CN109394812A - 一种高山火绒草植物细胞有效成分提取工艺及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明建立一种新的针对高山火绒草植物细胞培养物有效成分的提取工艺，并以黄酮类、绿原酸和咖啡酰奎宁酸类成分作为提取指标，整合超声及高温提取工艺，最大程度的保留并提取得到高山火绒草植物细胞培养物中的总黄酮和咖啡酰奎宁酸类物质，在验证提取物具备抗氧化、抗炎和抗衰老活性后，将其用于皮肤外用制剂的生产。

Description

一种高山火绒草植物细胞有效成分提取工艺及其用途

技术领域

本发明涉及植物活性成分提取领域，尤其是涉及一种高山火绒草植物细胞培养物活性成分的提取工艺，更具体的是涉及高山火绒草植物细胞培养物中总黄酮、绿原酸和咖啡酰奎宁酸类活性物质的提取及其在皮肤外用制剂中的用途。

背景技术

高山火绒草(Leontopodium alpinum)属菊科，火绒草属的植物，又叫高山薄雪草、小白花，主要生长在海拔1400-3500m的高山和亚高山的地方。因其富含有火绒草酸、黄酮、咖啡酰奎宁酸类、酚类等生物活性物质，常被用于治疗泌尿系疾病及美白、护肤、抗氧化、增强免疫的产品制剂。

近年来，伴随植物活性成分提取技术和植物细胞培养技术的成熟和广泛应用，已有大量美容制剂企业通过规模化培养高山火绒草植物细胞来提取其活性成分用于美容产品，并围绕其细胞培养有效成分提取技术申请了如：CN106924316、 CN107106478等专利，但现有技术中主要提取利用的是高山火绒草中含有的火绒草酸这一特定活性成分，虽然其在一定程度上满足了现代美容制剂的需求，但是高山火绒草中大量含有的黄酮、绿原酸和咖啡酰奎宁酸类等同样具有功效的活性成分却没有被重视，其主要原因是：在现有的提取和美容制剂的生产工艺中，受制于鲜细胞的培养量，往往需要干燥保存或冻存后集中提取，而在干燥或冻存过程中，细胞的活性成分尤其是黄酮、绿原酸或咖啡酰奎宁酸类物质会因为处理工艺或自身酶解而大量丧失，甚至难以通过常规提取工艺获取，同时干燥保存后细胞培养物在提取时需要泡发，增加了提取工艺的强度和提取成本，同时其提取效率显著下降。为解决上述技术问题，本发明开发出一种能最大程度保留高山火绒草植物细胞培养物中的黄酮、绿原酸和咖啡酰奎宁酸类物质提取工艺，并验证提取产物具备良好的抗氧化和延缓衰老的功能后，将其用作皮肤外用制剂。本申请得到天津市药用植物细胞规模培养企业重点实验室的资助。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中高山火绒草植物细胞培养物因冻存导致的黄酮、绿原酸和咖啡酰奎宁酸类物质大规模丧失，难以提取获得的问题。

本发明的另一技术目的在于，建立一种新的针对高山火绒草植物细胞培养物有效成分的提取工艺，并以黄酮类、绿原酸和咖啡酰奎宁酸类成分作为提取指标。

本发明的技术目的还在于，验证从高山火绒草植物细胞培养物中提取获得的黄酮类、绿原酸和咖啡酰奎宁酸类物质具备抗氧化和延缓衰老的功能，同时将其用于改善皮肤的皮肤外用制剂。

本发明的技术目的还在于，将高山火绒草植物细胞培养物提取物作为活性成分，制备成用于改善皮肤的皮肤外用组合剂。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案为：

