KR102157395B1

KR102157395B1 - 광천수 함유 배지에서 배양된 생열귀 캘러스 함유 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102157395B1
Application number: KR1020130129126A
Authority: KR
Inventors: 최선강; 이여훈; 김남준; 김상윤; 모상현; 서효현; 정해수; 모지홍
Original assignee: 에스엠생명과학 주식회사
Priority date: 2013-10-28
Filing date: 2013-10-28
Publication date: 2020-09-18
Also published as: KR20150049078A

Abstract

본 발명은 생열귀 캘러스 함유 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 광천수 함유 배지에서 배양된 생열귀 캘러스 함유 항노화 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 생열귀 캘러스 추출물 함유 화장료 조성물은 피부 세포에 독성이 없으면서도 피부 콜라겐 합성능이 탁월하며, 피부 보습, 모공 축소, 피지분비 억제, 여드름 개선, 항산화 효능을 가지고 있다.

Description

광천수 함유 배지에서 배양된 생열귀 캘러스 함유 화장료 조성물 {Cosmetic Composition including Rosa davurica Pall Callus Cultured in medicum containing mineral water }

본 발명은 생열귀 캘러스 함유 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 광천수 함유 배지에서 배양된 생열귀 캘러스 함유 항노화 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부는 나이를 먹으면서 끊임없이 변화하며, 점차적으로 노화된다. 외부로부터 받는 끊임없는 물리적, 화학적 자극은 피부 기능을 저하시키고 피부의 노화현상을 촉진시키게 되는데, 이러한 피부의 노화는 피부 구성 성분의 전체적인 악화를 수반하여 결과적으로 피부가 쉽게 갈라지게 되는 것이다.

또한, 섬유 아세포의 감소 및 이 세포의 활성도 손상 역시 피부 노화 프로세스 중에 중요한 부분을 차지한다. 이러한 피부 노화현상을 방지하고 보다 건강하고 아름다운 피부를 유지하기 위하여 종래에는 각종 식물, 동물, 미생물로부터 얻은 생리활성물질들을 함유한 화장품을 사용함으로써, 피부의 고유 기능을 유지시키고 피부 세포를 활성화시켜 피부 노화를 효과적으로 억제하기 위하여 부단히 노력해 왔다.

그러나 기존의 화장품 원료는 만족할만한 효과나 효능을 충족하기에는 여전히 미흡하고, 오히려 피부 부작용을 유발하는 문제점이 있다.

또한, 여드름(심상성 좌창 : Acne vulgaris)이란 모공이 좁아지거나 막혀 피지가 배출되지 못해 생기는 피부병이다.털을 만드는 모낭에는 털에 기름을 분비하여 촉촉하게 하는 피지선이 있는데. 이 피지선의 분비가 늘어나거나 모낭 입구가 막히면 여드름균의 증식이 활발하여 여드름을 일으킨다. 여드름의 원인은 여러 가지가 있지만 남성 호르몬인 안드로겐(androgen), 여드름을 일으키는 세균 즉, 프로피오니 박테리움 아크네(Propionibacterium acnes)의 증식 및 피지 분비 증가가 가장 중요하다. 여드름 환자의 경우 안드로겐이 피지선을 자극하여 피지 분비를 증가시키고, 이렇게 증가된 피지들이 죽은 피부세포들과 엉키고 뭉쳐지게 되면서 모낭 입구를 막는다. 이렇게 막힌 모낭 입구는 혐기성 세균인 프로피오니박테리움 아크네가 자랄 수 있는 환경을 제공하게 되고, 이들이 분비한 리파아제(lipase)들이 피지를 분해하여, 그 분해산물이 모낭에 자극을 주어 결국 염증을 일으킨다. 여드름의 예방과 치료는 과도한 피지 분비 억제와 염증완화를 통해서 얻을 수 있다. 따라서, 그 원인을 복합적으로 제거를 한다면 여드름을 매우 효과적으로 억제할 수 있게 된다. 특히, 여드름은 근래에 와서 외부적 스트레스, 대기 오염물, 호르몬 불균형 등으로 청소년 뿐만 아니라 성인에게서 유발되는 경향이 증가되고 있고, 이현상은 해마다 현저해지고 있기 때문에 여드름과 관련된 방법들이 많이 제시되고 있다. 여드름과 관련된 피부트러블을 개선하는 방법으로 살리실릭산 및 트리클로산(triclosan) 및 트리하이드록시팔미틱산을 화장료 조성물에 적용함으로써 모공을 열어주고 피지 분비를 촉진하여 여드름의 예방 및 치료하는 방법이 개시되고 있고(대한민국 공개특허 제2004-0089072호), 올리고사카라이드를 복용함으로써 피지선에서의 피지 분비량을 감소시켜 피지분비를 억제하는 방법을 개시하고 있다(일본 특허공개 평 05-294836호). 또한, 프로피오니박테리움 아크네에 항균력을 가진 제비꽃 추출물을 화장료에 적용시켜 여드름의 예방하는 방법이 제시되고 있다(대한민국공개특허 제2002-0082616호)

한편, 생열귀에 대해서는 종래에 화장료 조성물에 관한 특허 (대한민국등록특허 10-1043813)가 존재하나, 이것은 오존에 의한 피부손상에 대한 방어효능을 가지는 화장료 조성물에 관한 것이고, 생열귀로부터 유도된 캘러스에 관한 항노화 효과에 대해서 이전에 화장품의 소재로써 기능적인 연구가 된 바는 없다.

