KR20140060201A - 식물 세포 내 생리활성물질 함량 증가를 위한 고주파 장치 및 이를 이용한 식물 세포 배양방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포 내 생리활성물질 함량을 증가시키기 위한 고주파 장치 및 상기 고주파 장치를 이용하여 세포 내 유용한 이차대사산물 함량을 증가시키는 세포 배양방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포 배양에 의하면 세포 내 다이드제인(daidzein), 이퀄(equol) 같은 특정 이차대사산물의 함량을 증가시킴으로써, 생리활성물질을 함유한 다양한 의약품, 농약, 향신료, 색소, 식품 첨가물, 화장품으로의 개발에 유용하게 활용 가능할 것이다. 또한, 종래 특정 세포 혹은 특정 대사산물에만 한정되어 사용할 수 있었던 세포 내 생리활성물질 증가를 위한 세포배양 방식을 개선함으로써, 대다수의 세포 및 이차대사산물 생산에 광범위하게 적용할 수 있을 것이다.

Description

식물 세포 내 생리활성물질 함량 증가를 위한 고주파 장치 및 이를 이용한 식물 세포 배양방법{Radiofrequency device for increasing intracellular bioactive substance and plant cell culture method using the same}

본 발명은 식물 세포 내 생리활성물질 함량을 증가시키기 위한 고주파 장치 및 상기 고주파 장치를 이용하여 식물 세포 내 유용한 이차대사산물 함량을 증가시키는 식물 세포 배양방법에 관한 것이다.

식물은 의약품, 농약, 향신료, 색소, 식품 첨가물, 화장품 등으로 사용되는 폭넓은 이차대사산물을 생산할 수 있는 유용한 자원이다. 그러나, 식물에서 직접 이차대사산물을 추출하는 경우 그 함량이 낮고, 식물의 재배조건이나 부위 등에 따라 생산성에 큰 차이를 나타내어 안정된 공급을 제공하지 못한다. 또한, 식품, 의약품 화장품 분야에서 이차대사산물에 대한 수요가 증가하는 추세에 비하여 세포배양으로부터 이를 직접 생산하여 공급하는 공급량은 여전히 한정적이다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 이차대사산물을 대량 생산할 수 있는 생물반응기 내에서 대량생산공정 및 배양조건을 제어하는 다양한 시도가 있어 왔다.

식물 세포배양을 통한 이차대사산물의 대량생산은 배양세포주의 불안정성, 낮은 생산성, 느린 성장과 대량 배양의 문제 등으로 인하여 어려움을 겪고 있는데, 이러한 낮은 생산성을 극복하기 위하여 종래에는 1) 당, 질산염, 인산염, 성장조절제, 전구체의 첨가 등과 같은 배양 배지의 영양 물질 조작 2) 배양온도, 조명, 배지의 산도 등과 같은 배양 환경의 최적화 3) 생산성을 증가시키기 위한 유도제 처리 4) 이차 대사산물의 효과적인 회수를 위한 세포막 투과성화 및 이원상 배양 5) 이차대사산물의 생합성에 관여하는 유전자 변형 및 외래 유전자 도입을 통해 이차대사산물의 생산성을 증가시키는 방법들을 사용하였다. 그러나 이러한 방법들은 특정 세포 혹은 특정 대사산물에만 한정되어 사용할 수 있고, 대다수의 세포 배양 및 이차대사산물에 일반적으로 적용될 수 없다는 문제점이 있었다.

한편, 세포를 배양하는 방법에는 초기에 한번 배양액과 세포를 넣고 더 이상의 영양물질의 공급이나 제거가 없는 회분식 배양법과, 배양기 안에 배양액을 넣고 외부에서 새로운 배양액을 일정한 속도로 유입시킴과 동시에 같은 속도로 배양 생성물이 포함된 오래된 배양액을 외부로 유출시켜 세포들이 영양의 고갈없이 계속 배양되도록 유지시키는 연속 배양법이 있는데, 이 중 회분식 배양법은 대량생산이 어려워 연속 배양법 중 세포를 배양기 안에 머무르게 하고 생성물을 포함하고 있는 배지를 연속적으로 회수함과 동시에 새로운 배지를 공급하는 관류식 배양 방법이 주목받고 있다. 이 경우 초음파을 이용하여 세포와 배지를 분리하는 방법이 개시되었는데, 이는 초음파를 조사한 후, 세포들이 세포분리기 밖으로 유출되기 시작하면 초음파의 조사를 중단하고 펌프를 이용하여 역압을 가하여 세포를 생물반응기 내부로 돌려보낸 후 다시 초음파를 조사하는 방법으로 운전하는 초음파 세포분리기를 사용하여 세포와 배지를 분리하는 것에 의해 식물세포를 고농도로 배양하는 방법이다. 그러나 이 경우 초음파는 세포와 배지를 분리하기 위한 수단으로 사용되는 것으로 초음파가 세포의 이차대사산물 함량을 증가시키는 데에는 크게 기여하지 못한다는 문제점이 있었다. 또한, 초음파에 의한 식물세포의 괴사가 많은 문제점이 지적되어 왔다.

1. 대한민국특허출원 10-1997-0008119 2. 대한민국특허출원 10-2000-0017570

따라서, 본 발명의 목적은 식물 세포 내 생리활성물질 함량을 증가시키기 위한 세포 배양방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 세포 내 생리활성물질의 함량을 증가시키기 위하여 고주파 처리 강도 및 처리 방법 등에 있어 최적의 조건을 제공하는 것이다.

