CN106924316B - 含高山火绒草植物细胞培养提取物的皮肤外用剂组合物及其制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含有高山火绒草植物细胞培养物提取物的具有抗炎和抗衰老效果的皮肤外用剂组合物及其制造方法，更详细地涉及一种含有诱导自高山火绒草植物体的植物细胞培养物、不定根培养物或其提取物的具有抗炎、抗衰老效果的皮肤外用剂组合物及其制造方法。根据本发明的含有高山火绒草植物细胞或不定根培养物、或其提取物的皮肤外用剂组合物不但对皮肤细胞无毒性，而且还具有改善皮肤皱纹、治愈创伤、收缩毛孔、抑制皮脂分泌和改善粉刺等效果。

Description

含高山火绒草植物细胞培养提取物的皮肤外用剂组合物及其 制造方法

技术领域

本发明涉及一种含有高山火绒草(Edelweiss,Leontopodium alpinum)植物细胞培养物提取物的抗炎和抗衰老皮肤外用剂组合物及其制造方法，更详细地讲，涉及一种含有诱导自高山火绒草植物体的植物细胞培养物、不定根培养物或其提取物的、具有抗衰老、美白、治愈创伤、抗炎、抑制皮脂、抑制粉刺、保护皮肤免受紫外线损伤、保护皮肤屏障等效果的皮肤外用剂组合物及其制造方法。

背景技术

随着岁月的流逝，用以调节人体新陈代谢的各种激素的分泌逐渐减少、且免疫细胞的功能和细胞活性也逐渐下降，从而使人体所必需的免疫蛋白和组成人体的蛋白质生物合成逐渐减少而引起的内因性老化(intrinsic aging)，以及作为外因由各种污染物质和紫外线照射引起的光老化(photoaging)，通过上述内因性老化和光老化，皮肤变得越来越薄(发生内因性老化的情况下)，皮肤弹性下降，随着在紫外线照射下的暴露，表皮内的角质形成细胞和黑色素细胞受到紫外线的损伤。其中，皮肤老化可分成自然老化(chronologicaging)和光老化(actinic ageing)，上述自然老化发生在没有被暴露于太阳光下的部位，上述光老化是由发生在太阳光暴露部的退行性变化和自然老化联合而引起的。自然老化的临床特征在于可在皮肤上观察到微细皱纹、真皮萎缩、皮下脂肪层减少等。光老化过程中，出现又粗又深的皱纹(coatse wrinkling and furrowing)，皮肤因非正常弹性物质(elastotic material)的累积而变得像皮革一样厚且松弛。在受到慢性日光损伤的皮肤上有可能出现下述现象：位于真皮上方侧的胶原质中发生非正常弹性物质的沉着(solarelastosis)和会增加蛋白聚糖(proteoglycan)，从而使作为真皮层主要组成蛋白质的胶原蛋白的含量显著减少。胶原蛋白赋予皮肤韧度和张力，从而起到保护皮肤免受外部刺激或外力的损伤，胶原蛋白在真皮层中占90％，因此胶原蛋白含量的减少与皮肤老化具有密切的关系。在构成皮肤的细胞中，因发生内因性老化或光老化而导致细胞活性的降低，且信号传递系统变得不完整，从而使作为用以分解皮肤组织的酶的基质金属蛋白酶(MMPs，matrixmetalloproteinases)的生物合成能力得到提高，同时胶原蛋白的生物合成能力却在减少，从而使黑色素生成量增加，由此导致皱纹增加、皮肤弹性下降、以及皮肤黑化的现象。由此已知，通过细胞的增殖或增加构成皮肤基质物质的方式，由此能够使皮肤变厚的物质、对用以分解皮肤构成基质物质胶原蛋白的MMPs的生物合成起到抑制作用的物质、抑制黑色素生物合成的物质对皱纹、弹性消失、皮肤黑化等皮肤症状起到缓解作用。

目前，虽然正在积极进行对具有治愈创伤、防止老化和抗炎效果的物质的研究，但现有化学物质因其毒性、低活性、用途的局限性、以及服用过量会引起副作用等的问题而在使用上受到局限，因此以开发出副作用较小的原料为重要环节，积极进行从天然植物中提取有效成分的研究。然而，实际上，即使在采用天然植物的情况下，从安全性、稳定性、变色可能性等方面来看，当其使用量超过化妆品或药品的有效浓度以上时存在较多问题，并没有达到让人满意的效果。

另一方面，高山火绒草属于双子叶植物菊目菊科的多年生草本。高山火绒草的花被为6～9片，呈白色，副花冠的高度为4mm左右并呈黄色。副花冠形状因品种而不同，可呈白色、橘黄色和黄色。

最近，利用植物性资源开发功能性食品、以及将植物资源用作化妆品材料的研究在盛行，然而针对高山火绒草的研究，现有技术中仅存在含有高山火绒草提取物的皮肤组织再生和毛发生长促进剂(专利文献1)，却关于将从高山火绒草中培养的植物细胞、不定根培养物或其提取物本身用以化妆品材料的研究尚不存在的水平。

专利文献1：PCT国际专利申请公开公报WO2013180526

发明内容

本申请的发明人通过研究已确认高山火绒草的植物细胞、不定根的培养物或其提取物具有抗炎、抗老化、治愈创伤等的效果，并完成了本发明。

由此，本发明的目的在于，提供一种将高山火绒草的植物细胞、不定根培养物或其提取物作为有效成分含有的用来改善皮肤的皮肤外用剂组合物。

在本发明中，上述的改善皮肤用途包括改善皱纹、治愈创伤、缓解并抑制和改善皮肤炎症、抑制皮脂分泌、抑制或改善粉刺、使皮肤免受紫外线损伤、缓解和减轻或恢复受到的紫外线损伤、保护和改善皮肤屏障、皮肤美白、皮肤保湿等。

本发明的另一个目的在于，将上述高山火绒草的植物细胞、不定根培养物或其提取物作为有效成分含有的用来改善皮肤的皮肤外用剂组合物的制造方法。

为了达到上述目的，本发明提供一种将高山火绒草的植物细胞、不定根培养物或其提取物作为有效成分含有的用来改善皮肤的皮肤外用剂组合物。

而且，本发明还提供一种将高山火绒草的植物细胞、不定根培养物或其提取物作为有效成分含有的用来抑制或改善皮肤皱纹的皮肤外用剂组合物。

而且，本发明还提供一种将高山火绒草的植物细胞、不定根培养物或其提取物作为有效成分含有的用来治愈创伤的皮肤外用剂组合物。

而且，本发明还提供一种将高山火绒草的植物细胞、不定根培养物或其提取物作为有效成分含有的用来缓解或改善皮肤炎症的皮肤外用剂组合物。

而且，本发明还提供一种将高山火绒草的植物细胞、不定根培养物或其提取物作为有效成分含有的用来收缩毛孔的皮肤外用剂组合物。

而且，本发明还提供一种将高山火绒草的植物细胞、不定根培养物或其提取物作为有效成分含有的用来抑制皮脂、皮肤保湿和皮肤美白的皮肤外用剂组合物。

而且，本发明还提供一种将高山火绒草植物细胞、不定根培养物或其提取物作为有效成分含有的用来抑制或改善粉刺的皮肤外用剂组合物。

而且，本发明还提供一种将高山火绒草的植物细胞、不定根培养物或其提取物作为有效成分含有的用来防止皮肤免受紫外线损伤、缓解、减轻和恢复由紫外线引起的损伤的皮肤外用剂组合物。

而且，本发明还提供一种将高山火绒草的植物细胞、不定根培养物或其提取物作为有效成分含有的用来改善皮肤的皮肤外用剂组合物的制造方法，其特征在于，上述制造方法包括下述阶段：(a)分离出高山火绒草植物的叶组织或茎组织，并将其培养成植物细胞或不定根；以及(b)制造出含有上述高山火绒草植物细胞培养物、不定根培养物或其提取物的皮肤外用剂组合物。其中，本发明的特征在于，上述(a)阶段为(i)分离出上述高山火绒草植物的叶组织或茎组织，并将其放在含6-苄氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BAP)、2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)的培养基内进行培养，从而获得植物细胞培养物的阶段，或者是(ii)分离出上述高山火绒草植物的叶组织或茎组织，并将其放在含吲哚丁酸(IBA)的培养基内进行培养，从而获得不定根培养物的阶段。

在本发明的上述(b)阶段，其特征在于，该阶段还包括对从上述(a)阶段获得的高山火绒草植物细胞培养物或不定根培养物进行干燥、粉末化处理后，并将其放进精制水中进行混合以制造出组合物的工序；或者进行粉末化处理后将其放进精制水中进行混合，然后经过超音波提取或热水提取处理制造出组合物的工序。

