CN106137828B - 黑米提取物及其制备方法和在化妆品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种黑米提取物，该黑米提取物中矢车菊素的质量含量为0.5％‑50％。本发明还提供一种黑米提取物的制备方法，以及黑米提取物在护肤制品中的应用。本发明提供的黑米提取物，活性成分的含量高，除了具有美白作用外，还具有良好的抗衰老能力，能够通过促进胶原蛋白的分泌，保持皮肤弹性；能够去除人体细胞中的自由基，进而起到抗衰老的效果，可以作为一种复合型添加剂加入到护肤品中。

Description

黑米提取物及其制备方法和在化妆品中的应用

技术领域

本发明属于生物化学领域，涉及一种提取物及其制备方法和包含该提取物的化妆品，尤其涉及一种黑米提取物及其制备方法和在化妆品中的应用。

背景技术

远古时代起，化妆品配方已有本草成分。随着科学发展，目前已有很多新型技术可用于治疗皮肤老化。然而，天然本草产品因其高效低毒等特点仍然具有很大的吸引力和广阔的市场。研究已证实越来越多的本草化学物质对皮肤具有益处，很多提取物和化合物具有显著的治疗皮肤老化的潜力，并已初步阐明其机制。针对皮肤老化，天然本草产品的应用主要针对这些目标：修复细胞外基质(ECM)；抗细胞氧化应激；抗皮肤细胞早衰等。万寿菊花提取物通过抑制透明质酸酶弹性蛋白酶MMP-1的活性，抑制皱纹产生，具有光防护作用。越来越多的证据表明，抗氧化剂可以预防甚至改善部分的皮肤老化。海藻糖和深海胶原蛋白两种海洋活性提取物可提高超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活力。甜杏仁提取物可以通过影响谷胱甘肽和脂质过氧化物，从而降低皮肤紫外线照射后的损伤。

黑米为黑稻加工产品，属于糯米类，是由禾本科植物稻经长期培育形成的一类特色品种。黑米呈黑色或黑褐色，营养丰富，食用价值和药用价值均很高，素有“黑珍珠”和“世界米中之王”的美誉。申请号200480011842.1，发明名称：利用黑米提取物预防或治疗过敏性疾病的组合物及其治疗用途，公开了一种利用黑米提取物预防或治疗过敏性疾病的方法，该黑米提取物能够显著地抑制由卵清蛋白诱发哮喘的小鼠肺中的炎症。

申请号为201410569678.1的发明专利公开了一种除斑祛痘面膜，其在该面膜中加入了黑米，这样会导致如下不良后果：黑米颗粒较大，杂质较多，直接将其应用在面膜中会堵塞毛孔，并随之出现一系列其他问题，如毛囊炎、毛孔粗大、黑头等。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种黑米提取物，并研究了该提取物在化妆品领域中的应用。

本发明的第一个方面在于提供一种黑米提取物，所述黑米提取物中包括矢车菊素，所述矢车菊素的含量为0.5％-50％，如3％、8％、35％，优选为10％-30％，如20％。

作为本发明的一个优选实施例，所述黑米提取物中还包括矢车菊素-3-O-葡萄糖苷，所述矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的质量含量为0.5％-50％，如3％、8％、35％，优选为10％-30％，如20％。

作为本发明的一个优选实施例，所述黑米提取物为液体、膏状、固体中的任意一种或几种，优选为固体。

作为本发明的一个优选实施例，所述黑米提取物的粒度为小于300μm，优选为小于200μm，如100μm、50μm等。

作为本发明的一个优选实施例，所述黑米提取物中花色苷总质量含量为10％-60％。

作为本发明的一个优选实施例，所述黑米提取物中花青素总质量含量为5％-50％。

作为本发明的一个优选实施例，所述黑米提取物可以是水提物、醇提物、油提物、超临界CO₂提取物中的任意一种或几种的组合。

作为本发明的一个优选实施例，所述醇提物为C₁-C₆的醇，并优选为脂肪醇，更优选为一元醇和/或二元醇，如甲醇、乙醇、丙醇、丙二醇和丁二醇等。

本发明的第二个方面在于提供一种黑米提取物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

步骤1、取清洁的黑米粉末，向其中加入5-20体积倍率的溶媒提取，得到提取液；

步骤2、将步骤1中得到的提取液经浓缩后，得到所述黑米提取物。

作为本发明的一个优选实施例，步骤1中所述溶媒为水，甲醇、乙醇、丙酮及其水溶液，石油醚、苯、三氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯和二氯甲烷中的任意一种或几种组合。

