  • the culture medium in step (b) is IBA (Indole Butyric Acid) is a method, containing 3 to 5 mg / L based on the total volume of the culture medium.
  • the culture medium in step (c) is IBA (Indole Butyric Acid) is a medium containing 3 to 5 mg / L and 10-100 g / L sucrose based on the total volume of the culture medium, It is a way.
  • IBA Indole Butyric Acid
  • the culture medium in step (c) is 0.5-1.5 MS medium, a medium containing 30-60 g / L sucrose, the method.
  • the concentration of sucrose in step (c) is 10 g / L or more, 20 g / L or more, 21 g / L or more, 22 g / L or more, 23 g / L or more, 24 g based on the total volume of the culture medium / L or more, 25g / L or more, 26g / L or more, 27g / L or more, 28g / L or more, 29g / L or more, or 30g / L or more.
  • the concentration of sucrose is 100g / L or less, 80g / L or less, 60g / L or less, 50g / L or less, 40g / L or less, 39g / L or less, 38g / L or less, based on the total volume of the culture medium 37 g / L or less, 36 g / L or less, 35 g / L or less, 34 g / L or less, 33 g / L or less, 32 g / L or less, 31 g / L or less or 30 g / L or less.
  • step (c) when the concentration of sucrose is within the above range, the growth of the culture root is excellent, and the content of cumestrol in the culture root is enhanced.
  • the culture medium in step (c) may be 0.5 MS medium, 0.6 MS medium, 0.7 MS medium, 0.75 MS medium, 0.8 MS medium, 0.9 MS medium, 1.0 MS medium or 1.5 MS medium depending on the mineral concentration.
  • the MS medium according to the mineral concentration in step (c) is any one or more of the above, the growth of the culture root is excellent, the content of cumestrol in the culture root is enhanced
  • Another aspect of the present invention provides a legume culture root having an increased cumestrol content prepared by any one of the above methods.
  • the content of cumestrol in the culture root is at least 0.001% by weight relative to the total weight of the dried culture root.
  • the content of cumestrol is at least 0.001% by weight, at least 0.002% by weight, at least 0.003% by weight, at least 0.004% by weight, at least 0.005% by weight, at least 0.006% by weight, and at least 0.007% by weight relative to the total weight of the dried culture root.
  • the culture root cultured according to the culture method of legume culture root according to an aspect of the present invention may include 0.01-0.02% by weight of cumestrol relative to the total weight of the dried culture root. .
  • IBA Indole Butyric Acid
  • NAA Naphthalene Acetic Acid
  • Drying productivity of the dried soybean culture root of Preparation Example 1-2 was measured.
  • the measurement result was as shown in FIG.
  • the growth patterns of the soybean culture roots were different according to the types of soybeans and the induction sites. Especially, the myofiform soybean-derived roots increased 12.5 times compared to the initial level after 4 weeks, and the final dry matter yield was 4.1g / L.
  • the dried soybean culture root of Preparation Example 1-2 was immersed in 80% (w / v) ethanol and extracted at room temperature for 24 hours.
  • the extract was filtered using filter paper, the solvent was evaporated to dryness to obtain a powder, and then diluted with a 1% solution to prepare a final extract.
  • the amount of cumestrol in the culture root was analyzed by filtering 2 mL of the extract with a 0.45 ⁇ m filter and injecting 10 ⁇ L into High Performance Liquid Chromatography equipped with a UV detector.
  • the column used Mightysil RP-18 GP 250-4.6 (5 ⁇ m), and the cumestrol content in the extract was measured at 342 nm wavelength.
  • the measurement result was as shown in FIG.
  • the kumestrol content of the culture root of mythical soybean root was 0.18 mg / g DW.
  • the medium composition suitable for the production of cumestrol depends on the medium environment (mineral concentration and sugar concentration).
  • the optimum medium composition was selected according to the DOE technique using the myocartilized root-derived culture root selected as the most suitable soybean culture root for the production of cousstrom, and the culture root was grown in these media.
  • the medium composition optimization experiment was conducted using the Design of Experiments (DOE) technique. Experimental conditions were as follows.
  • the culture roots of Preparation Example 1-2 were grown at intervals of 3-4 weeks using 2 L 1MS medium to which IBA 4 mg / L and sucrose 30 g / L were added to a Bulb Type bioreactor having an air volume of 3 L. Medium was adjusted to pH 5.8 using 1N NaOH and then sterilized for 35 minutes at 121 °C, 1.2 atm. Cultivation was carried out under dark conditions in which the culture root was cut to 1-1.5 cm and inoculated with the culture root at 4 to 5 g / L inoculation density based on the fresh weight.
  • the air supply was regulated to 0.1vvm during the entire incubation period, and the air supplied into the bioreactor includes an air compressor that can condense compressed air, a filter that can remove impurities, and an air dryer to maintain a constant temperature. After passing sequentially, it was fed into the bioreactor by using an oilless air compressor.
  • the content of cumestrol with respect to the dry weight of the propagated soybean culture root was measured at 0.16 mg / g dry weight (0.016 wt%).