一种高山火绒草植物细胞培养物的提取工艺，具体包括以下步骤：

1)对反应器或摇瓶培养的产物进行离心或抽滤获得含水量90％以上，具有完整细胞结构的高山火绒草植物细胞培养物；

2)对获得的高山火绒草植物细胞培养物进行有机试剂超声破壁预处理，预处理后的细胞培养物可以常温或冷藏、冷冻保存，也可以即时进行下一步高温提取。

3)对预处理产物进行高温浸提；

4)对高温浸提产物进行离心或抽滤，获得细胞提取物。

更进一步的，步骤1)中的离心机转速为200-400g。

更进一步的，步骤2)中有机试剂是低级醇。

作为优选的，步骤2)中有机试剂是乙醇或丁二醇。

作为优选的，步骤2)中有机试剂是丁二醇。

作为优选的，步骤2)中有机试剂是浓度为65-100％。

更进一步的，步骤2)中有机试剂与细胞培养物的量比为1:1-5:1(V/M)。

更进一步的，步骤2)中的超声条件为：功率200-600W、频率30-200HZ、时长10-30min、温度25～50℃。

更进一步的，步骤3)中的高温浸提为水浸提，浸提条件是：向预处理产物中加入鲜细胞质量1-10倍的纯水，浸提温度80-120℃，浸提时长0.5-2h。

更进一步的，步骤4)中离心的条件是4000-10000g。

更进一步的，步骤4)中的细胞提取物进一步进行冷冻干燥处理。

作为优选的，步骤4)中的细胞提取物进一步进行浓缩处理。

进一步研究发现，本发明的高山火绒草植物细胞培养物提取物具备体外抗氧化、抗炎和抗衰老功能，可以作为用来改善皮肤的皮肤外用制剂组合物中的活性成分。

一种皮肤外用制剂组合物，由本发明中的高山火绒草植物细胞培养物提取物、生理学上可接受的介质组成。

“生理学上可接受的介质”是所述指皮肤外用制剂组合物中的赋形剂，包括但不限于水、水-醇性溶液、油包水或水包油型乳液、微乳或纳米乳液、凝胶、精华、囊泡的分散体。

“生理学上可接受的”表示组合物适用于局部或经皮使用,与哺乳动物特别是人的粘膜、附属物指甲、头发、头皮和皮肤接触,组合物可以摄入或注入皮肤中,没有毒性、不相容性、不稳定性、过敏反应等风险。

更进一步的，所述皮肤外用制剂组合物中还包括能与高山火绒草植物细胞培养物提取物协同增效的其它植物提取物。

作为优选的，所述其它植物提取物为灵芝提取物和/或红景天提取物。

在高山火绒草植物细胞培养物冷藏、冷冻保存过程中，细胞受损释放蛋白酶和/或水解酶，而这些酶能在短时间内酶解细胞中的活性成分，如果直接冷藏或冻存，本发明中关注的总黄酮、绿原酸和咖啡酰奎宁酸类活性物质会极速下降。在收获高山火绒草植物细胞培养物后，立即在有机试剂存在的情况下进行超声预处理，能使细胞培养物中各种酶立即失活，最大限度的保证细胞培养物中的活性成分。

附图说明

图1高山火绒草植物细胞培养物提取物定量实验标准品色谱图；

图2高山火绒草植物细胞培养物提取物定量实验样品测定色谱图；

图3高山火绒草植物细胞培养物提取物定性实验标准品色谱图；

图4超声破碎预处理联合高温提取工艺提取物定性实验色谱图；

图5超声破碎提取工艺提取物定性实验色谱图；

图6高温提取工艺提取物定性实验色谱图。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

实施例1冻存时间对高山火绒草植物细胞培养物有效成分含量的影响

收获高山火绒草植物细胞培养物，一部分进行即时鲜细胞提取，一部分进行 -20℃冷冻保存，冻存2-10d进行复融后提取。

细胞培养物有效成分提取方法为：

以料液1:5(鲜细胞质量：加液体积)在鲜细胞中加入纯化水，在100℃下提取，提取时间为1.0h；冻存细胞的提取方法同上。对提取后的提取液进行 6500rpm离心10min，保留上清液，测定上清液中的总黄酮、绿原酸、1,5-二咖啡酰奎宁酸和3,4-二咖啡酰奎宁酸的含量。对来源于不同的3批次细胞测试方法和检测结果如下：