대한민국 공개특허 제2004-0089072호 일본 특허공개 평 05-294836호 대한민국 공개특허 제2002-0082616호 대한민국 등록특허 제10-1043813호

본 발명자들은 피부개선능이 있는 화장료 조성물을 제조하기 위해 노력하던 중, 생열귀 캘러스 추출물, 특히, 광천수를 함유한 배지에서 자란 생열귀 캘러스 배양 추출물이 피부보습, 미백, 피지억제, 여드름 개선 및 주름개선효능 등이 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 생열귀 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 생열귀 캘러스의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 생열귀 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 생열귀 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 미백용, 주름방지 또는 개선용, 피부 보습용, 모공 축소용, 피지분비억제용, 여드름 개선용인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 생열귀 캘러스는 광천수 함유 배지에서 배양하여 유도된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 배지 중의 광천수의 농도는 0.5~4%(v/v)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 광천수 함유 배지에서 생열귀 캘러스를 배양하는 단계를 포함하는 티로시나제 활성 억제능, 항산화능, 또는 콜라겐 합성능을 가진 생열귀 캘러스의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 배지 중의 광천수의 농도는 0.5~4%(v/v)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 광천수 함유 배지는 0.5~3 ㎎/ℓ의 6-benzylaminopurine를 포함하고, pH가 6~6.5이며,6-benzylaminopurine 0.5~3 ㎎/ℓ, KNO3 2.3~2.7g/l, CaCl2·2H2O 0.1~0.3g/l, MgSO4·7H2O 0.3~0.5g/l, NH4H2PO4 0.2~0.4g/l, KI 0.0005~0.0015g/l, H3BO3 0.04~0.06g/l, MnSO4·H2O 0.005~0.015g/l, ZnSO4·7H2O 0.0005~0.0015g/l, Na2MoO4·2H2O 0.00005~0.00015g/l, CoCl2·6H2O 0.00005~0.00015g/l, FeSO4·7H2O 0.01~0.02g/l, Na2EDTA 0.015~0.025g/l 및 이노시톨(Inositol) 0.5~1.5g/l를 포함하는 배지인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, (a) 생열귀 종자로부터 캘러스를 유도하고, 광천수 함유 배지에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계에서 얻어진 배양물의 추출물을 함유하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 생열귀 캘러스 추출물 함유한 피부개선용 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 생열귀 캘러스 추출물 함유 화장료 조성물은 피부 세포에 독성이 없으면서도 피부 콜라겐 합성능이 탁월하며, 피부 보습, 모공 축소, 피지분비 억제, 여드름 개선, 항산화 효능을 가지고 있다.

도 1은 생열귀 종자로부터 발아된 결과를 발아 후 7, 8, 9, 10, 21일에 얻은 사진이다.
도 2는 유도된 생열귀 캘러스를 광천수 미함유, 함유 배지에서 배양하여 얻어진 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 생열귀 캘러스 추출물의 HPLC 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 광천수 및 생열귀 캘러스 추출물의 광천수 함유 농도별에 따라 달라진 HPLC 성분 분석 결과 그래프를 구분하여 나타낸 것이다.

본 발명은 생열귀 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 화장료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 생열귀(Rosa davurica Pall.)는 장미과(Rosacea)에 속하는 다년생 식물로서 우리나라, 일본, 만주 및 시베리아 등에 분포하는 낙엽활엽관목이다. 예로부터 민간에서는 식용으로 이용하였으며, 뿌리와 열매의 약용효과로서 건위이기와 양혈조경 등이 있는 것으로 알려져, 소화불량, 기대복사, 위통, 월경부조 등의 치료에 사용되어 온 유용한 약용식물자원이다. 생열귀나무의 열매는 아스코르빈산(ascorbic acid)의 함량이 레몬에 비하여 1030배 가량 높고, 베타-카로틴(-carotene)의 함량이 당근에 비하여 810배 가량 높다고 보고된 바 있다. 또한, 생열귀나무 열매의 과피에서는 베툴리닉애시드(betulinic acid), 알피톨릭 애시드(alphitolic acid), 올레아놀릭 애시드(oleanolic acid), 마스리닉 애시드(maslinic acid), 우르솔릭 애시드(ursolic acid), 포몰릭 애시드(pomolic acid), 토르멘틱 애시드(tormentic acid), 유스카픽 애시드(euscaphic acid) 등의 테트라사이클릭 트리테르펜(tetracyclic triterpene)과 케르세틴(quercetin), 하이페린(hyperin), 틸리로사이드(tiliroside) 등의 플라보노이드(flavonoid) 등이 분리되어 보고된 바 있다.

본 발명은 일 관점에서, 생열귀 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 구체적으로는, 상기 생열귀 캘러스 추출물은 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 10 중량%로 함유할 수 있다. 이러한 비율은 단지 바람직한 범위일 뿐이며, 예컨대, 10중량% 그 이상의 20%, 30% 이상 경우도, 우수한 모공축소, 피부보습, 여드름개선, 피지억제, 항염, 주름개선 기능을 비롯한 피부개선효과를 가짐은 당업자에게 자명하다.

본 발명에 있어서, 상기 생열귀 캘러스 배양물 (배양체) 자체를 사용하거나, 배양물을 여과하여 사용하거나, 배양물을 파쇄하여 사용하거나, 배양물을 건조시켜 분말화한 다음, 정제수에 녹여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, "추출물"은 상기 생열귀 캘러스를 분말화하거나, 동결건조하거나, 냉수추출법, 열수추출법, 에탄올 추출법 등 종래 알려진 다양한 추출법에 의해 수득한 추출물을 의미한다.

본 발명에서 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 추출, 열수 추출 등이 있다. 여기서, 열수추출의 경우, 열탕증류기에서 8~48시간동안, 80~ 100℃ 로 가열하여 열수 추출물을 얻는다.

냉수 추출의 경우, 예컨대, 냉수 (15-25℃)에 상기 배양물 자체 또는 그것의 건조된 분말을 혼합하여 3일동안 추출하여 냉수추출물을 얻는다.

또는, 물, 유기 용매, 또는 이의 혼합 용매를 사용하여 추출하는 방법으로 제조될 수 있다. 추출한 액은 바로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 유기용매를 사용하여 추출하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매인 유기용매를 사용하며 생약의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 약제의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 특히, 본 발명에 있어서는 에탄올 추출물, 바람직하게는 20-50% 에탄올 추출물, 일 구체예로써 50% 에탄올 추출물이 바람직하며, 추출방법은 50% 에탄올에 섞은 후 3일동안 교반하여 얻는다.

본 발명에 있어서, 상기 추출물은 농축, 또는 희석하여 사용할 수 있고, 추출물의 증류액을 사용할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 피부개선용이란, 피부 보호 및 피부 상태 개선, 피부 미백, 피부 노화 및 주름의 예방 또는 개선, 피부보습, 피지분비억제, 여드름개선, 모공축소, 피부 보호, 면역질환 개선 또는 피부 장벽 기능 개선, 피부자극 완화, 피부 세포 증식 및 재생능, 항산화능, 콜라겐 합성 증진능 등을 모두 포함하는 개념이다.