根据本发明的含有高山火绒草植物细胞或不定根培养物或其提取物的皮肤外用剂组合物，其对皮肤细胞不仅没有毒性，而且具有皮肤美白、改善皮肤皱纹、收缩毛孔、治愈皮肤创伤、抑制皮脂、抑制粉刺、让皮肤免受紫外线损伤、保护皮肤屏障、皮肤保湿、缓解皮肤炎症等效果。

附图说明

图1是表示实施例1中高山火绒草植物细胞培养(愈伤组织)结果的照片。

图2是表示高山火绒草植物细胞培养物的高效液相色谱(HPLC)分析结果的图表。

图3是表示为了确定高山火绒草植物细胞培养提取物是否具有保湿效果而采用的AQP3mRNA的相对强度图表。

图4是表示为了确定高山火绒草植物细胞培养提取物是否具有改善皱纹效果而采用的MMP-2mRNA相对强度图表。

图5是表示通过伤口愈合试验以确定高山火绒草植物细胞培养提取物的治愈创伤效果的图表。

图6是表示用以确定高山火绒草植物细胞培养提取物是否对紫外线照射起到保护效果的结果图表。

图7是表示应用于本发明高山火绒草植物细胞培养物的高频处理的高频处理装置结构图。

符号说明

100高频细胞培养器 200生物反应器 210壳体 211注入口

212高频安装部 220上部盖子 230高频端子 231端子部

232密封部件 233连接线 240水平支撑板 241固定孔

250固定棒 260缓冲部件 300高频供给器 310操作部

320显示部 330电平指示仪 400空气供给器 420排出口

440空气软管 500振动记录器 510振动操作部 520振动显示部

530连接线

具体实施方式

本发明涉及一种将高山火绒草的植物细胞、不定根培养物或其提取物作为有效成分含有的皮肤外用剂组合物及其制造方法。

根据本发明的一个方面，涉及一种将高山火绒草的植物细胞和不定根培养物或其提取物作为有效成分含有的用来改善皮肤的皮肤外用剂组合物。

本发明中“皮肤改善用”是指改善皮肤的状态，如可包括有炎症时可缓解、预防和减轻炎症、抗老化、改善和抑制皮肤皱纹、治愈创伤、收缩毛孔、增加皮肤弹性、抑制由紫外线引起的损伤、抑制皮脂、抑制粉刺、皮肤美白、保护或改善皮肤屏障和皮肤保湿等功能。

本发明中“含有有效成分”是指，作为皮肤外用剂组合物，能够显示出如上所述的改善皮肤效果，即如改善皱纹、通过抗氧化功能的创伤治愈、抗炎等多种效果的有效含有量。

本发明中的高山火绒草植物细胞培养物，其通过将高山火绒草植物体的一部分、如切割整个或部分茎或叶后放进诱导培养基中进行培养的方式来获得。

如上所述的诱导培养是涉及植物组织培养的一种技术，对小的活体植物组织在体外(in vitro)进行无菌培养后，根据不同的培养目的，对植物细胞、器官和植物体进行增殖处理的技术。由此看出，植物组织培养是利用了植物本身所具有的基本特性。植物组织培养技术是以植物所具有的独特特性、即从植物体细胞再生为完整植物体的植物细胞全能性(totipotency)为基础的技术。即，如果将植物单细胞(包括原生质体)、叶和根的切片放进添加有特定营养物质和生长调节剂的培养基内进行培养，则从它们的细胞和组织能够再生出植物体。植物之所以具有这样的植物细胞全能性(totipotency)是植物所具有的附着特性和为长期生存而在恶劣环境以及免遭草食动物采食而采取的战略。由此可以看出，植物是具有能够再生出被失去器官的能力的。从母本植株中分离出的植物组织细胞在适宜培养环境中培养时可再生为完整的植物体的潜力，即具有全能性的植物虽然在植物胚胎学等方面具有学术重要性，但在化妆品原料等实用化方面也具有很大的应用价值。

“植物细胞培养物”是指，将切割自植物体的组织放进含植物生长激素的培养基中进行培养、或者使某种植物创伤、或者用植物生长激素处理伤口时所生成的特殊组织或细胞块。一般来说，愈伤组织作为失去正常的器官形成或组织分化能力的无定形组织或细胞块，大部分由薄壁组织组成。广义上来讲，也包括由土壤杆菌(agrobacterium)等的感染引起的植物肿瘤组织。

由此，根据本发明，从高山火绒草的茎、叶等任何一个部位都可以实施诱导培养，但作为一具体实施例，切割高山火绒草的茎和叶的部分组织、或切割由高山火绒草种子发芽而成的幼苗的子叶后进行诱导培养的植物细胞；对高山火绒草的任何组织进行部分切割后，放进已调整好植物生长激素和细胞分裂素含量的培养基内进行培养，则也可以形成植物细胞。培养不定根时，虽然其与植物细胞培养的过程相同，但为了诱导出不定根，需要不同地进行植物激素的组合。

在本发明中，上述高山火绒草植物细胞或不定根培养物、及其提取物的含量可以为组合物总重量的0.1～10重量％。

这样的比例也只能是优选范围内的比例，例如，在下述实施例中，虽然包括0.1、0.5、1重量％或2重量％情况下的试验结果，但在5％、10％的情况下也具有优异效果，这已得到确认，同时也得到在10％的情况下细胞生存率也不受影响的事实。除此之外，在20％、30％以上的情况下，也具有优异的改善皮肤效果、改善皱纹、治愈创伤和抗炎功能，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。

在本发明中，上述“皮肤改善用”包括抗炎、抗老化、改善皮肤皱纹、治愈创伤、增加皮肤弹性、抑制由紫外线引起的损伤、抑制皮脂、抑制粉刺、皮肤美白、保护或改善皮肤屏障等。

在本发明中，可以使用上述高山火绒草的植物细胞或不定根培养物(培养体)自身、或对培养物进行过滤后使用、或将培养物破碎后使用，也可以对培养物进行干燥粉末化处理后，溶解在精制水中使用。

在本发明中，“提取物”是指，被粉末化的上述高山火绒草植物细胞或不定根培养物的提取物，或者是通过冷水提取法、热水提取法、乙醇提取法、荷荷芭油提取法等以往公知的多种提取法获得的提取物。

在本发明中，对于提取方法没有特别的限制，例如可以使用冷浸提取法、超音波提取法、回流提取法、热水提取法、荷荷巴油提取法等。在此，当采用热水提取方式时，用开水蒸馏器在80～100℃温度下加热8～48小时，从而获得热水提取物。

采用冷水提取时，例如可通过下述方式得到提取物：将整个上述培养物或该培养物的干燥粉末放进15～25℃的冷水中进行混合后进行3天的提取处理，从而获得冷水提取物。

或者，可通过用水、有机溶剂或它们的混合溶剂进行提取的方式来制造。所得到的提取液可以直接使用，或对提取液进行浓缩和/或干燥处理后使用。采用有机溶剂进行提取时，可使用甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、乙烯、丙酮、己烷、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、1,3-丁二醇、丙二醇或它们的混合有机溶剂，并在不破坏药材有效成分或破坏程度最低的条件下，于室温或加温情况下进行提取处理。根据所提取的不同的有机溶剂，药材有效成分的提取程度和损失程度均会有一些差异，因此需使用适宜的有机溶剂。特别是在本发明，适宜使用乙醇提取物，优选为20～50％的乙醇提取物，作为一具体实施例优选50％乙醇提取物，其提取方法如实施例所记载，与50％乙醇混合后，进行3天的搅拌处理而得到。

在本发明中，可以对上述提取物进行浓缩或稀释处理后使用，也可以使用提取物的蒸馏液。

根据本发明的另一方面，提供一种将高山火绒草的植物细胞、不定根培养物或其提取物作为有效成分含有的用以改善皮肤的皮肤外用剂组合物的制造方法，该制造方法包括下述阶段：(a)分离出高山火绒草植物的叶组织或茎组织，并将其培养成植物细胞或不定根；以及(b)制造出含有上述高山火绒草植物细胞培养物、不定根培养物或其提取物的皮肤外用剂组合物。