总黄酮的定量方法为：

亚硝酸钠-硝酸铝比色法进行总黄酮含量检测。具体实验过程如下：

1)绘制标准曲线：准确称取10mg芦丁对照品，甲醇溶解，定容100ml,配制0.2mg/ml的芦丁对照品溶液。精密吸取芦丁对照品溶液1、2、3、4、5与6ml，分别置25mL量瓶中，各加水至6ml，加入5％亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置 6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加4％氢氧化钠试液10ml，加纯水定容至25ml，摇匀，放置15min，以相应试剂为空白，照分光光度法，在500nm的波长处测定吸收度。

2)样品总黄酮含量测定：对制备的高山火绒草植物细胞培养物提取物进行10倍稀释后，准确量取1ml进行检测，检测方法同上。获取吸光度后，根据标准曲线，计算总黄酮含量。

绿原酸及二咖啡酰奎宁酸类定量方法为：

1)标准品配制:咖啡酰奎宁酸类以绿原酸、1,5-二咖啡酰奎宁酸和3,4-二咖啡酰奎宁酸为指标进行含量测定，分别配制0.1mg/ml的标准品溶液，UPLC进样不同体积，绘制标准曲线。

2)检测样品制备

准确称取0.1g制备好的高山火绒草植物细胞培养物提取物3份,加100ml 甲醇溶解，取1ml进行0.22μm过滤，过滤液进行UPLC检测。

UPLC检测条件：色谱柱：Agela Vensil ASB C18 3μm2.1×100mm

流动相：C：甲醇 D：0.2％磷酸，依下表进行梯度洗脱

时间(min)	0	5	5.1	11	14	14.5	14.6	16
									C(v％)	14	20	27	35	100	100	14	14
D(v％)	86	80	73	65	0	0	86	86

柱温：40℃ 样品温度：10℃ 流速：0.5ml/min

检测波长：327nm

以峰面积为纵坐标，进样质量为横坐标，计算回归方程。通过回归方程计算，获得绿原酸及二咖啡酰奎宁酸类的含量。

表1鲜细胞和冻存细胞有效成分含量的变化

实施例2高山火绒草细胞培养物的提取

准确称量高山火绒草植物鲜细胞100g，以料液比1:1(m/v)加入80％浓度乙醇100mL，混合均匀后，在超声设备中，进行超声20min，超声温度为30℃。在超声破壁预处理过的高山火绒草植物细胞溶液加入细胞质量2倍的纯化水 200mL，在100℃的高温下进行提取，提取时间为0.5h，之后进行6500rpm离心 10min，对上清液进行旋转浓缩，浓缩至体积为100mL，获得高山火绒草细胞培养物提取物。

按实施例1中总黄酮定量方法，测定提取物中的总黄酮含量，标准曲线、样品测定及计算结果参见表2：

表2高山火绒草植物细胞培养物的提取物定量分析

得回归方程为：y＝0.7x-0.061，R²＝0.9925。

通过回归方程，计算得到高山火绒草植物细胞提取物中总黄酮含量为 7.1mg/ml。

参照实施1中绿原酸及二咖啡酰奎宁酸类定量方法，进行绿原酸及二咖啡酰奎宁酸类定量，结果如下：

标准品定量色谱图参见图1；

高山火绒草植物细胞培养物提取物定量色谱图参见图2。

根据图1、图2得绿原酸及二咖啡酰奎宁酸类回归方程及计算得到的含量结果为：

绿原酸回归方程为：Y峰面积＝3345.5X+5380.9

1,5-二咖啡酰奎宁酸回归方程为：Y峰面积＝588.92X+11785

3,4-二咖啡酰奎宁酸回归方程为：Y峰面积＝726.85X+4070.5

通过回归方程计算，得到高山火绒草植物细胞培养物提取物中绿原酸含量为1.34mg/mL，1,5-二咖啡酰奎宁酸含量为275μg/mL和3,4-二咖啡酰奎宁酸含量为532μg/mL。

