KR102260735B1

KR102260735B1 - 금창초 및 제주상사화 중 하나 이상의 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102260735B1
Application number: KR1020200161735A
Authority: KR
Inventors: 염아름; 이기복; 박창민; 정민석
Original assignee: 주식회사 한국화장품제조
Priority date: 2020-11-26
Filing date: 2020-11-26
Publication date: 2021-06-07

Abstract

금창초 및 제주상사화 중 하나 이상의 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 상기 화장료 조성물의 제조방법에 관한 것으로, 우수한 피부 미백 및 보습 효과를 나타낸다.

Description

금창초 및 제주상사화 중 하나 이상의 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 이의 제조방법{COSMETIC COMPOSITION COMPRISING EXTRACT OF ONE OR MORE OF AJUGA DECUMBENS AND LYCORIS CHEJUENSIS, AND METHOD OF PREPARING THE SAME}

본 발명은 금창초 및 제주상사화 중 하나 이상의 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

식물은 오래 전부터 인류 복지에 도움을 주는 다양한 천연생리활성 물질들의 공급원이었다.

이들 물질들은 대부분 이차대사산물로서 의약품, 식품 첨가물, 화장품 원료, 향료, 색소 등의 용도로 다양하게 사용되고 있다. 생리활성 물질은 매우 적은 양으로 현저한 활성을 나타내는 고부가가치 물질로서 현재 수많은 종류가 유용하게 이용되고 있으며, 다양한 신물질들이 매해 연구 개발되고 있다. 산업문명이 고도로 발달됨에 따라 인공, 화학 합성물의 일부에서 안전성에 문제가 제기되면서 규제가 점점 강화되고 있고, 소비자들의 안전과 건강에 대한 욕구 증대에 따라 인공 합성품의 사용이 제한되는 추세이므로 천연물의 이용분야는 더욱 넓어지고 있다.

따라서 다양한 유용식물을 이용한 항산화, 미백, 항주름, 항알레르기 등에 효과가 있는 기능성 물질을 함유하고 있는 천연물 자원을 선발하여 화장품 원료로 개발하려는 연구가 다양한 각도에서 진행되고 있다.

그러나 2017년 8월 나고야 의정서 당사국으로 관련 법률이 발효됨에 따라 해외 유전자원 이용 시 이익을 공정하게 공유해야 하므로 산업체의 부담이 늘어났을 뿐 아니라, 각 나라의 해당 법률이 제정되지 않았고 해외 유전자원 이용 시 국가책임기관을 통한 사전승인 및 상호 협약 등의 과정으로 수입 원료에 대한 많은 시간 및 비용을 소모되는 실정에 이르게 되었다.

이에 국내산 유전자원이 대두되고 있으나 한정된 소재에 따른 원료의 다양성 축소화와 국내 유전자원 고갈이 우려되는 실정이다. 따라서 나고야의정서에 대비하고 국내유전자원의 고갈을 방지하며 지속가능하고 안정한 공급을 할 수 있는 친환경적인 식물조직배양 기술이 요구되며, 다양한 식물 캘러스 소재를 개발하고 식물 캘러스 소재 각각이 가지는 효능의 시너지 효과를 위해 복합소재의 공급 필요성이 대두 되었다. 식물 캘러스 배양은 1902 년 Gottlieb Haberlandt가 제안 한 'plant cell totipotency' 에 근거한다. 식물 캘러스는 식물 호르몬을 배지에 첨가함으로써 전체 식물로 분화 될 수 있으며, 일정한 배양 조건에서 안정적이고 빠른 식물 세포 생성의 이점을 가지고 있다. 또한 생물 반응기에서 대량생산하는 과정에서 식물 유해 2차 대사산물 이나 재조합 단백질을 생산할 수 있어 다양한 산업적인 이용가치를 가지고 있다. 또한 속적으로 생산 가능한 특징을 가지고 있어 지역, 환경, 재배조건 등의 생육환경과 관계없이 친환경적으로 생산 가능한 소재라 할 수 있다.

한편, 금창초는 한국 일본, 만주, 중국에 분포하며 국내에서는 경상도, 전라도, 제주도에서 자라며, 꿀풀과 조개나물속에 속하는 다년생 식물로서 길이가 4-6센티미터가량 되고 원줄기가 옆으로 뻗고 전체에 흰 털이 많다. 잎은 긴 타원형 또는 달걀 모양이고, 꽃은 오뉴월에 짙은 자주색으로 잎겨드랑이에 달려 핀다. 상기 금장초는 전통적으로 지상 부분을 백모하고초(白毛夏枯草)라 부르며 약으로 쓰였으나, 화장료로 적용된 바는 없다.

