KR101710302B1 - 풍란 태좌 세포 배양 추출물을 함유한 피부 장벽 기능 강화용 항노화 피부 외용제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 풍란 세포 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 풍란 세포 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 장벽 기능 강화용 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 풍란 세포 배양물 또는 그 추출물 함유 피부 외용제 조성물은 피부 세포에 독성이 없으면서도 피부 콜라겐 합성능이 탁월하며, 엘라스타제 발현 증진에 따른 피부 탄력 증진, 개선, 피부 수렴, 피부 장벽 기능 보호, 강화 개선능 등을 가지고 있다.

Description

풍란 태좌 세포 배양 추출물을 함유한 피부 장벽 기능 강화용 항노화 피부 외용제 조성물 {Anti-aging and Enhancing Skin Barrier Function composition for skin external application comprising Neofinetia falcate Placenta Cell Culture Extract}

본 발명은 풍란 세포 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 풍란 세포 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 장벽 기능 강화용 항노화 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

피부장벽(Stratum corneum, Skin barrier)은 죽은 각질세포(Coneocyte)와 세포간 지질(Intercellular lipid)로 구성되어 있고, 외부 자극으로부터 피부를 보호하며 피부에서 수분이 증발하는 것을 막아주는 피부 보호막으로서 피부건강에 핵심적인 기능을 담당한다. 즉, 체내에서 지나친 수분 방출을 막고 화학물질이나 미생물처럼 해로운 물질이 우리 몸 안으로 들어오는 것을 막아준다. 죽은 각질세포의 표면을 구성하는 각질세포 외피에는 세포간 지질의 안정성에 중요한 역할을 한다. 각질세포 외피는 involucrin, loricrin, filaggrin 등의 단백질 막으로 구성되어있다.

각질형성세포는 분화를 통화 각질화 과정을 통해 피부 장벽을 만든다. 피부 장벽 기능은 노화가 진행되거나 외부 요소들에 의해 파괴될 수 있으며, 노화된 피부는 아세톤 또는 테이프 스트리핑(tape stripping)에 의해 쉽게 파괴된다. 피부 장벽의 손상은 피부 수분량 감소와 주름을 일으킬 수 있다.

또한, 밀착연접은 세포연접의 한 종류로 occluding, claudin, tricellulin, junctional adhesion molecule(JAM), zona occluden(ZO) 등으로 구성되어 있다. 밀착연접은 세포막에 포함된 부분과 세포내 부분으로 나눌 수 있다. Occludin과 claudin은 세포막에 포함된 밀착연접 구성 단백질이다. Occludin은 밀착연접에서 처음으로 발견된 막관통 단백질로 4개의 막관통 영역을 가지고 있다. Occludin은 밀착연접의 구성 성분일 뿐만 아니라 밀착연접의 기능을 조절하는 것으로 알려졌다. Occludin과 함께 밀착연접 구성 단백질인 claudin도 4개의 막관통 영역을 가지고 있다. 밀착연접은 세포 간의 연결고리로 이웃한 세포와 세포 사이의 간격을 메워주고 작은 물질들의 이동을 조절하는 기능을 하며, 세포와 세포 간의 물질투과를 조절하고 세포의 극성을 유지하는 역할도 담당한다. 최근, 연구결과를 통해 밀착연접이 피부 장벽 기능에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있다고 보고되었다.

피부 건강에 핵심적인 역할을 하는 피부 장벽의 손상 방지 및 강화를 위한 다양한 화장품 소재 개발(특허문헌 1 및 2)이 시급한 실정이다.

특허문헌 1 : 대한민국 등록특허 제10-0727743호 특허문헌 2 : 대한민국 공개특허 제10-2014-0016556호

본 발명자들은 피부의 견고성을 개선하고, 태양 노출 및 다른 환경적 스트레스와 같은 외부적내부적 원인으로부터 유래하는 주름과 같은 노화의 가시적 증상을 방지하거나 감소시키는데 아스파라거스목 식물의 태좌 세포 배양물 또는 그 추출물이 유용함을 확인하고, 피부장벽강화, 피부수렴, 주름개선, 탄력개선을 비롯한 항노화에 효능이 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 아스파라거스목 태좌 세포 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 아스파라거스목 태좌 세포 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 아스파라거스목 태좌 세포 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 아스파라거스목 식물의 씨방내의 태좌조직을 분리하여 태좌세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계에서 얻어진 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 아스파라거스목 태좌 세포 배양물 또는 그 추출물을 함유한 피부개선용 피부 외용제 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 아스파라거스목 태좌 세포 배양물 또는 그 추출물 함유 피부 외용제 조성물은 피부 세포에 독성이 없으면서도 피부 콜라겐 합성능이 탁월하여 주름 개선에 효능이 있으며, 피부 수렴, 피부 장벽 강화, 탄력 개선 효능을 가지고 있다.

도 1은 알로에 베라 태좌 부위를 나타내 사진이다.
도 2는 풍란 태좌 부위를 나타낸 사진이다.
도 3은 알로에 추출물과 알로에 베라 태좌세포배양 추출물 HPLC에 의한 성분비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 풍란 추출물과 풍란 태좌세포배양 추출물 HPLC에 의한 성분비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 각질형성세포에서의 알로에베라 및 풍란 태좌세포배양추출물 처리에 의해 증가되는 claudin-1, occludin 단백질 수준을 확인한 결과이다.

본 발명은 아스파라거스목(Asparagales) 태좌 세포 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 일 관점에서, 아스파라거스목 태좌 세포 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물에 관한 것이다. 구체적으로는, 상기 아스파라거스목 태좌 세포 배양물 또는 그 추출물은 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 10 중량%로 함유할 수 있다.

이러한 비율은 단지 바람직한 범위일 뿐이며, 예컨대, 하기 실시예에서는 1 중량%,또는 2중량%의 경우를 실험한 결과를 포함하고 있으나, 5%, 10%에서도 우수한 효능을 가지고 있는 것을 확인하였으며, 세포 생존율 또한 10%에서도 영향이 없음을 확인하였다. 이 이외에 20%, 30% 이상 경우도, 우수한 피부개선효과, 피부장벽 강화, 개선, 피부 수렴, 주름개선 기능 등을 가짐은 당업자에게 자명하다.

본 발명에서, 아스파라거스목은 알로에 베라(Aloe vera) 또는 풍란(Neofinetia falcate)일 수 있다.

알로에 베라(Aloe vera)는 다년생 초본으로 백합과에 속한다. 약 500여종의 알로에 종이 존재하지만 약성으로 쓰이는 알로에는 약 5종으로 알로에 베라(Aloe vera), 알로에 아보레센스(Aloe arborescens), 알로에 사포나리아(Aloe saponaria), 알로에 페리(Aloe perryi), 알로에 페록스(Aloe ferox) 만이 약용으로서 사용되고 있다. (Park YI, Lee SK (2006) New perspectives on aloe. Springer Verlag). 그 중 알로에 베라(Aloe vera)는 상업적이나 약용으로서 사용되는 대표적인 알로에 종으로 여러 약리활성물질이 있다고 알려져 있는데 특히 안트라퀴논(anthraquinone) 계통 물질의 알로에 에모딘(Aloe emodin)은 항암, 항염, 항균 효과가 뛰어나다고 알려져있다(He et al. (2005) Food control 16: 95-104).