作为本发明的一个优选实施例，步骤1中提取所述黑米粉末的压力为0.5-1.5MPa，如0.6MPa、1.4MPa；优选为0.7-1.2MPa，如0.8MPa、1.1MPa。

作为本发明的一个优选实施例，所述黑米粉末的提取工艺在精馏塔中进行，所述精馏塔为填料塔、板式塔的任意一种或几种组合。

作为本发明的一个优选实施例，所述填料塔的填料为θ环填料、马鞍环填料、玻璃环填料中的一种或几种。

作为本发明的一个优选实施例，所述溶媒的进料流率为3-10L/min，塔顶的回流比为0.1-10。

作为本发明的一个优选实施例，所述提取液经浓缩后，还包括纯化步骤，所述纯化步骤为大孔吸附树脂纯化、高效液相色谱柱纯化、层析纯化、活性炭吸附和硅胶吸附中的任意一种或几种组合，优选为大孔吸附树脂纯化。

作为本发明的一个优选实施例，将提取液浓缩至黑米粉末体积的3-5倍得到浓缩液，将所述第一浓缩液在大孔吸附树脂中吸附2-4h，吸附过程的pH值＝4-6，温度为25℃-50℃，优选为30℃-40℃，所述大孔吸附树脂的型号为AB-8型、D-101、ADS-5中的任意一种或几种。

作为本发明的一个优选实施例，吸附结束后，采用体积含量为0-95％的乙醇溶液洗脱，乙醇溶液的流速为2-4BV/h，所述乙醇溶液的浓度可以为5％、30％、50％、80％、90％等。

作为本发明的一个优选实施例，所述喷雾干燥过程中，高压泵在80-120MPa压力下将所述过滤液通过雾化器形成100-200μm的颗粒，与所述颗粒接触的热空气的温度为60-100℃，接触时间为5-50s。

本发明的第三个方面在于提供上述任意一种黑米提取物的应用。

所述黑米提取物优选为施用于皮肤外表面，更优选为应用于制备涂覆于皮肤外表面的制品。

其中，本发明所述黑米提取物应用于制备日化用品，优选为应用于制备化妆品和/或护肤品。

作为本发明的一个优选实施例，所述化妆品和/或护肤品中，所述黑米提取物的含量为0.001％-50％，如0.003％，40％，优选为0.005％-30％，如0.008％，20％，更优选为0.01％-10％。

本发明的第四个方面在于提供一种包含上述任意一种黑米提取物的日化用品，优选为包含上述任意一种黑米提取物的化妆品和/或护肤品，更优选为所述化妆品和/或护肤品中，优选为化妆品和/或护肤品中，还可以包括营养性添加剂。

作为本发明的一个优选实施例，所述营养性添加剂可以为可用于化妆品和/或护肤品的任意一种或几种添加剂的组合，如蜂蜜、烟酰胺、乳清酸、芦荟苷、甘氨酸等。

作为本发明的一个优选实施例，所述化妆品和/或护肤品中，所述黑米提取物的含量为0.001％-50％，如0.003％，40％，优选为0.005％-30％，如0.008％，20％，更优选为0.01％-10％。

作为本发明的一个优选实施例，所述化妆品和/或护肤品中，还可以根据不同的需要，调整化妆品的配方，常用于化妆品的各种组分均可用于本发明，如角鲨烯等液状油，蜂蜡醇等固状油，各种活性剂，甘油，丁二醇等保湿剂。

本发明提供的黑米提取物，活性成分的含量高，除了具有美白作用外，还具有良好的抗衰老能力，能够通过促进胶原蛋白的分泌，保持皮肤弹性；能够去除人体细胞中的自由基，进而起到抗衰老的效果，可以作为一种复合型添加剂加入到护肤品中。