그리고, 본 발명의 또 다른 목적은 세포 내 생리활성물질의 함량을 증가시키기 위한 고주파 장치를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 식물 세포를 배지에 접종하여 배양하는 배양단계; 및 (b) 식물 세포 내 생리활성물질 함량을 증가시키기 위하여 배양된 세포에 고주파를 처리하는 고주파 처리단계를 포함하는, 식물 세포 내 생리활성물질 함량 증가를 위한 세포 배양방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서 상기 고주파는 0.1 내지 15 MHz로 처리될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서 상기 배양단계는, (a1) 발아한 식물로부터 캘러스를 유도하기 위하여 IAA(Indole acetic acid), BAP(6-benzylaminopurine), 수크로오스(sucrose), 젤라이트(gelite)를 함유한 MS 기본배지에서 2 내지 5주간 배양하는 캘러스 유도단계; 및 (a2) 상기 캘러스로부터 부정근을 유도하기 위하여 IBA(indole-3-butyric acid), MES Monohydrate(2-(N-morpholino), Benzyladenine, 수크로오스(sucrose), 젤라이트(gelite)를 함유한 MS 기본배지에서 2 내지 5주간 배양하는 부정근 유도단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 고주파는 하루에 2 내지 10분 간격으로 3회 처리하되, 이를 5 내지 15일간 반복 처리할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생리활성물질은 알칼로이드(alkaloids), 플라보노이드(flavonoids), 테르페네노이드(terpenenoids), 글리코사이드(glycosides), 대사색소(metabolite pigments)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 이차대사산물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서 상기 플라보노이드 이차대사산물은 이소플라본(isoflavones), 플라보놀(flavonols), 플라바논(flavanones), 플라본(flavones), 플라반-3-올(flavan-3-ols), 안토시아닌(anthocyanins)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 대사산물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 이소플라본은 다이드제인(daidzein), 제니스테인(genistein), 이퀄(equol)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 이차대사산물일 수 있다.

또한, 본 발명은 내부에 수용되는 식물 세포에 고주파 및 공기를 제공하여 배양시키는 바이오 리액터와 세포 내 생리활성물질 함량을 증가시키기 위하여 상기 바이오 리액터에 고주파를 제공하는 고주파 공급기와 상기 바이오 리액터에 공기를 제공하는 공기 공급기와 상기 고주파 공급기와 연결되고 상기 바이오 리액터의 진동을 기록하는 진동기록기를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 고주파 세포 배양기를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 바이오 리액터는 세포배양 및 배양액을 공급하는 주입구가 상부에 형성되고, 양측 동일선상에는 고주파 장착부가 형성되며, 하부에는 공기 주입부가 형성되는 케이스와 상기 주입구를 개방 또는 폐쇄하는 상부 덮개와 상기 고주파 장착부에 각각 장착되고 상기 고주파 공급기를 통해 전달되는 고주파를 전달하는 고주파 단자와 판 형상으로 형성되고 중앙에는 케이스를 지지하는 고정공이 형성되는 수평 지지판과 상기 수평 지지판의 가장자리 둘레를 따라 하부에 수직으로 장착되는 고정 봉을 포함하여 이루어질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 케이스 및 수평 지지판과 상기 수평 지지판 및 고정 봉의 연결부분에는 충격 및 진동의 감소를 위하여 완충부재가 각각 장착될 수 있다.

본 발명에 의하면, 다양한 식물세포에서 세포 내 생리활성물질의 함량을 높일 수 있어, 생리활성물질을 함유한 다양한 의약품, 농약, 향신료, 색소, 식품 첨가물, 화장품으로의 개발에 유용하게 활용 가능할 것이다. 또한, 종래 특정 세포 혹은 특정 대사산물에만 한정되어 사용할 수 있었던 세포 내 생리활성물질 증가를 위한 세포배양 방식을 개선함으로써, 대다수의 세포 및 이차대사산물 생산에 광범위하게 적용할 수 있을 것이다.

도 1A는 식물로부터 캘러스 유도방법을 나타내는 모식도.
도 1B는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따라 유도된 캘러스를 보여주는 사진.
도 2는 식물세포에 고주파 처리시 함유량이 증가된 물질을 동정한 HPLC 결과.
도 3은 식물세포에 고주파 처리시 다이드제인 함유량 증가를 보여주는 그래프.
도 4는 식물세포에 고주파 처리시 이퀄 함유량 증가를 보여주는 그래프.
도 5은 본 발명에 따른 고주파 세포배양기를 나타낸 구성도.
도 6은 본 발명에 따른 고주파 세포배양기를 구성하는 바이오 리액터를 나타낸 단면도.
도 7은 본 발명에 따른 고주파 세포배양기의 실사를 보여주는 참고사진.

본 발명은 세포 내 생리활성물질 함량을 증가시키기 위한 고주파 장치 및 상기 고주파 장치를 이용하여 세포 내 유용한 이차대사산물 함량을 증가시키는 세포 배양 방법에 관한 것이다.

이차대사산물이란 생물의 생장, 발육 및 생식과정과 같이 생존에 필요한 일차적이고도 직접적인 생리기능을 갖지 않고, 특정 생물에 한정되어 생성되는 부차적인 천연 산물을 일컫는다.