上述(a)阶段为通过分离自高山火绒草植物的部分组织来获得植物组织培养物的过程，即获得植物细胞培养物或不定根培养物的过程。

在本发明中，也可以从上述高山火绒草植物体中分离出叶或茎组织来使用。

在本发明中，为了从上述被分离的组织诱导出植物细胞培养物、不定根培养物，可以选择适宜的培养基。具体来说，在上述(a)阶段，为了培养高山火绒草的植物细胞或不定根，可以选择适宜的培养基。只要是本领域中常用于植物组织培养的培养基均可以使用，对此没有限制。针对植物，通常主要使用MS培养基、B5培养基，作为其一例，MS培养基(1L为标准)的成分由NH₄NO₃ 1650mg、KNO₃ 1900mg、CaCl₂·2H₂O 440mg、MgSO₄·7H₂O 370mg、KH₂PO₄170mg,、KI 0.83mg、H₃BO₃ 6.2mg、MnSO₄·4H₂O 22.3mg、ZnSO₄·7H₂O 8.6mg、Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg、CuSO₄·5H₂O 0.025mg、CoC_l2·6H₂O 0.025mg,、FeSO₄·7H₂O 27.8mg、Na₂EDTA·2H₂O37.3mg、肌醇(Myoinositol)100mg、烟酸(Nicotinic acid)0.5mg、盐酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl)0.5mg、盐酸硫胺素(Thiamine-HCl)0.5mg、甘氨酸(Glycine)2mg、蔗糖(Sucrose)30000mg组成。

从植物的叶子、植物的茎等诱导出植物细胞进行培养时，MS基本培养基的组成成分几乎没有什么差异，但诱导植物细胞、不定根时，作为最重要成分的植物生长激素的种类是不同的。

根据本发明的植物细胞培养、采用叶或茎组织进行植物细胞培养时，将其放在含6-苄氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BAP)、2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)的培养基内进行培养，由此可以得到植物细胞培养物。

在各个激素组合的比例中，6-苄氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BAP)和2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)的比例特征为1:0.4～0.8或1:0.5～0.6。即，相对于100重量份的6-苄氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BAP)，2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)占40～80重量份或50～60重量份。

例如，6-苄氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BAP)和2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)的含量可以优选为0.5～1mg/ml和0.3～0.6mg/ml。

另一方面，培养不定根时，将其放在含吲哚丁酸(Indole-3-butyric Acid，IBA)的培养基内进行培养，由此获得不定根培养物。例如，可以在含0.2～1mg/ml IBA的培养基内进行培养获得不定根培养物。

在本发明的上述(a)阶段中，还可以包括用UVA处理3～6小时，或往150uM～400uM培养基内添加莽草酸进行培养的工序。

在本发明中，为了提高治愈创伤、抗老化、抗炎、抑制皮脂、改善粉刺、皮肤免受紫外线损伤、保护和改善皮肤屏障、皮肤美白、皮肤保湿等效果，也可以包括用引诱剂处理的工序。

更详细地说，这样的引诱剂处理包括UVA处理、莽草酸处理、高频处理，而且也使酚类化合物、类胡罗卜素、类黄酮的含量增加。其详细条件如下，还可以包括下述工序：

1)UVA:按照用作为物理引诱剂的UV-A荧光灯(20W，Sankyo Denki，Japan)每天处理0.5h～8h的方式进行培养。

2)莽草酸：将200～600M莽草酸(shikimic acid)添加到MS培养基内进行培养。

3)高频处理：将已培养好的植物细胞或不定根，在50～500kHz的条件下以5～30分钟的间隔进行2～6次的高频处理。

特别是，本发明中的高频处理可以采用本领域中通常所使用的器具(ITC株式会社、NEO株式会社等)、或韩国专利申请第10-2012-0127017号(大韩民国专利公开10-2014-0060201号)所公开的高频处理装置。

本发明中，对于如上所述的高频处理装置，只要是能够发生和处理200-1500kHz高频的装置均可以适用。

本发明中，培养出上述高山火绒草的植物细胞或不定根后，利用高频发生装置优选在100～400kHz频率下，一天当中以15分钟的间隔处理四次，并将该处理方式重复一周或两周。

具体来说，对于在上述韩国专利申请第10-2012-0127017号所公开的高频处理装置，其构成如图7所示，以下对其制造过程和高频处理过程进行详细说明。

首先准备由下述组件构成的生物反应器200，该生物反应器200包括：具有规定大小的壳体210、在上述壳体210上方按照可拆卸的方式配置的上部盖子220、配置于上述壳体210两侧同一线上的高频端子230、支撑上述壳体210的水平支撑板240、具有规定高度且支撑上述水平支撑板240的固定棒250。而且，按照离上述生物反应器200有一定间隔的方式设置高频供给器300，该高频供给器300由用以生成高频的工作部(未图示)、启动/结束工作和调节高频的操作部310、显示当前状态和工作状态的显示部320和表示频率状态的电平指示仪330组成。然后，按照离上述高频供给器300有一定间隔且呈规定大小的方式设置的空气供给器400，该空气供给器400包括：配置于内部的空气生成部(未图示)，配置在前方用以排出空气的排出部420、向上述排出部420传输空气的空气软管440。而且，如果在上述空气供给器400的一侧配置振动记录仪500，则完成了高频细胞培养器100的组装，其中，上述振动记录仪500包括：用以改变和记录振动的振动工作部(未图示)、用来调整开启/结束工作和各种功能的振动操作部510、显示当前状态的振动显示部520、以及与上述高频供给器300相连接的连接线530。在此，上述高频细胞培养器100的组装顺序可以按照与上述情况不同的方式来构成。

接下来，观察通过上述方式组成的高频细胞培养器100的使用状态，情况如下：首先，打开构成上述生物反应器200的、处于堵塞壳体210注入口211状态的上部盖子220，并向上述壳体210的内部供给培养液和细胞培养，然后利用上部盖子220关闭上述注入口211。

接着，通过构成上述高频供给器300的操作部300调整好高频设定值后，利用连接线233，将高频传送到生物反应器200的高频端子230上。

同时，通过空气软管440将发生在上述空气供给器400内的空气输送到上述生物反应器200的空气注入部213。然后，被收纳在上述壳体210内部的细胞培养会受到通过高频端子230传输的高频影响，使用者通过显示部320和电平指示仪330可以获得实时供给的高频信息。

同时，振动记录仪500对传送到上述高频供给器300的生物反应器200的振动状态进行记录。

对于上述高频细胞培养器100，在生物反应器200的培养结束后，操作部310通过高频供给器300对作为物理引诱剂的高频进行调整，同时振动记录部500经过振动显示部520的确认后进行处理。

在培养植物细胞、不定根时，采用上述高频细胞培养器的情况下，例如，生物反应器的反应体积为1L、功率为20W、用以细胞培养的培养基组成成分为MS培养基粉末4.4g、蔗糖30g、苄基腺嘌呤2mg、IAA 2mg、缓冲用MES(pH 5.8)，在上述培养基内培养一周后进行高频处理，然后将经过上述处理的样品回收后进行6～10小时的真空干燥处理。然后，以50％乙醇为溶剂，实施1个小时的超音波提取和30分钟的涡流处理(vortexing)，对充分分离出次级代谢产物的上清液进行离心处理后得到样品，所有样品均采用高效液相色谱仪(HPLS，Waters 650E Advanced Protein PurificationSystem)分析方式，此时使用Gemini 5uC18110A色谱柱(4.6*250mm,5micron，phenomenex公司)。流动相溶剂的浓度梯度设为水(含0.1％TFA(三氟乙酸，Trifluoro acetic acid))：乙腈(Acetonnitrile，含0.1％TFA)，在开始的0～45分钟，将浓度梯度设为10:0，之后的45～50分钟，将浓度梯度变换成1:9，并在流速1ml/min条件下对样品进行分析，此时检测器采用UV检测器(230nm)。

在本发明的上述(b)阶段，将包括通过(a)阶段培养而获得的植物细胞或不定根培养物自身的组合物制成适宜形态的皮肤外用剂组合物，或者通过公知的提取方法，对上述培养物进行提取处理后获得提取物状态的产物，并将其制造成适宜形态的皮肤外用剂组合物。

例如，在上述(b)阶段，对通过(a)阶段获得的高山火绒草植物细胞或不定根培养物进行干燥、粉末化处理后，将其与精制水混合在一起制成组合物；或者是对通过(a)阶段获得的高山火绒草植物细胞或不定根培养物进行干燥、粉末化处理后将其混合在精制水中后，还可以包括实施冷水提取、热水提取、采用荷荷巴油等植物性油的提取、采用无机溶剂的提取、或者采用如乙醇等的酒精等有机溶剂的提取处理制造出组合物的工序。