实施例3不同提取工艺对高山火绒草植物细胞培养物提取物成分的影响

对比例1：绿原酸及二咖啡酰奎宁酸类标准品定性

标准品制备方法参见实施例1，绿原酸及二咖啡酰奎宁酸类标准品定性色谱图对照图参见图3。

试验例1：超声破碎预处理联合高温提取工艺

准确称取高山火绒草鲜细胞20g，以料液比1:2(m/v)加入75％浓度乙醇40mL，混合均匀后，在超声设备中，进行超声25min，超声温度为25℃。在超声破壁预处理过的高山火绒草植物细胞溶液加入细胞质量2倍的纯化水40mL，在100℃的高温下进行提取，提取时间为2h，之后进行6500rpm离心10min，对上清液进行旋转浓缩，浓缩至体积为20mL，获得高山火绒草植物细胞培养物提取物并进行提取物定性色谱检测。定性色谱检测结果参见图4。

试验例2：超声破碎提取工艺

准确称取高山火绒草植物鲜细胞20g，加入20ml纯化水进行超声破碎提取，超声时间25min，超声温度为25℃，提取之后进行6500rpm离心10min，对上清液进行UPLC成分分析，检测结果参见图5。

试验例3：高温提取工艺

准确称取高山火绒草植物鲜细胞20g，加入20ml纯化水进行高温提取，提取时间2.0h，提取温度100℃，提取之后进行6500rpm离心10min，对上清液进行UPLC成分分析，检测结果参见图6。

实施例4不同体积有机试剂超声破壁预处理对高山火绒草细胞培养物提取物活性成分含量的影响

准确称取高山火绒草植物鲜细胞10g，以不同料液比加入不同体积的乙醇，进行超声处理10min，超声温度为30℃。之后再加入20ml的纯化水进行高温80℃提取，提取时间为0.5h，提取之后进行6500rpm离心10min，对上清液进行浓缩，浓缩至10mL，测其总黄酮、绿原酸、1,5-二咖啡酰奎宁酸和3,4-二咖啡酰奎宁酸的含量。得其结果如下：

表3超声预处理不同料液比对高山火绒草植物细胞培养物提取物活性成分的影响

实施例5不同体积纯化水对高山火绒草植物细胞培养物提取物活性成分含量的影响

准确称取高山火绒草植物鲜细胞10g，以料液比1:3加入80％浓度的乙醇，进行超声处理10min，超声温度为30℃。之后再以不同料液比加入不同体积纯化水进行高温100℃提取，提取时间为1.0h，提取之后进行6500rpm离心10min，对上清液进行浓缩，浓缩至10mL，测其总黄酮、绿原酸、1,5-二咖啡酰奎宁酸和3,4-二咖啡酰奎宁酸的含量。得其结果如下：

表4高温提取不同料液比对高山火绒草植物细胞培养物提取物活性成分的影响

实施例6高山火绒草植物细胞培养物提取物体外抗氧化实验

体外抗氧化实验待测样品溶液配制：实施例2中获得的高山火绒草植物细胞培养物提取液稀100倍后，进行体外抗氧化实验。

1)DPPH实验

DPPH乙醇溶液的配制：准确称取3.94mg DPPH，加入无水乙醇溶解并定容至 100ml容量瓶中，配制成0.1mM的DPPH溶液，低温(0-4℃)避光保存。量取不同体积的高山火绒草植物细胞提取物水溶液加入到3mL DPPH溶液中，混合均匀，之后加水补足至4mL，517nm下测其吸光度，计算其清除率，计算公式如下：