이차대사산물은 주로 식물과 미생물에서 생성되는데, 주요한 유용산물의 대부분은 이들 식물과 미생물에서 유래되었다고 해도 과언이 아니다. 동물은 식물과 달리 유전적 조성의 차이, 영양급원의 차이, 저장 형태의 차이가 있을 뿐 아니라 운동성이 있어 그들의 생활에 필요한 양식을 쉽게 구할 수 있고, 생명의 위협으로부터 벗어날 수 있는 반면 운동성이 없는 식물의 경우, 자위 수단으로서 독성물질을 생성하여 그들 자신을 보호하고 양분의 경합 또는 종의 번식을 위해 곤충을 유인하는 수단으로서 이차대사산물을 생성한다.

종래에는 이러한 이차대사산물을 분석 및 추출하는 기술이 발달되어 있지 않아 오감에 의해 유용성분을 함유한 식물을 탐색하는데 그쳤으나, 근래 천연물화학, 생물학, 약리학 및 생화학의 발달에 따른 분석방법의 개발로 미량의 성분까지 정확한 추출 및 구조의 결정이 가능하게 되었다. 이러한 추세와 더불어 이차대사산물의 유용성에 근거하여 좀 더 다양한 이차대사산물을 좀 더 과량으로 생산할 수 있는 방법에 초점을 맞추어 연구가 진행중이다.

이차대사산물의 합성과 축적은 특정한 시기에 특정한 기관이나 조직, 세포에 한정되어 일어나는 경우가 많아 이러한 적정 시기를 포착하여 충분한 이차대사산물을 추출하는 것이 중요하다. 현재 이차대사산물의 생산은 세포배양에 주로 의존하는데, 이는 세포배양이 생물 자체에 비해 성장속도가 빠르고, 지역적, 기후적 제약을 받지 않으며, 무균 배양을 통해 병충해 손실이 적다는 점에 근거할 때 환경 조건에 관계없이 균일한 배양이 가능하기 때문이다. 또한, 세포배양은 특정 이차대사산물의 생산을 촉진하기 위한 인위적 환경조절도 가능하다는 잇점이 있다.

이차대사산물의 종류는 크게 구조와 합성과정에 따라 알칼로이드, 페놀화합물, 테르펜, 기타 대사산물 등 4가지로 분류될 수 있다.

알칼로이드는 방향족 질소화합물로서 그 구조적 특성은 질소원자를 포함하는 헤테로 고리를 가진 것이다. 알칼로이드는 질소 원자가 양전하를 띠게 되어 분자는 염기성을 나타내며 일반적으로 수용성이다. 알칼로이드는 헤테로고리의 구조에 따라 몇 가지 종류로 구분할 수 있는데, 피롤리딘, 트로판, 피페리딘, 피롤리지딘, 퀴놀리지딘, 이소퀴놀린, 인돌 등이 있다. 지금까지 밝혀진 알칼로이드의 종류는 10만 가지 이상이며 이들은 유관속식물의 20~30%에 해당하고 주로 식물에서 분포되어 있다. 주로 초본성 쌍자엽식물에서 발견되며 양귀비나 키나나무 등 한 식물에 20종 이상의 알칼로이드가 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 식물체 내에서 알칼로이드의 기능은 정확히 밝혀져 있지 않으나, 포유류를 비롯한 동물에게 주는 강한 생리적 영향 때문에 많은 주목을 받고 있다. 니코틴, 카페인, 코카인 등은 자극제 또는 진정제의 기능이 있기 때문에 기호품 등으로 많이 이용되며 몰핀, 코테인, 아트로핀, 에페드린, 키니네 등은 의약학적으로 유용하게 사용되고 있다.

한편, 페놀화합물은 치환될 수 있는 수산기를 가진 방향족 고리구조를 가지고 있는 이차대사산물의 총칭이다. 식물의 페놀화합물은 화학적으로 이질적인 물질들이 포함되는데, 유기용매에만 녹는 지용성인 것도 있고, 수용성의 카르복실산이나 배당체, 그리고 크기가 큰 중합체도 이에 포함된다. 페놀화합물의 기능은 그 구조적 다양성 만큼이나 다양하여 초식동물이나 병원균의 공격에 대한 방어작용, 기계적 지지작용, 수분 매개의 유도 및 종자의 분산작용, 인접한 경쟁 식물체의 생장저해작용 등이 있다.

페놀화합물의 일종으로 플라보노이드가 있다. 플라보노이드는 종류가 매우 많은 페놀 화합물로서, 치환기의 구조와 위치에 따라 안토시아닌, 플라폰, 플라보놀, 이소플라본의 4 종류로 나누어진다.

안토시아닌은 꽃과 과일의 붉은색, 연분홍색, 자주색, 청색 등을 나타내는 색소로 동물을 유인하여 식물이 화분과 종자를 퍼뜨리는데 도움을 주고, 눈과 간의 기능을 향상시키는 것으로 알려져 있다.

플라본과 플라보놀은 꽃에 들어있으며 일반적으로 안토시아닌보다 짧은 파장의 빛을 흡수한다. 따라서 이들 색소는 사람의 눈에 보이지 않으나 자외선 영역의 빛을 볼 수 있는 벌과 같은 곤충의 눈에 보이게 된다.

