CN102283129A - 一种千层塔原叶体诱导和增殖方法 - Google Patents
一种千层塔原叶体诱导和增殖方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102283129A CN102283129A CN 201110206745 CN201110206745A CN102283129A CN 102283129 A CN102283129 A CN 102283129A CN 201110206745 CN201110206745 CN 201110206745 CN 201110206745 A CN201110206745 A CN 201110206745A CN 102283129 A CN102283129 A CN 102283129A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- prothallium
- explant
- sporangium
- culture
- inducing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种千层塔原叶体诱导和增殖方法。该方法以孢子囊或孢子作为外植体,进行离体组织培养,并建立了千层塔原叶体的诱导体系,原叶体的诱导频率达到15%,在人工调控下,对原叶体进行增殖培养,月增殖倍数达到5倍。方法简单易行,效率高,为千层塔的人工快速繁殖建立重要的技术基础。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域,具体涉及一种千层塔原叶体诱导和增殖方法。
背景技术
千层塔为石杉科(Huperziaceae)石杉属(Huperzia Bernh.)植物蛇足石杉(Huperzia serrata(Thunb.)Trevis)的全草,异名:虱子草、矮杉树、虱婆药。千层塔始载于《植物名实图考》,性味辛、苦、平。具有散瘀消肿、解毒和止痛的功效。1972年我国科技工作者报道了从该植物中分离的石杉碱甲具有横纹肌松弛作用,之后的大量研究发现石杉碱甲是一种高效、低毒、可逆和高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂。由于千层塔所具有的显著医疗作用和潜在的市场效益,其野生资源迅速减少。世界各国同行从不同的角度对这一重要药用植物资源进行研究。
自然环境中千层塔生活史包括两种繁殖方式,一种是通过孢子进行繁殖。孢子萌发后属地下生配子体,需6~15年才能成熟。成熟的配子体即块状体,其上产生精子器和卵子器。在水环境中,卵子和精子结合形成胚,再发育成孢子体。孢子体是千层塔作为药用植物的原植物形式。孢子体的根生于茎的基部,为不定根。不定根和真菌共生,其真菌的菌丝侵入根的皮层细胞间隙中,而不侵入细胞内,为外生菌根。共生真菌的菌丝起到了根毛的功能,增加根系的吸收面积。自然界中千层塔的另一种繁殖方式是芽孢繁殖,但这种方式在野外极少发现。因此,千层塔野生资源的再生受到了极大限制。
利用植物组织培养可进行珍稀和濒危药用植物的微繁殖,建立高效和稳定培养系,培育出脱毒的优质品种,解决珍稀濒危药用植物人工种植存在的种子稀少、种苗奇缺、种质退化等严重问题,保存野生药用植物资源和基因多样性,为药用植物的可持续利用提供技术手段。
但是,千层塔组织培养过程主要采用的是根、茎、叶。这些外植体存在外植体灭菌困难、无菌外植体获得率低,外植体接种后污染和褐化现象严重,不能生长、分化和增殖等问题。
发明内容
针对上述现有技术存在的缺陷或不足,本发明的目的在于,提供一种千层塔原叶体诱导和增殖方法,该方法以孢子囊或孢子作为外植体,进行离体组织培养,为千层塔的快速繁殖建立技术基础。
为了实现上述任务,本发明采取如下的技术解决方案:
一种千层塔原叶体诱导和增殖方法,其特征在于,具体按以下步骤操作:
(1)外植体的选择
从野外采集蛇足石杉的孢子囊,经自来水冲洗干净;
(2)外植体的表面灭菌
将洗干净的孢子囊在超净工作台中先浸在质量分数为70%的乙醇溶液中30s~60s;接着置于浓度0.1%的HgCl2溶液中浸泡5min~8min,再用无菌水冲洗3-5次,将孢子囊或者孢子囊破裂后从中散出的孢子作为千层塔原叶体诱导的外植体;
(3)原叶体的诱导培养
将得到的外植体接种在原叶体诱导培养基上,在培养温度为22±2℃、光照时间12/d~16/d、光照强度为300 Lx~2000 Lx条件下培养10-12周,从外植体上长出绿色的原叶体组织;
(4)原叶体的增殖
将步骤(3)中获得的原叶体组织切割成0.2cm2~0.5cm2的小片,然后转入原叶体增殖培养基上继续培养,培养条件与步骤(3)中相同,培养6周后,获得大量的新增殖的原叶体。
所述原叶体诱导培养基组成为:在常规的MS培养基中加入3-吲哚丁酸0.2mg/L~2mg/L。
所述原叶体增殖培养基组成为:在常规的MS培养基中加入2,4-二氯苯氧乙酸0.2mg/L~1mg/L,以及6-苄氨基嘌呤0.5mg/L~2mg/L 。
采用本发明的千层塔原叶体诱导和增殖的方法,带来的技术效果体现在以下几方面:
1、选取千层塔[Huperzia serrata (Thunb.)Trev.]的孢子囊或孢子作为外植体,由于孢子囊或孢子与根、茎或叶片相对比,对外植体除菌较容易,因此,很容易建立千层塔的无菌组织培养体系,从而避免了外植体灭菌困难、无菌外植体获得率低,外植体接种后污染和褐化现象严重的问题。