其中A对照为不加样品溶液，只加入1.0ml纯化水的吸光度；A样品为不同体积样品溶液的吸光度。

实验结果如表2所示，高山火绒草植物细胞培养物提取物对DPPH自由基具有较强的清除能力，其IC50约为0.85mg，具有显著的抗氧化能力。

表5高山火绒草植物细胞培养物提取物对DPPH自由基的清除率

测定样品体积/ml	加水体积/ml	加入DPPH体积/ml	DPPH自由基的清除率/％
				0	1.0	3.0	0
0.05	0.95	3.0	38.96
				0.10	0.9	3.0	53.84
0.15	0.8	3.0	69.17
				0.20	0.7	3.0	84.92
0.25	0.6	3.0	90.49
				0.30	0.5	3.0	91.23

2)ABTS实验

所需溶液配制:

7.4mM ABTS溶液：准确称取0.0384g ABTS置于10mL棕色容量瓶中，纯化水定容；2.6mM过硫酸钾溶液：准确称取0.0066g过硫酸钾置于10mL容量瓶中，纯化水定容；ABTS工作液：7.4mM ABTS溶液与2.6mM过硫酸钾溶液以体积比1:1混合，室温条件下避光静置12h备用，使用前用80％乙醇溶液稀释至吸光度为0.7±0.02。

样品对ABTS氧自由基的清除实验，准确量取不同体积的高山火绒草植物细胞培养物提取物样品液，加入到3.4ml的ABTS工作液中，之后加水定容至4.0ml, 混合均匀，室温静置30min，之后在734nm下进行分光光度检测，通过吸光度变化计算其清除率，计算公式如下：

其中A对照为不加样品溶液，只加入1.0ml纯化水的吸光度；A样品为不同体积样品溶液的吸光度。

实验结果如表6所示，结果表明高山火绒草植物细胞提取物对ABTS的氧自由基具有很好的清除率，其IC50为1.51mg，同时表明高山火绒草具有显著的抗氧化能力。

表6高山火绒草植物细胞培养物提取物对ABTS自由基的清除率

测定样品体积/ml	加水体积/ml	加入ABTS工作液体积/ml	ABTS氧自由基的清除率/％
				0	0.6	3.4	0
0.1	0.5	3.4	45.23
				0.2	0.4	3.4	68.36
0.3	0.3	3.4	84.56
				0.4	0.2	3.4	88.23
0.5	0.1	3.4	90.21
				0.6	0	3.4	91.23

实施例7高山火绒草细胞培养物提取物动物细胞实验抗氧化实验

CAA法：

检测样品配制：准确称取0.1g的高山火绒草植物细胞培养物提取物(即 0.1mL的高山火绒草植物细胞培养物提取物)，采用100mL的DMEM培养基中，其浓度为1mg/mL，对其溶液进行0.22μm无菌过滤膜进行过滤，过滤液-20℃保存备用。对过滤液采用DMEM稀释配制，分别配制80μg/mL、60μg/mL、40μg/mL、 20μg/mL和10μg/mL的高山火绒草植物细胞提取物溶液，进行CAA实验。

细胞培养：将人体肝癌细胞HepG2接种于75cm2的细胞培养瓶，以含10％胎牛血清、1％双抗的DMEM为培养液，培养环境为37℃，5％CO2。根据细胞生长状态进行传代或换液。

取生长状态好的细胞进行96孔板CAA实验，每孔加液100μl，细胞浓度6 ×104个/ml,于培养箱中培养24h后，移去上清液，并用PBS清洗后加入25μ mol/l的DCFH-DA溶液和不同浓度的高山火绒草植物细胞提取物溶液各50μL, 空白对照采用DMEM培养基，继续培养1h后吸弃孔中的液体，并立即加入100μ L 25μmol/L的ABAP，在337℃下孵化，测定激发波长485nm，发射波长538nm 的荧光值，每5min测一次，共跟踪测定60min。以时间为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制出样品和空白组的荧光强度随时间变化曲线，通过样品曲线下面积计算样品的CAA50值。