하지만 알로에 베라는 재배한 지 3년 이상이 되어야 약성이 뛰어나며 주로 사용되는 알로에 잎 부분은 98% 이상이 물로 이루어져 있고 나머지 2%에서도 아주 적은 양의 부분만이 알로에가 가지는 약리활성물질을 포함하고 있다(Femenia et al. (1999) Carbohydrate polymers 39: 109-117). 게다가 노지 재배의 특성상 알로에가 가지는 약리활성물질 함량은 얼마든지 외부 환경에 의해 변화할 수 있다(Beppu et al. (2004) Biochemical systematics and ecology 32: 783-795). 따라서 알로에 베라의 약리성분을 안정적으로 꾸준히 얻기 위해서는 알로에 세포 배양을 통한 기내 배양이 필요하다.

최근 파낙스 진생(Panax ginseng), 히페리쿰 펄포라툼(Hypericum perforatum)과 같은 약용작물에서 세포 배양을 통해 약리활성물질을 안정적으로 공급하는 사례가 보고되고 있다(Ferrie AMR (2010) Annals of Botany 105:vii). 알로에의 여러 종에서 캘러스 유기에는 성공한 사례가 몇 차례 보고가 있었으나(Kawai et al. (1993) Phytotherapy Research 7: S5-S10), 액체 현탁 배양을 통해 약리활성물질을 안정적으로 생산하였다는 사례가 보고되지 않았으며, 더욱이 알로에 종에서 부정근 배양을 통해 약리활성물질을 생산한 사례는 알려진 바가 없다.

풍란(風蘭; Neofinetia falcata)은 한국(남부제주도) 일본(중부 이서)에 자생하며 소엽(小葉)풍란이라고도 한다. 햇빛이 잘 드는 숲속의 습기가 많은 나무나 암벽에 붙어사는 착생란이다. 자생지의 환경에 따라 잎의 생김새에 변이가 많다. 고려시대에는 방란(芳蘭)이라고도 하였으며 통영(統營)지방 자생종을 감상 가치가 높은 것으로 쳤다. 6~7월에 잎이 겹쳐진 부분의 중간에서 2개의 꽃자루가 나와 자루마다 3~5송이의 흰 꽃이 핀다.

풍란은 산 속의 물가의 노목이나 바닷가 암벽에 붙어살던 안그레컴(Angreacum) 무리의 난과 상록 다년초로서 바람이 잘 통하는 곳을 좋아한다는 점에서 풍란이라는 이름이 붙었다고 전해진다. 그 외의 이름으로는 향이 그윽하다 하여 계란(桂蘭), 나무 위나 바위 등 높은 곳에 산다 하여 선초(仙草), 시인, 묵객들이 처마 끝에 매달아놓고 그 운치를 즐겼다 하여 헌란(軒欄)이라고도 한다. 풍란은 두 종류가 있는데 Aerides japonicum Reichbfil 이라는 학명을 가진 나도풍란, 일명 대엽풍란과 Neofinetia falcata Hu 라는 학명을 가진 소엽풍란이 그것이며 소엽풍란 중 잎 모양이나 잎의 무늬, 꽃의 색깔과 형태 등의 면에서 특이하여 남다른 감상가치가 있는 것을 일본인들은 부귀란(富貴蘭)이라 부른다. 그래서 애란인들이 의미를 두고 일컫는 풍란은 주로 소엽풍란, 그 중에서도 부귀란이다.

풍란이 애란인들의 관심을 집중적으로 끌고 있는 이유는 뭐니뭐니해도 그 첫 번째 이유가 바로 독특한 향에 있다. 6,7월경에 피는 꽃의 향은 주로 빛이 없는 밤이나 흐린 날 진하게 풍기는데 달콤한 향이 사람의 후각을 매료시킨다. 그 외에도 잎 무늬와 형태의 아름다움, 뿌리가 성장할 때의 그 생장점의 영롱한 색깔, 또 작은 식물이기 때문에 가정에서 재배할 때 좁은 공간에서도 얼마든지 즐길 수 있다는 이점 등 여러 가지 면에서 풍란은 애란인들의 사랑을 받고 있다.

대체로 풍란은 흙에서 사는 것이 아니기 때문에 병충해에 의한 피해가 거의 없고 아주 강건하여 크게 신경 쓰지않아도 잘 자란다. 일반 난들처럼 매년 새 촉이 불어나는 것은 아니고 잎도 일년에 두 장 나오기 때문에 번식이 빠른 편은 아니다. 그러나 새 촉이 붙을 경우 한꺼번에 여러 촉이 붙기도 하므로 약간의 기다림과 시간만 할애하면 대주로 키우는 것도 그리 어려운 문제는 아니다. 풍란은 잎의 자태와 무늬, 뿌리의 색깔, 꽃의 모양과 색깔, 잎들이 붙어 있는 곳을 일컫는 축의 색깔, 그리고 그 축 부위에 연결되어 있는 각 잎의 붙어 있는 자리를 일컫는 붙음매의 형태 등에 따라 그 품종의 특성이 구분된다.

본 발명에 있어서, 상기 피부개선용은 피부수렴용, 주름개선용, 피부 장벽강화 또는 개선용을 포함한다.

본 발명은 아스파라거스목(Asparagales) 식물의 태좌 세포 배양물 또는 그 추출물을 함유한 피부개선용 피부외용제 조성물의 제조방법은 다음의 단계를 포함한다:

(a) 아스파라거스목 식물의 씨방내의 태좌조직으로부터 태좌세포를 분리하여 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계에서 얻어진 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 조성물을 제조하는 단계.

본 발명에 있어서, 상기 (b)단계는, (a)단계에서 얻어진 아스파라거스목 식물의 태좌세포 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시켜 조성물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (b)단계는, (a)단계에서 얻어진 아스파라거스목 식물의 태좌세포 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시킨 다음, 초음파 추출 또는 열수 추출하여 조성물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 아스파라거스목 태좌 세포 배양물 (배양체) 자체를 사용하거나, 배양물을 여과하여 사용하거나, 배양물을 파쇄하여 사용하거나, 배양물을 건조시켜 분말화한 다음, 정제수에 녹여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, "추출물"은 상기 아스파라거스목 태좌 세포 배양 추출물을 분말화하거나, 냉수추출법, 열수추출법, 에탄올 추출법 등 종래 알려진 다양한 추출법에 의해 수득한 추출물을 의미한다.

본 발명에서 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 추출, 열수 추출 등이 있다. 여기서, 열수추출의 경우, 열탕증류기에서 8~48시간동안, 80~100℃ 로 가열하여 열수 추출물을 얻는다.

냉수 추출의 경우, 예컨대, 냉수 (15-25℃)에 상기 태좌조직 배양물 자체 또는 그것의 건조된 분말을 혼합하여 3일동안 추출하여 냉수추출물을 얻는다.