이중 이소플라본은 에스트로겐과 구조적 유사성을 가지며, 작용도 유사하여 체내에서 에스트로겐 효과를 나타내는 phytoestrogen의 일종이다. 따라서, 골다공증, 암, 심혈관계질환 등의 예방 효과가 있는 것으로 보고되고 있다. 에스트로겐을 장기간 사용할 경우, 암 발병 위험 및 두통 등의 부작용을 나타내기 때문에 논란이 제기되고 있는 반면, 이소플라본은 에스트로겐 수용체의 결합 능력에 따라 agonist/antagonist의 두 가지 작용을 가지고 있으나, 부작용은 거의 보고된 바 없다. 미국 식품의약청에서는 이소플라본을 하루 25mg 이상 섭취할 것을 권장한다.

다이드제인(daidzein)은 대두로부터 분리된 이소플라본 화합물 중 하나이다. 혈중 콜레스테롤 수치를 낮춰 주어 각종 만성 질환의 예방과 치료에 효과적인 것으로 알려져 있다. 에스트로겐과 비슷한 구조로 되어 있어, 체내 흡수율이 높으며, 에스트로겐 수용체와 결합하여 그 작용을 활성화 시킨다. 유방암 등 부작용을 유발하는 에스트로겐 요법과 비교하여 부작용이 없으므로 에스트로겐을 대체할 수 있는 성분으로 주목받고 있는데, 조직 안에서 자유라디칼에 의한 손상을 감소시켜 효과 좋은 항산화제로 알려져 있으며, 에스트로겐과 유사한 작용을 통해 폐경기 여성에게 효과적은 건강 보조제이다. 또한, 몸 속에서 암세포 성장과 관련하여 세포의 무작위적 성장을 통제하여 세포성장과 세포분열을 적절히 조절하는 물질로도 이용될 수 있다.

<다이드제인의 화학식>

한편, 이퀄(Equol)은 상기 다이드제인(daidzein)의 대사산물로 알려져 있으며, 이는 전립선암, 남성형 대머리를 유발하는 남성호르몬인 DHT(dihydrotestosterone)를 억제하는 것으로 보고되고 있다. 즉, 수컷 마우스에 이퀄(Equol)을 주입하자 전립선이 줄어드는 것이 확인되었고, 고환을 제거해 DHT의 생성이 불가능한 쥐에 DHT를 주입해 전립선이 커진 경우, 이퀄(Equol)을 함께 주입하면 이러한 변화가 관찰되지 않는 것으로 확인되었다.

<이퀄의 화학식>

그리고, 테르펜은 이차대사산물 중 가장 많은 종류가 있으며 주로 살충효과를 갖는 것으로 알려져 있고, 이외에도, 글리코시드, 글루코시놀산, 카나바닌 등과 같은 기타 이차대사산물이 알려져 있다.

본 발명자들은 이와 같은 유용한 이차대사산물을 다량 함유한 세포의 배양을 위하여 식물세포에 대해 연구하였다.

우선, 본 발명자들은 식물에서 유래된 세포배양을 위해서 대두 태좌를 이용하여 캘러스를 유도하고 이로부터 다시 부정근을 유도하였는데, 캘러스란 식물체에 상처가 났을 때 생기는 조직으로, 식물체의 상처부위에 형성된 조직을 뜻하나 절편, 기관, 조직 등을 조직 배양하여 형성된 정상적인 기관형성이나 조직분화를 일으키는 능력을 잃은 무정형(無定形)의 조직 또는 세포 덩어리를 주로 이름하고, 대부분 유세포(柔細胞)로 되어 있고, 넓은 의미로는 아그로박테리움(agrobacterium) 등의 감염에 의해서 생기는 식물종양조직을 통칭하기도 한다.

오늘날은 식물체에서 잘라낸 조직을 옥신이 함유된 배지(培地)에서 배양하거나, 어떤 종류의 식물에 상처를 내거나, 상구(傷口)를 옥신으로 처리하거나 할 때에 생기는 특수한 조직 또는 세포 덩어리를 말하며, 아직 분화되지 않은 조직세포로써 여러 자극을 통해 줄기, 뿌리, 잎 등의 여러 기관으로 분화하기 때문에 식물의 줄기세포라고 불리기도 한다.

캘러스는 조직배양의 유용한 수단이 된다. 조직배양이란, 식물로부터 기관, 조직 혹은 세포를 분리하여 영양분이 포함된 인공배지에서 배양하여 캘러스(callus)를 만들어내어, 식물체를 유지, 분화, 증식시키는 기술을 의미하고, 이는 동물세포에는 없으나 식물세포는 모든 세포로 분화할 수 있는 능력인 전형성능(분화전능성 : Totipotency, 세포나 조직이 세포전체의 형태를 형성하거나 식물체를 재생하는 능력 및 모든 세포로 분화할 수 있는 능력)이 있어 가능하다.

식물 조직배양은 많은 세포로 이루어진 식물의 기관, 조직 또는 세포 등을 식물체에서 적출, 분리해서 영양분이 들어있는 기내에서 배양하여 캘러스나 단세포집단을 유기시키든지, 또는 식물체나 기관을 캘러스, 세포 등에서 식물체로 재 분화 시키는 일을 말한다.

이러한 조직배양을 함으로써 잎, 줄기, 뿌리 등의 어느 부분에서도 캘러스를 만들어 낼 수가 있으며, 이것을 계대배양(繼代培養)해 감으로써 캘러스를 계속해서 만들어 낼 수 있는데 완전히 미분화된 세포의 증식이 되풀이될 뿐 아니라 배지 중의 식물호르몬의 양을 조절해 줌으로써 불규칙한 도관이나 체관[篩管]의 분화나 부정아(不定芽) 또는 부정근(不定根)의 형성, 다시 캘러스에서 완전한 개체의 형성도 이룰 수가 있어서, 캘러스는 형태형성의 연구에 유력한 재료가 된다.