按如下公式计算高山火绒草植物细胞提取物抗氧化活性(CAA)值：

CAA＝100-(∫SA÷∫CA)×00

实验结果如下表4所示，结果表明高山火绒草植物细胞培养物提取物具有良好的清除氧自由基作用，并且其功效与浓度成依赖关系，随着浓度的身高，其抗氧化能力越强，当CAA值为50时，高山火绒草植物细胞提取物的浓度约为47 μg/mL。

表7不同浓度高山火绒草细胞培养物提取物对CAA值的影响

高山火绒草细胞培养物提取物浓度(μg/mL)	CAA值
		100	12.4
80	16.3
		60	36.2
40	54.3
		20	69.2
10	82.3
		0	100

实施例8高山火绒草细胞培养物提取物抗炎实验

检测样品配制：准确称取0.1g的高山火绒草植物细胞培养物提取物(即 0.1mL的高山火绒草植物细胞培养物提取物)，采用100mL的DMEM培养基中，其浓度为1mg/mL，对其溶液进行0.22μm无菌过滤膜进行过滤，过滤液-20℃保存备用。对过滤液采用DMEM稀释配制，分别配制80μg/mL、60μg/mL、40μg/mL、 20μg/mL和10μg/mL的高山火绒草植物细胞提取物溶液，进行实验。

细胞培养：RAW 264.7小鼠巨噬细胞培养于高糖DMEM培养基中，培养基中添加10％胎牛血清、1％的双抗，培养环境为37℃，5％CO2。根据细胞生长状态进行传代或换液。

收集对数生长期细胞，并调整浓度为4×105个细胞/ml的单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100μl，培养过夜。弃去培养液，分为3个组：空白组、 LPS模型组和高山火绒草植物细胞提取物实验组。LPS模型组和高山火绒草植物细胞提取物实验组加入180μl含有1μg/ml LPS的含血清的DMEM培养液，培养 1h。之后高山火绒草植物细胞提取物实验组分别加入20μl的不同浓度的高山火绒草植物细胞提取物，空白组和LPS实验组加入不含血清的DMEM培养基20μl。每组各做5个平行孔，刺激维持24h后，吸取96孔板中的培养上清液50μl，加入等体积的Griess reagent试剂1、2，室温反应10min，用酶标仪读取540 nm处光吸收值。实验重复三次。计算各药物不同剂量对细胞上清液中NO抑制率， NO浓度以亚硝酸钠为标准，计算方法如下：

NO抑制率＝(LPS模型组吸光值—各剂量药物组吸光值)/(LPS模型组吸光值- 空白组吸光值)×100％。

实验结果表明，高山火绒草植物细胞提取物可以抑制LPS导致的RAW 264.7 小鼠巨噬细胞上清中NO的分泌，表明高山火绒草植物细胞提取物具有抗炎的作用，并且其效果与高山火绒草植物细胞提取物的浓度呈现剂量依赖关系。

表8不同浓度高山火绒草植物细胞对NO抑制率的影响

高山火绒草细胞培养物提取物浓度(μg/mL)	NO抑制率/％
		10	17.8
20	24.3
		40	35.6
60	43.7
		80	52.3
100	64.5

实施例9高山火绒草细胞培养物提取物皮肤抗老化实验

真皮成纤维细胞细胞内胶原蛋白生成实验

检测样品配制：准确称取0.1g的高山火绒草植物细胞提取物(即0.1mL的高山火绒草植物细胞提取物)，采用100mL的DMEM培养基中，其浓度为1mg/mL，对其溶液进行0.22μm无菌过滤膜进行过滤，过滤液-20℃保存备用。对过滤液采用DMEM稀释配制，分别配制80μg/mL、60μg/mL、40μg/mL、20μg/mL和 10μg/mL的高山火绒草植物细胞提取物溶液，进行实验。