본 발명에 있어서, "유효성분으로 함유하는"의 의미는, 화장료 조성물로써 피부 개선 효과를 나타낼 수 있는, 예컨대, 화장료 조성물로써 항산화, 모공축소, 피부보습, 피지억제, 여드름개선, 주름개선효능과 관련된 콜라겐 합성 또는 iNOS 억제 활성 등을 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미한다.

따라서, 본 발명에 따른 화장료 조성물은, 특히, 콜라겐 합성 유전자 발현능, 티로시나아제(tyrosinase) 활성 억제, 콜라겐 생합성 유전자의 발현율의 증가, 프로콜라겐 증가, 피부 보습과 관련된 아쿠아포린-3(aquaporine-3), 필라그린(filaggrin) 발현 증가능 등을 가지고 있어, 피부 노화 방지, 피부 주름 개선/방지, 미백, 항산화, 모공수축, 피지억제, 피부 보습용 등으로 적용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 캘러스는 식물체에서 잘라낸 조직을 옥신을 함유한 배지에서 배양하거나, 어떤 종류의 식물에 상처를 내거나, 상구를 옥신으로 처리하거나 할 때에 생기는 특수한 조직 또는 세포덩어리를 말한다. 보통 캘러스는 정상적인 기관형성이나 조직분화를 일으키는 능력을 잃은 무정형의 조직 또는 세포덩어리로 대부분 유세포로 되어 있다. 넓은 의미로는 아그로박테리움(Agrobacterium) 등의 감염에 의해서 생기는 식물종양조직도 포함시키기도 한다.

본 발명에서 생열귀 캘러스는 생열귀의 종자, 성체 어느 부위에서 유도된 캘러스이던지 제한되지 않고, 일 구현예로, 생열귀 종자로부터 발아하여 얻은 생열귀조직을 잘라내어 캘러스유도 할 수 있다.

식물조직배양은 살아있는 작은 식물 조직을 기내(in vitro)에서 무균적으로 배양하여 배양 목적에 따라서 식물 세포, 기관 및 식물체를 증식 시키는 기술이다. 식물조직배양에는 식물이 지니는 기본적인 특성을 이용한다고 볼 수 있다. 식물조직배양 기술은 식물이 지니는 독특한 특징인 식물의 체세포로부터 식물체를 재생시킬 수 있는 분화전능성(totipotency)을 이용하는 것을 기반으로 하는 기술이다. 즉, 식물의 단세포(원형질체 포함), 잎 및 뿌리 절편을 특정 영양물질 및 생장 조절제가 첨가된 배지에 배양하면 이들 세포 및 조직으로부터 식물체가 재생될 수 있다. 이러한 식물이 분화전능성(totipotency)을 지니는 능력은 식물이 지니는 특성인 고착 생활과 장기간 생존을 위하여 열악한 환경 및 초식동물의 피해로부터 생존을 하기 위한 전략이다. 따라서 식물은 잃어버린 기관을 다시 재생시키기 위한 능력을 갖게 되었다고 볼 수 있다. 모식물체로부터 분리된 식물조직세포는 적정배양환경에서 배양하면 완전한 식물체로 재생될 수 있는 잠재력 즉, 전형성능을 가지고 있는 식물은 발생학 등의 학술적인 중요성은 물론이지만 화장품 원료 등의 실용화를 위해서도 활용가치가 크다.

본 발명은 다른 관점에서, (a) 생열귀 종자로부터 캘러스를 유도하고, 광천수 함유 배지에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계에서 얻어진 배양물의 추출물을 함유하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 생열귀 캘러스 추출물 함유한 피부개선용 화장료 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

상기 (a) 단계에서, 생열귀 캘러스 유도시에, 적절한 배지를 선택할 수 있다. 기술 분야에서 식물조직배양에 일반적으로 사용되고 있는 배지가 있다면, 제한 없이 사용가능하다. 식물에서는 일반적으로 MS배지, B5배지 등을 주로 사용하고, 일 예로, MS배지의 조성(1L기준시)은 NH₄NO₃ 1650 mg, KNO₃ 1900 mg, CaCl₂.2H₂O 440 mg, MgSO₄.7H₂O 370 mg, KH₂PO₄ 170 mg, KI 0.83 mg, H₃BO₃ 6.2 mg, MnSO₄.4H₂O 22.3 mg, ZnSO₄.7H2O 8.6 mg, Na₂MoO₄.2H₂O 0.25 mg, CuSO₄,5H₂O 0.025 mg, CoCl₂.6H₂O 0.025 mg, FeSO₄.7H₂O 27.8 mg, Na₂EDTA.2H₂O 37.3 mg, Myoinositol 100 mg, Nicotinic acid 0.5 mg, Pyridoxine-HCl 0.5 mg, Thiamine-HCl 0.5 mg, Glycine 2 mg, Sucrose 30000 mg 이다.

본 발명에 있어서, 상기 (b)단계에서 있어서, (a)단계의 배양을 통해 얻어진 생열귀 캘러스 추출물을 포함하는 조성물을 적절한 형태의 피부 외용제 조성물로 제조하거나, 또는 상기 배양물을 공지된 추출 방법을 통해 추출물 형태로 수득하여 적절한 형태의 피부 외용제 조성물로 제조할 수 있다.

예컨대, 상기 (b)단계는, (a)단계에서 얻어진 생열귀 캘러스 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시켜 조성물을 제조하거나, (a)단계에서 얻어진 생열귀 캘러스 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시킨 다음, 냉수 추출, 열수 추출 또는 에탄올 추출하여 조성물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

또 다른 예로, 상기 (a)단계에서 얻어진 배양물을 열풍 건조후 분말화하여 수분을 증발시켜 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 유도된 생열귀 캘러스는 광천수가 함유된 배지에서 배양하여 얻어진 캘러스추출물일 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 광천수 함유 배지에서 생열귀 캘러스를 배양하는 단계를 포함하는 티로시나제 활성 억제능, 항산화능, 또는 콜라겐 합성능을 가진 생열귀 캘러스의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, “광천수”란, 수원이 강원도 강릉시 옥계면 금진리 해변 인근 산의 광천수(금진온천수)로서 지하 1,011m에서 취수한 것이며, 이러한 광천수의 염도의 비율이 전체 중량의 18~22% 이며, 칼슘과 마그네슘의 비율이 1.6~1.7:1일 수 있으며, 바람직하게는 염도의 비율은 전체 중량의 20%이며, Ca(칼슘)과 Mg(마그네슘)의 비율이 1.66:1로 구성되어 체내 흡수에 최적인 황금비율로 구성되어 있다.