본 발명자들은 대두 태좌에서 캘러스를 형성하고 이를 다시 부정근으로 유도하여, 고주파 세포배양기(100)를 이용하여 이를 조직배양하였다. 즉, 본 발명자들은 조직배양 단계에서 고주파를 처리함으로써 세포 내 유용 성분인 이차대사물질의 함량을 증가시키고자 시도하였다.

조직배양은 고주파 세포배양기(100)의 바이오 리액터 내에서 가능한데, 바이오 리액터는 상온상압에서 특이성이 높은 반응을 효율적으로 조절하는 효소가 갖는 특성을 이용하여 물질생산 등에 사용하는 장치를 의미한다. 원래는 생체반응을 이용하여 미생물 또는 세포를 배양시켜 물질을 생산하는 장치를 가리키지만 고정화 효소나 미생물 등을 이용한 여러 가지 화학반응을 하게 하는 반응장치를 의미하는 경우가 많으며, 유용물질의 공업적 규모의 대량생산이나 특정 생체성분의 미량정량에 의한 질병진단용 등으로 사용되고 있다. 기존의 배양 방법은 병 하나하나에 고체배지를 제조하여 치상 하였다면 생물반응기는 대량의 액체배지를 용기에 넣어 공기를 주입시키며 배양하는 것으로, 기존의 배양방법보다 많은 양을 동시에 배양시킬 수 있고 성장도 우량하여 훨씬 빠른 시간에 우량한 묘를 얻을 수 있으며, 또한, 식물의 주요성분등을 추출하는데 많이 이용되고 있다. 본 발명에서는 특히 세포 내 이차대사산물 함량을 증가시키기 위한 고주파 공급기가 함께 부착된 바이오 리액터를 사용하였는데, 그 구성에 대한 자세한 내용은 하기와 같다.

본원발명인 고주파 세포 배양기(100)는 바이오 리액터(200)와, 상기 바이오 리액터(200)에 고주파를 제공하는 고주파 공급기(300)와, 상기 바이오 리액터(200)에 공기를 제공하는 공기 공급기(400)와, 상기 고주파 공급기(300)와 연결되고 상기 바이오 리액터(200)의 진동을 기록하는 진동기록기(500)로 구성된다.

상기 바이오 리액터(200)는 내부에 수용되는 세포배양에 고주파 및 공기를 제공하여 배양시키게 된다.

상기와 같은 역할을 수행하는 바이오 리액터(200)는 소정의 크기를 가지고 형성되는 케이스(210)와, 상기 케이스(210)의 상부에 착·탈 가능하게 장착되는 상부 덮개(220)와, 상기 케이스(210)의 양측 동일선상에 장착되는 고주파 단자(230)와, 상기 케이스(210)를 지지하는 수평 지지판(240)과, 소정의 높이를 가지며 상기 수평 지지판(240)을 지지하는 고정봉(250)으로 구성된다.

그리고 상기 케이스(210)는 세포배양 및 배양액을 공급하는 주입구(211)가 상부에 형성되고, 양측 동일선상에는 고주파 장착부(212)가 형성되며, 하부에는 공기 주입부(213)가 형성된다.

즉 상기 케이스(210)는 상, 하부가 뒤집힌 호리병 형상으로 형성되면서 상부와 양측 동일선상 및 하부에 주입구(211)와 고주파 장착부(212) 및 공기 주입부(213)가 내부와 연통되도록 형성되는 것이다.

또한 상기 케이스(210)의 상부에 착·탈 가능하게 장착되는 상부 덮개(220)는 고정 또는 분리를 통해 상기 케이스(210)의 내부를 개방 또는 폐쇄하게 된다.

다음으로 상기 케이스(210)를 구성하는 고주파 장착부(212)에 각각 장착되는 고주파 단자(230)는 고주파 공급기(300)를 통해 전달되는 고주파를 케이스(210)의 내부에 전달하게 된다.

그리고 본원발명에서 상기 고주파 단자(230)는 "ㅓ"자 형상으로 형성되는 단단자부(231)와, 상기 단자부(231)의 일 측에 장착되면서 케이스(210)의 고주파 장착부(212)와 밀착되는 밀봉부재(232)와, 상기 단자부(231)에 일 측이 결합되고 반대 측이 고주파 공급기(300)에 전달되는 연결선(233)으로 구성된다.

즉 상기 고주파 단자(230)는 고주파 공급기(300)와 연결디는 연결선(233)을 통해 고주파를 전달받은 후 상기 고주파를 단자부(231)를 통해 케이스(210)의 내부에 전파되도록 한 것이다.

또한 상기 케이스(210)를 지지하는 수평 지지판(240)은 소정의 두께와 지름을 가지는 판으로 제작되고 중앙에는 케이스(210)를 고정하는 고정공(241)이 관통형성된다.

그리고 상기 수평 지지판(240)의 가장자리 둘레를 따라 하부에 수직으로 장착되는 고정 봉(250)은 소정의 높이를 가지는 공지된 봉이나 바를 택일하여 구성된다.

이때 상기 케이스(210) 및 수평 지지판(240)과 상기 수평 지지판(240) 및 고정 봉(250)의 연결부분에는 충격 및 진동의 감소를 위하여 고무, 실리콘, 합성수지 중 선택된 재질로 형성되는 완충부재(260)가 각각 장착된다.