附图说明

图1为自然状态下黑米提取物对HDF细胞I型胶原蛋白分泌的影响；

图2为过氧化氢对细胞存活率的影响；

图3为黑米提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞存活率的影响；

图4为黑米提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞I型胶原蛋白分泌的影响；

图5为黑米提取物对DPPH清除率的影响；

图6为黑米提取物对透明质酸含量的影响；

图7为黑米提取物对过氧化氢损伤的HaCat细胞LOR含量的影响；

图8为黑米提取物对过氧化氢损伤的HaCat细胞AQP3含量的影响；

图9为黑米提取物对酪氨酸酶抑制率的影响。

具体实施方式

黑米提取物的制备

实施例一

取10kg干燥的黑米，去离子水洗涤两遍后热风吹干，粉碎，并过80目筛，将过筛后的黑米加入到塔釜体积为150L、装有直径为5mmθ环的精馏塔中，精馏塔的理论塔板数为20。进料口设在第5层，自进料口向塔釜加入100L去离子水，浸泡2h，调节精馏塔压力至0.8MPa，塔釜加热煮沸，并保持沸腾2h，设定塔顶回流比为5，进料口的流量为3L/min，塔釜连续采出提取液，塔顶采出的去离子水返回溶媒槽循环使用。提取液在5kPa、30℃浓缩至原体积的20％，得到浓缩液。

调节浓缩液pH值＝3，将提取液采用D-101型大孔吸附树脂吸附至饱和，然后使用去离子水、30％乙醇水溶液、60％乙醇水溶液梯度洗脱，常温、常压洗脱大孔吸附树脂，10KPa、45℃下减压浓缩，回收其中的乙醇，纯化后的浓缩液即得到黑米提取物，经液质联用仪分析可知，该黑米提取物中矢车菊素的质量含量为3％，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的质量含量为5％，花色苷总质量含量为10％，花青素的总质量含量为8％。

液相色谱的分析条件为：乙腈：0.2％磷酸＝12：88，检测波长为520nm，C18色谱柱。

实施例二

取10kg干燥的黑米，去离子水洗涤两遍后热风吹干，粉碎，并过60目筛，将过筛后的黑米加入到塔釜体积为250L、装有直径为5mmθ环的精馏塔中，精馏塔的理论塔板数为15。进料口设在第7层，自进料口向塔釜加入200L 70％甲醇溶液，浸泡2h，塔釜加热煮沸，并保持沸腾2h，设定塔顶回流比为5，进料口的流量为5L/min，塔釜连续采出提取液，塔顶采出的甲醇返回溶媒槽循环使用。

调节提取液pH值＝4，采用ADS-5大孔吸附树脂吸附至饱和，分别使用去离子水、20％乙醇水溶液、50乙醇水溶液于50℃洗脱大孔吸附树脂，混合每次的洗脱液，10KPa、45℃下减压浓缩洗脱液，回收其中的乙醇，浓缩液经喷雾干燥后得到黑米提取物，经液质联用仪分析可知，该黑米提取物中矢车菊素的质量含量为10％，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的质量含量为5％，花色苷总质量含量为10％，花青素的总质量含量为8％。

液相色谱的分析条件为：乙腈：0.2％磷酸＝12：88，检测波长为520nm，C18色谱柱。

实施例三

取10kg干燥的黑米，去离子水洗涤两遍后热风吹干，粉碎，并过80目筛，将过筛后的黑米加入到提取塔中，然后向其中加入50L去离子水，浸泡2h，在1.1MPa压力下加热煮沸，并保持沸腾2h，得到提取液一，然后向剩余残渣中加入100L三氯甲烷，在1.1MPa压力下加热煮沸，并保持沸腾2h，得到提取液二，混合提取液一与提取液二，分别浓缩提取液一和提取液二至加入体积的30％，然后将浓缩后的提取液一、提取液二分别使用ADS-5大孔吸附树脂吸附至饱和，然后分别使用去离子水、30％乙醇溶液、60％乙醇溶液洗脱大孔吸附树脂，混合洗脱液，并于10KPa、45℃下减压浓缩，回收其中的乙醇，浓缩液在70℃电加热干燥后得到黑米提取物，经液质联用仪分析可知，该黑米提取物中矢车菊素的质量含量为20％，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的质量含量为10％，花色苷总质量含量为30％，花青素的总质量含量为40％。