2、通过对孢子囊或孢子培养,比较容易获得原叶体,原叶体在人工培养基上很容易实现增殖,从而克服了传统千层塔组织培养中出现的外植体不能生长、分化和增殖等问题。
3、通过控制光照强度很容易控制原叶体的增殖倍数,为通过原叶体进行千层塔大规模繁殖建立重要的技术基础。
具体实施方式
以下通过发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1:
(1)外植体的选择
从野外采集千层塔[Huperzia serrata(Thunb.)Trev.]的孢子囊,经自来水冲洗干净;
(2)外植体的表面灭菌
将洗干净的孢子囊在超净工作台中先浸在质量分数70%的乙醇溶液中30-60s;接着置于质量浓度0.1%的升汞(HgCl2)溶液中浸泡5-8min,再用无菌水冲洗3-5次,作为千层塔原叶体诱导的外植体;
(3)原叶体的诱导培养
将所述外植体接种在原叶体诱导培养基上,原叶体诱导培养基组成为:在常规的MS培养基中加入3-吲哚丁酸0.2mg/L~2mg/L。在培养温度为22±2℃、光照强度为300 Lx、光照时间12/d -16/d条件下进行培养10-12周,从外植体上长出绿色的原叶体组织,原叶体的诱导频率为70%;
(4)原叶体的增殖
将步骤(3)中获得的原叶体组织切割成0.2-0.5cm2的小片,然后转入原叶体增殖培养基上继续培养,原叶体增殖培养基组成为:在常规的MS培养基中加入2,4-二氯苯氧乙酸0.2mg/L~1mg/L和6-苄氨基嘌呤0.5mg/L~2 mg/L。培养条件与步骤(3)中相同。培养6周后,可获得大量的新增殖的原叶体,增殖倍数平均为3.5倍。
实施例2:
(1)外植体的选择
从野外采集千层塔[Huperzia serrata(Thunb.)Trev.]的孢子囊,经自来水冲洗干净;
(2)外植体的表面杀菌
将洗干净的孢子囊在超净工作台中先浸在质量分数70%的乙醇溶液中30-60s;接着置于质量浓度0.1%的升汞(HgCl2)溶液中浸泡5-8min,再用无菌水冲洗3-5次,作为千层塔原叶体诱导的外植体;
(3)原叶体的诱导培养
将外植体接种在原叶体诱导培养基上(原叶体诱导培养基的组成与实施例1相同),培养温度为22±2℃、光照强度为1500 Lx、光照时间12/d~16/d条件下进行培养10-12周,从外植体上长出绿色的原叶体组织,原叶体的诱导频率为15%;
(4)原叶体的增殖
将步骤(3)中获得的原叶体组织切割成0.2-0.5cm2的小片,然后转入原叶体增殖培养基上(原叶体增殖培养基的组成与实施例1相同)继续培养,培养条件与步骤(3)中相同。培养6周后,可获得大量的新增殖的原叶体,增殖倍数平均为5倍。
实施例3:
(1) 外植体的选择
从野外采集千层塔[Huperzia serrata(Thunb.)Trev.]的孢子囊,经自来水冲洗干净;
(2) 外植体的表面杀菌
将洗干净的孢子囊在超净工作台中先浸在质量分数70%的乙醇溶液中30-60s;接着置于质量浓度0.1%的升汞(HgCl2)溶液中浸泡5-8min,再用无菌水冲洗3-5次。
将灭过菌的孢子囊挤压,使孢子从孢子囊中散出,然后采用离心的方法收集孢子,作为千层塔原叶体诱导的外植体;
(3)原叶体的诱导培养
取步骤(2)中的孢子,先用常规的MS液体培养基将孢子稀释成100个/ml悬液,将1ml孢子悬液均匀接种于原叶体诱导培养基上(原叶体诱导培养基的组成与实施例1相同),在培养温度为22±2℃、光照强度为1500 Lx、光照时间12/d -16/d条件下进行培养10-12周,从外植体上长出绿色的原叶体组织,原叶体的诱导频率为10%;
(4)原叶体的增殖
将步骤(3)获得的原叶体组织切割成0.2cm2-0.5cm2的小片,然后转入原叶体增殖的MS培养基上(原叶体增殖培养基的组成与实施例1相同)继续培养,培养条件与步骤(3)中相同。培养6周后,可获得大量的新增殖的原叶体,增殖倍数平均为5倍。
Claims (3)
1.一种千层塔原叶体诱导和增殖方法,其特征在于,按以下步骤进行:
(1)外植体的选择
从野外采集蛇足石杉的孢子囊,经自来水冲洗干净;
(2)外植体的表面灭菌
将洗干净的孢子囊在超净工作台中先浸在质量分数为70%的乙醇溶液中30s~60s;接着置于浓度0.1%的HgCl2溶液中浸泡5min ~8min,再用无菌水冲洗3-5次,将孢子囊或者孢子囊破裂后从中散出的孢子作为千层塔原叶体诱导的外植体;
(3)原叶体的诱导培养
将得到的外植体接种在原叶体诱导培养基上,在培养温度为22±2℃、光照时间12/d~16/d、光照强度为300 Lx~2000 Lx条件下培养10-12周,从外植体上长出绿色的原叶体组织;
(4)原叶体的增殖