또는, 물, 유기 용매, 또는 이의 혼합 용매를 사용하여 추출하는 방법으로 제조될 수 있다. 추출한 액은 바로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 유기용매를 사용하여 추출하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매인 유기용매를 사용하며 생약의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 약제의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 특히, 본 발명에 있어서는 에탄올 추출물, 바람직하게는 20-50% 에탄올 추출물, 일 구체예로써 50% 에탄올 추출물이 바람직하며, 추출방법은 실시예에 기재된 바와 같이, 50% 에탄올에 섞은 후 3일동안 교반하여 얻는다.

본 발명에 있어서, 상기 추출물은 농축, 또는 희석하여 사용할 수 있고, 추출물의 증류액을 사용할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 항노화란, 피부 보호 및 피부 상태 개선, 피부 미백, 피부 노화 및 주름의 예방 또는 개선, 모공 수축, 축소, 피부 보호 및 피부의 염증 반응의 완화, 면역질환 개선능, 또는 피부 장벽 기능 개선, 피부자극 완화, 피부 세포 증식 및 재생능, 항산화능, 콜라겐 합성 증진능 등을 모두 포함하는 개념이다.

본 발명에 있어서, "유효성분으로 함유하는"의 의미는, 피부 외용제 조성물로써 피부 수렴, 피부 장벽 강화, 개선, 주름 개선을 비롯한 항노화에 따른 피부 개선 효과를 나타낼 수 있는, 예컨대, 피부 외용제 조성물로써 주름개선효능과 관련된 콜라겐 합성, 엘라스틴 발명 증가, 피부수렴, 주름 개선, 피부장벽 강화, 개선 을 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 피부 수렴 작용의 원리는 피부 단백질의 고분자 flavonoids와 결합하여 가교결합을 형성하여 피부가 수축되는 현상을 말한다. 수렴이란 뜻에는 기본적으로 주름이 지고 혹은 움츠린다는 의미가 있으며, 수렴제는 피부와 점막 혈관 등을 수축시키는 작용이 있고, 세포간극 및 림프간극을 가로막아 점액의 분비를 억제시키는 효과가 있다. 또한 수렴제는 단백질과 결합하는 성질을 가지기 때문에 일반적으로 헤모글로빈의 단백질이 추출물과 결합하는 정도에 따라서 수렴효과 정도를 판단할 수 있다. 이러한 수렴작용에는 외용 혹은 내용에 의해서 피부와 점막의 표면에 난용성의 피막을 형성하고 그 결과 국소를 보호하거나, 혹은 조직을 조밀하게 하여 세포막의 투과성을 감소시키는 효과가 있다고 할 수 있다.

이러한 피부에 대한 수렴 작용에는, 화학적 수렴작용과 물리적 수림작용의 두 가지로 구분됩니다. 화학적 수렴작용은 탄닌과 같이 단백질 응고작용을 하는 물질에 의해 땀샘과 모공이 일시적으로 수축 되는 것을 말합니다. 반면에 물리적 수렴작용은 차가운 물을 피부에 사용하거나 에탄올의 휘발 로 피부의 온도를 저하시켜 땀샘과 모공을 일시적으로 수축시키는 것을 말한다.

또한, 이러한 피부 수렴은 여름철 같은 경우나 스트레스로 인해서, 피지가 더 많이 생기다보면 피부 트러블이 발생하고, 피부 트러블이 일어난 부위는 점점 더 빨개지게 되는데, 피부 진정이란 이러한 피부 트러블을 완화시키는 것을 의미하며, 피부 수렴과는 구별되는 작용이다.

본 발명에 따른 피부 장벽 보호 기능에 있어서, 피부장벽(skin barrier)은 표피의 최외곽 층인 각질층(stratum corneum)은 주로 무핵의 편평한 각질세포(corneocyte)로 이루어져 있다. 정상적인 표피세포의 분열 및 분화과정을 통해 유지되는 피부장벽의 각질세포가 합성하는 세라마이드, 콜레스테롤, 및 지방산과 같은 세포간 지질로 형성된 다층지질막(multi lamella lipid layer)는 피부 내의 수분이 증발하지 않도록 방어막 역할을 한다. 한편, 이들 세포간 지질 중 오메가 히드록시 세라마이드는 각질세포(corneocyte) 외곽층의 단백질인 인볼루크린(involucrin)과 화학적 공유결합으로 연결되어 각질세포지질막(corneocyte lipid envelope, CLE)을 형성함으로써 다층 지질막 형태의 세포간 지질을 물리적으로 안정화시키는 역할을 하여 장벽기능을 강화시키는 역할을 하게 된다.

본 발명의 조성물은 피부도포를 통해 각질층에 전달되어 각질세포의 분화를 촉진시켜, 표피층의 두께를 두껍게 개선시키는 효과가 있을 뿐 아니라, 피부장벽 손상을 회복시키는 효과가 우수하여 피부장벽의 손상에 의해 유발되는 피부질환의 치료 및 예방에 유용하게 사용할 수 있다. 상기 피부장벽 손상에 의해 유발되는 피부질환 으로는 아토피 피부염(atopic dermatitis), 피부건조증(xeroderma),건선(psoriasis), 어린선(ichthyosis), 여드름 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 피부 장벽 보호 기전은 밀착연접 구성 단백질인 occludin과 claudin-1의 단백질량 증가를 통해 확인하였다. Filaggrin은 각질형성세포가 분화단계에서 발현시키는 여러 구조 단백질 중 하나로 표피의 기저층으로부터 각질층까지 분화가 이루어지도록 하는데에 관여하며, 피부 조직의 수분유지에 필수적인 천연보습인자(Natural moisture factor, NMF)의 주체를 이루기도 해 피부의 수분 유지 및 피부막기능의 주요한 지표로 사용되는데, 본 발명에 따른 알로에 베라 태좌 세포 배양물, 풍란 태좌 세포 배양물은 필라그린의 유전자 발현이 월등히 증가됨에 따라 우수한 피부 장벽 보호, 강화, 개선 기능을 가진다.

아울러, 본 발명에 따른 알로에 베라 태좌 세포 배양물, 풍란 태좌 세포 배양물이 자외선 조사에 따른 피부 세포 보호 효과가 월등함을 확인한 바, 자외선 조사에 따른 피부 보호용으로도 활용 가능하다.

또한 본 발명에 따른 알로에 베라 태좌 세포 배양물, 풍란 태좌 세포 배양물은 엘라스티 발현 증가능을 가진다. 엘라스틴(Elastin)은 결합조직의 세포외기질에 존재하는 구조물질이며, 피부에 존재하여 탄성을 부여하는 물질이다. 엘라스틴은 트로포엘라스틴(Tropo elastin)이라는 폴리펩타이드로 세포에서 합성된 다음 세포외에서 트로포엘라스틴간의 교차결합으로 생성된다. 따라서 엘라스틴은 트로포엘라스틴의 교차결합에 의하여 2차 또는 3차원적인 탄성을 가지게 된다. 따라서, 본 발명에 따른 알로에 베라 태좌 세포 배양물, 풍란 태좌 세포 배양물은 피부 탄력 증진, 개선용으로 활용 가능하다.