液相色谱的分析条件为：乙腈：0.2％磷酸＝12：88，检测波长为520nm，C18色谱柱。

对比实施例

取10kg粉碎过60目筛的黑米粉，加入一定量蒸馏水，70℃糊化5min后，冷却至室温，调节酶解pH值＝6.0，分别加入纤维素酶240U/g黑米，α-淀粉酶28U/g黑米，在料液比1：20、温度50℃条件下进行磁力搅拌酶解60min。灭酶后再5000r/min转速下离心10min，收集上层清液旋转浓缩，冻干得黑米花色苷产品，经液质联用仪分析可知，该黑米提取物中矢车菊素的质量含量为15％，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的质量含量为20％，花色苷总质量含量为35％，花青素的总质量含量为30％。。

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷一般以盐酸盐的形式保存或使用，其盐酸盐结构如下：

黑米提取物对HDF细胞和HaCat细胞存活率的影响

取对数生长期、浓度为10⁵个/mL的人HDF细胞，将细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞液100μL。最终所铺的细胞孔数取决于样品数，每个样品设3个复孔。

将96孔板置于37℃的细胞培养箱中贴壁培养6h。

将终浓度为1mg/mL、0.1mg/mL和0.01mg/mL的黑米提取物加入到96孔细胞培养板中，向对照组加入等体积的细胞培养液。于37℃、包含5％CO₂的细胞培养箱中孵育48h。

然后向每孔中加入0.5mg/mL的MTT100μL，于37℃、包含5％CO₂的细胞培养箱中黑暗条件下孵育4h。去除上清液，加入150μL DMSO，震荡以570nm为实验波长，630nm为参照波长，检测吸光度。

计算细胞存活率，结果如表1所示：

表1，黑米提取物对人HDF细胞和HaCat细胞存活率的影响

以细胞存活率高于80％为对人HDF细胞和Hacat细胞无毒的标准，由表1可知，本发明提供的黑米提取物对人HDF细胞无毒的最高浓度为0.1mg/mL，本发明提供的黑米提取物对人Hacat细胞无毒的最高浓度为0.1mg/mL，因此，确定黑米提取物浓度0.1mg/mL为后续的实验浓度。

黑米提取物的抗衰老性能

自然状态下黑米提取物对HDF胶原蛋白分泌的影响

为了考察本发明提供的黑米提取物对HDF胶原蛋白分泌的影响，本实施例将试验分为空白组、实验组、对照实验组和标准组。

取对数生长期、浓度为10⁵个/mL细胞，每孔100μL，于37℃、含有CO₂的细胞培养箱中培养24h，之后取出上清液，以3000rpm的速度离心10min，取上清液。

向标准组中加入50μL标准液，向实验组中加入10μL上清液和40μL本发明提供的黑米提取物的稀释液，向对照实验组中加入10μL上清液和40μL对比实施例提供的黑米提取物的稀释液，空白组中不加样品，分别于37℃孵育1h，并洗板5次，每组样品设3个复孔。

向四组样品中分别加入生物素标记的抗-lgG抗体50μL，于37℃温育30min，洗涤5次。

向四组样品中分别加入50μL的链霉素和素-HRP，轻轻震荡混匀，于37℃温育30min，洗涤5次。

向四组样品中分别加入显色剂A和显色剂B各50μL，轻轻震荡混匀，于37℃避光孵育30min，向四组样品中加入终止液50μL。

以空白组调零，在终止反应后15min内，在450nm波长测量各组的吸光度，结果如表2和图1所示。

表2，黑米提取物对HDF细胞I型胶原蛋白分泌的影响

组别	I型胶原蛋白含量(％)
		实验组	120.85
对照实验组	103.26
		空白组	100

胶原蛋白主要包括I型胶原和III型胶原，外界诱导促使真皮细胞中氧化水平提高是细胞损伤的主要因素，氧化水平提高的直接结果是降低了I型胶原蛋白的表达及I型胶原蛋白被基质金属蛋白酶MPP-1降解，两种情况造成的结果均为I型胶原蛋白在皮肤中的含量减少，而I型胶原蛋白含量减少是皮肤形成皱纹的主要原因。