여기서 상기 완충부재(260)는 중공형상으로 형성되면서 상, 하부에 간격을 두고 엠보싱 돌기가 선택적으로 형성될 수 있음을 밝힌다.

상기 고주파 공급기(300)는 고주파를 발생시키는 작동부(미도시)와, 온/오프 작동 및 고주파를 조절하는 조작부(310)와, 현재상태 및 작동상태를 나타내는 표시부(320)와, 주파수의 상태를 표시하는 레벨메타(330)로 구성되어 상기 바이오 리액터(200)에 고주파를 제공하게 된다.

여기서 상기 작동부는 공지된 고주파 공급기를 구성하는 작동부의 구성을 택일하여 구성되고 별도의 설명은 생략하기로 한다.

즉 상기 고주파 공급기(300)는 조작부(310)의 작동에 따라 작동부가 연동작동하면서 상기 바이오 리액터(200)의 고주파 단자(230)에 고주파를 공급하고, 현재 상태는 표시부(320)와 레벨 메타(330)를 통해서 실시간으로 확인할 수 있게 되는 것이다.

상기 공기 공급기(400)는 소정의 크기를 가지며, 내부에 공기 생성부(미도시)가 장착되고, 전방에는 공기를 배출하는 배출구(420)가 형성되며, 상기 배출구(420)에는 공기를 전달하는 공기 호스(440)가 장착되어 상기 바이오 리액터(200)에 공기를 제공하게 된다.

여기서 상기 공기 생성부는 공지된 공기 공급기나 공기 공급장치를 구성하는 공기 생성부의 구성을 택일하여 구성되고 별도의 설명은 생략하기로 한다.

즉 상기 공기 생성부(400)는 입력되는 신호에 따라서 공기 생성부를 통해 공기를 생성한 후 상기 배출구(420)와 공기 호스(440)를 통해 상기 바이오 리액터(200)의 케이스(210)에 공기를 공급하게 되는 것이다.

상기 진동기록기(500)는 진동을 변환 및 기록하는 진동 작동부(미도시)와, 온/오프 작동 및 각종 기능을 조절하는 진동 조작부(510)와, 현재상태를 나타내는 진동 표시부(520)와, 상기 고주파 공급기(300)와 연결되는 연결선(530)으로 구성된다.

여기서 상기 진동 작동부는 공지된 진동기록기에 장착되는 진동 작동부를 택일하여 구성되고 별도의 설명은 생략하기로 한다.

즉 상기 진동기록기(500)는 고주파 공급기(300)와 연결되는 연결선(530)와 진동 표시부(520)를 통해 상기 바이오 리액터(200)의 진동상태를 실시간으로 확인할 수 있게 되는 것이다.

상기와 같이 구성되는 고주파 세포 배양기(100)의 실시 예를 참조로 설명하면 다음과 같다.

먼저, 소정의 크기를 가지고 형성되는 케이스(210)와, 상기 케이스(210)의 상부에 착·탈 가능하게 장착되는 상부 덮개(220)와, 상기 케이스(210)의 양측 동일선상에 장착되는 고주파 단자(230)와, 상기 케이스(210)를 지지하는 수평 지지판(240)과, 소정의 높이를 가지며 상기 수평 지지판(240)을 지지하는 고정봉(250)으로 구성되는 바이오 리액터(200)를 준비한다.

그리고 상기 바이오 리액터(200)와 간격을 두고 고주파를 발생시키는 작동부(미도시)와, 온/오프 작동 및 고주파를 조절하는 조작부(310)와, 현재상태 및 작동상태를 나타내는 표시부(320)와, 주파수의 상태를 표시하는 레벨메타(330)로 구성되는 고주파 공급기(300)를 설치한다.

다음으로 상기 고주파 공급기(300)와 간격을 두고 소정의 크기를 가지며, 내부에 공기 생성부(미도시)가 장착되고, 전방에는 공기를 배출하는 배출구(420)가 형성되며, 상기 배출구(420)에는 공기를 전달하는 공기 호스(440)가 장착되는 공기 공급기(400)를 설치한다.

그리고 상기 공기 공급기(400)의 일 측으로 진동을 변환 및 기록하는 진동 작동부(미도시)와, 온/오프 작동 및 각종 기능을 조절하는 진동 조작부(510)와, 현재상태를 나타내는 진동 표시부(520)와, 상기 고주파 공급기(300)와 연결되는 연결선(530)으로 구성되는 진동기록기(500)를 장착하면 고주파 세포 배양기(100)의 조립은 완료되는 것이다.

여기서 상기 고주파 세포 배양기(100)의 조립 순서는 상기와 다르게 구성될 수 있음을 밝힌다.

다음으로 상기와 같이 구성되는 고주파 세포 배양기(100)의 사용상태를 살펴보면 다음과 같다.

먼저 상기 바이오 리액터(200)를 구성하는 케이스(210)의 주입구(211)를 폐쇄하고 있는 상부 덮개(220)를 개방한 후 상기 케이스(210)의 내부에 배양액과 세포배양을 공급한 상기 주입구(211)를 상부 덮개(220)를 이용하여 폐쇄한다.

그리고 상기 고주파 공급기(300)를 구성하는 조작부(310)를 이용하여 고주파의 설정 값을 조절한 후 연결선(233)을 이용하여 바이오 리액터(200)의 고주파 단자(230)에 고주파를 전달한다.