따라서, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은, 특히, 프로콜라겐 증가, 콜라겐 생합성 증가능을 가지고 있어, 피부 노화 방지, 피부 주름 개선/방지용으로 적용될 수 있으며, 이외에도 엘라스틴 발현 증진에 따른 피부 탄력 증진, 피부장벽 강화, 개선용 으로 적용될 수 있다.

특히, 여러 유인제들 중, 200~500 μM 시킴산 유인제 처리를 한 경우, 유인제를 처리하지 않은 경우보다 더 우수한 효능을 가진다.

식물조직배양은 살아있는 작은 식물 조직을 기내(in vitro)에서 무균적으로 배양하여 배양 목적에 따라서 식물 세포, 기관 및 식물체를 증식 시키는 기술이다. 식물조직배양에는 식물이 지니는 기본적인 특성을 이용한다고 볼 수 있다. 식물조직배양 기술은 식물이 지니는 독특한 특징인 식물의 체세포로부터 식물체를 재생시킬 수 있는 분화전능성(totipotency)을 이용하는 것을 기반으로 하는 기술이다. 즉, 식물의 단세포(원형질체 포함), 잎 및 뿌리 절편을 특정 영양물질 및 생장 조절제가 첨가된 배지에 배양하면 이들 세포 및 조직으로부터 식물체가 재생될 수 있다. 이러한 식물이 분화전능성(totipotency)을 지니는 능력은 식물이 지니는 특성인 고착 생활과 장기간 생존을 위하여 열악한 환경 및 초식동물의 피해로부터 생존을 하기 위한 전략이다. 따라서 식물은 잃어버린 기관을 다시 재생시키기 위한 능력을 갖게 되었다고 볼 수 있다. 모식물체로부터 분리된 식물조직세포는 적정배양환경에서 배양하면 완전한 식물체로 재생될 수 있는 잠재력 즉, 전형성능을 가지고 있는 식물은 발생학 등의 학술적인 중요성은 물론이지만 화장품 원료 등의 실용화를 위해서도 활용가치가 크다.

식물의 태좌(胎座, Placenta)는 동물 유래의 태반과 같이, 종자 육성을 주관하는 중요한 부위로, 암술의 씨방(자방, 子房, Ovary)안에서 밑씨가 붙는 부분이다. 보통 씨방을 형성하는 심피(心皮, carpel)의 가장자리에 있는데, 때로는 심피의 중맥에도 있다. 또 씨방의 기저나, 기저로부터 씨방 안에 직립하는 기둥 모양으로 생길 때도 있다.

본 발명은 다른 관점에서, (a) 아스파라거스목 식물의 태좌조직을 분리하여 배양하는 단계; 및 (b) 상기 아스파라거스목 태좌 세포 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 아스파라거스목 태좌 세포 배양물 또는 그 추출물을 함유한 피부개선용 피부 외용제 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

상기 (a)단계에서, 구체적으로는 아스파라거스목 태좌 세포를 배양하기 위해 적절한 배지를 선택할 수 있다. 기술 분야에서 식물조직배양에 일반적으로 사용되고 있는 배지가 있다면, 제한 없이 사용가능하다. 식물에서는 일반적으로 MS배지, B5배지 등을 주로 사용하고, 일 예로, MS배지의 조성(1L기준시)은 NH₄NO₃ 1650 mg, KNO₃ 1900 mg, CaCl₂.2H₂O 440 mg, MgSO₄.7H₂O 370 mg, KH₂PO₄ 170 mg, KI 0.83 mg, H₃BO₃ 6.2 mg, MnSO₄.4H₂O 22.3 mg, ZnSO₄.7H2O 8.6 mg, Na₂MoO₄.2H₂O 0.25 mg, CuSO₄,5H₂O 0.025 mg, CoCl₂.6H₂O 0.025 mg, FeSO₄.7H₂O 27.8 mg, Na₂EDTA.2H₂O 37.3 mg, Myoinositol 100 mg, Nicotinic acid 0.5 mg, Pyridoxine-HCl 0.5 mg, Thiamine-HCl 0.5 mg, Glycine 2 mg, Sucrose 30000 mg 이다.

본 발명에 있어서, 상기 (b)단계에서 있어서, (a)단계의 배양을 통해 얻어진 아스파라거스목 태좌 세포 배양물 그대로를 포함하는 조성물을 적절한 형태의 피부 외용제 조성물로 제조하거나, 또는 상기 배양물을 공지된 추출 방법을 통해 추출물 형태로 수득하여 적절한 형태의 피부 외용제 조성물로 제조할 수 있다.

예컨대, 상기 (b)단계는, (a)단계에서 얻어진 아스파라거스목 태좌 세포 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시켜 조성물을 제조하거나,

(a)단계에서 얻어진 아스파라거스목 태좌 세포 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시킨 다음, 냉수 추출, 열수 추출 또는 에탄올 추출하여 조성물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

또 다른 예로, 상기 (a)단계에서 얻어진 배양물을 열풍 건조후 분말화하여 수분을 증발시켜 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물 또는 약제학적 조성물일 수 있다.

상기 화장료 조성물에 있어서는, 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 피부 외용제 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량 %로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 피부 외용제 조성물이 제조되는 후술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로써, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 상기 아스파라거스목 태좌 세포 배양 추출물 이외에 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글키롤, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 에탄올, 트리에탄올아민 등을 포함할 수 있으며, 방부제, 항료, 착색료, 정제수 등을 필요에 따라 미량 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은, 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 화장수, 에센스, 젤, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말, 또는 젤라틴 등의 피막이 있는 캅셀 (소프트 캅셀, 하드 캅셀) 제형 등의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 있어서의 피부는 얼굴 뿐만 아니라, 두피, 전신도 포함되는 개념으로, 이러한 두피에 적용될 수 있는 피부 외용제 조성물로써, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 발모제 등이 있고, 전신에 적용될 수 있는 바디클렌져 등의 용도로써 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 아스파라거스목 태좌 세포 배양 추출물을 함유 피부 외용제 조성물의 제조방법은 전술한 제조방법에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 제조방법을 일부 변형시킨 방법으로도 본 발명에 따른 아스파라거스목 태좌 세포 배양 추출물을 함유 피부 외용제 조성물을 제조할 수 있다.

특히, 상기 피부 외용제 조성물은 본 발명에 특별히 개시된 제조방법 이외에도, 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조될 수 있다.

화장료 조성물로 제조될 경우, 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일,염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

이러한, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 콜라겐 합성 증진능에 따른 피부 노화 방지, 엘라스타제 발현 증진을 통한 피부 탄력 개선, 피부 수렴, 피부 장벽 기능 보호, 강화, 개선을 할 수 있는 기능성 화장품의 형태를 포함한다.

본 발명에 있어서, 약제학적 조성물의 경우, 하기 실시예에서 제시하는 피부 상태 개선을 위한 약제학적 조성물로써 기능할 수 있다.