[그림 1] 광천수 성분 분석

상기 배지 중의 광천수의 농도는 0.5~10%(v/v), 바람직하게는 0.5~4%(v/v), 더욱 바람직하게는 1.0 ~ 3.0%(v/v) 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 배지는 바람직하게는 MS (Murashige & Skoog), WPM (McCown Lloyd) 또는 SH (Shenk & Hildebrant Medium) 배지일 수 있고, 더욱 바람직하게는 MS 배지일 수 있고, 더 더욱 바람직하게는 KNO3 2.3~2.7g/l, CaCl2·2H2O 0.1~0.3g/l, MgSO4·7H2O 0.3~0.5g/l, NH4H2PO4 0.2~0.4g/l, KI 0.0005~0.0015g/l, H3BO3 0.04~0.06g/l, MnSO4·H2O 0.005~0.015g/l, ZnSO4·7H2O 0.0005~0.0015g/l, Na2MoO4·2H2O 0.00005~0.00015g/l, CoCl2·6H2O 0.00005~0.00015g/l, FeSO4·7H2O 0.01~0.02g/l, Na2EDTA 0.015~0.025g/l 및 이노시톨(Inositol) 0.5~1.5g/l을 포함하는 배지일 수 있고, 가장 바람직하게는 KNO3 2.5g/l, CaCl2·2H2O 0.2g/l, MgSO4·7H2O 0.4g/l, NH4H2PO4 0.3g/l, KI 0.001g/l, H3BO3 0.05g/l, MnSO4·H2O 0.01g/l, ZnSO4·7H2O 0.001g/l, Na2MoO4·2H2O 0.0001g/l, CoCl2·6H2O 0.0001g/l, FeSO4·7H2O 0.015g/l, Na2EDTA 0.02g/l 및 이노시톨(Inositol) 1g/l을 포함하는 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 배지는 생장조절물질을 포함할 수 있고, 바람직하게는 6-benzylaminopurine를 포함할 수 있고, 더욱 바람직하게는 6-benzylaminopurine 0.5~3㎎/ℓ을 포함할 수 있고, 가장 바람직하게는 6-benzylaminopurine 1㎎/ℓ을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지의 pH는 6~6.5일 수 있고, 바람직하게는 pH 6일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 생열귀 캘러스의 배양은 20~32℃에서 배양할 수 있으며, 바람직하게는 22~28℃에서 배양할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 바람직한 배지 중의 광천수 농도는 2~5%(v/v)이고, pH가 6~6.5이며, 6-benzylaminopurine 1~3 ㎎/ℓ, KNO3 2.3~2.7g/l, CaCl2·2H2O 0.1~0.3g/l, MgSO4·7H2O 0.3~0.5g/l, NH4H2PO4 0.2~0.4g/l, KI 0.0005~0.0015g/l, H3BO3 0.04~0.06g/l, MnSO4·H2O 0.005~0.015g/l, ZnSO4·7H2O 0.0005~0.0015g/l, Na2MoO4·2H2O 0.00005~0.00015g/l, CoCl2·6H2O 0.00005~0.00015g/l, FeSO4·7H2O 0.01~0.02g/l, Na2EDTA 0.015~0.025g/l 및 이노시톨(Inositol) 0.5~1.5g/l를 포함하는 배지에서 생열귀 캘러스를 25~32℃에서 배양할 수 있고, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 화장료 조성물은 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 화장료 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량 %로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 화장료 조성물이 제조되는 후술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로써, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기 미나리아재비목 식물 태좌 세포 배양 추출물 이외에 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글키롤, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 에탄올, 트리에탄올아민 등을 포함할 수 있으며, 방부제, 항료, 착색료, 정제수 등을 필요에 따라 미량 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은, 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 화장수, 에센스, 젤, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말, 또는 젤라틴 등의 피막이 있는 캅셀 (소프트 캅셀, 하드 캅셀) 제형 등의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 있어서의 피부는 얼굴 뿐만 아니라, 두피, 전신도 포함되는 개념으로, 이러한 두피에 적용될 수 있는 화장료 조성물로써, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 발모제 등이 있고, 전신에 적용될 수 있는 바디클렌져 등의 용도로써 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 생열귀 캘러스 추출물을 함유 화장료 조성물의 제조방법은 전술한 제조방법에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 제조방법을 일부 변형시킨 방법으로도 본 발명에 따른 미나리아재비목 식물 태좌 세포 배양 추출물을 함유 화장료 조성물을 제조할 수 있다.

특히, 상기 화장료 조성물은 본 발명에 특별히 개시된 제조방법 이외에도, 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조될 수 있다.

화장료 조성물로 제조될 경우, 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일,염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

이러한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 미백, 피부보습, 모공축소, 피지분비억제, 여드름개선, 항산화, 콜라겐 합성 증진능에 따른 피부 노화 방지의 기능을 할 수 있는 기능성 화장품의 형태를 포함한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1-1: 본 발명에 따른 생열귀 캘러스 유도

본 발명에 사용된 생열귀 종자는 강원도 정선 정선읍 애산리에서 수확한 것으로 흙에 파종하여 발아를 유도하였다. 발아된 생열귀를 70% 에탄올에 30초 동안 침지한 후 멸균수로 세척하고 다시 소독액 (30% 락스 +Tween20)으로 20분 소독한 후 멸균수로 3회 수세하여 날카로운 칼을 이용하여 단번에 상처를 내어 1mg/L 6-Benzylaminopurine, 0.3mg/L 2,4-D, 3% Sucrose 및 agar 8g/L 가 포함된 기본 1/2MS배지에서 25℃, 습도 70% 의 생장상 조건으로 암배양하며 초기 캘러스를 유도하였다 (도 1).

실시예 1-2: 본 발명에 따른 광천수가 농도별로 함유된 배지에서 자란 생열귀 캘러스 조직배양 및 대량생산

무균적으로 유도되어 배양된 생열귀 캘러스를 광천수가 농도별(0%, 1%, 3%, 5%, 10%)로 포함된 1/2MS(+1mg/L 6-벤질아미노퓨린(Benzylaminopurine), 0.3mg/L 2,4-D)배지에서 25℃, 습도 70% 의 생장상 조건으로 암배양하며 2~3주의 일정기간 간격으로 계대 배양하였다. 이후, 풍선형 생물반응기를 이용하여 agar를 제외한 동일한 조성의 액체 배지에서 온도 25℃, 습도 70%, 공기공급량 0.1 vvm으로 일정하게 조절하며 14일 간격으로 배양 및 증식하여 대량생산하였다 (도 2).