동시에 상기 공기 공급기(400)에서 발생하는 공기를 공기 호스(440)를 이용하여 상기 바이오 리액터(200)의 공기 주입부(213)에 공급한다.

다음으로 상기 케이스(210)의 내부에 수용된 세포배양은 고주파 단자(230)를 통해 전달되는 고주파의 영향을 전달받게 되고, 사용자는 표시부(320)와 레벨메타(330)를 통해 실시간으로 공급되는 고주파의 정보를 확인하게 된다.

더불어 상기 고주파 공급기(300)에 전달되는 바이오 리액터(200)의 진동을 진동기록기(500)를 통해 기록하면 되는 것이다.

이하, 상기 고주파 장치를 이용하여 생리활성물질 함량을 증가시키기 위한 세포 배양방법의 실시예를 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

배양 조직의 표면 소독

본 발명자들은 식물 세포 배양을 위하여 대두 태좌를 이용하였는데, 이는 태좌조직이 식물의 씨앗을 만들어주는 조직으로서 보다 다양한 피토케미칼(phytochemicals)이 발현되고 그 발현량 또한 높은 부위라는 점에 착안한 것이다. 태좌는 암술의 씨방 안에서 밑씨가 붙는 부분으로, 보통 씨방을 형성하는 심피의 가장자리에 있으나, 때로는 심피의 중맥에도 있으며, 씨방의 기저나 기저로부터 씨방 안에 직립하는 기둥 모양으로 생기기도 하는 조직이다.

본 발명자들은 대두 태좌 조직으로부터 캘러스를 유도하기 위하여 우선 소독 단계를 진행하였다. 이를 위하여 우선 대두 태좌를 적절한 크기로 자른 다음, 태좌의 표면을 흐르는 물에서 약 6시간 씻어주었다. 깨끗하게 씻은 대두 태좌 조직을 70% 에탄올로 5초간 침지하여 1차 소독하고 멸균수로 3회 세척한 후, 다시 4% NaOCl 용액에 10분간 처리하여 표면 살균 후, 무균상 내에서 멸균수로 3회 세척하고 멸균된 필터지로 물기를 제거하였다.

< 실시예 2>

캘러스 유도

본 발명자들은 상기 세척된 대두 태좌 조직을 가로*세로, 약 5mm*5mm 크기로 자르고 이로부터 캘러스를 유도하기 위하여, 식물생장조절물질인 옥신 종류인 IAA(Indole acetic acid) 2mg/L, 사이토키닌 종류인 BAP(6-benzylaminopurine) 2mg/L과 수크로오즈 30g/L, 한천배지인 젤라이트(gelite) 2g/L를 함유한 MS(Murashige and Skoog) 기본배지에 상기 세척된 식물 조직을 치상하여 25±2℃에서 4주간 배양하였다. 그 결과, 도 1B에서 볼 수 있는 바와 같은 캘러스를 확인할 수 있었다.

<실시예 3>

부정근 유도

본 발명자들은 실시예 2에서 유도된 캘러스를 이용하여 다시 부정근을 유도하였다. 부정근이란 종자의 배에서 유래하는 정단분열조직에 발달하는 뿌리가 아닌 삽목, 삽엽 혹은 조직배양시에 나타나는 뿌리를 말한다.

부정근 배양을 위하여 본 발명자들은 식물생장조절물질인 IBA(indole-3-butyric acid) 2mg/L, MES Monohydrate(2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid)) 0.5g/L, Benzyladenine 2mg/L, 수크로오즈 30g/L, 한천배지인 젤라이트(gelite) 2g/L를 함유한 MS(Murashige and Skoog) 기본배지에 상기 캘러스를 치상하여 21±1℃에서 4주간 배양하였다. 배양시 pH는 5.8로 하고, 암실 조건에서 배양하였다.

본 발명자들은 상기와 같은 부정근 배양을 통하여 생합성 발현에 뿌리의 분화가 불가피한 성분의 생산도 가능하도록 하였다.

< 실시예 4>

고주파 처리에 의해 유도되는 생리활성물질 비교

본 발명자들은 상기 유도된 부정근에 고주파를 처리하여 유도되는 생리활성물질을 비교하고자 하였다. 우선 본 발명자들은 상기 부정근을 상기 고주파 세포 배양기에서 배양하면서 부정근에 하루동안 고주파를 240 또는 270kHz로 하여 5분 간격으로 3번 처리하고 이를 일주일 또는 이주일간 반복하였다. 바이오 리액터의 반응 부피는 1L, 전력은 20W, 세포 배양 배지의 조성은 MS 배지 파우더 4.4g, 수크로오스 30g, 벤질 아데닌 2mg, IAA 2mg, 버퍼용 MES(pH 5.8)으로 하였다.

상기 배지에서 일주일간 배양하며 고주파 처리된 상기 샘플은 회수한 후 6 내지 10시간 동안 진공 건조하였다. 이후, 50% 에탄올을 용매로 1시간 초음파 추출하고 30분간 볼텍싱(vortexing)하였다. 충분하게 이차대사산물이 나온 상등액을 원심분리한 후 수득하였다. 모든 샘플은 HPLC(Waters 650E Advanced Protein Purification System)를 이용하여 분석하였으며, Gemini 5u C18 110A(4.6*250mm, 5 micron, Phenomenex 사) 컬럼을 사용하였다. 이동상 용매의 농도구배는 물(0.1% TFA(Trifluoro acetic acid)함유):아세토니트릴(Acetonnitrile, 0.1% TFA(Trifluoro acetic acid)함유)를 초기 0-45분에는 10:0, 45-50분에는 1:9로 변화시키며 유속 1ml/min으로 하여 분석하였다. 검출기는 UV 검출기(230nm)를 이용하였다.