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

본 명세서에는 콩과 식물에 극미량 존재하는 쿠메스트롤을 대량으로 생산할 수 있는 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과식물 배양근의 배양 방법에 관한 것으로, 상기 배양 방법은 (a) 콩과 식물 종자를 배양 배지에서 발아시켜 자엽, 배축 및 유근이 생성된 기내 식물체를 유도하는 단계; (b) 상기 유도된 기내 식물체의 자엽, 배축 및 유근 중 어느 하나 이상의 부위를 배양 배지에서 배양하여 부위별 배양근을 유도하는 단계; 및 (c) 상기 유도한 부위별 배양근을 배양배지에서 증식하는 단계; 를 포함하며, 상기 배양 배지는 NH4NO3,CaCl2 ·2H2O,MgSO4 ·7H2O및 KH2PO4,KNO3의 영양성분을 포함하는 배지인, 방법에 관한 것이다.

Description

쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과식물 배양근의 배양 방법
본 명세서는 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과식물 배양근의 배양방법 및 상기 배양방법으로 제조된 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과식물 배양근에 관한 것이다.
쿠메스트롤(coumestrol)은 식물성 에스트로겐 중에서 현재까지 가장 강력한 것으로 알려져 있는 물질로서 주로 콩과(leguminosae), 국화과(compositae) 식물의 씨앗, 뿌리 그리고 잎에서 발견되는 물질로써 이소플라보노이드(isoflavonoid)의 일종으로 일반적으로는 쿠메스탄(coumestan) 계열 화합물로 분류되고 있다. 쿠메스트롤은 식물이 외상을 입었을 때 상처 부위에서 짙은 농도로 분비되어 항산화, 항염 및 항독소 작용을 통해 항균, 항진균 및 항바이러스 작용을 하여 감염을 방지하는 역할을 하는 것이 알려지면서 주목을 받았던 물질이다. 이러한 현상은 다양한 박테리아 및 곰팡이류, 바이러스 등의 감염이 쿠메스트롤을 포함한 다양한 방향족 화합물(aromatic compounds)의 합성을 유도하기 때문이다. 이러한 쿠메스트롤의 항생 작용의 근원은 항산화제로서의 화학적 기본 골격인 페놀성 구조 를 보유하고 있어 프리 라디칼성(free radicals) 산화제의 유입을 억제하여 생체 내 과산화 화합물 생성을 저지 하기 때문으로 알려지고 있다. 또한 다양한 천연 쿠메스탄 계열의 유도체들 중에서 오직 쿠메스트롤만이 에스트로겐 효과를 갖고 있는 것으로 알려지고 있다. 에스트로겐 효과에 대한 실험은 미숙한 쥐에게 경구 투여한 후 자궁의 무게 변화에 기초하여 평가되었다. 이러한 실험 결과에서 특기할 만한 사항으로 쿠메스트롤은 어린 암쥐에서는 효과적으로 에스트로겐 효과가 나타났지만 성숙한 수컷 동물들에게는 활성을 나타내지 않았으며 독성이 전혀 없는 것으로 나타났다.
그러나, 쿠메스트롤은 콩과 식물에 극미량으로 존재하므로 현재 상용되는 천연 쿠메스트롤은 고가로 시판되고 있다. 이러한 이유로 합성을 통해 쿠메스트롤을 얻으려는 연구가 간헐적으로 시도되어 왔으나 여러 개의 방향족 고리가 융합되어 있는 다소 복잡한 화학 구조 때문에 손쉬운 합성법 개발에 대한 접근법이 소개되지 않고 있으며, 비록 몇 가지의 합성법이 보고되고 있으나 각 합성법들은 다양한 문제점을 내포하고 있어 상용화에 많은 어려움이 따르고 있다. 또한 최근에 화학적 합성법에 의해 생산한 성분 보다는 천연에서 생산한 성분이 안전성 측면 에서 좋은 이미지를 가지고 있기 때문에 천연에서 대량으로 생산 할 수 있는 방법에 대해서도 진행 중에 있다.
이에 본 발명의 발명자들은 천연으로 쿠메스트롤을 대량생산할 수 있는 방법을 연구하여 본 발명에 이르게 되었다.
상기와 같은 문제점에 착안하여, 본 발명의 발명자들은 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과식물 배양근의 배양 방법 및 이에 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과식물 배양근을 연구하여 본 발명에 이르게 되었다.
본 발명의 일측면은, 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과식물 배양근의 배양 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일측면은, 연중 균일한 쿠메스트롤 생산이 가능한 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과식물 배양근의 배양 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일측면은, 쿠메스트롤의 대량 생산이 가능한 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과식물 배양근의 배양 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 측면은, 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과식물 배양근을 제공하고자 한다.