실시예 1-3: 본 발명에 따른 광천수가 농도별로 함유된 배지에서 자란 생열귀 캘러스 배양 추출물 제조

증식된 생열귀 캘러스 배양물을 수확하여 깨끗한 티슈로 충분히 수분을 제거한 후 60℃로 2일 동안 건조기에서 건조하였다. 건조된 생열귀 캘러스 배양물 분말 50g을 용기에 담고, 1L의 정제수를 넣은 후 121 ℃에서 1시간동안 추출하였다. 추출 후, mesh로 여과하여 고형분을 제거하고, 여과하여 나온 생열귀 캘러스 배양 추출물을 동결건조하여 정제수에 녹여 본 발명에 사용하였다.

실험예 1 : 광천수 함유 배지에서 자란 생열귀 캘러스 배양 추출물의 HPLC에 의한 성분분석

광천수가 농도별로 함유된 배지에서 자란 생열귀 캘러스 배양 추출물의 HPLC에 의하여 성분분석을 수행하였고, 분석조건은 다음과 같다.

광천수가 0%, 1%, 3%, 5% 및 10% 함유된 배지에서 배양된 생열귀 캘러스 배양 추출물을 HPLC로 분석하였을 경우, 생열귀 캘러스 배양 추출물 내 비슷한 유용성분 패턴을 보였으며, 특히, 1% 광천수가 함유된 배지에서 배양된 생열귀 캘러스 배양 추출물의 경우 Rt값 6.4min에 검출된 peak가 가장 증가해보였다 (도 3 및 도 4).

실험예 2: 본 발명에 따른 광천수가 농도별로 함유된 배지에서 자란 생열귀 캘러스 배양 추출물의 피부 세포 viability에 미치는 영향

실시예 1에서 제조한 추출물에 대한 피부 세포의 증식 활성을 알아보기 위하여, 인간섬유아세포(Human Skin Fibroblast, CCD-986Sk)는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 분주 받아서 배양하였다. 각 세포를 1×10⁴cells/ml의 농도로 하여 24well 배양판에 접종하였다. 배지는 10 % FBS를 함유한 DMEM(Dubelcco'S Modified Eagle Medium, BRL,USA)을 사용하였다. 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 48시간 배양하여 배양용기 표면적의 25 ~ 30%만큼 배양되면, 실시예 1에서 제조된 추출물이 0.5 ~ 5 %가 함유된 FBS-free DMEM으로 교체하여 24시간 더 배양하였다. 배양 후 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브롬화물 (MTT, Sigma M5655, USA) 용액 (2.5 mg/ml)을 5㎕ 첨가하고 3시간동안 추가로 배양한 후 상등액을 제거하고, 각 well 당 200㎕의 Dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma D265O, USA)용액을 가한 후 20분간 교반하여 형성된 포르마잔(formazan) 결정을 녹인 다음, 100㎕ 씩을 96 well 로 취하여 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)로 570 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 피부 세포의 증식 활성 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 하기 수학식에 따라 계산하여 백분율로 표시하였고, 결과는 표 2에 나타난 바와 같았다.

[수학식 1]

세포증식효과(%) = [(실험군 흡광도 - 대조군 흡광도)/대조군의 흡광도] 100

상기 인간각질형성 세포(keratinocyte)를 이용한 Cytotoxicity(세포독성)에 미치는 영향시험 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 광천수가 0%, 1%, 3%, 5% 및 10%가 함유된 배지에서 자란 생열귀 캘러스 배양 추출물 0.05 ~ 1 mg/ml 처리에 의한 세포독성은 보이지 않았다.

실험예 3: in vitro tyrosinase 활성 억제에 의한 미백효과

Tyrosinase는 피부 멜라닌 생성에 있어서 매우 중요한 역할을 수행하는 rate-limiting enzyme이다. 피부의 색소를 생성하는 세포인 색소생성세포 (melanocyte)의 색소형성기관 (melanosome)에서 tyrosine을 산화시켜 dopa를 만들고, 다시 dopa를 산화시켜 dopachrome을 만드는 dopa oxidase로 작용한다. tyrosinase는 멜라닌 합성 단계에서 3가지 구별되는 반응을 촉매 하는데, 1) monophenol (L-tyrosine)의 hydroxylation, 2) catechol (L-DOPA)의 dehydrogenation, 3) DHI의 dehydrogenation 등이다. 따라서 다양한 미백 기능성 원료의 tyrosinase 활성 억제는 미백 활성의 중요한 척도가 될 수 있다. 따라서, 시험관(in vitro)내에서 광천수가 농도별로 함유된 배지에서 유도된 생열귀 캘러스 배양 추출물이 mushroom tyrosinase 효소 활성을 저해하는 정도를 측정하였다.

광천수 미함유, 1%, 3%, 5% 및 10% 함유배지에서 유도된 생열귀 캘러스 배양 추출물 30㎕, 100mM 인산염완충액(pH 6.5) 210㎕, mushroom tyrosinase (1500 U/ml - 2000 U/ml, Fulka Cat. No. 93898) 20㎕, 1.5 mM tyrosine 40㎕를 넣고 37℃에서 10~15분동안 반응 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

tyrosinase 활성 저해율 (%) = 100 - [(b-b')/(a-a') X 100]

a: 공시료액의 반응 후의 흡광도

b: 시료액의 반응 후의 흡광도

a', b': tyrosinase 대신 완충액으로 대체하여 측정한 흡광도

In vitro Tyrosinase 활성억제효과에 의한 미백효과는 표 3에 나타난 바와 같이, 광천수가 0%, 1%, 3%, 5% 및 10%가 함유된 배지에서 자란 생열귀 캘러스 배양 추출물 0.05 ~ 1 mg/ml 처리에 의하여 광천수 1% 함유된 배지에서 자란 생열귀 캘러스 배양 추출물 1mg/ml에서 15% 정도 가장 높은 Tyrosinase 활성 억제효과를 보였고, 전반적으로, 광천수를 포함하지 않았을 경우보다는 우수한 미백효과를 나타내었다.

