KR102298335B1

KR102298335B1 - 밀몽화 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부장벽강화용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102298335B1
Application number: KR1020160079363A
Authority: KR
Inventors: 김민지; 강승현; 김연준
Original assignee: 코스맥스 주식회사
Priority date: 2016-06-24
Filing date: 2016-06-24
Publication date: 2021-09-07
Also published as: KR20180001652A

Abstract

본 발명은 밀몽화 추출물 또는 그로부터 분리된 아카세틴(acacetin)을 유효성분으로 함유하는 피부장벽강화용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 밀몽화 추출물 또는 그로부터 분리된 acacetin을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물의 경우, 피부장벽강화기능을 담당하고 있는 유전자 발현을 증가시킴으로써 피부장벽을 강화할 수 있다.

Description

밀몽화 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부장벽강화용 화장료 조성물{Cosmetic composition for skin barrier comprising extract of Buddleia officinalis or fractions thereof}

본 발명은 밀몽화 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부장벽강화용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 밀몽화 추출물 또는 그로부터 분리된 아카세틴(acacetin)을 유효성분으로 함유하는 피부장벽강화용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부장벽은 죽은 각질세포와 세포 간 지질로 구성되어 있고, 외부 자극으로부터 피부를 보호하며 피부에서 수분이 증발하는 것을 막아주는 피부 보호막으로서 피부건강에 핵심적인 기능을 담당한다. 즉, 체내에서 지나친 수분 방출을 막고 화학물질이나 미생물처럼 해로운 물질이 우리 몸 안으로 들어오는 것을 막아준다. 죽은 각질세포의 표면을 구성하는 각질세포 외피에는 세포 간 지질의 안정성에 중요한 역할을 한다. 각질형성세포는 분화를 통해 각질화 과정을 통해 피부 장벽을 만든다. 피부 장벽 기능은 노화가 진행되거나 외부 요소들에 의해 파괴될 수 있으며, 피부 장벽의 손상은 피부 수분량 감소와 주름을 일으킬 수 있다. 또한 밀착연접(tight junction)은 세포연접의 한 종류로 occludin, claudin, zona occluden(ZO) 등으로 구성되어 있다. 밀착연접은 세포막에 포함된 부분과 세포내 부분으로 나눌 수 있는데, occludin과 claudin은 세포막에 포함된 밀착연접 구성 단백질이다. 이러한 밀착연접은 세포 간의 연결고리로 이웃한 세포와 세포 사이의 간격을 메워주고 작은 물질들의 이동을 조절하는 역할도 담당한다. 최근, 연구결과를 통해 밀착연접이 피부 장벽 기능에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있다고 보고되었다. (Aileen S. et al., Journal of Cell Science, 122 (9), 1285, 2009)

아쿠아포린은 물 분자만을 선택적으로 통과시키며 모든 세포막에 존재하는 막관통단백질로 피부의 수분 흡수를 증가시키는 기작이 있다. 포유동물에서는 13가지 종류가 알려져 있고, 이들 중 아쿠아포린 3은 피부의 각질형성세포에서 발현하며 아쿠아포린 3을 통한 물과 글리세롤의 흡수와 이동은 세포의 수분 손실을 방지해 피부 탄력을 증가시킨다. (Ji Li et al., Australasian Journal of Dermatology, 51, 106, 2010)

본 발명에서, “밀몽화”(Buddleia officinalis)는 마전과에 속한 낙엽 관목으로 전통적으로 간이 허해 눈이 잘 보이지 않는 병중에 주로 사용되었으며, 밀몽화의 생물학적 효능으로는 항염, 항균, 항암, 미백, 항산화 (Houghton P. J. et al., Journal of Ethnopharmacology, 100, 100-107, 2005) 효과 등이 알려져 있다. 현재 알려진 밀몽화의 성분으로는 플라보노이드로 linarin, acaciin, acacetin 등이 있다. (Li J. et al., Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 22(10), 613, 1997)

그러나 밀몽화 추출물, 밀몽화 성분인 acacetin의 보습 효능과 피부장벽 개선에 관한 연구는 보고된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 연구 노력한 결과, 밀몽화 추출물 또는 그로부터 분리된 acacetin을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물의 경우, 피부장벽강화기능을 담당하고 있는 유전자 발현을 증가시킴으로써 피부장벽을 강화할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