본 발명의 일측면은, 하기 단계를 포함하는 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과식물 배양근의 배양 방법을 제공한다:
(a) 콩과 식물 종자를 배양 배지에서 발아시켜 자엽, 배축 및 유근이 생성된 기내 식물체를 유도하는 단계; (b) 상기 유도된 기내 식물체의 자엽, 배축 및 유근 중 어느 하나 이상의 부위를 배양 배지에서 배양하여 부위별 배양근을 유도하는 단계; 및 (c) 상기 유도한 부위별 배양근을 배양배지에서 증식하는 단계; 를 포함하며, 상기 배양 배지는 NH4NO3, CaCl2　·2H2O, MgSO4　·7H2O 및 KH2PO4, KNO3 의 영양성분을 포함하는 배지인, 방법.
본 발명의 일측면에서, 상기 배양 배지의 NH4NO3의 농도는 1,500 내지 2,000 mg/L이며, 상기 CaCl2　·2H2O의 농도는 300 내지 500 mg/L이고, 상기 MgSO4　·7H2O의 농도는 300 내지 500 mg/L이며, 상기 KH2PO4의 농도는 100 내지 200 mg/L이고, 그리고 상기 KNO3의 농도는 1,700 내지 2,100mg/L일 수 있다.본 발명의 일측면에서, 상기 배양배지는 MS 배지(Murashige and Skoog medium)일 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 상기 단계 (a)에서의 콩과식물은 밤색약콩(Phynchosia nulubilis Loureiro), 서리태(Glycine max Merr.), 신화콩(Glycine Max Merr.) 및 납작콩(Glycine gracillis)중 어느 하나 이상인, 방법이다.
본 발명의 일측면에서, 상기 단계 (a)에서 배양배지는 배지 전체 부피를 기준으로 10-100g/L 수크로오스가 포함된 배양배지인, 방법이다.
본 발명의 일측면에서, 상기 단계 (b)에서 상기 배양 배지는 IBA(Indole Butyric Acid)및 NAA (Naphthalene Acetic Acid)중 어느 하나 이상을 배양배지 전체 부피를 기준으로 0.1 내지 10 mg/L 포함하며, 상기 배양 배지는 배양배지 전체 부피를 기준으로 10-100g/L 수크로오스를 포함하는, 방법이다.
본 발명의 일측면에서, 상기 단계 (b)에서 상기 배양배지는 IBA(Indole Butyric Acid)를 배양배지 전체 부피를 기준으로 2 내지 8 mg/L 포함하는, 방법 이다.
본 발명의 일측면에서, 상기 단계 (a)에서의 콩과 식물은 신화콩 및 납작콩 중 어느 하나 이상이며, 상기 단계 (b)에서의 유도된 부위는 배축 및 유근 중 어느 하나 이상이며, 상기 단계 (b)에서의 배양배지는 IBA(Indole Butyric Acid)를 배양배지 전체 부피를 기준으로 3 내지 5 mg/L 포함하는, 방법이다.
본 발명의 일측면에서, 상기 단계 (c)에서의 배양배지는 IBA(Indole Butyric Acid)를 배양배지 전체 부피를 기준으로 3 내지 5 mg/L 및 10-100g/L 수크로오스를 포함하는 배지인, 방법이다.
본 발명의 일측면에서, 상기 단계 (c)에서의 배양배지는 0.5-1.5 MS 배지이며, 30-60g/L의 수크로오스를 포함하는 배지인, 방법이다.
본 발명의 다른 측면은 상기 방법 중 어느 한 방법에 의해 제조된, 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과식물 배양근을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따른 배양방법은 대량의 쿠메스트롤 생산이 가능하다.
본 발명의 일 측면에 따른 배양방법은 연중 균일한 쿠메스트롤의 생산이 가능하다.
본 발명의 일 측면에 따른 배양방법은 단시간에 대량의 쿠메스트롤 생산이 가능하다.
본 발명의 다른 측면에 따른 콩과식물 배양근은 쿠메스트롤 함량이 증가되어 있다.
본 발명의 다른 측면에 따른 콩과식물 배양근은 균일한 양의 쿠메스트롤 함량을 보인다.
도 1은 제조예 1-1에 따른 콩 종자의 발아 및 기내 식물체를 유도하는 모식도이다.
도 2 내지 3은 제조예 1-2에 따른 콩의 종류, 기내 식물체의 유도 부위, 옥신의 종류와 농도에 따른 배양 2주후 유도양상이다.
도 4 및 5는 실험예 1에 따른 콩의 종류와 유도 부위에 따른 콩 배양근의 생장 양상 결과 및 콩 배양근 내 쿠메스트롤 함량 분석결과이다.
도 6은 제조예 1-3에서 배양근의 증식단계에서 최적의 쿠메스트롤 증식 배지조성을 DOE 기법으로 측정한 결과이다.
이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
쿠메스트롤은 외부 자연환경의 변화에 따라 콩 식물체 내 함량이 변화하며, 같은 속/ 종/ 품종에 따라 함량차이가 크고 특히, 식물체 내 극미량 존재하는 콩의 주요 생리활성물질이다. 본 발명의 배양방법으로 유도된 콩과식물 배양근을 이용하여 쿠메스트롤을 생산 할 경우, 원료의 연중 균일한 생산이 가능하며 배양공정 조절을 통한 기내 쿠메스트롤 대량생산이 가능하다.
본 발명의 일측면은, 하기 단계를 포함하는 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과식물 배양근의 배양 방법을 제공한다:
(a) 콩과 식물 종자를 배양 배지에서 발아시켜 자엽, 배축 및 유근이 생성된 기내 식물체를 유도하는 단계; (b) 상기 유도된 기내 식물체의 자엽, 배축 및 유근 중 어느 하나 이상의 부위를 배양 배지에서 배양하여 부위별 배양근을 유도하는 단계; 및 (c) 상기 유도한 부위별 배양근을 배양배지에서 증식하는 단계; 를 포함하며, 상기 배양 배지는 NH4NO3,CaCl2 ·2H2O,MgSO4 ·7H2O 및 KH2PO4, KNO3의 영양성분을 포함하는 배지인, 방법.
본 발명에서 사용되는 “콩과 식물”은 쿠메스트롤을 생산할 수 있는 콩과식물을 사용할 수 있다.
본 명세서에서 콩과 식물의 종자는 콩과 식물에서 유래되는 씨(씨앗)이다. 구체적으로, 콩과 식물의 종자는 “콩”일 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 상기 단계 (a)에서의 콩과식물은 밤색약콩(Phynchosia nulubilis Loureiro), 서리태(Glycine max Merr.), 신화콩(Glycine Max Merr.) 및 납작콩(Glycine gracillis)중 어느 하나 이상일 수 있다.
본 명세서에서 “콩과 식물 배양근의 배양방법”은 콩과 식물의 특정 세포, 조직, 및 기관 중 어느 하나 이상을 적출하여 기내(in-vitro)에서 영양분이 함유되어 있는 배양배지를 이용하여 무균적으로 배양함으로써 캘러스(callus)나 단세포 집단을 유기 또는 완전한 기능을 가진 식물체로 재생시키는 기술이다.
상기와 같은 식물 혹은 콩과 식물 배양근의 배양방법은 식물 혹은 콩과 식물 엑스플렌테이션(plant explantation), 조직배양, 기내배양, 무균배양 혹은 식물 줄기세포 배양 등으로도 불릴 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 상기 배양 배지의 NH4NO3의 농도는 1,500 내지 2,000 mg/L이며, 상기 CaCl2 ·2H2O의 농도는 300 내지 500 mg/L이고, 상기 MgSO4 ·7H2O의 농도는 300 내지 500 mg/L이며, 상기 KH2PO4의 농도는 100 내지 200 mg/L이고, 그리고 상기 KNO3의 농도는 1,700 내지 2,100mg/L일 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 상기 배양배지는 MS 배지(Murashige and Skoog medium)일 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 상기 배양 배지는 MS 배지(Murashige and Skoog medium)일 수 있다. 구체적으로, 배지 내 무기물의 농도에 따라, 1/4MS 배지, 1/2MS 배지, 3/4MS배지, 1MS 배지, 3/2 MS 배지 또는 2MS 배지를 사용할 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 상기 단계 (a)에서 배양배지는 배지 전체 부피를 기준으로 10-100g/L 수크로오스가 포함된 배양배지인, 방법이다.
구체적으로, 상기 수크로오스의 농도는 배양배지 전체 부피를 기준으로 10 g/L 이상, 20 g/L 이상, 21 g/L 이상, 22g/L 이상, 23g/L 이상, 24g/L 이상, 25g/L 이상, 26g/L 이상, 27g/L 이상, 28g/L 이상, 29g/L 이상 또는 30g/L 이상일 수 있다. 또한, 상기 수크로오스의 농도는 배양배지 전체 부피를 기준으로 100g/L 이하, 80g/L 이하, 60g/L 이하, 50g/L 이하,40 g/L 이하, 39g/L 이하, 38g/L 이하, 37g/L 이하, 36g/L 이하, 35g/L 이하, 34g/L 이하, 33g/L 이하, 32g/L 이하, 31g/L 이하 또는 30g/L 이하일 수 있다. 단계 (a)에서 수크로오스의 농도가 상기 범위 내일 때 기내 식물체의 유도율이 우수하다.
본 발명의 일측면에서, 상기 단계 (a)의 기내 식물체를 유도하는 단계는 종자에서 자엽, 배축 및 유근이 생성될 때가지 유도할 수 있다. 상기와 같은 단계 (a)의 기내 식물체 유도는 1일 내지 25일동안 유도할 수 있다. 구체적으로, 단계 (a)의 기내 식물체 유도는 1일 이상, 1.5일 이상, 2일 이상, 2.5일 이상, 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 11일 이상, 12일 이상, 13일 이상, 14일 이상 또는 15일 이상일 수 있다. 또한, 25일 이하, 24일 이하, 23일 이하, 22일 이하, 21일 이하, 20일 이하, 19일 이하, 18일 이하, 17일 이하 또는 16일 이하일 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 상기 단계 (a)의 기내 식물체 유도는 기내식물체의 길이가 8 내지 15cm의 길이가 될 때까지 유도할 수 있다. 본 명세서에서 상기 “기내 식물체의 길이”는 자엽의 끝에서 유근의 끝까지 직선길이이다. 구체적으로, 8cm 이상, 9cm 이상, 10cm 이상 또는 11cm 이상일 수 있으며, 또한, 15cm 이하, 14cm 이하 또는 13cm 이하일 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 상기 단계 (a)의 기내 식물체 유도는 명조건에서 유도할 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 상기 단계 (b)에서 상기 배양 배지는 IBA(Indole Butyric Acid)및 NAA (Naphthalene Acetic Acid)중 어느 하나 이상을 배양배지 전체 부피를 기준으로 0.1 내지 10 mg/L 포함하며, 상기 배양 배지는 배양배지 전체 부피를 기준으로 10-100g/L 수크로오스를 포함하는, 방법이다.