실험예 4: DPPH 자유라디컬 소거능을 통한 항산화 시험

에탄올에서 1,1-Diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH, Sigma D9132-1G)가 발생시키는 free radicals에 대한 소거능을 시험함으로써 항산화 효과의 직접적인 작용 정도를 파악할 수 있다. 화합물 1,1-Diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH, Sigma D9132-1G)는 에탄올 내에서 자유라디칼을 발생하고, 광천수 미함유 및 함유배지에서 유도된 생열귀 캘러스 배양 추출물과 혼합하여 자유라디칼의 양이 어느 정도 감소하는지 확인하였다.

Ethanol 400㎕, 0.1mM DPPH solution 500㎕, 광천수 미함유 및 함유배지에서 유도된 생열귀 캘러스 배양 추출물 100㎕ 첨가 후, 10초간 강하게 vortexing 후 냉암소에서 30분간 반응시킨다. ELISA를 이용하여 517nm에서 흡광도를 측정하며, 항산화능의 정도는 에탄올을 사용한 대조군의 흡광강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

Free radical 활성 저해율(%) = 100-(각시료액의 반응흡광도/공시료액의 반응흡광도)X100

DPPH 라디칼 소거에 의한 항산화 효과는 표 4에 나타난 바와 같이, 광천수가 0%, 1%, 3%, 5% 및 10%가 함유된 배지에서 자란 생열귀 캘러스 배양 추출물 0.05 ~ 1mg/ml 처리에 의하여 광천수 3% 함유된 배지에서 자란 생열귀 캘러스 배양 추출물 1mg/ml에서 가장 높은 30% 정도의 항산화 효과를 보였다. 또한, 광천수를 포함하지 않았을 경우보다는 포함하여 배양되었을 경우 더 뛰어한 항산화 효과를 나타내었다.

실험예 5: 주름개선효과에 관련한 콜라겐 합성 관련 유전자(Collagen)발현 효과

피부의 주요한 구성성분은 콜라겐이다. 콜라겐은 진피 건조 중량의 70-80%를 차지 한다. 사람의 진피 중 type I, III 콜라겐이 주요한 성분이며, type I은 총 콜라겐의 80%를 type III는 총 콜라겐의 15%를 차지한다. 피부의 주름은 콜라겐의 합성과 분해의 불균형에 기안하는데 보통 피부에서 type I 콜라겐의 합성과 그 분해효소인 MMP-1이 균형을 이루고 있다. 그러나 광노화 된 피부에서는 type I, III 콜라겐의 합성이 저하되고, MMP-1의 활성이 증가되어 있다고 보고되고 있다.

본 시험은 인간섬유아세포주(Fibroblast)에서 콜라겐 합성에 관여하는 Collagen 유전자의 발현정도를 mRNA 수준에서 확인하는 방법이다. 인간섬유아세포주를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% Fatal bovine serum(FBS), 1% Antibiotic-Antimycotic과 함께 100 mm/60.1 cmculture dish에서 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다. 인간섬유아세포주가 80%이상 confluence 될 때 96 well plate에 1×10⁴ cells/well 분주한 후 세포배양 조건에서 confluence가 80%이상 도달 될 때 까지 배양한 후, DMEM free 배지로 교환 후 광천수 미함유 및 농도별로 함유된 배지에서 유도된 생열귀 캘러스 배양 추출물을 24시간 처리한 후, 관련 유전자 Collagen 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다. 시험방법은 Real-time PCR 법을 수행하였으며, 그 시험 순서는 아래와 같다.

(1) RNA Isolation과 cDNA 합성

RNA isolation과 cDNA 합성은 FastLane Cell one-step buffer set (QIAGEN 216213)이용하였다. 배지를 제거한 세포는 FCW(cell wash buffer)로 세척하고, 50㎕ cell processing mixture을 첨가하여 실온에서 5분간 incubation 한 후, 75℃에서 5분간 반응시켰다.

(2) Real-time PCR 분석

콜라겐 합성과 관련한 Collagen 유전자 분석하기 위하여 상기에서 합성된 cDNA를 template로하여 2X QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master mix의 매뉴얼에 따라 Rotor Gene Q Real-time PCR Machine (Qiagen社)으로 수행하였다. 실험에 사용한 primer들은 Qiagen사의 QuantiTectprimer assays (18S rRNA QT00199367, -actin QT01680476, Collagen QT01005725)를 사용하였다. 발현율은 18S rRNA로 Normalization하였다. Real-time PCR 조건은 다음과 같다.

＜ Real-time cycler conditions ＞

qPCR에 의한 콜라겐 생합성 유전자의 발현율을 확인한 결과, 표 5에 나타난 바와 같이, 광천수가 0%, 1%, 3%, 5% 및 10%가 함유된 배지에서 자란 생열귀 캘러스 배양 추출물 0.05 ~ 1 mg/ml 처리에 의하여 광천수 1% 함유된 배지에서 자란 생열귀 캘러스 배양 추출물 1mg/ml에서 대조군에 비하여 2.8배 증가된 콜라겐 합성 유전자 발현율을 확인하였다. 또한, 광천수를 포함하지 않았을 경우보다는 광천수가 농도별로 포함하여 배양된 생열귀 캘러스 배양 추출물에 의하여 콜라겐 생합성 유전자의 발현율을 확인하였다.

실험예 6: 피부 보습효과와 관련한 유전자(Aquaporin-3)발현

피부의 보습 작용도 기능을 다하지 못하면 피부 탄력 저하의 원인이 된다. 즉 피부의 보습력 상실은 피부노화의 중요한 요인이 되고 있다. 피부의 수분균형은 표피(epidermis)에 의해 조절된다. 표피의 각질층은 죽은 세포들이 쌓여 있는 것이지만 피부의 수분유지를 위해서 매우 중요한 역할을 한다. 사람의 생체는 생명체 유지에 중요한 역할을 하는 물로 대부분 구성되어 있다. 정상 피부에서의 수분은 체내에 70%, 각질층에 20%가 함유되어 있어 피부의 탄력성 및 유연성을 지탱해 준다. 각질층의 수분이 10% 이하일 경우, 피부는 건성화되고 피부 트러블의 원인이 된다고 알려져 있다. 규칙적인 각질화(keratinization)로 생성된 각질층안의 수분의 양은 항상 10~20%를 유지한다.