이러한 약제학적 조성물은 유효성분인 아스파라거스목 태좌 세포 배양물 또는 그 추출물 외에, "약학적으로 허용가능한 담체"를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제 및 방부제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 약학 조성물은 첨가제를 더 포함할 수 있다. 상기 첨가제로 향료, 비타민, 및 항산화제가 포함될 수 있다. 상기 담체로 약제학적으로 허용 가능한 담체는 모두 가능하며, 예를 들면, 희석제로는 유당, 덱스트린, 타피오카(tapioca) 녹말, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘 또는 탈크, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필셀룰로오스일 수 있다. 또한, 붕해제로는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨, 또는 크로스포비돈, 감미제로는 백당, 과당, 솔비톨, 또는 아스파탐, 안정제로는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 베타-사이클로덱스트린, 또는 잔탄검, 방부제로는 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는 솔빈산칼륨일 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 약제학적 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 경구 투여제제, 주사제, 좌제, 경피 투여제제, 및 경비 투여제제의 제형으로 제제화되어 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 제형은 액제, 현탁제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 또는 엑스제와 같은 경구 투여용 제형일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 이하의 실시예에서는 아스파라거스목 태좌 세포 배양 추출물에 관한 효능을 확인하였으나, 추출물이 아닌 배양물 자체에 대해서도 이러한 효과가 있음은 당업자에게 자명할 것이다.

1-1. 본 발명에 따른 아스파라거스목 ( Asparagales ) 부위별 추출물의 제조

(1) 세포 분리

1.1 아스파라거스목(Asparagales) 태좌세포의 분리

배양을 위해서, 아스파라거스목(Asparagales)인 알로에 베라(Aloe vera), 풍란(Neofinetia falcata)을 70 % 에탄올 및 0.5 % sodium hypochlorite로 5분간 멸균 소독하고, 멸균수로 여러 차례 씻어줬다. 조심스럽게 핀셋을 이용하여 씨방벽을 벗겨내고, 태좌세포를 분리하여 5% Sucrose가 포함된 MS 배지(Duchefa, Cat# M0256)에서 2~ 3주간 배양하였다.

1.2 아스파라거스목(Asparagales) 꽃 세포의 분리

배양을 위해서, 아스파라거스목(Asparagales)인 알로에 베라(Aloe vera), 풍란(Neofinetia falcata)의 꽃잎을 70 % 에탄올 및 0.5 % sodium hypochlorite로 1분간 멸균 소독하고, 멸균수로 여러 차례 씻어줬다. 조심스럽게 핀셋과 날카로운 칼을 이용하여 단번에 잘라, 잘라진 꽃 부분이 5% Sucrose가 포함된 MS 배지(Duchefa, Cat# M0256)에 치상하여 2~ 3주간 배양하였다.

1.3 아스파라거스목(Asparagales) 잎 세포의 분리

배양을 위해서, 아스파라거스목(Asparagales)인 알로에 베라(Aloe vera), 풍란(Neofinetia falcata)의 잎을 70 % 에탄올 및 0.5 % sodium hypochlorite로 1분간 멸균 소독하고, 멸균수로 여러 차례 씻어줬다. 조심스럽게 핀셋과 날카로운 칼을 이용하여 단번에 잘라, 잘라진 잎 부분이 5% Sucrose가 포함된 MS 배지(Duchefa, Cat# M0256)에 치상하여 2~ 3주간 배양하였다.

1.4 아스파라거스목(Asparagales) 줄기 세포의 분리

배양을 위해서, 아스파라거스목(Asparagales)인 알로에 베라(Aloe vera), 풍란(Neofinetia falcata)의 줄기를 70 % 에탄올 및 0.5 % sodium hypochlorite로 1분간 멸균 소독하고, 멸균수로 여러 차례 씻어줬다. 조심스럽게 핀셋과 날카로운 칼을 이용하여 단번에 잘라, 잘라진 줄기 부분이 5% Sucrose가 포함된 MS 배지(Duchefa, Cat# M0256)에 치상하여 2~ 3주간 배양하였다.

1.5 아스파라거스목(Asparagales) 뿌리 세포의 분리

배양을 위해서, 아스파라거스목(Asparagales)인 알로에 베라(Aloe vera), 풍란(Neofinetia falcata)의 뿌리를 70 % 에탄올 및 0.5 % sodium hypochlorite로 1분간 멸균 소독하고, 멸균수로 여러 차례 씻어줬다. 조심스럽게 핀셋과 날카로운 칼을 이용하여 단번에 잘라, 잘라진 뿌리 부분이 5% Sucrose가 포함된 MS 배지(Duchefa, Cat# M0256)에 치상하여 2~ 3주간 배양하였다.

(2) 분리된 아스파라거스목(Asparagales) 태좌, 꽃, 잎, 줄기 및 뿌리세포의 배양 및 대량생산

무균적으로 분리된 아스파라거스목(Asparagales) 태좌, 꽃, 잎, 줄기 및 뿌리세포를 5% Sucrose가 포함된 MS배지에서 2~ 3주의 일정기간 간격으로 계대 배양하였고, 이후, 풍선형 생물반응기(삼성과학)를 이용하여 Agar를 제외한 동일한 조성의 액체 배지에서 온도 25℃, 공기공급량을 0.1vvm으로 일정하게 조절하며 14일 간격으로 배양증식하여 대량생산하였다.

(3) 아스파라거스목(Asparagales) 태좌, 꽃, 잎, 줄기 및 뿌리세포 배양추출물의 제조

증식된 아스파라거스목(Asparagales)인 알로에 베라(Aloe vera), 풍란(Neofinetia falcata)의 태좌, 꽃, 잎, 줄기 및 뿌리세포를 수확하여 깨끗한 티슈로 충분히 수분을 제거한 후 60℃로 2일 동안 건조기에서 건조하였다. 건조된 아스파라거스목(Asparagales)인 알로에 베라(Aloe vera), 풍란(Neofinetia falcata)의 태좌, 꽃, 잎, 줄기 및 뿌리세포분말 100g을 용기에 담고, 정제수 10 L를 넣은 후, 열탕증류기에서 8 ~ 48시간동안, 80 ~100℃로 가열하여 열수 추출물을 얻었다. 추출 후, mesh로 여과하여 고형분을 제거하고, 아스파라거스목(Asparagales)인 알로에 베라(Aloe vera), 풍란(Neofinetia falcata) 세포배양추출물을 제조하였다.

1-2. 시킴산에 따른 알로에 및 풍란 태좌세포의 이차대사산물의 함량 증진

MS 기본배지에 IAA(indole-3-acetic acid) 0.5 /L, 제아틴(Zeatin) 0.2/L의 생장조절물질을 첨가하여 25℃ 배양 온도로 상기 1-1의 추출물들을 4주 동안 배양하였다. 시킴산을 배양 5주에 100, 200, 400 및 500 μM의 농도로 각각 배지에 첨가하여 배양하고, 카로티노이드, 플라보노이드 및 페놀화합물의 함량을 측정하였다.