作为另一例，也可以采用对获得自(a)阶段的培养物进行热风干燥后，通过粉末化处理使水分蒸发的方式来制造。

另外，根据本发明的高山火绒草植物细胞、不定根培养物或其提取物具有优异的酪氨酸酶抑制力，因此可应用于皮肤美白。

另外，根据本发明的高山火绒草植物细胞、不定根培养物或其提取物均可以应用在收缩毛孔方面。

另外，根据本发明的高山火绒草植物细胞、不定根培养物或其提取物，具有抑制皮脂分泌、抑制或改善粉刺、保护皮肤免受紫外线损伤、治愈创伤、皮肤保湿、保护或改善皮肤屏障等的效果。

另外，根据本发明的高山火绒草植物细胞、不定根培养物或其提取物具有通过抑制iNOS活性达到抗炎效果，即具有缓解、减轻和抑制炎症等的效果。

在本发明中，上述皮肤外用剂组合物可以为化妆品组合物或药剂组合物。

上述化妆品组合物中，化妆品制剂可包括可接受的载体。在此，“化妆品制剂中可接受的载体”是指，可包含在化妆品制剂中的、本领域技术人员公知的化合物或组合物，或者是将来需要开发的化合物或组合物，这些化合物或组合物与人体皮肤接触时不发生异常毒性、不稳定性或刺激性，可适用于人体。

相对于本发明的皮肤外用剂组合物，上述载体含量占整个组合物重量的约1重量％～99.99重量％，优选占组合物重量的90％～99.9％。然而，上述比率可根据本发明所制造出的后述皮肤外用剂组合物的不同剂型、或其具体适用部位(脸、脖子等)、或优选的适用量等而不同，因此无论从哪个方面来看，上述比率不能理解为限制本发明范围的因素。

作为上述载体，可举出酒精、油、表面活性剂、脂肪酸、硅油、润湿剂、保湿剂、粘性改性剂、乳剂、稳定剂、紫外线散射剂、紫外线吸收剂、成色剂、香料等。用作上述酒精、油、表面活性剂、脂肪酸、硅油、润湿剂、保湿剂、粘性改性剂、乳剂、稳定剂、紫外线散射剂、紫外线吸收剂、成色剂、香料等而使用的化合物/组合物等均已在本领域中公知，因此只要是本领域的技术人员均可以选择适当的物质/组合物来使用。

作为本发明的一实施方式，本发明的皮肤外用剂组合物除了包括上述高山火绒草的植物细胞、不定根培养物或其提取物之外，还可以包括甘油、丁二醇、丙二醇、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚、乙醇和三乙醇胺等，也可以根据需要包括微量的防腐剂、香料、着色剂、精制水等。

根据本发明的皮肤外用剂组合物可制成多种形态，例如可以制成为化妆水、精华素、凝胶、乳液、护肤液、霜(水包油型、油包水型、多相)、溶液、悬浮液(无水和水系)、无水生成物(油或醇系)、凝胶、面膜、剥撕式面膜、粉末或明胶等有皮膜的胶囊(软胶囊、硬胶囊)剂型等形态。

本发明的皮肤的概念不仅指脸，也包括头皮、全身的皮肤，作为能够适用于上述头皮的皮肤外用剂组合物，可举出洗发露、护发素、焗油膏、头发生长剂等，作为可适用于全身的沐浴露等的用途，能够制成多种形态的组合物。

含有本发明高山火绒草植物细胞、不定根培养物或其提取物的皮肤外用剂组合物的制造方法并不限定于上述制造方法，只要是具有本发明所属技术领域的通常知识的人员都可以知道通过对上述制造方法进行部分变形的方式也可以制造出含有本发明高山火绒草植物细胞、不定根培养物或其提取物的皮肤外用剂组合物。

特别是，除了在本发明特别公开的制造方法以外，上述皮肤外用剂组合物还可以通过常用的制造方法制造出一般乳剂型和可溶化剂型状态的组合物。

被制造成皮肤外用剂组合物时，作为乳化剂型化妆品可举出营养化妆水、精华素等，作为可溶化剂型可举出柔肤化妆水。而且，本发明的组合物含有皮肤科学上可允许的介质和基剂，由此可以制造出皮肤科学上通常用于局部或全身的辅助剂形式的皮肤外用剂组合物。

而且，还可以提供适宜用作化妆品的剂型，例如以溶液、凝胶、固体或者面糊无水生成物，将油相分散于水相而获取的乳液、悬浮液、微乳液、微胶囊、微粒或者离子型(脂质体)、非离子型的囊泡分散剂的形态，面霜、化妆水、乳液、粉底、软膏、喷雾或者遮瑕棒的形态提供。并且本发明的组合物可以被制成泡沫(foam)形态、或者制成还包括被压缩的推进剂的气雾剂组合物的形态。

另外，本发明的皮肤外用剂组合物还可以含有如脂肪物质、有机溶剂、溶解剂、浓缩剂及胶化剂、软化剂，抗氧化剂，悬浮剂、稳定化剂、发泡剂(foaming agent)、芳香剂、表面活性剂、水、离子型或者非离子型柔化剂、填充剂、金属离子封锁剂及螯合剂、保存剂、维生素、阻断剂、湿润剂、精油、染料、颜料、亲水性或者亲油性活性剂、脂类囊泡、或者与通常使用于化妆品的其他任意成分一样、通常使用在化妆品学或皮肤科学领域中的辅助剂。而且，上述成分可以按照化妆品学或者皮肤科学领域里通常所使用的量来进行添加。

如上所述的本发明的皮肤外用剂组合物，包括皮肤收敛、抗炎、治愈创伤、抗老化等功能性化妆品的形态。

如果本发明的组合物为药学组合物，则在下述实施例中可起到改善皮肤状态的药学组合物的功能。

上述药学组合物，除了作为有效成分的高山火绒草植物细胞、不定根培养物或其提取物之外，还可以包括“药学上可允许的载体”，这样的载体可选自由稀释剂、润滑剂、结合剂、崩解剂、甜味剂、稳定剂和防腐剂组成的组中。上述药学组合物还可以包括添加剂。作为上述添加剂可包括香料、维生素和抗氧化剂。作为上述载体，只要是药学上可允许的载体均可以使用，例如作为稀释剂可为乳糖、糊精、木薯(tapioca)淀粉、玉米淀粉、大豆油、微晶纤维素、或者为甘露醇，作为润滑剂可为硬脂酸镁或滑石，作为结合剂可为聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基纤维素。而且，作为崩解剂，可以为羧甲基纤维素钙、淀粉乙醇酸钠、波拉克林钾、或交聚维酮，作为甜味剂可以为白糖、果糖、山梨糖醇或阿斯巴甜，作为稳定剂可以为羧甲基纤维素钠、β-环糊精或黄原胶，作为防腐剂可以为对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸钾。

上述药剂学组合物可被制成在本技术领域大家所公知的常用药学剂型。上述药学组合物能够被制剂成口服给药制剂、注射剂、栓剂、透皮给药制剂和鼻腔给药制剂的剂型进行给药。例如，上述剂型可以为如液体、悬浮剂、散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂或提取物的口服给药剂型。

以下，通过实施例对本发明进行更详细的说明。但是下述的实施例仅仅是一种例示并不限定本发明。本领域的技术人员应当可以理解，本发明的范围并不限定在这些实施例上。

特别是在下述实施例中，虽然对高山火绒草的植物细胞、不定根培养物或其提取物的功能进行了确定，但对于非提取物的培养物自身来说也具有同样的效果，这对本领域技术人员来说是显而易见的。

实施例1

实施例1-1根据本发明的从高山火绒草中的植物细胞诱导

将本发明中所使用的高山火绒草种子(通过网购购买，原产地：荷兰)浸泡在70％乙醇中30秒，然后用灭菌水洗涤、用消毒液(30％ROX+Tween20)消毒20分钟，再用灭菌水洗涤3次，种子发芽后，利用锋利的刀一下子割伤高山火绒草的叶，并将其放进含有6-苄氨基嘌呤1mg/L、2,4-D 0.3mg/L、3％蔗糖和琼脂8g/L的基础MS(Murashige and Skoog 1962，Duchefa公司制造，Cat No.M0221)培养基内，并在温度25℃、湿度70％的生长条件下进行暗培养，从而诱导出初期植物细胞。采用1N的氢氧化钠(NaOH)将各个培养基的pH值调整为5.8。继代培养的间隔时间设为2周(图1)。