由表2和图1可知，向HDF细胞中添加本发明提供的浓度为0.1mg/mL黑米提取物后，皮肤中的I型胶原蛋白含量为120.85％，现有技术制备的黑米提取物中，I型胶原蛋白的含量为103.26％，说明本发明提供的黑米提取物相对于现有技术制备的黑米提取物能够更加显著的促进I型胶原蛋白的表达，是潜在的抗老化添加剂。

过氧化氢对HDF细胞存活率的影响

选取不同浓度的过氧化氢，如50μM、100μM、200μM、400μM、600μM、800μM和1000μM，与HDF细胞共同孵育不同时间，如3h、6h和9h等，采用MTT法检测不同浓度的过氧化氢对HDF细胞存活率的影响。

取培养至浓度为10⁵个/mL的HDF细胞，接种于96孔细胞培养板，每孔100μL。于37℃、含有CO₂的培养箱中贴壁培养6h，每板做复孔3个。

使用不同浓度的过氧化氢分别孵育造模3h、6h和9h；向每个样品孔中加入浓度为0.5mg/mL的MTT 100μL，于37℃、含有CO₂的培养箱中，黑暗条件下孵育4h。

去除上清液，向样品中加入150μL DMSO，震荡，以570nm为实验波长，630nm为参照波长，检测每个样品的吸光度，计算细胞存活率。

测试结果如图2所示，人HDF细胞于浓度为50-800μM的过氧化氢共孵育3-9h后，人HDF细胞的存活率明显下降，当孵育浓度超过400μM时，细胞存活率低于50％。200μM过氧化氢作用6h后，细胞存活率降到70％。

黑米提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞存活率的影响

取培养至密度为10⁵个/mL的HDF细胞接种于96孔板，每孔100μL。于37℃，含有CO₂的培养箱中贴壁培养6h，加入本发明提供的黑米提取物，利用过氧化氢损伤建模。

向每孔加入0.5mg/mL的MTT 100μL，于37℃、5％CO₂的黑暗条件下孵育4h。去除上清液，加入DMSO 150μL，震荡检测吸光度。计算细胞存活率，并以供试物不同浓度和细胞的存活率作图。

结果如图3所示，经过过氧化氢孵育后，HDF细胞的存活率降低至70％以下，如阴性对照组所述，向经过氧化氢损伤过的HDF细胞中加入本发明提供的黑米提取物后，人HDF细胞的存活率达到92％，而向经过氧化氢损伤过的HDF细胞中加入对比实施例制备的黑米提取物后，人HDF细胞的存活率为80％，明显低于本发明提供的黑米提取物对受损细胞I型胶原蛋白的分泌能力，即本发明提供的黑米提取物相对于现有技术制备的黑米提取物能够显著减轻过氧化氢对HDF细胞的损伤。

黑米提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞分泌胶原蛋白的影响

取对数生长期、浓度为10⁵个/mL的HDF细胞接种于24孔细胞培养板中，每孔1mL。于37℃、含有CO₂的培养箱中培养6h。

向实验组加入本发明提供的黑米提取物，向对照实验组加入对比实施例制备的黑米提取物，空白组和阴性对照组不加样品。

实验组、对照实验组和阴性对照组利用过氧化氢损伤建模。

小心收集每孔中的上清培养液，离心，按照ELISA试剂盒说明书，取细胞悬液进行实验。以空白孔调零，反应终止15min内，在450nm波长处测量各孔的吸光度。

根据标准品的浓度及对应的吸光度值，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据实验组的吸光度，利用回归方程计算出实验组中对应的I型胶原蛋白的分泌量。