< 시킴산 농도의 변화에 따른 캘러스 이차대사산물의 함량 >

시킴산 농도 (M)	부위	(단위: /g)
		카로티노이드	플라보노이드	페놀화합물
0		22	19	14
100	태좌	45	41	30
	꽃	20	20	13
	잎	19	21	14
	줄기	23	19	13
	뿌리	22	20	12
200	태좌	253	185	159
	꽃	22	21	14
	잎	20	22	14
	줄기	21	19	13
	뿌리	22	18	15
400	태좌	108	99	68
	꽃	20	17	13
	잎	21	19	12
	줄기	22	19	13
	뿌리	20	19	14
500	태좌	45	45	30
	꽃	20	19	12
	잎	21	18	12
	줄기	22	20	11
	뿌리	23	21	13

그 결과, 200M 시킴산의 첨가에 의하여, 알로에 및 풍란 태좌세포배양추출물의 이차대사산물의 카로티노이드, 플라보노이드 및 페놀 화합물의 함량이 증가한 것을 확인할 수 있었으나, 시킴산의 농도를 600M의 농도로 배지에 첨가한 경우는 카로티노이드, 플라보노이드 및 페놀 화합물의 함량이 다소 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 그 밖의 알로에 및 풍란의 꽃, 잎, 줄기 및 뿌리 추출물의 경우에는 시킴산 유인제 처리에 의하여 이차대사산물의 변화량이 없음을 확인하였다.

1-3. 알로에 태좌세포배양추출물과 난 태좌세포배양추출물의 HPLC에 의한 성 분분석

알로에 태좌세포배양추출물과 풍란 태좌세포배양추출물의 HPLC에 의하여 성분분석을 수행하였다. 분석조건은 다음과 같다.

구 분	분 석 조 건
HPLC 기기 종류	Waters 1525 Binary HPLC Pump
Column 종류	Gemini 5 C18 110 A (Phenomenex 사)
Column 규격	250 * 4.60 mm, 5 micron
용매 조건	- 용매 A : Water (0.1 % TFA (Trifluoro acetic acid) 함유) - 용매 B : Acetonitrile (0.1 % TFA (Trifluoro acetic acid) 함유)
파장	234 nm (UV 램프)
유속	1 ml/min

도 3에 나타난 바와 같이, 알로에 추출물과 비교했을 때, 알로에 태좌세포배양추출물에서 gallic acid의 함량이 월등히 높은 것이 확인되었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 풍란 추출물과 비교했을 때, 풍란 태좌세포배양추출물에서는 Chlorogenic acid의 함량이 월등히 높은 것이 확인되었다.

따라서, 풍란 추출물, 풍란 태좌세포 배양 추출물, 알로에 베라 추출물, 알로에 베라 태좌세포 배양 추출물은 그 구성성분이 서로 상이한 물질로 확인되었다.

실험예 1: 본 발명에 따른 아스파라거스목 ( Magnoliales ) 부위별 피부 수렴 효과 시험

수렴 효과 측정을 위해 피부단백질과 유사한 혈액단백질(hemoglobin)을 사용하여 측정하였다. 원심분리관 용기에 각각의 시료용액과 헤모글로빈 용액(500ppm)을 1:1로 넣어서 진탕 혼합한 다음 1,500 rpm에서 3분간 원심분리 후 576 nm에서 흡광도를 측정하였다. 수렴효과의 측정은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

[수학식 1]

수렴효과(%) = (1-시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도)×100

처리농도		부위	수렴 효과 측정 (Astringent activity test) ( % of control)
	대조군	-	0
1 %	Tannic acid	-	37.9
	알로에	태좌	38
		꽃	11
		잎	20
		줄기	12
		뿌리	3
	풍란	태좌	28
		꽃	8
		잎	10
		줄기	6
		뿌리	4

알로에 및 풍란 부위별 추출물의 수렴 효과를 측정한 결과, 표 3에 나타난 바와 같이, 알로에와 풍란의 태좌부위 수렴효과가 다른 꽃, 잎, 줄기 및 뿌리와 비교하여 수렴효과가 뛰어남을 확인하였다.

실험예 2: 피부 장벽 보호 기전 확인 시험

알로에 베라 태좌세포배양추출물 및 풍란 태좌세포배양추출물에 의한 피부 장벽 보호 기전을 확인함으로써, 피부 장벽 강화, 개선 기능이 있는지 여부를 확인해보았다.

인간표피각질형성세포(Human epidermal Keratinocyte)를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% Fatal bovine serum(FBS), 1% Antibiotic-Antimycotic(GIBCO, Cat.#15240-062)과 함께 100 mm/60.1 cm culture dish에서 37℃, 5% CO₂의 조건으로 배양한다.

인간표피각질형성세포가 80%이상 confluence 될 때 12-well에 3×10⁵ cells/well 분주한 후 48시간 배양한 뒤, 자외선 조사기를 이용하여 UVB 40 mJ/cm²을 조사한 뒤, 알로에 베라 태좌세포배양추출물 및 풍란 태좌세포배양추출물이 농도별로 포함된 함유된 배지에서 3일간 배양하였다. 배양을 마친 후, cell lysis buffer (0.1% SDS, 1% NP40, 150 mM NaCl, 0.5% sodium deoxycholate, 50 mM Tris-Cl (pH 7.5))로 용출한 후에 BCA(bicinchoninic acid) 정량 방법으로 단백질량을 측정하였다. 20㎍의 동량의 단백질을 넣고 SDS-polyacrylamide gel 전기영동으로 분리한뒤, nitrocellulose membrane으로 이동시켰다. Membrane을 5% Skim milk를 함유한 TBST (10mM Tris HCl, pH8.0, 150mM NaCl, 0.1% Tween 20) buffer로 1시간 동안 반응시킨 뒤 occludin (invitrogen, USA), claudin-1 (abcam, USA) 및 -actin(Santa Cruz, USA) 1차 항체를 반응시켰다. 2차 항체로는 goat anti-rabbit IgG-HRP(Santa Cruz, USA)와 donkey anti-goat IgG-HRP(Santa Cruz, USA)를 사용하여 1시간 반응시켰다. TBST buffer로 세척 후에 ECL solution kit(amersham, UK)으로 발색하여 분석하였다.

알로에 베라 태좌세포배양추출물 및 풍란 태좌세포배양추출물에 의한 밀착연접 구성 단백질의 양적 변화를 알아보기 위하여 각질형성세포를 이용하여 단백질 변화를 확인하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, 자외선을 조사한 각질형성세포는 밀착연접 구성 단백질인 occludin과 claudin-1 단백질량이 감소됨을 확인하였으나, 자외선 조사 후에 농도별로 알로에 베라 태좌세포배양추출물 및 풍란 태좌세포배양추출물을 처리하면 감소된 occludin 단백질 생성량이 증가된 것을 볼 수 있었다.

실험예 3: 자외선 조사에 의한 세포보호 효과

UV 조사에 사용할 광원으로는 302 nm 파장의 자외선을 방출하는 ultraviolet crosslinker CL-1000 (Ultra-Violet Products, CA)을 사용하였다. 피부각질형성세포인 HaCaT 세포를 1×10⁵ cells/ml 농도로 24-well plate에 넣고 배양기에서 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 인산완충액으로 세척하였다. 인산완충액을 500 L 첨가한 다음 자외선을 10 mJ/cm로 조사 후 FBS를 포함하지 않은 신선한 세포배양배지로 교체하고 시료를 1% 농도로 처리한 다음 24시간 추가배양하였다. 여기에, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma) 5 mg/ml를 첨가한 후 배양기에서 3시간 배양한 후 형성된 fomazan을 DMSO로 녹이고, 96well plate로 옮긴 후 595 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하여 자외선 조사 후 시료를 처리하지 않은 대조군과 세포생존율을 비교하였다.