实施例1-2根据本发明的高山火绒草植物体不定根的诱导

为了从高山火绒草的植物细胞诱导出不定根，往MS基础培养基内添加蔗糖30g/L、蛋白石(Gelite)2.0g/L，并投入生长调节物质IBA(indole-3-butyric acid)0.5mg/L，然后放在25±2℃培养室内进行4周的培养。从被诱导出的不定根顶端部切出1cm左右，并将其接种在向1/2MS培养基内添加0.5mg/L IBA(indole-3-butyric acid)、蔗糖50g/L而形成的液体培养基内。然后放在25±2℃培养室内进行4周的培养。采用不锈钢滤网对所得到的不定根进行过滤以分离出培养基，并用干净的纸巾充分除去水分，之后在60℃温度下进行2天的干燥处理后用于试验。采用1N的氢氧化钠(NaOH)将各个培养基的pH值调整为5.8。

实施例1-3根据本发明的高山火绒草植物细胞和不定根的批量生产

为了批量生产出无菌诱导自高山火绒草植物体后经过培养而获得的高山火绒草植物细胞和高山火绒草不定根，如上所述，若批量生产出高山火绒草植物细胞，则在含有6-苄氨基嘌呤1mg/L、2,4-D 0.3mg/L的MS培养基内进行培养，若批量生产出高山火绒草不定根，则在含有0.5mg/L IBA(indole-3-butyric acid)、蔗糖50g/L的1/2MS培养基内培养，然后将上述培养基放在温度25±2℃培养室内，并在湿度70％、20L气球型生物反应器(由三星科学株式会社制造)的空气供给量为0.1vvm左右的条件下培养5周。

实施例1-4对根据本发明的高山火绒草植物细胞和不定根的引诱剂处理

对获得自上述实施例1-3的植物细胞、不定根培养物实施下述的引诱剂处理。

对上述获得的植物细胞、不定根培养物在生物反应器中在添加有1mg/L的玉米素(Zeatin)、0.2mg/L的生长调节物的MS基础培养基内在25℃温度下培养5周，然后连接高频波形发生装置而在100～400kHz的频率下以15分钟的间隔一天之内进行4次高频处理，并将上述处理重复进行一周或两周。在上述培养基内培养一周、且经过高频处理的上述样品被回收后，对样品进行3～5天的真空干燥处理。

对作为根据本发明的高山火绒草的植物细胞、不定根培养物的次级代谢产物的类胡罗卜素、类黄酮和酚类化合物的含有量的测定方法如下：

根据AOAC法检测出类胡罗卜素的总量。即，往经过冷冻干燥处理的高山火绒草植物细胞和不定根试料中加入丙酮：核酸(3:7v/v)混合液后进行提取处理，然后用蒸馏水洗涤经过滤而得到的提取液，并将上述提取液注入到由活性氧化镁：硅藻土(1:9v/v)的混合物而制成的柱层析内，然后进行吸引的同时，用丙酮：核酸(1:9v/v)的混合液测量436nm处的吸光度。

类黄酮总含量通过基于比色法(Colorimetric)的Sakanaka等(2005)方法来进行测定。往高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物、以及标准物质溶液0.25ml内添加1.25ml蒸馏水，然后再添加5％(w/v)NaNO₂溶液0.075ml。6分钟后，往上述混合液内添加10％(w/v)AlCl₃溶液0.15ml后放置5分钟，之后再添加1N NaOH溶液0.5ml。继续添加蒸馏水直至混合液的最终体积达到2.5ml，然后测定波长510nm处的吸光度。作为标准物质使用了(+/-)儿茶素标准溶液(catechin standard solution，Sigma chemical Co.,St.Louis,MO,USA)，用mgg^-1DW表示类黄酮的总含量。

酚类总含量采用下述方法来进行测定：采用基于FoLin-Ciocalteu法(FoLin和Ciocalteu，1927)的Ali等(2006a)提出的方法来测定酚的总含量，其中在FoLin-Ciocalteu法，FoLin-Ciocalteu试剂被高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物中所含有的酚类物质还原而发出钼蓝色。在提取液和标准物质溶液0.05ml中添加蒸馏水2.55ml后，继续添加2N福林酚试剂溶液(10time dilution；Sigma chemical Co.,St.Louis,MO,USA)0.1ml。6分钟后，往上述混合液中添加20％(w/v)Na₂CO₃溶液0.15ml，并在黑暗状态下放置30分钟后，测定波长760nm处的吸光度。作为标准物质使用了没食子酸(garlic acid)，用mgg^-1DW表示酚的总含有量。

表1

(单位：mgg^-1)

根据上述表1所示的结果可知，实施高频处理后类胡萝卜素、类黄酮和酚类的含量在增加，这作为一种信号与抗炎和抗老化功能相关联，最终确认本发明的组合物具有抗老化效果。

除了本发明的高山火绒草以外，对山参不定根进行如上所述的高频处理时，其有效成分的峰值反而却减少，由此可知高频处理不是对所有植物细胞都具有提高效能的作用。

实施例1-5根据本发明的高山火绒草植物细胞培养提取物的制造

通过实施例1-3得到高山火绒草植物细胞和不定根的培养物后，用干净的纸巾除去水分，然后将其放进干燥器内，在60℃温度下进行2天的干燥处理。将高山火绒草植物细胞和不定根的培养物的干燥粉末50g放进容器内后添加1L的精制水，并在90～120℃温度下进行48小时的热水提取处理。提取处理结束后，用滤网进行过滤以除去固体成分，并将经过过滤而得到的高山火绒草植物细胞和不定根提取物用于本发明中。作为对照试验，通过相同的热水提取方法获得高山火绒草提取物后进行比较。

实施例1-6针对根据本发明的高山火绒草植物细胞培养提取物的HPLC成分分析

采用高效液相色谱仪(HPLS)，对高山火绒草植物细胞和不定根的培养提取物进行成分分析。分析条件如下：

表2

对高山火绒草植物体(热水提取和70％乙醇提取)和高山火绒草植物细胞的热水提取物进行分析的结果可知，虽然通过高山火绒草植物体的热水提取和70％乙醇提取看起来得到了相似成分的图案，但在高山火绒草植物细胞的热水提取中，经过引诱剂处理，能够使表现出抗氧化功能、抗老化功能的绿原酸(Chlorogenic acid)成分含量增加(图2)。

试验例1：高山火绒草的植物细胞和不定根培养提取物的细胞毒性 (Cytotoxicity)

为了观察皮肤细胞对实施例1～3中所制造的组合物的生存率，从美国标准培养物保藏中心(ATCC，American Type Culture Collection)分株引进人皮肤成纤维细胞(HumanSkin Fibroblast,CCD-986Sk)，并对其进行了培养。将各个细胞的浓度设成1×10⁴cells/ml后，将其接种在24孔(well)培养板上。所使用的培养基为含有10％FBS的DMEM(Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium，BRL，USA)培养基。将细胞放进含有10％FBS的DMEM培养基内进行48小时的培养，当细胞培养物占培养容器表面积的25～30％时，将细胞放进由实施例1～3制造的组合物含量占0.1～5％的、另一个FBS-free DMEM培养基内，再进行24小时的培养。培养结束后，添加3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，Sigma M5655，USA)溶液(2.5mg/ml)50ul后，再进行3个小时的培养，然后除去上清液，在每个孔加入200ul的二甲基亚砜(DMSO,Sigma D2650,USA)溶液后搅拌20分钟，由此形成结晶甲瓒(Formazan)，将上述结晶融化后，使用96孔板，每孔取100ul，并通过酶联免疫吸附剂测定(Enzyme-linked immunosorbent Assay，ELISA)方式检测出570nm处的吸光度。对于皮肤细胞的生存率状况，以使用纯水的对照组的吸光强度为标准，通过下述数学式算出来后用百分比来表示生存率状况，其结果如表3所示。

数学式1

细胞增殖效果(％)＝[(试验组吸光度-对照组吸光度)/对照组吸光度]×100

表3

如表3所示，采用上述人皮肤成纤维细胞检查培养提取物对细胞毒性的影响的结果呈0.5％、2.0％和5.0％浓度的高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物均没有表现出细胞毒性。即，对细胞生存率没有影响。相反，在高山火绒草提取物的情况下，根据处理浓度表现出20～30％的细胞毒性率。

试验例2：高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物的抗氧化效果(ABTS自由基清 除能力)

利用ABTS试剂的抗氧化能力的测定方法如下：通过与过硫酸钾的反应而生成的ABTS自由基，被提取物中的抗氧化物质所清除，从而使自由基所特有的青绿色褪去，利用上述ABTS试剂特征，通过对Van den Berg等方法的变形来进行测定。

1.0mM的AAPH(2,2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐)与用100mM PBS缓冲液溶解的2.5mM ABTS(2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐)混合后，放在68℃的恒温槽内进行12分钟的反应。取按不同浓度进行稀释的高山火绒草植物细胞和不定根的培养提取物20ul和ABTS溶液980ul，将其放进37℃温度的水槽内反应10分钟，同时测定在735nm处逐渐减少的吸光度，此时，作为阳性对照组，使用了水溶性维生素E(Trolox)0.1％。对于ABTS自由基的清除能力，通过下述数学式2来进行计算，其结果如表4所示。