표피수화를 조절하는 아쿠아포린(aquaporins)을 증가시킴으로서 피부의 수분의 흡수를 증가시키는 기작을 통하는 보습제 연구가 진행되고, 일반적으로 사람에 있어서 1초당 30억개의 물분자가 피부를 통과하는데 이는 아쿠아포린(aquaporin)이라는 단백질을 통해서이다. 아쿠아포린(aquaporin)은 구조와 기능에 따라 여러 종류로 나뉘게 되는데 그중 피부와 관련된 것으로 알려져있는 아쿠아포린-3(aquaporins-3)은 각질형성세포에 존재하며 표피의 기저층에 존재하는 것으로 알려져 있다.

본 시험은 인간각질형성세포주(Keratinocytes)에서 피부보습효과에 관여하는 Aquaporin-3 유전자의 발현정도를 mRNA 수준에서 확인하는 방법이다. 인간각질형성세포주를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% Fatal bovine serum(FBS), 1% Antibiotic-Antimycotic과 함께 100 mm/60.1 cmculture dish에서 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다. 인간각질형성세포주가 80%이상 confluence 될 때 96 well plate에 1 cells/well 분주한 후 세포배양 조건에서 confluence가 80%이상 도달 될 때 까지 배양한 후, DMEM free 배지로 교환 후 광천수 미함유 및 농도별로 함유된 배지에서 유도된 생열귀 캘러스 배양 추출물을 24시간 처리한 후, 관련 유전자 Aquaporin-3 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다. 시험방법은 Real-time PCR 법을 수행하였으며, 그 시험 순서는 아래와 같다.

(1) RNA Isolation과 cDNA 합성

(2) Real-time PCR 분석

피부보습과 관련한 Aquaporin-3 유전자 분석하기 위하여 상기에서 합성된 cDNA를 template로하여 2X QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master mix의 매뉴얼에 따라 Rotor Gene Q Real-time PCR Machine (Qiagen社)으로 수행하였다. 실험에 사용한 primer들은 Qiagen사의 QuantiTectprimer assays (18S rRNA QT00199367, -actin QT01680476, Aquaporin-3 QT00212996)를 사용하였다. 발현율은 18S rRNA로 Normalization하였다. Real-time PCR 조건은 다음과 같다.

＜ Real-time cycler conditions ＞

qPCR에 의한 Aquaporin-3 생합성 유전자의 발현율을 확인한 결과, 표 6에 나타난 바와 같이, 광천수가 0%, 1%, 3%, 5% 및 10%가 함유된 배지에서 자란 생열귀 캘러스 배양 추출물 0.05 ~ 1 mg/ml 처리에 의하여 광천수 1% 함유된 배지에서 자란 생열귀 캘러스 배양 추출물 1mg/ml에서 대조군에 비하여 3.2배 증가된 Aquaporin-3 합성 유전자 발현율을 확인하였다. 또한, 광천수를 포함하지 않았을 경우보다는 광천수가 농도별로 포함하여 배양된 생열귀 캘러스 배양 추출물에 의하여 Aquaporin-3 생합성 유전자의 발현율을 확인하였다.

실험예 7: filaggrin 유전자 발현 효과

각질층 수분량 유지에 천연보습인자(NMF)가 중요한 기능을 한다. NMF의 주성분인 아미노산은 케라토히알린(keratohyalin) 과립에서 유래되는 필라그린(filaggrin) 단백질의 분해에 의해 생산되는 것으로 보고되어 있다. 필라그린은 317개의 아미노산으로 이루어진 단백질이다. NMF의 주성분인 아미노산이 필라그린에서 유래되는 것으로 밝혀진 이후, 건조피부를 띠는 병태와 필라그린의 관련성에 대한 연구가 진행되고 있다. 노인성 건조증, 아토피성 질환 등과 같은 건조피부에서 각질층 내의 아미노산이 감소되는 것 및 필라그린 발현이 감소되는 것이 밝혀지고 있다. 또한, 건조 환경에 의해 피부거침 등의 피부 트러블을 발생시키는 것은 잘 알려져 있다.

필라그린(Filaggrin)은 317 아미노산(amino acid)으로 구성되어, 이 필라그린 유니트(fillaggrin uint) (분자량34kDa)가 7 아미노산(amino acid)으로 이루어지는 링커 펩타이드(linker peptide)가 사이에 끼어 10수개의 여러 묶음이 된 전구체 단백질인 프로펠라그린(profilaggrin : 분자량 약 400 kDa의 거대분자)로서 발현된다. 필라그린(Fillaggrin)은 각질층 상층에 이르는 과정에서, 아미노펩티데이스(amino peptidase), 카르복시펩티데이스(carboxypeptidase) 등의 활동에 의해서 최종적으로 아미노산으로 분해된다.

본 시험은 인간각질형성세포주(Keratinocytes)에서 filaggrin 유전자의 발현정도를 mRNA 수준에서 확인하는 방법이다. 인간각질형성세포주를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% Fatal bovine serum(FBS), 1% Antibiotic-Antimycotic과 함께 100 mm/60.1 cmculture dish에서 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다. 인간각질형성세포주가 80%이상 confluence 될 때 96 well plate에 1 cells/well 분주한 후 세포배양 조건에서 confluence가 80%이상 도달 될 때 까지 배양한 후, DMEM free 배지로 교환 후 광천수 미함유 및 농도별로 함유된 배지에서 유도된 생열귀 캘러스 배양 추출물을 24시간 처리한 후, 관련 유전자 filaggrin 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다. 시험방법은 Real-time PCR 법을 수행하였으며, 그 시험 순서는 아래와 같다.

(1) RNA Isolation과 cDNA 합성

(2) Real-time PCR 분석

filaggrin 유전자 분석하기 위하여 상기에서 합성된 cDNA를 template로하여 2X QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master mix의 매뉴얼에 따라 Rotor Gene Q Real-time PCR Machine (Qiagen社)으로 수행하였다. 실험에 사용한 primer들은 Qiagen사의 QuantiTectprimer assays (18S rRNA QT00199367, -actin QT01680476, filaggrin QT02448138)를 사용하였다. 발현율은 18S rRNA로 Normalization하였다. Real-time PCR 조건은 다음과 같다.