상기 IBA 또는 NAA의 농도는 0.1 mg/L 이상, 0.5mg/L 이상, 1mg/L 이상, 2mg/L 이상, 3mg/L 이상, 3.5mg/L 이상, 3.6mg/L 이상, 3.7mg/L 이상, 3.8mg/L 이상, 3.9mg/L 이상, 4mg/L 이상 또는 5mg/L 이상일 수 있다. 또한, 상기 IBA 또는 NAA의 농도는 10mg/L 이하, 9 mg/L 이하, 8 mg/L 이하, 7 mg/L 이하, 6 mg/L 이하, 5 mg/L 이하, 4.5 mg/L 이하, 4.3 mg/L 이하, 4.1 mg/L 이하, 3.5 mg/L 이하 또는 3 mg/L 이하일 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 상기 단계 (b)에서 상기 배양배지는 IBA(Indole Butyric Acid)를 배양배지 전체 부피를 기준으로 2 내지 8 mg/L 포함하는, 방법 이다. 구체적으로, IBA(Indole Butyric Acid)를 배양배지 전체 부피를 기준으로 2mg/L 이상, 3mg/L 이상, 3.6mg/L 이상, 3.7mg/L 이상, 3.8mg/L 이상, 3.9mg/L 이상, 4mg/L 이상 또는 5mg/L 이상 포함할 수 있으며, 또한, 8 mg/L 이하, 7 mg/L 이하, 6 mg/L 이하, 5 mg/L 이하, 4.5 mg/L 이하, 4.3 mg/L 이하, 4.1 mg/L 이하, 3.5 mg/L 이하 또는 3 mg/L 이하 포함할 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 상기 단계 (a)에서의 콩과 식물은 신화콩 및 납작콩 중 어느 하나 이상이며, 상기 단계 (b)에서의 유도된 부위는 배축 및 유근 중 어느 하나 이상이며, 상기 단계 (b)에서의 배양배지는 IBA(Indole Butyric Acid)를 배양배지 전체 부피를 기준으로 3 내지 5 mg/L 포함하는, 방법이다.
본 발명의 일측면에서, 상기 단계 (c)에서의 배양배지는 IBA(Indole Butyric Acid)를 배양배지 전체 부피를 기준으로 3 내지 5 mg/L 및 10-100g/L 수크로오스를 포함하는 배지인, 방법이다.
본 발명의 일측면에서, 상기 단계 (c)에서의 배양배지는 0.5-1.5 MS 배지이며, 30-60g/L의 수크로오스를 포함하는 배지인, 방법이다.
구체적으로, 상기 단계 (c)에서의 수크로오스의 농도는 배양배지 전체 부피를 기준으로 10 g/L 이상, 20 g/L 이상, 21 g/L 이상, 22g/L 이상, 23g/L 이상, 24g/L 이상, 25g/L 이상, 26g/L 이상, 27g/L 이상, 28g/L 이상, 29g/L 이상 또는 30g/L 이상일 수 있다. 또한, 상기 수크로오스의 농도는 배양배지 전체 부피를 기준으로 100g/L 이하, 80g/L 이하, 60g/L 이하, 50g/L 이하,40 g/L 이하, 39g/L 이하, 38g/L 이하, 37g/L 이하, 36g/L 이하, 35g/L 이하, 34g/L 이하, 33g/L 이하, 32g/L 이하, 31g/L 이하 또는 30g/L 이하일 수 있다. 단계 (c)에서 수크로오스의 농도가 상기 범위 내일 때 배양근의 증식이 우수하며, 배양근 내 쿠메스트롤의 함량이 증진된다.
또한, 상기 단계 (c)에서의 배양배지는 무기물 농도에 따라 0.5 MS 배지, 0.6 MS 배지, 0.7 MS 배지, 0.75 MS 배지, 0.8 MS 배지, 0.9 MS 배지, 1.0 MS 배지 또는 1.5 MS 배지일 수 있다. 단계 (c)에서 무기물 농도에 따른 MS 배지가 상기 중 어느 하나 이상일 때, 배양근의 증식이 우수하며, 배양근 내 쿠메스트롤의 함량이 증진된다
본 발명의 다른 측면은 상기 방법 중 어느 한 방법에 의해 제조된, 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과식물 배양근을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 배양근 내 쿠메스트롤의 함량은 건조된 배양근 전체 중량에 대하여 0.001 중량% 이상이다. 구체적으로, 쿠메스트롤의 함량은 건조된 배양근 전체 중량에 대하여 0.001 중량% 이상, 0.002 중량% 이상, 0.003 중량% 이상, 0.004 중량% 이상, 0.005 중량% 이상, 0.006 중량% 이상, 0.007 중량% 이상, 0.008 중량% 이상, 0.009 중량% 이상, 0.01 중량% 이상, 0.012 중량% 이상, 0.014 중량% 이상, 0.015 중량% 이상, 0.016 중량% 이상 또는 0.017 중량% 이상일 수 있다. 또한, 쿠메스트롤의 함량은 건조된 배양근 전체 중량에 대하여 1 중량% 이하, 0.9 중량% 이하, 0.8 중량% 이하, 0.6 중량% 이하, 0.5 중량%, 0.4 중량%, 0.3 중량% 또는 0.2 중량% 이하일 수 있다.일 구현예에서, 본 발명의 일 측면에 따른 콩과식물 배양근의 배양 방법에 따라 배양된 배양근은 건조된 배양근 전체 중량에 대하여 0.01-0.02 중량%의 쿠메스트롤을 포함할 수 있다.