数学式2

ABTS自由基清除能力(％)＝(Blank O.D.-Sample O.D.)/Blank O.D.×100

表4

从上述表4中可知，在0.1～5.0％浓度条件下，随着本发明组合物高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物的含量的增加，其抗氧化能力也在增加，而且通过高频处理的组合物，其抗氧化能力会进一步得到提高。

试验例3：高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物的前胶原蛋白生物合成增加 试验

将人皮肤成纤维细胞(Human Skin Fibroblast)放进温度37℃、5％CO₂且能够维持一定湿度的细胞培养器内，将其用含有10％FBS、青霉素(50U/ml)、链霉素(50/ml)的DMEM(Dubelcco's Modified Eagle's Medium,Gibco，USA)培养基后，以1x10⁵cell/ml的密度、每孔500ul的方式分株到48孔板后进行24小时的分株培养。将对照组(DMEM培养基)、以及含有0.1～5％浓度的高山火绒草植物细胞和不定根的培养提取物的培养基放到温度37℃、5％CO₂培养器内进行48小时培养。经过48小时后，从各培养基的上清液各取20ul，用I型前胶原羧基端肽试剂盒(PICP，Takara，Cat No.MK101)检测新合成的胶原蛋白含量。并根据下述数学式进行计算后，将其结果表示在表中。

数学式3

胶原蛋白生物合成的增加率(％)＝{试验组胶原蛋白量/对照组胶原蛋白量}·1×100

表5

从上述表5中可知，随着本发明组合物高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物的含量的增加，胶原蛋白的生物合成量也在增加，而且还可以了解到即使经过高频处理，这种胶原蛋白的生物合成量也在进一步增加。由此可知，本发明的组合物对胶原蛋白的合成具有优异的增进效果。

试验例4：由高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物的AQP3表达增加而产生的 保湿效果

将人角质形成细胞株(HaCaT)与DMEM(Dubelcco's Modified Eagle's Medium)、10％胎牛血清(Fatal bovine serum，FBS)、1％抗菌-抗真菌剂(GIBCO,Cat.#15240-062)一起放进100mm/60.1cm的培养皿后，在温度37℃、5％CO₂条件下进行培养。当80％以上的人角质形成细胞融合(confluence)时，以1×10⁴cells/well的密度分株在96孔板上，并在细胞培养条件下进行培养，直至细胞融合度达到80％以上，如果细胞融合度达到80％以上，则换成DMEM自由培养基(不含FBS)来处理试验物质。结束物质处理后，再培养24小时，然后观察各个物质对水通道蛋白3(Aquaporin3)表达的影响。试验方法采用实时荧光定量PCR法，其试验顺序如下：

RNA分离采用了实时细胞一步法缓冲液套装(FastLane Cell one-step bufferset，QIAGEN Cat.#216213)。用FCW(细胞洗涤缓冲液)来洗涤去除了培养基的细胞后，添加50ul的细胞处理混合物(在添加有FCPL缓冲液的FCPW中添加gDAN Wipeout缓冲液的混合物)，在室温下进行5分钟培养(incubation)后转移到新的E-管，并在75℃温度下使其反应5分钟。为了分析出与保湿功能相关的基因-水通道蛋白3，将上述提取的RNA作为模板(template)，按照2X QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master mix手册，用实时荧光定量PCR分析仪(商品名:Rotor-Gene Q，由Qiagen公司制造)进行分析。试验中所使用的引物(primer)通过Qiagen公司制造的Quanti Tect primerassays(Aquaporin3,Cat.#QT00212996)和GAPDH(Cat.#QT01192646)进行了规范化。

实时荧光定量PCR的条件如下：

数学式4：

表达率(fold)＝(试样处理组的表达率)/(对照组的表达率)

根据图3可知，随着本发明的组合物高山火绒草植物细胞培养提取物含量的增加，与保湿效果相关联的AQP-3(Aquaporin-3)遗传基因的生物合成量也在增加，而且通过高频处理，这样的基因生物合成功能得到进一步提高。

试验例5：基于高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物的MMP-2表达抑制的皱纹 改善效果

皮肤皱纹是因胶原蛋白的合成和分解的不均衡而引起的，一般来讲，皮肤上Ⅰ型胶原合成与其分解酶MMP-1处于平衡状态。然而，在出现光老化的皮肤上，Ⅰ、Ⅲ型胶原合成下降，MMP-1活性增强。这样的基质金属蛋白酶类(matrix metalloproteinases，MMPs)作为蛋白分解酶具有分解细胞外基质(extracellular matrix)的功能，在正常情况下与治愈伤口或组织再生过程相关联。

为了确认本发明组合物是否具有抑制MMP-2生成的效果，进行了下述试验。

将人皮肤成纤维细胞(CCD-986Sk，fibroblast)与DMEM(Dubelcco’s ModifiedEagle’s Medium)、10％胎牛血清(fatal bovine serum，FBS)、1％抗菌-抗真菌剂(GIBCO,Cat.#15240-062)一起放进100mm/60.1cm的培养皿后，在温度37℃、5％CO₂条件下进行培养。

当100％以上的人皮肤成纤维细胞融合(confluence)时，以1×10⁴cells/well的密度的细胞分株接种在96孔板上，并在细胞培养条件下进行分株培养，直至细胞融合度达到80％以上，如果细胞融合度达到80％以上，则除去培养基后，用10～15mJ/cm²的UVB进行照射以诱导出皱纹，然后换成DMEM自由培养基(不含FBS的培养基)来处理试验物质。结束物质处理后，在细胞培养条件下再培养24小时，然后观察各个物质对作为UVB照射而引起皱纹的关联基因MMPs表达的影响。试验方法采用实时荧光定量PCR法，其试验顺序如下：

RNA分离采用了实时细胞一步法缓冲液套装(QIAGEN Cat.#216213)。用FCW(细胞洗涤缓冲液)来洗涤去除培养基的细胞后，添加50ul的细胞处理混合物(在添加有FCPL缓冲液的FCPW中添加gDAN Wipeout缓冲液的混合物)，在室温下进行5分钟的培养后转移到新的E-管，并在75℃温度下使其反应5分钟。为了分析出与皱纹形成相关的基因，将上述提取的RNA作为模板，按照2X QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master mix手册，用实时荧光定量PCR分析仪(商品名:Rotor-Gene Q，由Qiagen公司制造)进行分析。使用Qiagen公司的QuantiTectprimerassays(MMP-2,Cat.#QT00088396)，而且相对表达率利用作为管家基因(Housekeeping genes)的GAPDH(Cat.#QT01192646)来进行了规范化。实时荧光定量PCR的条件如下：

数学式5：

表达率(fold)＝(试样处理组的表达率)/(对照组的表达率)

根据图4可知，对MMP-2生物合成的抑制效果，通过0.5～5.0％浓度的高山火绒草植物细胞培养提取物的处理，表现出对MMP-2生物合成基因表达的优异的抑制效果，而且通过高频处理，仍然具有对MMP-2生物合成基因表达的优异的抑制效果。

试验例6：通过抑制iNOS活性来检测抗炎效果的试验

生成自RAW264.7细胞株的一氧化氮(NO)的量在细胞培养液中以NO₂ ^-的形态存在，因此利用Griess试剂进行了测定。通过1g的脂多糖(LPS)形成活性化状态的Raw264.7细胞株中，为了检测出对一氧化氮(NO)生成的抑制效果，对含有通过上述实施例1而获得的0.1～5.0％浓度的高山火绒草植物细胞和不定根细胞培养提取物的培养基进行处理的试验组、以及对照组进行细胞培养处理后，将Griess试剂与细胞培养上清液按照细胞培养上清液100ul、Griess试剂(1％sulfanilamide in 5％phosphoric acid,1％-naphthylamidein H₂O)100ul进行混合，使其在96孔板进行10分钟的反应，然后检测540nm处的吸光度。关于NO₂ ^-浓度的测定，采用了稀释硝酸钠后测定吸光度的方式，最后得到标准曲线。

表6

如表6所示，iNOS的活性通过0.5～5.0％浓度的高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物处理，与对照组相比阻碍NO生成，且显示出极其优异的抑制炎症的效果。而且通过实验可知，即使在经过高频处理的情况下，也显示基于优异的iNOS活性的炎症抑制效果。

试验例7：毛孔收缩效果试验(体外试验)