상기 HPLC에 의하여 고주파를 처리하지 않은 경우에 비해, 고주파 처리에 의해 그 양이 현저히 증가하는 이차대사산물의 프로파일을 분석한 결과, 가장 현격한 결과를 보인 것이 다이드제인(daidzein) 및 이퀄(equol)임을 확인할 수 있었다(도 2). 즉, 다이드제인의 양은 고주파 처리에 의해 약 5.4배까지 증가되는 것으로 확인되었고, 또한, 고주파를 이용하여 하루 동안 고주파를 240kHz, 전력20W로 하여 5분 간격으로 3번 처리하고 이를 이주일간 반복하였을시, 이소플라본 종류 중 이퀄(equol) 함량 또한, 약 5.9배까지 증가되는 것으로 확인되었다 (도 4).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

100: 고주파 세포 배양기 200: 바이오 리액터
210: 케이스 211: 주입구
212: 고주파 장착부 220: 상부 덮개
230: 고주파 단자 231: 단자부
232: 밀봉부재 233: 연결선
240: 수평 지지판 241: 고정공
250: 고정봉 260: 완충부재
300: 고주파 공급기 310: 조작부
320: 표시부 330: 레벨메타
400: 공기 공급기 420: 배출구
440: 공기 호스 500: 진동기록기
510: 진동 조작부 520: 진동 표시부
530: 연결선

Claims (10)

1. (a) 식물 세포를 배지에 접종하여 배양하는 배양단계; 및
   (b) 식물 세포 내 생리활성물질 함량을 증가시키기 위하여 배양된 세포에 고주파를 처리하는 고주파 처리단계를 포함하는, 세포 내 생리활성물질 함량 증가를 위한 세포 배양방법.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 고주파는 0.1 내지 15 MHz로 처리되는 것을 특징으로 하는 세포 배양방법.
3. 제2항에 있어서,
   상기 배양단계는
   (a1) 발아한 식물로부터 캘러스를 유도하기 위하여 IAA(Indole acetic acid), BAP(6-benzylaminopurine), 수크로오스(sucrose), 젤라이트(gelite)를 함유한 MS 기본배지에서 2 내지 5주간 배양하는 캘러스 유도단계; 및
   (a2) 상기 캘러스로부터 부정근을 유도하기 위하여 IBA(indole-3-butyric acid), MES Monohydrate(2-(N-morpholino), Benzyladenine, 수크로오스(sucrose), 젤라이트(gelite)를 함유한 MS 기본배지에서 2 내지 5주간 배양하는 부정근 유도단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양방법.
4. 제3항에 있어서,
   상기 고주파는 하루에 2 내지 10분 간격으로 3회 처리하되, 이를 5 내지 15일간 반복 처리하는 것을 특징으로 하는 세포 배양방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 생리활성물질은 알칼로이드(alkaloids), 플라보노이드(flavonoids), 테르페네노이드(terpenenoids), 글리코사이드(glycosides), 대사색소(metabolite pigments)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 이차대사산물인 것을 특징으로 하는 세포 배양방법.
6. 제5항에 있어서,
   상기 플라보노이드 이차대사산물은 이소플라본(isoflavones), 플라보놀(flavonols), 플라바논(flavanones), 플라본(flavones), 플라반-3-올(flavan-3-ols), 안토시아닌(anthocyanins)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 이차대사산물인 것을 특징으로 하는 세포 배양방법.
7. 제6항에 있어서,
   상기 이소플라본은 다이드제인(daidzein), 제니스테인(genistein), 이퀄(equol)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 이차대사산물인 것을 특징으로 하는 세포 배양방법.
8. 내부에 수용되는 세포에 고주파 및 공기를 제공하여 배양시키는 바이오 리액터와;
   세포 내 생리활성물질 함량을 증가시키기 위하여 상기 바이오 리액터에 고주파를 제공하는 고주파 공급기와;
   상기 바이오 리액터에 공기를 제공하는 공기 공급기와;
   상기 고주파 공급기와 연결되고 상기 바이오 리액터의 진동을 기록하는 진동기록기;를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 고주파 세포 배양기.
9. 제8항에 있어서, 상기 바이오 리액터는,
   세포배양 및 배양액을 공급하는 주입구가 상부에 형성되고, 양측 동일선상에는 고주파 장착부가 형성되며, 하부에는 공기 주입부가 형성되는 케이스와;
   상기 주입구를 개방 또는 폐쇄하는 상부 덮개와;
   상기 고주파 장착부에 각각 장착되고 상기 고주파 공급기를 통해 전달되는 고주파를 전달하는 고주파 단자와;
   판 형상으로 형성되고 중앙에는 케이스를 지지하는 고정공이 형성되는 수평 지지판과;
   상기 수평 지지판의 가장자리 둘레를 따라 하부에 수직으로 장착되는 고정 봉;을 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 고주파 세포 배양기.
10. 제9항에 있어서,
    상기 케이스 및 수평 지지판과 상기 수평 지지판 및 고정 봉의 연결부분에는 충격 및 진동의 감소를 위하여 완충부재가 각각 장착되는 것을 특징으로 하는 고주파 세포 배양기.
    

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