表3，黑米提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞分泌胶原蛋白的影响

组别	I型胶原蛋白含量(％)
		空白组	100
阴性对照组	74
		实验组	83
对照实验组	76

结果如表3和图4所示，经过过氧化氢损伤后，HDF细胞I型胶原蛋白分泌量变为未损伤时的74％，如阴性对照组所示。而向经过过氧化氢损伤的HDF细胞中加入本发明提供的黑米提取物后，人HDF细胞中I型胶原蛋白的含量达到83％。而向经过氧化氢损伤过的HDF细胞中加入现有技术制备的黑米提取物后，人HDF细胞中I型胶原蛋白的含量为76％，明显低于加入本发明提供的黑米提取物后人HDF细胞中I型胶原蛋白的含量，即本发明提供的黑米提取物相对于现有技术制备的黑米提取物，具有优良的修复细胞损伤的能力，能够显著修复过氧化氢对HDF细胞造成的损伤，是优良的抗衰老化妆品添加剂。

黑米提取物对DPPH自由基的影响

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)是一种很稳定的氮中心的自由基，它的稳定性主要来自3个苯环的共振稳定作用及空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。作为一种稳定的自由基，其可以清除其他的自由基。目前广泛用于定量测定生物试样和食品的抗氧化能力。此法是根据DPPH自由基有单电子，在517nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析。

测试步骤

用无水乙醇配置0.2mmol/L的DPPH溶液，避光保存，配置0.01mg/mL的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)溶液。

向实验组添加20uL浓度为0.01mg/mL本发明提供的黑米提取物溶液和0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液180uL至96孔板中，向空白组1中添加180uL无水乙醇与20uL本发明提供的黑米提取物溶液，向标准组中添加180uL DPPH溶液与20uL蒸馏水，每孔设置至少3个复孔，分别摇匀，室温下暗处静置30min，测定各组的吸光度。

向对照试验组添加20uL浓度为0.01mg/mL采用现有技术制备的黑米提取物溶液和0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液180uL至96孔板中，向空白组2中添加180uL无水乙醇与20uL采用现有技术制备的黑米提取物溶液，每孔设置至少3个复孔，分别摇匀，室温下暗处静置30min，测定各组的吸光度。

DPPH自由基的清除能力按下式表示：

其中，计算实验组的DPPH清除率时，测试样吸光度为实验组的吸光度，空白组吸光度分别为空白组1的吸光度；

计算对照实验组的DPPH清除率时，测试样吸光度为对照实验组的吸光度，空白组吸光度为空白组2的吸光度；

清除率越大表明抗氧化能力越强，结果如图5所示，当溶液中不存在DPPH自由基时，空白组的DPPH清除率为0，EGCG对DPPH自由基的去除率为47.23％，本发明提供的黑米提取物对DPPH自由基的去除率为98.35％，采用现有技术制备的黑米提取物对DPPH自由基的去除率为53.82％，说明本发明制备的黑米提取物相对于现有技术，具有更优异的DPPH清除率。

综上，本发明提供的黑米提取物具有优异的抗衰老和修复受损细胞的能力，可以作为抗衰老添加剂加入到化妆品中。

黑米提取物的保湿性能

皮肤内水分的含量的多少，直接影响皮肤的弹性、光泽度等，皮肤的表皮、真皮、皮下组织均对皮肤维持水分起着不同的作用。在皮肤保湿过程中，主要有两种机制影响皮肤对水的维持作用：

1)皮肤作为天然屏障，避免水分流失；

皮肤表皮是人的天然屏障，其中透明层、颗粒层和角质层对皮肤锁水能力起到重要作用。透明层含有磷脂类物质和角质蛋白，能够防止水分及电解质等透过皮肤。颗粒层的细胞排列致密，对贮存水分、防止水分渗透具有重要的作用。角质层是由角质形成细的坚韧、有弹性的板层结构，细胞内充满了角蛋白。

2)皮肤中存在许多保湿因子，吸收和锁住水分。

黑米提取物对透明质酸(HA)分泌的影响

在皮肤真皮层中，透明质酸(HA)是含量较多的氨基多糖，HA粘稠度极高且能高比例地结合水分子，HA的含量直接影响皮肤中水分的含量。作为皮肤内重要的保湿成分，它对皮肤细胞的增殖、分化有显著作用，对维持皮肤细胞的正常新陈代谢至关重要。

本测试分为空白组、实验组、对照实验组和标准组。

取对数生长期的浓度为10⁵个/mL的人HDF细胞，将培养的细胞接种于24孔板中，每孔细胞液1mL，于37℃、含有CO₂的细胞培养箱中培养6h。

向实验组1细胞液中加入本发明提供的黑米提取物，向对照实验组细胞液中加入对比实施例提供的黑米提取物，置于37℃、含有5％CO₂及饱和湿度的细胞培养箱中分别培养24h；