为了检测出本发明高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物组合物的毛孔收缩效果，以通过上述实施例1所制造的组合物为对象，作为代替皮肤的蛋白质使用了血红蛋白，由此进行了检测毛孔收缩效果的试验。

利用0.9％磷酸盐缓冲生理盐水(0.1mM,pH 7.4)制造出血红蛋白溶液(0.05g/50ml)，并向2ml血红蛋白溶液中加入通过上述实施例1而制造的高山火绒草植物细胞和不定根细胞培养提取物2ml，然后进行30秒的振荡混合处理，接着在转速3500rpm的条件下进行10分钟的离心分离，取其上清液1ml，加入2ml的精制水后，在波长407nm条件下，用紫外可见光谱法进行了测定。

作为对照组，添加了2ml的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)。

表7

测定含有0.5～5.0％浓度的高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物组合物的组成物中血红蛋白的沉淀量，由此评价毛孔收缩效果，判断标准为血红蛋白的沉淀(％)越高，其毛孔收缩效果更优秀。即，通过与高山火绒草提取物的比较，确定高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物的毛孔收缩效果极佳，而且通过实验可知，即使在进行高频处理的情况下，也具有优异的毛孔收缩效果。

试验例8：皮脂抑制效果试验

为了确定高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物对皮脂的抑制效果，选出10名被试验者，4周后利用皮肤油脂测试仪(Sebum meter SM810)对皮肤的皮脂分泌量进行测定。该试验在22±2℃、40±5％湿度下进行。如果是油性皮肤，则测定值为220ug/cm²以上，如果是正常皮肤，则测定值为100～220ug/cm²。作为对照组使用了精制水，其试验结果如表8所示。

表8

如上述表8所示的结果，与对照组相比，2％高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物具有极其优良的抑制皮脂分泌的效果，而且即使在经过高频处理的情况下，仍然具有优异的抑制皮脂分泌效果。

试验例9：改善粉刺的效果

以有粉刺的男女10名为被试验者，早晚各一次连续4周在脸上均匀抹上由实施例1制造的2％浓度的高山火绒草植物细胞培养提取物化妆水。对于判断粉刺的改善效果来说，根据被试验者的感觉程度，参考了下述判断标准，用1～3分来评价试验之前的状态后，再评价粉刺的治愈效果，并将其结果表现在表中。

<试验前状态的评价>

1＝有一点点粉刺 2＝有一些粉刺 3＝粉刺严重

<粉刺治愈效果判断>

-：几乎没有效果 +：有一点效果 ++：减轻很多

+++：完全治愈

表9

测试对象	试验前状态	经过2周后的效果	经过4周后的效果
				测试对象1	2	+	+
测试对象2	1	+	++
				测试对象3	1	-	+
测试对象4	2	-	-
				测试对象5	2	+	++
测试对象6	2	+	+
				测试对象7	3	++	+++
测试对象8	2	-	++
				测试对象9	3	+	+
测试对象10	2	+	++

如上述表9可知，使用了4周含有2％高山火绒草植物细胞培养提取物的柔肤化妆水后，大部分测试对象的粉刺均得到了改善，而且即使在经过高频处理的情况下，也具有上述的粉刺改善效果。

试验例10：针对紫外线照射的细胞保护效果

作为用以UV照射的光源使用了放射出302nm波长紫外线的紫外线交联仪CL-1000(Ultra-Violet Products，CA)。将作为皮肤角质形成细胞的HaCaT细胞以1x10⁵cells/ml浓度放进24孔板后，放在培养器内进行24小时的培养后，去除培养基并用磷酸缓冲液进行洗涤。添加500ul磷酸缓冲液后，以10mJ/cm的剂量照射紫外线，然后换成不含FBS的新鲜细胞培养基，并将通过实施例1获得的高山火绒草植物细胞培养提取物、不定根培养提取物试样处理成1％浓度，然后在上述新鲜细胞培养基上继续培养24小时。在此，添加5mg/ml的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，Sigma)后，放进培养器内培养3小时后形成甲臜(formazan)，用DMSO溶解甲臜(formazan)后将其移动到96孔板，并通过酶标仪(ELISAreader)测定595nm处的吸光度，然后与紫外线照射后未用试剂处理的对照组比较细胞生存率。

表10

为了评价植物细胞和不定根培养提取物对角质形成细胞的保护效果，将人皮肤表皮角质形成细胞(keratinocytes，HaCaT)露出在20mJ/cm剂量的紫外线照射下后，进行24小时的培养，并实施能够确定细胞生存率的MTT细胞存活率分析(MTT Assay)，其结果发现：与对照组相比，随着高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物浓度的增加，细胞生存率(CellVialbility)也在增加。由此可以确定：高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物在紫外线照射下具有细胞保护效果，且在经过高频处理的情况下，也具有良好的细胞保护功能。

试验例11：采用伤口愈合实验的创伤治愈、抗老化效果

将人角质形成细胞株(HaCaT)与DMEM(Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium)、10％胎牛血清(fatal bovine serum，FBS)、1％抗菌-抗真菌剂(GIBCO)一起放进100mm/60.1cm²的培养皿后，在温度37℃、5％CO₂条件下进行培养。当90％以上的人角质形成细胞融合(confluence)时，在100mm/60.1cm²的培养皿以1.5×10⁵cells/12孔板的密度分株后进行24小时的培养，然后换成DMEM自由培养基(不含FBS)，在各个孔内利用200P探针划出#形状的划痕，然后用高山火绒草提取物、高山火绒草植物细胞培养提取物和不定根提取物来处理划痕。处理后的0小时时间段内，用显微镜照下细胞图像，并在温度37℃、5％CO₂条件下进行培养。物质处理后进行18-20小时的继续培养，然后去除培养基并加入定像液(4％多聚甲醛)，并在常温下进行15分钟的培养(incubation)，结束后用PBS洗涤3次。固定细胞(Fixedcells)可以在4℃下保存一个月左右。用显微镜照下伤口愈合程度后利用Image J的程序进行计算。作为阳性对照组使用了300ng/ml表皮生长因子(EGF)。

通过伤口愈合实验，观察试验物质是否促进细胞增生(proliferation)和细胞迁移(migration)，从而进行对抗老化功能的评价。作为阳性对照组，使用了300ng/ml表皮生长因子(EGF)。

用1％浓度的从高山火绒草植物体诱导的植物细胞和不定根培养提取物进行处理后的试验结果如图5所示，与对照组相比，可确定用高山火绒草植物细胞培养提取物和不定根培养提取物处理的皮肤细胞均表现出贴着底部长出来，从而使愈合面积增加，而且在经过高频处理的情况下，也具有良好的愈合效果(如图5)。

试验例12：关于确定皮肤屏障保护机制的试验

通过确定高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物对皮肤屏障的保护机制，确认是否具有强化或改善皮肤屏障的功能。

人表皮角质形成细胞(Human epidermal Keratinocyte)与DMEM(Dubelcco’sModified Eagle’s Medium)、10％胎牛血清(fatal bovine serum，FBS)、1％抗菌-抗真菌剂(GIBCO,Cat.#15240-062)一起放进100mm/60.1cm²的培养皿后，在温度37℃、5％CO₂条件下进行培养。当80％以上的人表皮角质形成细胞融合(confluence)时，以3×10⁵cells/well的密度将其放进12孔板内进行48小时的分株培养，然后用紫外线照射器照射UVB40mJ/cm后，在含有不同浓度的高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物的培养基内培养3天。培养结束后，采用细胞裂解缓冲液(0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)、1％NP40、150mM NaCl、0.5％脱氧胆酸钠、50mM Tris-Cl(PH 7.5))使其溶出后，利用BCA(bicinchoninic acid)定量法测定出蛋白质量。添加20ug相同量的蛋白质，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离后，移动到硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane)上。然后用含有5％脱脂乳的TBST(10mMTris HCl,pH8.0,150mM NaCl,0.1％Tween 20)缓冲液使上述细胞膜反应1小时后，再与紧密连接蛋白occludin(Invitrogen公司,美国)、紧密连接蛋白claudin-1(abcam,USA)和β-肌动蛋白(β-actin，Santa Cruz，USA)一次抗体进行反应。作为二次抗体使用了辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体(Santa Cruz，USA)和辣根过氧化物酶标记的驴抗羊IgG抗体(Santa Cruz,USA)并使其反应1小时。然后，用TBST缓冲液洗涤，通过化学发光液检测试剂盒(ECL solution kit，amersham,UK)使其显色后进行分析。