이하 실시예를 통하여, 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[제조예 1-1] 콩 종자발아 및 기내 식물체 유도
신화콩 및 납작콩의 콩 종자 각각을 2% 치아염소산 나트륨(Sodium Hypochlorite) 용액으로 각각 20분간 표면 살균한 뒤 멸균수로 3회 세척하였다. 그 후 수크로스 30g/L가 첨가된 1/2 MS 배지(Murashige and Skoog Medium)을 이용하여 25±1℃가 유지되는 명조건에서 2~3주간 식물체를 유도하였다.
콩과 식물의 기내 식물체를 유도하는 과정은 도 1에 도시하였다.
[제조예 1-2] 콩 배양근 유도
유도된 식물체의 자엽, 배축, 유근을 1cm 내외로 절단하여 IBA(Indole Butyric Acid)와 NAA (Naphthalene Acetic Acid)가 각각 0, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0mg/L씩 처리된 수크로스 30g/L가 첨가된 1MS 배지에서 배양근을 유도하였다. 기타 배양조건은 22±1℃가 유지되는 암조건으로 2~3주간 유지하였다.
콩의 종류, 유도 부위, 옥신의 종류 및 농도에 따른 배양근 유도 양상은 도 2 내지 도 3과 같았다.
[ 실험예 1] 콩 품종, 부위 및 옥신의 종류와 농도에 따른 배양근의 건물 생산성 및 쿠메스트롤 함량 측정
상기 제조예 1-2의 건조한 콩 배양근의 건물 생산성을 측정하였다. 측정결과는 도 4와 같았다. 콩의 종류와 유도부위에 따른 콩 배양근의 생장 양상 결과는 상이하였으며, 특히 신화콩 유근 유래 배양근이 4주 배양 후 생체중 기준 초기 대비 12.5배 증가하였고, 최종 건물 생산량이 4.1g/L으로 우수하였다.
또한, 상기 제조예 1-2의 건조한 콩 배양근을 80%(w/v) 에탄올에 침지하여 상온에서 24시간 추출하였다. 추출액은 여과지를 이용하여 여과한 다음 용매를 증발 건조시켜 분말 수득 후, 1% 용액으로 희석하여 최종 추출물을 조제하였다. 배양근 내 쿠메스트롤 함량은 추출액 2mL을 0.45μm Filter로 여과한 다음 UV Detector가 장착된 High Performance Liquid Chromatography에 10μL씩 주입하며 분석하였다. 컬럼은 Mightysil RP-18 GP 250-4.6 (5 μm)을 사용하였으며, 추출물 내 쿠메스트롤 함량은 342nm 파장에서 측정하였다. 측정결과는 도 5와 같았다. 도 5에서과 같이 신화콩 유근 유래 배양근의 쿠메스트롤 함량이 0.18mg/g DW로 가장 우수하였다.
상기 실험결과에 따라 쿠메스트롤 함량이 가장 우수한 신화콩 유근 유래 배양근을 선정하여 제조예 1-3의 방법으로 증식 시켰다.
[제조예 1-3] DOE 기법을 이용한 콩 배양근 최적 증식 배지 조건 및 상기 배지를 이용한 증식
생물반응기내에서 증식시, 배지 환경(무기물 농도 및 당농도)에 따라 쿠메스트롤 생산에 적합한 배지 조성이 달라진다. 이에, 쿠메스트롤 생산에 가장 적합한 콩 배양근으로 선정된 신화콩 유근 유래 배양근을 이용하여 최적 배지조성을 DOE 기법에 따라 선정하고 이러한 배지에서 배양근을 증식하였다.
(1) 배양근 증식시 최적 배지조성 선정
Design of Experiments(DOE) 기법을 이용하여 배지조성 최적화 실험을 진행하였다. 실험 조건은 하기와 같았다.
2인자 X 3수준 X 2반복 (처리 인자: Sucrose X MS Salt / 처리 수준: Sucrose = 1~9% / MS Salt = 0.25~2배)
상기 기법에 따른 예측모델의 결과는 도 6과 같았다. 확인 결과, 최적 배지 조성은 배지 내 무기물 농도가 0.5-1 MS 이고, 당(sucrose) 농도가 3-6% 였다.
(2) 최적 배지에서 배양근 증식
제조예 1-2의 배양근을 공기용적이 3L인 Bulb Type 생물반응기에 IBA 4mg/L, 수크로스 30g/L 가 첨가된 2L의 1MS 배지를 이용하여 배양근을 3~4주 간격으로 증식시켰다. 배지는 1N NaOH를 이용하여 pH 5.8로 조정 후 121℃, 1.2기압에서 35분간 멸균하여 사용하였다. 배양은 배양근을 1-1.5cm로 절단하여 생체중을 기준으로 4~5g/L 접종밀도로 배양근을 접종한 후 22±1℃가 유지되는 암조건에서 실시하였다. 공기공급량은 배양 전 기간 동안 0.1vvm으로 일정하게 조절하였으며, 생물반응기 내부로 공급하는 공기는 일정한 온도 유지를 위하여 압축공기를 응축시킬 수 있는 공기압축기와 불순물을 제거할 수 있는 필터 및 공기 건조기 등을 순차적으로 통과시킨 후 기름을 사용하지 않는 공기 압축기를 이용하여 생물반응기 내부로 공급하였다.
[실험예 2] 증식된 콩 배양근의 쿠메스트롤 함량측정
상기 제조예 1-3을 통해 증식된 콩 배양근을 상기 실험예 1의 쿠메스트롤 함량 측정과 동일한 방식으로 쿠메스트롤 함량을 측정하였다.
실험결과 증식된 콩 배양근의 건조 중량에 대한 쿠메스트롤의 함량은 0.16mg/g Dry weight (0.016중량%)로 측정되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