Aileen S. et al., Journal of Cell Science, 122 (9), 1285, 2009 Ji Li et al., Australasian Journal of Dermatology, 51, 106, 2010 Houghton P. J. et al., Journal of Ethnopharmacology, 100, 100-107, 2005 Li J. et al., Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 22(10), 613, 1997

따라서, 본 발명의 주된 목적은 피부장벽강화 기능을 담당하고 있는 유전자 발현을 증가시킴으로써 피부장벽을 강화할 수 있는 밀몽화 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부장벽강화용 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 밀몽화 추출물 또는 그로부터 분리된 아카세틴(acacetin)을 유효성분으로 함유하는 피부장벽강화용 화장료 조성물을 제공한다.

본원발명의 상기 용어 ‘피부장벽강화’란 피부의 가장 외각에 위치하는 각질층의 장벽기능을 강화하는 것을 의미한다. 피부장벽은 죽은 각질세포와 세포 간 지질로 구성되어 있고, 외부 자극으로부터 피부를 보호하며 피부에서 수분이 증발하는 것을 막아주는 피부 보호막으로서 피부건강에 핵심적인 기능을 담당한다. 또한, 각질형성세포는 분화 및 각질화 과정을 통해 피부 장벽을 만든다. 피부 장벽 기능은 노화가 진행되거나 외부 요소들에 의해 파괴될 수 있으며, 피부 장벽의 손상은 피부 수분량 감소와 주름을 일으킬 수 있다. 본 발명에서는 본원발명의 밀몽화 추출물 또는 아카세틴은 세포간의 간격을 채워주고 물질 이동을 조절하는 밀착구조물 단백질의 유전자와 표피층의 증식 및 분화과정을 통해 완전한 각질층을 만들어주는 유전자 및 피부 각막화를 형성해주는 유전자의 발현을 증가시킴으로써, 피부 외각에 위치하는 각질층의 장벽을 강화시킨다.

본 발명에 있어서, 상기 밀몽화 추출물은 종래에 천연식물을 추출하기 위한 어떠한 용매로도 추출될 수 있으며, 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 아카세틴은 밀몽화를 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합용매 중 선택된 어느 하나 이상의 용매로 추출하여 얻어진 밀몽화 추출물에 실리콘겔 크로마토그래피에 의하여 분획하여 얻어진 것을 특징으로 한다. 상기 크로마토그래피에서 이동상으로는 클로로포름, 메탄올, n-헥산, 에틸아세테이트 또는 이들의 혼합용매를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 디클로로메탄 및 메탄올의 혼합용매를 이용할 수 있다. 상기 크로마토그래피는 아카세틴이 정제될 때까지 1회 ~ 수회에 걸쳐 수행할 수 있으며, 필요에 따라 농축, 재결정을 실시할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 밀몽화 추출물 또는 아카세틴은 조성물 종 중량대비 0.001 내지 50 중량% 함유하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실험예에 따르면, 본 발명의 밀몽화 추출물 또는 그 분획물인 아카세틴은 표피층의 증식과 분화과정을 통해 완전한 각질층을 만드는 유전자인 필라그린과 피부각막화 형성에 관여하는 트랜스글루타미나아제-1 및 세포와 세포의 간격을 채워주고 물질 이동을 조절하는 밀착구조물 유전자인 클라우딘-1의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 또한, 인공피부를 통해서도 보습인자인 아쿠아포린 3과 필라그린의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 이러한 결과로 볼 때, 본 발명의 밀몽화 추출물 또는 아카세틴은 피부장벽기능을 강화시키는 유전자들의 발현을 증가시킴으로써 피부 최외각층의 수분 흡수를 증가시키고 각질 형성세포 간의 연결고리를 증가시킬 뿐만 아니라 각질층과 세포를 강화시켜 결론적으로는 피부장벽기능을 개선시킬 수 있음을 알 수 있다(실험예 1-2 참조).