为了观察高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物对紧密连接蛋白的量变情况，利用角质形成细胞确认蛋白质的量变。如下所述，在紫外线照射下，已确定角质形成细胞的紧密连接蛋白occludin和claudin-1的蛋白量减少，紫外线照射后，用不同浓度的高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物处理上述角质形成细胞时，发现所减少的occludin和claudin-1的蛋白量在增加，而且即使在经过高频处理的情况下，也看出上述减少的蛋白质生成量表现出增加趋势(图6)。

试验例13：确认皮肤屏障功能的试验

人表皮角质形成细胞(Human epidermal Keratinocyte)与DMEM(Dubelcco’sModified Eagle’s Medium)、10％胎牛血清(fatal bovine serum，FBS)、1％抗菌-抗真菌剂(GIBCO，Cat.#15240-062)一起放进100mm/60.1cm²的培养皿后，在温度37℃、5％CO₂条件下进行培养。

当80％以上的人表皮角质形成细胞融合(confluence)时，以3×10⁵cells/well的密度将其放进12孔板内进行24小时的分株培养，然后放进含不同浓度的高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物的培养基内进行24小时培养。当80％以上的人表皮角质形成细胞融合(confluence)时，以1×10⁴cells/well的密度将其放进96孔板内进行分株后，用含不同浓度的高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物处理细胞。然后，继续培养24小时，通过实时荧光定量PCR(real-time PCR)法确认中间丝聚合蛋白(filaggrin)基因的表达。

对于RNA分离和cDNA合成采用实时细胞一步法缓冲液套装(QIAGEN Cat.#216213)。用FCW(细胞洗涤缓冲液)洗涤已除去培养基的细胞后，添加50细胞处理混合物(在添加有缓冲液FCP的缓冲液FCPW中，加入gDNA Wipeout缓冲液的混合物)，然后在室温下进行5分钟繁殖后，移动到新的E-管，并在75℃条件下反应5分钟。为了对中间丝聚合蛋白(filaggrin)基因的表达进行分析，将上述合成的cDNA作为模板，按照2X QuantiTect SYBRGreen RT-PCR Master mix手册，用实时荧光定量PCR分析仪(商品名:Rotor-Gene Q，由Qiagen公司制造)进行分析。用于试验的中间丝聚合蛋白引物(Filaggrin primer)为由Qiagen公司制造的Cat.#QT01192646，表达率通过管家基因(housekeeping genes，GAPDH,Cat.#QT01192646)实现了规范化。实时荧光定量PCR的条件如下。

表达率(fold)＝(试样处理组的表达率)/(对照组的表达率)

表11

中间丝蛋白(filaggrin)的表达增加通过高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物促进角质形成细胞的正常分化，并促进在皮肤上转换成自然保湿因子的、中间丝蛋白(filaggrin)在皮肤内的表达，由此可知具有改善皮肤屏障的功能。即，对高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物的中间丝蛋白基因表达的进行检测，并将其结果表示在表11中，从表11可知，高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物的基因表达率使基因表达量显著增加，而且即使在进行高频处理的情况下，这样的基因表达量也表现出增加。

试验例14：基于酪氨酸酶(Tyrosinase)活性抑制的美白效果的确认试验(体外试 验)为了确认高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物是否具有美白效果，进行了高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物对黑色素形成起重要作用的、酪氨酸酶活性的影响试验。将磷酸盐缓冲液(phosphate buffer)分株成每孔50ul放进96孔板内，然后往每孔内添加不同浓度的高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物试样10ul。之后，精制水中添加蘑菇酪氨酸酶(mushroom tyrosinase)直至其浓度达到50ug/ml后，取20ul加入到每孔内。之后每孔再添加2.5mM左旋多巴(L-DOPA)20l进行混合，然后在37℃温度下使其发生反应，同时每隔10分钟测定475nm处的吸光度，该测定大概进行1小时左右。作为阳性对照组添加了250uM曲酸(kojic acid)。

表12

通过高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物的处理，酪氨酸酶活性表现下降，由此可以确定酪氨酸酶活性的降低导致抑制黑色素形成，因此具有美白功能。即，如表12所示，通过高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物对酪氨酸酶活性的测定结果可知，高山火绒草植物细胞和不定根培养提取物确定具有降低酪氨酸酶活性的功能，而且即使在经过高频处理的情况下，仍然具有上述的美白功能。

实施例2皮肤外用剂组合物的制造

采用将本发明的高山火绒草植物、不定根培养提取物作为有效成分含有的化妆品，制造出营养化妆水、面霜、精华素等乳化剂型的化妆品、以及柔肤化妆水等可溶化剂型的化妆品。

制造例2-1：化妆水

根据下述处方，通过常用的化妆水制造方法制造出化妆水。

表13

制造例2-2：精华素

根据下述处方，通过常用的精华素制造方法制造出化妆水。

表14

制造例2-3：乳液

根据下述处方，通过常用的乳液制造方法制造出乳液。

表15

原料名称	重量％(w/w)
		十六十八醇	0.8
自乳化单硬脂酸	1.0
		蜂蜡	0.5
硬脂酸	0.5
		液体石蜡	7.0
角鲨烷	5.0
		澳洲坚果油	3.0
异辛酸十六烷基酯	2.0
		二甲基硅氧烷	0.3
山梨醇酐单硬脂酸酯	0.5
		聚乙二醇单硬脂酸酯	1.2
甘油	4.0
		丙二醇	4.0
甜菜碱	4.0
		羧基聚合物	0.12
三乙醇胺	0.15
		防腐剂	0.25
香料	适量
		着色剤	适量
高山火绒草植物、不定根培养提取物	5.0
		精制水	达到100

制造例2-4：面霜

根据下述处方，通过常用的面霜制造方法制造出面霜。

表16

原料名称	重量％(w/w)
		十六十八醇	3.0
自乳化单硬脂酸	1.5
		亲油性单硬脂酸	1.5
蜂蜡	0.5
		液体石蜡	8.0
角鲨烷	7.0
		异辛酸十六烷基酯	4.0
精制荷荷芭油	4.0
		二甲基硅氧烷	0.3
山梨醇酐单硬脂酸酯	1.0
		聚乙二醇单硬脂酸酯	1.2
甘油	6.0
		丙二醇	4.0
甜菜碱	4.0
		黄原胶	0.06
三乙醇胺	0.10
		防腐剂	0.25
香料	适量
		着色剤	适量
高山火绒草植物、不定根培养提取物	7.0
		精制水	达到100

制造例2-5：凝胶

根据下述处方，通过常用的凝胶制造方法制造出凝胶。

表17

原料名称	重量％(w/w)
		甘油	4.0
丙二醇	4.0
		乙醇	10
氢化蓖麻油聚氧乙烯醚	0.1
		羧基聚合物	0.30
三乙醇胺	0.30
		防腐剂	适量
香料	适量
		着色剤	适量
高山火绒草植物、不定根培养提取物	1.0
		精制水	达到100

如上所述，对本发明内容中的特定部分进行了详细说明，本领域的技术人员应当可以理解，上述具体技术仅仅是优选具体实施方式而已，并不限定本发明的范围。由此，本发明权利要求和它们的等同物均被定义在本发明的实质性范围内。

Claims (3)

1.一种含有高山火绒草植物细胞培养物的提取物或高山火绒草不定根培养物的提取物在皮肤美白用、毛孔收缩用、皮肤皱纹抑制用、皮脂抑制用、粉刺抑制用、皮肤屏障保护用皮肤外用剂组合物的制造中的应用，

其中，所述皮肤外用剂组合物的制造方法包括下述阶段：

(a)分离出高山火绒草植物的叶组织或茎组织，并将其培养成植物细胞或不定根；以及

(b)制造出含有所述高山火绒草植物细胞培养物的提取物或高山火绒草不定根培养物的提取物的皮肤外用剂组合物，

其中，所述制造方法还包括用50～500kHz的频率对所述(a)阶段培养的植物细胞或不定根每隔10～30分钟进行3～5次高频处理的阶段。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述(a)阶段为

(i)分离出所述高山火绒草植物的叶组织或茎组织后，将其放在含6-苄氨基嘌呤、2，4-二氯苯氧乙酸的培养基内进行培养，从而获得高山火绒草植物细胞培养物的阶段；或者是

(ii)分离出所述高山火绒草植物的叶组织或茎组织后，将其放在含吲哚丁酸的培养基内进行培养，从而获得高山火绒草不定根培养物的阶段。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述(b)阶段还包括：

对通过所述(a)阶段获得的高山火绒草植物细胞培养物或不定根培养物进行干燥并粉末化处理后，将其混合在精制水中，并通过有机溶剂、超声波提取或热水提取处理方式制造出组合物的阶段。

Images