  1. 하기 단계를 포함하는 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과식물 배양근의 배양 방법:
    (a) 콩과 식물 종자를 배양배지에서 발아시켜 자엽, 배축 및 유근이 생성된 기내 식물체를 유도하는 단계;
    (b) 상기 유도된 기내 식물체의 자엽, 배축 및 유근 중 어느 하나 이상의 부위를 배양 배지에서 배양하여 부위별 배양근을 유도하는 단계; 및
    (c) 상기 유도한 부위별 배양근을 배양배지에서 증식하는 단계;
    를 포함하며, 상기 배양 배지는 NH4NO3,CaCl2 ·2H2O, MgSO4 ·7H2O,KH2PO4및 KNO3의 영양성분을 포함하는 배지인, 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 배양 배지의 NH4NO3의 농도는 1,500 내지 2,000 mg/L이며, 상기 CaCl2 ·2H2O의 농도는 300 내지 500 mg/L이고, 상기 MgSO4 ·7H2O의 농도는 300 내지 500 mg/L이며, 상기 KH2PO4의 농도는 100 내지 200 mg/L이고, 그리고 상기 KNO3의 농도는 1,700 내지 2,100mg/L인, 방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 배양배지는 MS 배지(Murashige and Skoog medium)인, 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 단계 (a)에서의 콩과식물은 밤색약콩(Phynchosia nulubilis Loureiro), 서리태(Glycine max Merr.), 신화콩(Glycine Max Merr.) 및 납작콩(Glycine gracillis)중 어느 하나 이상인, 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 단계 (a)에서 배양배지는 배지 전체 부피를 기준으로 10-100g/L 수크로오스가 포함된 배양배지인, 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 단계 (b)에서
    상기 배양 배지는 IBA(Indole Butyric Acid)및 NAA (Naphthalene Acetic Acid)중 어느 하나 이상을 배양배지 전체 부피를 기준으로 0.1 내지 10 mg/L 포함하며,
    상기 배양 배지는 배양배지 전체 부피를 기준으로 10-100g/L 수크로오스를 포함하는, 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 단계 (b)에서
    상기 배양배지는 IBA(Indole Butyric Acid)를 배양배지 전체 부피를 기준으로 2 내지 8 mg/L 포함하는, 방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 단계 (a)에서의 콩과 식물은 신화콩 및 납작콩 중 어느 하나 이상이며,
    상기 단계 (b)에서의 유도된 부위는 배축 및 유근 중 어느 하나 이상이며,
    상기 단계 (b)에서의 배양배지는 IBA(Indole Butyric Acid)를 배양배지 전체 부피를 기준으로 3 내지 5 mg/L 포함하는, 방법.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 단계 (c)에서의 배양배지는 IBA(Indole Butyric Acid)를 배양배지 전체 부피를 기준으로 3 내지 5 mg/L 및 10-100g/L 수크로오스를 포함하는 배지인, 방법.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 단계 (c)에서의 배양배지는 0.5 내지 1.5 MS 배지이며, 30-60g/L의 수크로오스를 포함하는 배지인, 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된, 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과식물 배양근.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 콩과식물 배양근은 쿠메스트롤 함량이 0.001 중량 % 이상인, 배양근.
  13. 쿠메스트롤 함량이 0.001 중량% 이상인, 콩과 식물 배양근.
PCT/KR2017/007356 2016-07-14 2017-07-10 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과식물 배양근의 배양 방법 WO2018012827A1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17827898.2A EP3485726A4 (en) 2016-07-14 2017-07-10 CULTIVATION PROCESS FOR ROOTS OF CULTIVATED LEGUMES WITH INCREASED COUMESTROL CONTENT
US16/317,414 US20190289805A1 (en) 2016-07-14 2017-07-10 Culturing method for cultured leguminous roots having increased coumestrol content
CN201780056761.0A CN109714953A (zh) 2016-07-14 2017-07-10 香豆雌酚含量增加的豆科培养根的培养方法