본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 화장수(스킨로션), 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양 로션, 마사지 크림, 영양 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 제형을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 밀몽화 추출물 또는 그의 분획물인 아카세틴은 피부장벽기능을 강화시키는 유전자인 필라그린, 트랜스글루타미나제-1, 클라우딘-1 및 아쿠아포린-3의 발현을 증가시킴으로써, 피부장벽을 강화 및 개선 시킬 수 있다.

도 1은 acacetin의 화학식을 나타낸다.
도 2는 밀몽화 추출물, acacetin 처리 시 아쿠아포린3 유전자의 발현을 보여주는 그래프이다.
도 3은 밀몽화 추출물, acacetin 처리 시 필라그린 유전자의 발현을 보여주는 그래프이다.
도 4은 밀몽화 추출물, acacetin 처리 시 트랜스글루타미나제1 유전자의 발현을 보여주는 그래프이다.
도 5은 밀몽화 추출물, acacetin 처리 시 클라우딘1 유전자의 발현을 보여주는 그래프이다.
도 6은 밀몽화 추출물, acacetin 처리 시 인공피부에서 아쿠아포린3, 필라그린의 발현을 보여주는 시각적 효과를 입증하는 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 밀몽화 추출물의 제조

밀몽화는 경동시장(서울, 한국)에서 구입한 것을 건조하여 사용하였다. 상기 건조시킨 밀몽화를 분말화 한 후, 각 10g당 70% 에탄올 100㎖을 가한 후, 상온에서 1일간 숙성시켰다. 그 다음, 상기 추출물을 순차적으로 여과하고 감압농축하여 추출물을 제조하였다.

실시예 2: Acacetin의 제조

Acacetin은 n-butanol 용매로 추출한 밀몽화 추출물에서 크로마토그래피 실리카겔 칼럼을 이용하여 분획을 얻어 제조하였다. 분획 용매 조건은 dichloromethane/methanol (30:1→0:1, v=v)과 같다. 또한 UV 흡수파장을 acacetin 표준품과 비교한 결과 위 분획물이 acacetin임을 확인할 수 있었다.

실험예 1: 각질형성세포주에서 유전자 발현 확인

1-1: 인간피부 각질형성세포주 HaCaT 세포 배양

인간피부의 구성 세포주인 각질형성세포 HaCaT는 10% fetal bovine serum (FBS)과 항생제가 들어있는 DMEM 배양액을 사용하여 배양하였다. 배양 용기는 75T-flask와 6 well plate를 사용하였으며 5% CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 배양액은 3~4일마다 교환해 주며 세포가 과다하게 증식되었을 때는 계대배양 하였다. HaCaT(5*10⁵/well)을 분주하고 배양 24 시간 후, 인산 완충 식염수 용액(PBS)로 세척하고, 각 웰에 FBS를 넣지 않은 DMEM 배지에 밀몽화 추출물과 acacetin을 각각 10 ppm이 되도록 희석시켜 각 웰에 첨가하였다. 24 시간 후 cDNA를 합성하고 PCR을 실시하여 유전자 발현 정도를 평가하였다.

1-2: Real-time PCR을 이용한 보습 인자, 장벽 개선 인자 유전자 발현 시험

합성된 cDNA를 타겟 주형(primer) 및 시아닌 염료인 SYBR 그린(green) 마스터 혼합물(master mix)을 사용하여 실시간(real-time) 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 최종적으로 유전자 발현 정도를 평가하였다. 유전자에 관한 발현은 Ct(threshold cycle) 방법에 의한 내부 대조 유전자 β-actin의 보정 정량화를 통한 상대적인 값으로 비교되었으며 서열은 아래 표 1에서 볼 수 있다. (음성 대조군에 대하여 *: p<0.05, **: p<0.01)

프라이머 이름	서열
Aquaporin3	정방향 5'-AGACAGCCCCTTCAGGATTT-3'
Aquaporin3	역방향 5'-TCCCTTGCCCTGAATATCTG-3'
Filaggrin	정방향 5'-TAGTGCACTCAGGGGGCTCACA-3'
Filaggrin	역방향 5'-TCCGGCTTGGCCGTAATGTGT-3'
Transglutaminase1	정방향 5'-CCCCAAGAGACTAGCAGTGG-3'
Transglutaminase1	역방향 5'-AGACCAGGCCATTCTTGATG-3'
Claudin1	정방향 5'-GCTCTAGAATTCCGAGCGAGTCATGGCCAACGC-3'
Claudin1	역방향 5'-GCTCTAGAATTCTCACACGTAGTCTTTCCCGCT-3'
β-actin	정방향 5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3'
β-actin	역방향 5'-GACACCTTCAACACCCCAGC-3'