처리농도	UV조사 유무	구분	부위	자외선 조사에 의한 세포 보호 효과 ( % of Control )
	UV (-)	대조군	-	1.0
1 %	UV (+)	대조군	-	0.5
		알로에	태좌	0.98
			꽃	0.8
			잎	0.7
			줄기	0.6
			뿌리	0.4
		풍란	태좌	0.97
			꽃	0.88
			잎	0.76
			줄기	0.45
			뿌리	0.64

알로에 및 풍란 부위별 추출물 및 태좌세포배양추출물의 각질형성세포 보호 효과를 평가하기 위하여, 인간각질형성세포(Keratinocytes, HaCaT)를 자외선 조사 20 mJ/cm에 노출시킨 뒤 24시간 추가 배양한 뒤 세포생존율을 확인할 수 있는 MTT assay를 수행한 결과, 알로에 및 풍란의 꽃, 잎, 줄기 및 뿌리로부터 유래한 추출물은 세포보호 효과에 큰 영향을 미치지 않았다. 알로에 및 풍란의 태좌세포배양추출물은 1% 농도 처리에 의하여 자외선을 조사한 대조군에 비교하여 세포 생존율(Cell Vialbility)가 증가하였다. 따라서, 알로에 및 풍란 태좌세포배양추출물이 자외선조사에 의한 세포보호효과를 확인할 수 있었다.

실험예 4: 피부 장벽 기능 확인 시험

인간표피각질형성세포(Human epidermal Keratinocyte)를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% Fatal bovine serum(FBS), 1% Antibiotic-Antimycotic(GIBCO, Cat.#15240-062)과 함께 100 mm/60.1 cm culture dish에서 37℃, 5% CO₂의 조건으로 배양한다.

인간표피각질형성세포가 80%이상 confluence 될 때 12-well에 3×10⁵ cells/well 분주한 후 24시간 배양한 뒤 알로에 베라 태좌세포배양추출물 및 풍란 태좌세포배양추출물이 농도별로 포함된 함유된 배지에서 24시간 배양하였다. 인간표피각질형성세포가 80%이상 confluence 될 때 96 well plate에 1×10⁴ cells/well 분주한 후 농도별로 함유된 알로에베라 태좌세포배양추출물 및 풍란 태좌세포배양추출물을 처리한다. 그 후 24시간 추가 배양하여 Filaggrin 유전자 발현을 Real-time PCR 법으로 확인하였다.

RNA isolation과 cDNA 합성은 FastLane Cell one-step buffer set (QIAGEN, Cat.#216213)이용한다. 배지를 제거한 세포는 FCW(cell wash buffer)로 세척하고, 50㎕ cell processing mixture(Buffer FCPL이 첨가된 Buffer FCPW에 gDAN Wipeout buffer 첨가한 mixture)을 첨가하여 실온에서 5분간 incubation 한 후 새로운 E-tube에 옮긴 후 75℃에서 5분간 반응시킨다. Filaggrin 유전자 발현을 분석하기 위하여 상기에서 합성된 cDNA를 template로하여 2X QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master mix의 매뉴얼에 따라 Rotor Gene Q Real-time PCR Machine (Qiagen社)으로 진행한다. 실험에 사용한 Filaggrin primer는 Qiagen사의 Cat.#QT01192646)를 사용하였고, 발현율은 Housekeeping genes(GAPDH, Cat.#QT01192646)로 Normalization였다. Real-time PCR 조건은 다음과 같다.

처리농도		부위	Filaggrin 유전자 발현율 (Relative Expression of Filaggrin)
	음성 대조군	-	1.00
1 %	알로에	태좌	2.52
		꽃	0.98
		잎	2.09
		줄기	1.08
		뿌리	1.14
	풍난	태좌	3.38
		꽃	2.01
		잎	1.91
		줄기	0.95
		뿌리	1.05

Filaggrin 발현증가는 알로에 베라 태좌세포배양추출물 및 풍란 태좌세포배양추출물에 의하여 각질형성세포의 정상적인 분화를 촉진하고, 피부에서의 자연보습인자로 변환되는 filaggrin의 피부내 발현을 촉진함으로써 피부장벽기능을 개선할 수 있음을 나타낸다.

즉, 알로에 및 풍란 부위별 추출물 및 태좌세포배양추출물의 Filaggrin 유전자의 발현을 측정한 결과, 표 5에 나타난 바와 같이, 알로에와 풍란의 태좌세포배양추출물의 유전자 발현율이 다른 부위에 유래한 추출물보다 유전자 발현양이 월등히 증가함을 확인하였다.

실험예 5: Procollagen 합성 증진 시험

인간섬유아세포(Human Skin Fibroblast)를 37℃, 5% CO₂배양기에서 일정한 습도를 유지하는 세포 배양기내에서 10% FBS, Penicillin(50U/ml), Streptomycin(50/ml)를 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco, USA)으로 배양하여, 1×10⁵개/ml로 24 well plate에 500㎕ 씩 분주한 다음 24시간 배양하였다. 대조군(DMEM 배지)과 0.1%, 0.5%, 1.0%, 2.0%, 5.0% 및 10.0%의 농도의 알로에 베라 태좌세포배양추물과 풍란 태좌세포배양추출물을 함유한 배지를 넣고 48시간동안 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양하였다. 48시간 후, 배지의 상층액을 각각 20㎕ 을 취해 Procollagen Type I C-Peptide EIA Kit(PICP, Takara, Cat No. MK101)를 이용하여 측정함으로써 새로 합성된 콜라겐 양을 측정하였다. PICP양은 ng/1×10⁵세포로 환산하였으며, 하기 수학식에 따라 계산하여 그 결과는 표 6에 나타나 있다.

[수학식 2]

콜라겐 생합성 증가율(%) = [(시험군 콜라겐 양)/(대조군 콜라겐양)] × 100

처리농도		부위	Procollagen 생합성량 PIP (ng/ml)
	음성 대조군	-	70
	양성 대조군 TGF-1 (10ng/ml)	-	280
1 %	알로에	태좌	210
		꽃	108
		잎	110
		줄기	85
		뿌리	75
	난	태좌	234
		꽃	120
		잎	107
		줄기	70
		뿌리	84

알로에 및 풍란 부위별 추출물 및 태좌세포배양추출물 처리에 의한 콜라겐 합성과 관련한 Procollagen 생성량을 측정한 결과, 표 6에 나타난 바와 같이, 알로에와 풍란의 태좌세포배양추출물의 PIP 생성량이 다른 부위에 유래한 추출물보다 월등히 증가하여 탁월한 콜라겐 합성 증진 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

실험예 6: 엘라스틴 유전자 발현 분석

인간진피형성세포(Human epidermal Fibroblast)를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% Fatal bovine serum(FBS), 1% Antibiotic-Antimycotic(GIBCO, Cat.#15240-062)과 함께 100 mm/60.1 cm culture dish에서 37℃, 5% CO₂의 조건으로 배양하였다.