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2016-0089464 2016-07-14
KR20160089464 2016-07-14
KR1020170082586A KR102287587B1 (ko) 2016-07-14 2017-06-29 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과식물 배양근의 배양 방법
KR10-2017-0082586 2017-06-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018012827A1 true WO2018012827A1 (ko) 2018-01-18

Family

ID=60952606

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2017/007356 WO2018012827A1 (ko) 2016-07-14 2017-07-10 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과식물 배양근의 배양 방법

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2018012827A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111084739A (zh) * 2018-10-23 2020-05-01 株式会社爱茉莉太平洋 包含豆科植物培养根的酶处理提取物的用于增强皮肤弹性或改善皮肤皱纹的组合物

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20010070932A (ko) * 2001-06-02 2001-07-27 박재욱 생물반응기를 이용한 산삼 부정근(세근)의 대량생산 방법
KR20130079220A (ko) * 2012-01-02 2013-07-10 (주)아모레퍼시픽 콩뿌리 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물
KR20140060201A (ko) * 2012-11-09 2014-05-19 주식회사 바이오에프디엔씨 식물 세포 내 생리활성물질 함량 증가를 위한 고주파 장치 및 이를 이용한 식물 세포 배양방법
KR20140089691A (ko) * 2013-01-07 2014-07-16 영농조합법인 이노플랜트 유리코마 속 식물 부정근의 생장 및 생리활성 물질 함량을 증대시키는 방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20010070932A (ko) * 2001-06-02 2001-07-27 박재욱 생물반응기를 이용한 산삼 부정근(세근)의 대량생산 방법
KR20130079220A (ko) * 2012-01-02 2013-07-10 (주)아모레퍼시픽 콩뿌리 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물
KR20140060201A (ko) * 2012-11-09 2014-05-19 주식회사 바이오에프디엔씨 식물 세포 내 생리활성물질 함량 증가를 위한 고주파 장치 및 이를 이용한 식물 세포 배양방법
KR20140089691A (ko) * 2013-01-07 2014-07-16 영농조합법인 이노플랜트 유리코마 속 식물 부정근의 생장 및 생리활성 물질 함량을 증대시키는 방법

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BOURGAUD, F. ET AL.: "Production of Flavonoids by Psoralea Hairy Root Cultures", PLANT CELL , TISSUE AND ORGAN CULTURE, vol. 56, 1999, pages 97 - 104, XP055273987 *
HABIBI, PEYMAN ET AL.: "Efficient Genetic Trans Formation and Regeneration System from Hairy Root of Origanum Vulgate", PHYSIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY OF PLANTS, (ELECTRONIC PUBLISHING, vol. 22, no. 2, 30 April 2016 (2016-04-30), pages 271 - 277, XP035996919 *
See also references of EP3485726A4 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111084739A (zh) * 2018-10-23 2020-05-01 株式会社爱茉莉太平洋 包含豆科植物培养根的酶处理提取物的用于增强皮肤弹性或改善皮肤皱纹的组合物
CN111084739B (zh) * 2018-10-23 2024-02-13 株式会社爱茉莉太平洋 包含豆科植物培养根的酶处理提取物的用于增强皮肤弹性或改善皮肤皱纹的组合物

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sellés et al. Effect of sucrose on growth and galanthamine production in shoot-clump cultures of Narcissus confusus in liquid-shake medium
Ataei-Azimi et al. High in vitro production of ant-canceric indole alkaloids from periwinkle (Catharanthus roseus) tissue culture
KR102287587B1 (ko) 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과식물 배양근의 배양 방법
WO2010137918A2 (ko) 가지과의 형성층 유래 식물줄기세포 및 이의 분리배양방법
WO2018105936A1 (ko) 섬단풍나무의 캘러스 유도 또는 증식용 배지 및 이를 이용한 캘러스 유도 또는 증식방법
Carimi et al. Somatic embryogenesis and plant regeneration from undeveloped ovules and stigma/style explants of sweet orange navel group [Citrus sinensis (L.) Osb.]
US6713303B2 (en) Method for the mass propagation of adventitious roots of ginseng, camphor ginseng and wild ginseng by tissue culture and the improvement of their saponin content
Gangopadhyay et al. Hairy root culture of Plumbago indica as a potential source for plumbagin
Bais et al. Influence of polyamines on growth and formation of secondary metabolites in hairy root cultures of Beta vulgaris and Tagetes patula
CN111183902B (zh) 一种卷叶黄精组织培养方法
Ficcadenti et al. Genotype and medium affect shoot regeneration of melon
WO2018012827A1 (ko) 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과식물 배양근의 배양 방법
Zeng et al. Establishment of the callus and cell suspension culture of Elaeagnus angustifolia for the production of condensed tannins
WO2019098598A9 (ko) 콩과식물 배양근을 이용한 쿠메스트롤 생산 방법
Sharma et al. Callus Initiation and Plant Regeneration from Triticale Embryos 1
Khan et al. Callus induction via different growth regulators from cotyledon explants of indigenous chick pea (Cicer arietinum L.) cultivars KK-1 and Hassan-2K
Trindade et al. The role of cytokinin and auxin in rapid multiplication of shoots of Eucalyptus globulus grown in vitro
Mizukami et al. Improvement of propagation frequency with two-step direct somatic embryogenesis from carrot hypocotyls
KR102262309B1 (ko) 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과 식물 배양근의 생산 방법
Lippmann et al. Soybean embryo culture: factors influencing plant recovery from isolated embryos
Hisajima et al. Induction of ears from maize seeds in vitro and plant regeneration from ovaries of unfertilized ears
Narasimhan et al. Tissue culture of some woody species
WO2016153167A1 (ko) 흰등멸구를 접종한 벼로부터 크리소에리올을 분리하는 방법
KR20210035601A (ko) 메틸자스모네이트 처리를 통한 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과 식물 배양근의 생산 방법
WO2016153166A2 (ko) 흰등멸구를 접종한 벼로부터 코클리오퀴논을 분리하는 방법

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17827898

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017827898

Country of ref document: EP

Effective date: 20190214