小心收集上清培养基，离心后得到上清液，备用。

向标准组中加入50μL标准液，向实验组中加入10μL上清液和40μL本发明提供的黑米提取物的稀释液，向对照实验组中加入10μL上清液和40μL对比实施例提供的黑米提取物的稀释液，空白组中不加样品，分别于37℃孵育1h，并洗板5次。

向四组样品中分别加入显色剂A和显色剂B各50μL，于37℃避光孵育30min，向四组样品中加入终止液50μL。

以空白组调零，在终止反应后15min内，在450nm波长测量各组的吸光光度值，并根据吸光度值计算细胞液中HA的含量，结果如表4和图6所示。

表4，黑米提取物对HA分泌的影响

组别	HA含量(％)
		实验组	86.55
对照实验组	78.32
		空白组	100

由表4和图6可知，添加本发明和现有技术制备的黑米提取物后，人HDF细胞中HA含量均比未添加黑米提取物时的含量有所降低，且相对于本发明提供的黑米提取物，加入现有技术制备的黑米提取物后，HDF细胞中HA的含量降低的更多。

黑米提取物对HaCat细胞兜甲蛋白(LOR)表达的影响

角质层是由角质形成细胞构成的坚韧有弹性的板层结构，细胞内充满了角蛋白。角蛋白是非水溶性的硬蛋白，有阻止化学物质内渗和体液外渗的作用，其中含量最高的角蛋白叫做兜甲蛋白，约占角蛋白的80％，兜甲蛋白的含量会直接影响皮肤水分的流失状况。

本试验通过考察HaCat细胞兜甲蛋白(LOR)的表达来考察本发明提供的黑米提取物的保湿性能。本测试分为空白组、实验组、对照试验组和标准组。

取对数生长期的浓度为10⁵个/mL的HaCat细胞，将培养的细胞接种于24孔板中，每孔细胞液1mL，于37℃、含有CO₂的细胞培养箱中培养6h。

向实验组细胞液中加入一定量本发明提供的黑米提取物，向对照实验组细胞液中加入一定量对比实施例提供的黑米提取物，空白组不加样品，置于37℃、含有5％CO₂及饱和湿度的细胞培养箱中分别培养24h。

弃除上清液，用预冷PBS冲洗细胞两次，在培养孔中加入100μL裂解液，冰上裂解细胞10min，收集细胞裂解液，以13000rpm离心10min，取上清液备用。

按照ELISA试剂盒说明书，取细胞裂解液进行试验；

利用BCA试剂盒检测不同组别蛋白质含量，各组LOR表达量采用蛋白量矫正，结果如表5和图7所示。

表5，黑米提取物对LOR表达的影响

组别	LOR含量(％)
		实验组	149.71
对照实验组	118.69
		空白组	100

由表5和图7可知，添加本发明提供的黑米提取物后，人HaCat细胞中LOR含量比不添加黑米提取物时高出近50％，添加现有技术制备的黑米提取物后，人HaCat细胞中LOR含量为不添加黑米提取物时的18％，说明本发明提供的黑米提取物保湿性比现有技术制备的黑米提取物的保湿性好。

黑米提取物对HaCat细胞水通道蛋白3(AQP3)表达的影响

在皮肤细胞中，内源性甘油的吸收、分布以及随后的水分的分布主要由AQP3介导，通过改变细胞膜两端的渗透压，AQP3增加了细胞膜双向的渗透性，有助于一系列小分子的转移。随着内源甘油被AQP3吸收和转运，甘油也成为皮肤中水的容器，起到保湿效果。因此，AQP3的含量可以间接反映皮肤中水分的含量。

为了考察本发明提供的黑米提取物对HaCat细胞AQP3表达的影响，本发明分为空白组、对照组和实验组。试验方法与兜甲蛋白表达的试验方法相同。

表6，黑米提取物对AQP3表达的影响

组别	AQP3含量(％)
		实验组	122.78
对照实验组	106.59
		空白组	100

由表6和图8可知，本发明提供的黑米提取物相对于现有技术制备的黑米提取物，能够明显提高HaCat细胞AQP3的表达，说明本发明提供的黑米提取物保湿性比现有技术制备的黑米提取物的保湿性好。