인간진피형성세포가 80%이상 confluence 될 때 12-well에 3×10⁵ cells/well 분주한 후 24시간 배양한 뒤 알로에 태좌세포배양추출물 및 풍난 태좌세포배양추출물이 농도별로 포함된 함유된 배지에서 24시간 배양하였다. 인간진피형성세포가 80%이상 confluence 될 때 96 well plate에 1×10⁴ cells/well 분주한 후 농도별로 함유된 알로에 태좌세포배양추출물 및 난 태좌세포배양추출물을 처리한다. 그 후 24시간 추가 배양하여 Elastin 유전자 발현을 Real-time PCR 법으로 확인하였다.

RNA isolation과 cDNA 합성은 FastLane Cell one-step buffer set (QIAGEN, Cat.#216213)이용한다. 배지를 제거한 세포는 FCW(cell wash buffer)로 세척하고, 50㎕ cell processing mixture(Buffer FCPL이 첨가된 Buffer FCPW에 gDAN Wipeout buffer 첨가한 mixture)을 첨가하여 실온에서 5분간 incubation 한 후 새로운 E-tube에 옮긴 후 75℃에서 5분간 반응시킨다. Filaggrin 유전자 발현을 분석하기 위하여 상기에서 합성된 cDNA를 template로하여 2X QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master mix의 매뉴얼에 따라 Rotor Gene Q Real-time PCR Machine (Qiagen社)으로 진행한다. 실험에 사용한 Elastin primer는 Qiagen사의 Cat.#QT00034594)를 사용하였고, 발현율은 Housekeeping genes(GAPDH, Cat.#QT01192646)로 Normalization였다. Real-time PCR 조건은 다음과 같다.

처리농도		부위	Elastin 유전자 발현율 (Relative Expression of Elastin)
	음성 대조군	-	1.00
	양성 대조군 TGF-1 (10ng/ml)	-	1.52
1 %	알로에	태좌	1.42
		꽃	0.98
		잎	1.09
		줄기	1.08
		뿌리	1.14
	난	태좌	1.38
		꽃	1.01
		잎	0.91
		줄기	0.95
		뿌리	1.05

알로에 및 풍란 부위별 추출물 및 태좌세포배양추출물의 피부탄력과 관련한 Elastin 유전자의 발현을 측정한 결과, 표 7에 나타난 바와 같이, 알로에와 풍란의 태좌세포배양추출물의 유전자 발현율이 다른 부위에 유래한 추출물보다 유전자 발현양이 월등히 증가함을 확인하였다.

화장료 조성물의 제조

본 발명의 아스파라거스목 태좌 세포 배양 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장품으로 영양화장수, 크림, 에센스 등의 유화 제형의 화장품 및 유연화장수 등의 가용화 제형의 화장품을 제조하였다.

제조예 2-1: 화장수

다음 처방에 따라 통상의 화장수 제조 방법에 따라 제조하였다.

원 료 명	중량 %(w/w)
글리세린	5.0
디프로필렌글리콜	3.0
히아루론산	0.5
폴리옥시에틸렌 경화피마자유	0.1
폴리에틸렌 올레일에틸	0.1
에탄올	5.0
방부제	0.15
항료	적량
착색료	적량
아스파라거스목 태좌 세포 배양 추출물	2.0
정제수	to 100

제조예 2-2: 에센스

다음 처방에 따라 통상의 에센스 제조 방법에 따라 제조하였다.

원 료 명	중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올	1.0
자기유화형모노스테아린산	1.0
밀납	0.5
스쿠알란	5.0
이소세틸옥타노에이트	3.0
디메틸실록산	0.3
모노스테아린산소르비탄	0.5
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜	8.0
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	0.2
카르복시폴리머	0.22
트리에탄올아민	0.25
방부제	적량
향료	적량
착색료	적량
아스파라거스목 태좌 세포 배양 추출물	7.0
정제수	to 100

제조예 2-3: 로션

다음 처방에 따라 통상의 로션 제조 방법에 따라 제조하였다.

원료명	중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올	0.8
자기유화형모노스테아린산	1.0
밀납	0.5
스테아린산	0.5
유동파라핀	7.0
스쿠알란	5.0
마카데미아오일	3.0
이소세틸옥타노에이트	2.0
디메틸실록산	0.3
모노스테아린산소르비탄	0.5
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜	1.2
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	4.0
베타인	4.0
카르복시폴리머	0.12
트리에탄올아민	0.15
방부제	0.25
향료	적량
착색료	적량
아스파라거스목 태좌 세포 배양 추출물	5.0
정제수	to 100

제조예 2-4: 크림

다음 처방에 따라 통상의 크림 제조 방법에 따라 제조하였다.

원 료 명	중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올	3.0
자기유화형모노스테아린산	1.5
친유형모노스테아린산	1.5
밀납	0.5
유동파라핀	8.0
스쿠알란	7.0
이소세틸옥타노에이트	4.0
정제호호바유	4.0
디메틸실록산	0.3
모노스테아린산소르비탄	1.0
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜	1.2
글리세린	6.0
프로필렌글리콜	4.0
베타인	4.0
산탄검	0.06
트리에탄올아민	0.10
방부제	0.25
향료	적량
착색료	적량
아스파라거스목 태좌 세포 배양 추출물	7.0
정제수	to 100

제조예 2-5: 젤

다음 처방에 따라 통상의 젤 제조 방법에 따라 제조하였다.

원료명	중량 %(w/w)
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	4.0
에탄올	10
폴리옥시에틸렌경화피마자유	0.1
카르복시폴리머	0.30
트리에탄올아민	0.30
방부제	적량
향료	적량
착색료	적량
아스파라거스목 태좌 세포 배양 추출물	1.0
정제수	to 100

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

1. 풍란(Neofinetia falcate) 식물의 태좌 세포 배양물의 추출물을 함유하는 피부 수렴용 화장료 조성물.
   
2. 풍란(Neofinetia falcate) 식물의 태좌 세포 배양물의 추출물을 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
   
3. 삭제
4. 풍란(Neofinetia falcate) 식물의 태좌 세포 배양물의 추출물을 함유하는 피부 탄력 증진용 화장료 조성물.
   
5. 삭제
6. 다음의 단계를 포함하는 풍란(Neofinetia falcate) 식물의 태좌 세포 배양물 의 추출물을 함유한 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 따른 화장료 조성물의 제조방법:
   (a) 풍란 식물의 씨방내의 태좌조직으로부터 태좌세포를 분리하여 배양하는 단계; 및
   (b) 상기 (a)단계에서 얻어진 배양물의 추출물을 함유하는 조성물을 제조하는 단계.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 (b)단계는, (a)단계에서 얻어진 풍란 식물의 태좌세포 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시켜 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
8. 제6항에 있어서, 상기 (b)단계는, (a)단계에서 얻어진 풍란 식물의 태좌세포 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시킨 다음, 초음파 추출 또는 열수 추출하여 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
   

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