将步骤(3)中获得的原叶体组织切割成0.2cm2~0.5cm2的小片,然后转入原叶体增殖培养基上继续培养,培养条件与步骤(3)中相同,培养6周后,获得大量的新增殖的原叶体。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)中的原叶体诱导培养基组成为:在常规的MS培养基中加入3-吲哚丁酸0.2mg/L~2mg/L。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(4)中的原叶体增殖培养基组成为:在常规的MS培养基中加入2,4-二氯苯氧乙酸0.2mg/L~1mg/L和6-苄氨基嘌呤0.5mg/L~2 mg/L。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 201110206745 CN102283129B (zh) | 2011-07-22 | 2011-07-22 | 一种千层塔原叶体诱导和增殖方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 201110206745 CN102283129B (zh) | 2011-07-22 | 2011-07-22 | 一种千层塔原叶体诱导和增殖方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102283129A true CN102283129A (zh) | 2011-12-21 |
CN102283129B CN102283129B (zh) | 2013-01-02 |
Family
ID=45330120
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 201110206745 Expired - Fee Related CN102283129B (zh) | 2011-07-22 | 2011-07-22 | 一种千层塔原叶体诱导和增殖方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102283129B (zh) |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102550416A (zh) * | 2012-01-10 | 2012-07-11 | 江西师范大学 | 产石杉碱甲的离体蛇足石杉叶状体诱导和增殖的培养方法 |
CN102577951A (zh) * | 2012-02-10 | 2012-07-18 | 西北大学 | 一种利用蛇足石杉原叶体生产石杉碱甲的方法 |
CN102577832A (zh) * | 2012-03-24 | 2012-07-18 | 恩施清江生物工程有限公司 | 一种蛇足石杉的繁殖方法 |
CN102640706A (zh) * | 2012-05-10 | 2012-08-22 | 西北大学 | 一种蛇足石杉孢子体试管扦插的方法 |
CN104894206A (zh) * | 2015-06-12 | 2015-09-09 | 重庆大学 | 利用蛇足石杉细胞和内生真菌共培养富集石杉碱甲的方法 |
CN105815218A (zh) * | 2016-03-29 | 2016-08-03 | 西北大学 | 一种提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法 |
CN105830918A (zh) * | 2016-03-29 | 2016-08-10 | 西北大学 | 一种提高千层塔芽孢移栽成活率的方法 |
CN106924316A (zh) * | 2015-12-30 | 2017-07-07 | 生物Fd&C株式会社 | 含高山火绒草植物细胞培养提取物的皮肤外用剂组合物及其制造方法 |
CN107267436A (zh) * | 2017-07-04 | 2017-10-20 | 西北大学 | 一种千层塔叶片原生质体的制备方法 |
CN109169233A (zh) * | 2018-10-28 | 2019-01-11 | 江西兼济堂农业开发有限公司 | 一种千层塔的水培养殖方法以及生态提取石杉碱甲的方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101658124A (zh) * | 2009-09-01 | 2010-03-03 | 王忠华 | 千层塔的快速繁殖方法 |
-
2011
- 2011-07-22 CN CN 201110206745 patent/CN102283129B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101658124A (zh) * | 2009-09-01 | 2010-03-03 | 王忠华 | 千层塔的快速繁殖方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
《中国中药杂志》 20090831 郭斌等 千层塔的研究进展 2018-2023 1-3 第34卷, 第16期 * |
《吉首大学学报(自然科学版)》 20090331 周颖等 蛇足石杉的组织培养初探 90-93 1-3 第30卷, 第2期 * |
《吉首大学学报(自然科学版)》 20090731 李贵等 蛇足石杉外植体表面消毒及内生菌消除方法 100-103 1-3 第30卷, 第4期 * |
Cited By (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102550416A (zh) * | 2012-01-10 | 2012-07-11 | 江西师范大学 | 产石杉碱甲的离体蛇足石杉叶状体诱导和增殖的培养方法 |
CN102550416B (zh) * | 2012-01-10 | 2013-04-10 | 江西师范大学 | 产石杉碱甲的离体蛇足石杉叶状体诱导和增殖的培养方法 |