黑米提取物的美白作用

酪氨酸酶是黑素合成的主要限速酶，通过抑制酪氨酸酶的活性，可以减少黑素的生成，酪氨酸酶活性检测方法有：放射性同位素法、免疫学法和生化酶学法，以生化酶学法较为简单成熟。生化酶学法测定酪氨酸酶活性抑制的原理是：酪氨酸或多巴酸在酪氨酸酶的作用下转化为多巴醌，通过比色法测定判断酪氨酸酶活性的抑制率，该方法通过体外测定酪氨酸酶的活性，简单快捷。

材料与试剂

蘑菇酪氨酸酶 PH值＝6.8的磷酸盐缓冲液

左旋多巴(L-DOPA) 200μL吸头

96孔板 8通道加样枪

酶标仪

操作步骤

测定本发明提供的黑米提取物的酪氨酸酶抑制作用

本测试分为空白组、空白参照组、实验组和实验参照组。

配制质量浓度为0.1％的L-DOPA水溶液，配制pH值＝6.8的磷酸盐缓冲溶液。

向实验组中加入5μL浓度为0.1mg/mL的本发明提供的黑米提取物，向实验参照组中加入5μL浓度为0.1mg/mL的本发明提供的黑米提取物和45μL pH值＝6.8的磷酸盐缓冲溶液，向空白参照组加入5μL蘑菇酪氨酸酶的磷酸盐溶液，和45μL pH值＝6.8的磷酸盐缓冲溶液，向空白组加入50μL pH值＝6.8的磷酸盐缓冲溶液。

置于37℃空气浴中20min，向每孔加入50μL、质量浓度为0.1％的L-DOPA水溶液，于37℃空气浴中静置20min，于475nm下测定每组的吸光度值，并计算本发明提供的黑米提取物对蘑菇酪氨酸酶的活性抑制率。

采用相同的测试方法计算采用对比实施例(现有技术)制备的黑米提取物以及阳性对照组曲酸对酪氨酸酶的抑制率。

结果如图9所示，本发明提供的黑米提取物对蘑菇酪氨酸酶的抑制率为49.40％，采用现有技术制备的黑米提取物对蘑菇酪氨酸酶的抑制率为58.23％，说明本发明提供的黑米提取物具有优异的美白作用，可以作为添加剂添加到化妆品中。

综上所述，本发明提供的黑米提取物，相对于现有技术制备的黑米提取物，具有更优越的抗衰老、去除自由基的能力，而且具有良好的美白效果和保湿性能，可以作为化妆品添加剂加入到化妆品中。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (4)

1.黑米提取物在制备化妆品中的用途，其中所述化妆品能够促进胶原蛋白的分泌，保持皮肤弹性，并且能够去除人体细胞中的自由基，所述黑米提取物在化妆品中的含量为0.001％-50％；其中所述黑米提取物是采用下列方法制备的：

步骤1、取清洁的黑米粉末，向其中加入5-20体积倍率的溶媒进行提取，所述溶媒为水、或者是乙醇的水溶液，提取黑米的设备为精馏塔，所述精馏塔为填料塔，填料塔的填料为θ环填料；

步骤2：将步骤1得到的提取物进行浓缩，并采用D-101或ADS-5大孔吸附树脂纯化，得到黑米提取物；

其中所述黑米提取物中包括矢车菊素，所述矢车菊素的含量为3％-10％。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述黑米提取物中还包括矢车菊素-3-O-葡萄糖苷，所述矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的质量含量为3％-8％。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤1中提取所述黑米粉末的压力为0.8MPa-1.5MPa。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，在步骤2中进行减压浓缩，然后还包括干燥步骤，所述干燥步骤的干燥方法为喷雾干燥，所述喷雾干燥的条件为，高压泵在80-120MPa压力下将所述过滤液通过雾化器形成100-200μm的颗粒，与所述颗粒接触的热空气的温度为60-100℃，接触时间为5-50s。

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