细胞培养：HDF-α人真皮成纤维细胞培养于含低糖DMEM培养基的T25细胞培养瓶中，培养基中添加10％胎牛血清、1％的双抗，培养环境为37℃，5％CO2。根据细胞生长状态进行传代或换液。

收集对数生长期细胞，并调整浓度为2×104个细胞/ml的单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔200μl，孵化8h后，分为3个组，分别为空白组和高山火绒草植物细胞提取物实验组，其中空白组中加入40μl的DMEM培养基，高山火绒草植物细胞提取物实验组加入40μl不同浓度的高山火绒草植物细胞提取物溶液，每组各做5个平行孔，刺激维持24h后，96孔板离心，吸取96孔板中的培养上清液150μl，加入10μl的10mM PMSF，按照人Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白ELISA试剂盒的操作方法进行Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白含量测定。高山火绒草植物细胞提取物对胶原蛋白的促进分泌率按如下方式进行计算：

促进分泌率/％＝(高山火绒草植物细胞实验组吸光值—空白组吸光值)/(空白组吸光值)×100％。

实验结果表明，高山火绒草植物细胞提取物可以促进HDF-α人真皮纤维细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的分泌，而Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的分泌增多表明具有延缓皮肤衰老的作用，并且高山火绒草植物细胞提取物的促胶原蛋白分泌效果与高山火绒草植物细胞提取物的浓度呈现剂量依赖关系。

表9不同浓度高山火绒草植物细胞对Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的影响

实施例10皮肤外用制剂--水剂组合物

由高山火绒草细胞培养物提取物1-100份、红景天提取物10-50份、余量为生理学上可接受的赋形剂。

实施例11皮肤外用制剂—凝胶剂组合物

由高山火绒草细胞培养物提取物1-100份、灵芝提取物10-50份、余量为生理学上可接受的赋形剂。

本发明的实施例中，仅列举了乙醇作为提取工艺的有机试剂的，甲醇、丙醇、 丁二醇等其它低级醇均能代替乙醇并具有相同或相似的技术功效。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更改或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种高山火绒草植物细胞培养物的提取工艺，具体包括以下步骤：

1)对反应器或摇瓶培养的产物进行离心或抽滤获得含水量90％以上，具有完整细胞结构的高山火绒草植物细胞培养物；

2)对获得的高山火绒草植物细胞培养物进行有机试剂超声破壁预处理；

3)对预处理产物进行高温浸提；

4)对高温浸提产物进行离心或抽滤，获得细胞提取物。

2.根据权利要求1所述的培养物提取工艺，其特征在于：步骤2)中的有机试剂是低级醇。

3.根据权利要求1所述的培养物提取工艺，其特征在于：步骤2)中有机试剂与细胞培养物的量比为1:1-5:1(V/M)。

4.根据权利要求1所述的培养物提取工艺，其特征在于：步骤2)中的超声条件为：功率200-600W、频率30-200HZ、时长10-30min、温度25～50℃。

5.根据权利要求1所述的培养物提取工艺，其特征在于：步骤3)中的高温浸提为水浸提，浸提条件是：向预处理产物中加入鲜细胞质量1-10倍的纯水，浸提温度80-120℃，浸提时长0.5-2h。

6.根据权利要求1或2所述的培养物提取工艺，其特征在于：步骤2)中的有机试剂是乙醇或丁二醇。

7.根据权利要求6所述的培养物提取工艺，其特征在于：步骤2)中的有机试剂是丁二醇。

8.一种皮肤外用制剂组合物，其特征在于：所述组合物含有高山火绒草植物细胞培养物提取物。

9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于：所述高山火绒草植物细胞培养物提取物具备体外抗氧化、抗炎和抗衰老功能。

10.高山火绒草植物细胞培养物提取物的组合物，其特征在于：所述组合物还包括灵芝提取物和/或红景天提取物。