CN102577951A (zh) * | 2012-02-10 | 2012-07-18 | 西北大学 | 一种利用蛇足石杉原叶体生产石杉碱甲的方法 |
CN102577832A (zh) * | 2012-03-24 | 2012-07-18 | 恩施清江生物工程有限公司 | 一种蛇足石杉的繁殖方法 |
CN102640706A (zh) * | 2012-05-10 | 2012-08-22 | 西北大学 | 一种蛇足石杉孢子体试管扦插的方法 |
CN102640706B (zh) * | 2012-05-10 | 2013-07-10 | 西北大学 | 一种蛇足石杉孢子体试管扦插的方法 |
CN104894206A (zh) * | 2015-06-12 | 2015-09-09 | 重庆大学 | 利用蛇足石杉细胞和内生真菌共培养富集石杉碱甲的方法 |
CN106924316A (zh) * | 2015-12-30 | 2017-07-07 | 生物Fd&C株式会社 | 含高山火绒草植物细胞培养提取物的皮肤外用剂组合物及其制造方法 |
CN106924316B (zh) * | 2015-12-30 | 2020-09-15 | 生物Fd&C株式会社 | 含高山火绒草植物细胞培养提取物的皮肤外用剂组合物及其制造方法 |
CN105815218A (zh) * | 2016-03-29 | 2016-08-03 | 西北大学 | 一种提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法 |
CN105830918A (zh) * | 2016-03-29 | 2016-08-10 | 西北大学 | 一种提高千层塔芽孢移栽成活率的方法 |
CN105815218B (zh) * | 2016-03-29 | 2017-09-29 | 西北大学 | 一种提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法 |
CN107267436A (zh) * | 2017-07-04 | 2017-10-20 | 西北大学 | 一种千层塔叶片原生质体的制备方法 |
CN107267436B (zh) * | 2017-07-04 | 2021-07-13 | 西北大学 | 一种千层塔叶片原生质体的制备方法 |
CN109169233A (zh) * | 2018-10-28 | 2019-01-11 | 江西兼济堂农业开发有限公司 | 一种千层塔的水培养殖方法以及生态提取石杉碱甲的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102283129B (zh) | 2013-01-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102283129B (zh) | 一种千层塔原叶体诱导和增殖方法 | |
CN102422810A (zh) | 一种茶树无性系离体再生培养的方法 | |
CN108901856B (zh) | 一种山茶属植物高效体细胞胚发生和植株再生的方法 | |
CN102948367B (zh) | 厚叶岩白菜离体培养和快速繁殖的方法 | |
CN102318560B (zh) | 一种文心兰组培育苗的方法 | |
CN106417011A (zh) | 野生白芨组织培养快速繁殖方法 | |
CN105265316B (zh) | 一种葱属植物鳞茎盘快速繁殖方法 | |
CN103518625A (zh) | 琴叶榕叶片的组织培养基及离体再生方法 | |
CN101803571A (zh) | 一种水半夏的组培快繁法 | |
CN105475129A (zh) | 一种竹叶兰组培快繁的方法 | |
CN105613288B (zh) | 一种金边黄杨快繁体系的构建方法 | |
CN104488723A (zh) | 一种朝鲜淫羊藿组培快速繁殖方法 | |
CN107278414B (zh) | 一种促进珍稀濒危植物马蹄香种子萌发的方法 | |
CN105265317A (zh) | 一种茖葱快速繁殖方法 | |
CN104160962A (zh) | 同源四倍体七叶一枝花植株的培育方法 | |
CN109984039B (zh) | 一种香石蒜组织培养方法 | |
CN112042537A (zh) | 一种白芨植株再生体系的建立方法 | |
CN101836589B (zh) | 一种南抗杨的快速繁殖方法 | |
CN106577280A (zh) | 一种利用驼峰藤幼嫩茎段及叶片快速繁殖无菌苗 | |
CN104255498A (zh) | 一种楤木的种苗快速繁殖的方法 | |
CN104381130B (zh) | 适用于多基因型的豇豆高效再生体系的建立方法 | |
CN102657089A (zh) | 一种榉树无菌播种方法 | |
CN106106151A (zh) | 苦参的良种培育方法 | |
CN116472963B (zh) | 一种宜昌荚蒾叶片诱导愈伤组织及快繁体系建立的方法 | |
CN116098063B (zh) | 一种石蒜叶鞘诱导试管小鳞茎的试管苗的快繁方法及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130102 Termination date: 20130722 |