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 밀몽화 추출물과 acacetin 10 ppm 처리에 따라 아쿠아포린3 발현양이 유의적으로 증가함을 확인할 수 있었다. 따라서, 아쿠아포린3의 증가는 세포간의 부착과 세포주위 공간을 통한 수분 이동의 조절을 더 효과적으로 수행할 수 있음을 나타냄으로써 보습기능을 강화할 수 있다.

또한, 도 3에서 확인할 수 있듯이 필라그린의 증가는 표피층의 증식과 분화의 과정을 통해 완전한 각질층을 만듦을 의미한다. 이를 통하여, 본 발명에서는 밀몽화 추출물, acacetin은 피부 장벽 개선을 통해 수분보유능력을 증진시켜 피부 보습에 탁월한 효과를 나타낼 것으로 생각된다.

더욱이, 도 4, 5에 확인할 수 있듯이 피부 각화막(cornified envelope) 형성에 결정적인 역할을 수행하는 트랜스글루타미나제 1 유전자의 발현을 증가시키고, 외부 환경으로부터 내부기관을 보호하고 인체의 항상성을 유지하는 역할을 담당하는 밀착연접의 구조물인 클라우딘 1의 발현을 증가시킨다. 따라서 이는 세포간의 부착과 세포주위 공간을 통한 수분 함유의 용질 및 수분의 이동의 조절을 더 효과적으로 수행할 수 있음을 나타냄으로써 피부장벽기능을 강화할 수 있다.

실험예 2: 피부의 조직학적 관찰

2-1. 인공피부 배양

밀몽화 추출물, acacetin에 의한 보습인자 발현 정도를 인간피부와 유사하도록 재현한 삼차원 배양피부 모델 (RHE: Reconstructed Human Epidermis)에서 확인하였다. RHE가 도착하면 안정화를 위해 growth medium에 24시간 배양 후, 밀몽화 추출물, acacetin을 10 ppm 처리한다.

2-2: 면역염색법을 이용한 아쿠아포린3 및 필라그린 발현 영향 시험

배양 3일 후 적출한 피부 조직을 10% 포르말린 용액에 고정한 후, 파라핀으로 포매하고 절편을 잘라 조직면역염색법을 수행하였다.

그 결과, 도 6에 나타난바와 같이 대조군((-))에 비해 밀몽화 추출물, acacetin을 처리한 군은 아쿠아포린 3과 필라그린이 증가되었음을 확인할 수 있었다. 또한 기저층의 배열이 더 규칙적으로 배열되고 표피층이 두꺼워짐을 확인할 수 있었다. 따라서 이는 피부 조직학적으로도 밀몽화 추출물, acacetin이 피부 장벽 개선에 효과가 있음을 확인할 수 있다.

Claims

밀몽화 추출물 또는 그로부터 분리된 아카세틴(acacetin)을 유효성분으로 함유하는, 표피층의 증식과 분화과정을 통해 각질층을 만드는 유전자인 필라그린(Filaggrin)과 피부각막화 형성에 관여하는 트랜스글루타미나아제-1(Transglutaminase-1) 및 세포와 세포의 간격을 채워주고 물질 이동을 조절하는 밀착구조물 유전자인 클라우딘-1(Claudin-1)의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 피부장벽강화용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 밀몽화 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 것을 특징으로 하는 피부장벽강화용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 아카세틴은 밀몽화를 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합용매 중 선택된 어느 하나 이상의 용매로 추출하여 얻어진 밀몽화 추출물에 실리콘겔 크로마토그래피에 의하여 분획하여 얻어진 것을 특징으로 하는 피부장벽강화용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 밀몽화 추출물 또는 아카세틴은 조성물 종 중량대비 0.001 내지 50 중량%함유하는 것을 특징으로 하는 피부장벽강화용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 화장수(스킨로션), 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양 로션, 마사지 크림, 영양 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 피부장벽강화용 화장료 조성물.