＜ Real-time cycler conditions ＞

qPCR에 의한 filaggrin 생합성 유전자의 발현율을 확인한 결과, 표 7에 나타난 바와 같이, 광천수가 0%, 1%, 3%, 5% 및 10%가 함유된 배지에서 자란 생열귀 캘러스 배양 추출물 0.05 ~ 1 mg/ml 처리에 의하여 광천수 1% 함유된 배지에서 자란 생열귀 캘러스 배양 추출물 1mg/ml에서 대조군에 비하여 2.4배 증가된 filaggrin 합성 유전자 발현율을 확인하였다. 또한, 광천수를 포함하지 않았을 경우보다는 광천수가 농도별로 포함하여 배양된 생열귀 캘러스 배양 추출물에 의하여 filaggrin 생합성 유전자의 발현율을 확인하였다.

실험예 8: 모공수축효과 시험 (In vitro Test)

본 발명의 조성물의 모공 수축 효과를 측정하기 위해 상기 실시예 1에서 제조된 추출물을 대상으로 피부를 대신할 단백질로 헤모글로빈을 사용하여 모공수축효과를 시험하였다. 0.9％ Phosphate Buffer Saline (0.1mM, pH 7.4)으로 헤모글로빈 용액(0.05g/50ml)을 제조하여 헤모글로빈 용액 2 ml에, 상기 실시예에서 획득한 추출물 2 ml을 가한 후, 30초동안 진탕 혼합한 다음 3,500 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 그 상등액 1 ml에 정제수 2 ml을 가하여 407 nm에서 UV-Visible spectrum으로 측정하였다. 대조군으로 상기 실시예의 추출물 대신 PBS(Phosphate Buffer Saline) 2 ml을 가하였다. 다양한 농도의 조성물을 함유한 실험군의 경우에, 헤모글로빈의 침전량을 측정하여 수축효과를 평가하였고, 헤모글로빈의 침전(％)가 높을수록 모공수축효과가 우수한 것으로 판별하였다.

상기 표의 결과에서 나타난 바와 같이, 광천수 1% 및 3% 함유 생열귀 캘러스 배양 추출물이 유의적인 차이를 보이며, 모공수축효과를 나타내었다.

실험예 9: 피지 억제효과 실험

피시험자 10명의 4주 후에 피부 유분 측정기(Sebum meter SM810)를 이용하여 피부의 피지분비량을 측정하였다. 실험은 22, 40 humidity에서 이루어졌다. 지성 피부인 경우 측정값이 220 /cm²이상이고, 정상 피부인 경우 100220 /cm²이다. 대조군으로 정제수를 사용하였고, 실험결과는 표와 같다.

상기 표 9의 결과에서 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여 광천수 1% 및 3% 함유 생열귀캘러스배양추물 처리군이 우수한 피지분비 억제효과를 보였다.

실험예 10 : 여드름 개선 효과

여드름이 발생한 남녀 10명으로 대상으로 아침, 저녁으로 4주간 얼굴 전체에 광천수 1% 함유된 배지에서 자란 생열귀 캘러스 배양 추출물이 1% 함유된 화장수를 고루 바르도록 하였다. 여드름 개선 효과의 판정은 실험에 참가한 본인이 느끼는 정도에 따라 하기 판정기준을 참고로 1-3점으로 시험전 상태를 평가한 뒤 여드름 치유 효과를 평가하도록 하여 그 결과를 표에 나타내었다.

＜시험전 상태의 평가＞

1 = 여드름 조금 있음 2 = 여드름 약간 있음 3 = 여드름 심함

＜여드름 효과 판정＞

- : 효과 거의 없음, + : 약간의 효과 있음, ++ : 많이 완화, +++ : 완전히 치유됨

상기의 표 10에서 알 수 있듯이, 광천수가 1% 함유된 생열귀 캘러스 배양 추출물이 1% 함유된 유연 화장수를 4주간 사용한 후 대다수 피험자들에서 여드름의 개선 효과를 확인할 수 있었다

화장료 조성물의 제조

본 발명의 실시예 1의 생열귀추출물을 유효성분으로 함유하는 화장품으로 영양화장수, 크림, 에센스 등의 유화 제형의 화장품 및 유연화장수 등의 가용화 제형의 화장품을 제조하였다.

제조예 2-1: 화장수

다음 처방에 따라 통상의 화장수 제조 방법에 따라 제조하였다.

제조예 2-2: 에센스

다음 처방에 따라 통상의 에센스 제조 방법에 따라 제조하였다.

제조예 2-3: 로션

다음 처방에 따라 통상의 로션 제조 방법에 따라 제조하였다.

제조예 2-4: 크림

다음 처방에 따라 통상의 크림 제조 방법에 따라 제조하였다.

제조예 2-5: 젤

다음 처방에 따라 통상의 젤 제조 방법에 따라 제조하였다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

생열귀 캘러스 추출물을 함유하는 피부 보습용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 생열귀 캘러스는 광천수 함유 배지에서 배양하여 유도된 것을 특징으로 하는 피부 보습용 화장료 조성물.
제2항에 있어서, 상기 배지 중의 광천수의 농도는 0.5~4%(v/v)인 것을 특징으로 하는 피부 보습용 화장료 조성물.
생열귀 캘러스 추출물을 함유하는 모공 축소용 화장료 조성물.
제4항에 있어서, 상기 생열귀 캘러스는 광천수 함유 배지에서 배양하여 유도된 것을 특징으로 하는 모공 축소용 화장료 조성물.
제5항에 있어서, 상기 배지 중의 광천수의 농도는 0.5~4%(v/v)인 것을 특징으로 하는 모공 축소용 화장료 조성물.
생열귀 캘러스 추출물을 함유하는 피지분비억제용 화장료 조성물.
제7항에 있어서, 상기 생열귀 캘러스는 광천수 함유 배지에서 배양하여 유도된 것을 특징으로 하는 피지분비억제용 화장료 조성물.
제8항에 있어서, 상기 배지 중의 광천수의 농도는 0.5~4%(v/v)인 것을 특징으로 하는 피지분비억제용 화장료 조성물.
생열귀 캘러스 추출물을 함유하는 여드름개선용 화장료 조성물.
제10항에 있어서, 상기 생열귀 캘러스는 광천수 함유 배지에서 배양하여 유도된 것을 특징으로 하는 피지분비억제용 화장료 조성물.
제11항에 있어서, 상기 배지 중의 광천수의 농도는 0.5~4%(v/v)인 것을 특징으로 하는 피지분비억제용 화장료 조성물.