또한, 제주상사화는 제주도에 분포하는 한국 고유종으로 여러해살이풀이며 잎은 205월에 걸쳐 10장이 달리는 데 선형으로 50-60츠 길어지고 꽃은 연한 노란색을 띄며 8월부터 줄기 끝에 달리는 산형화서에 무리지어 피며 열매는 장과로 익는다, 해발 300m 이하 저지대의 방목지대나 오름주변의 계곡이나 물이 고여있는 지역 인근의 풀밭에서 자란다. 제주상사화 추출 활성물질은 뇌에서 염증반응을 주로 유발하는 미세교세포의 다양한 염증인자들을 억제시키는 것으로 보고되고 있으나, 이 역시 화장료로써 적용된 바는 없다.

최근 이미 알려진 소재들을 다양한 기술을 통하여 재활용하는 연구 개발이 이루어지고 있으며, 대한민국 등록특허 제10-1523631호는 할미꽃 추출물, 인도 유향나무 추출물, 후박나무 추출물 및 봉삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물을 개시하고 있다. 그러나, 상술한 바와 같이, 금창초나 제주상사화를 화장료에 적용하기 위한 연구는 진행된 바 없다. 이에, 인체에 자극이 없는 천연 물질 유래의 물질로, 독성이 없을 뿐 아니라 피부 보습 및 미백 효과가 우수하여 화장품에 바로 적용할 수 있는 원료의 개발이 필요한 실정이다.

KR

10-1523631

B

본 발명은 금창초 또는 제주상사화를 화장료 조성물로 적용하기 위한 용도 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 금창초 및 제주상사화 중 하나 이상의 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은, 상기 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물은 피부 미백 및 보습 효과가 우수하며, 인체에 무해하여 화장품, 의약품 및 의약외품의 피부외용제 등의 분야에서 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 제조예1 내지 제조예 6 에서 제조한 (생물전환) 추출물의 농도별 세포생존율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 제조예1 내지 제조예 6 에서 제조한 (생물전환) 추출물의 농도별 타이로시네이즈 활성 저해능을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 제조예1 내지 제조예 6 에서 제조한 (생물전환) 추출물의 농도별 히알루론산 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 제조예 5 및 6의 처리 농도별 세포내 히알루론산 생성량 측정 평가 결과를 무처리군과 비교하여 나타낸 결과이다.

본 발명의 화장료 조성물은 피부 미백 및 보습 효과가 우수하며, 독성이 없어 인체에 무해하고, 피부자극이 적어 화장품, 의약품 및 의약외품의 피부외용제 등의 분야에서 사용될 수 있다.

< 화장료 조성물 >

본 발명의 화장료 조성물은 금창초 및 제주상사화 중 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 포함한다.

본 발명의 상기 금창초는, 금창초(Ajuga decumbens)일 수 있으며, 당업계에서 “금창초”로 인식되는 일체의 식물을 포함한다. 혼 발명의 상기 제주상사화는 “제주상사화 (Lycoris chejuensis)”일 수 있으며, 당업계에서 제주상사화로 인식되는 일체의 식물을 포함한다.

본 발명에서, 상기 금창초 및 제주상사화 중 하나 이상의 추출물은 물 또는 유기용매를 이용하여 추출한 것일 수 있으며, 바람직하게는 물을 이용하여 추출한 것일 수 있고, 가장 바람직하게는 물을 이용한 열수 추출일 수 있다. 상기 열수 추출은 상기 금창초, 제주상사화 또는 이들의 혼합물의 10 내지 200배 중량의 물을 가하여, 80℃ 내지 150℃에서 수행되는 것 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 열수 추출은, 30분 내지 5시간 동안 수행되는 것 일 수 있다.

본 발명의 상기 금창초 및 제주상사화는 각각 잎, 줄기 및 뿌리 중 하나 이상의 부위가 추출될 수 있고, 잎에서 추출되는 것이 바람직하며, 구체적으로는 입자루에서 추출되는 것 일 수 있다.

또한, 금창초 및/또는 제주상사화의 입자루로부터 캘러스의 발생을 유도하여, 상기 캘러스로부터 제조된 추출물을 사용하는 것이, 미백 및 보습 효과 측면에서 가장 바람직하다.

이와 같이 추출된 상기 추출물은, 타이로시네이즈 활성 저해능 및 히알루론산 생성능 중 하나 이상의 효과를 갖는다.

본 발명에서 사용되는 용어, "생물전환(biorenovation)"은 미생물을 이용하여 기질로부터 인산화(phosphorylation) 또는 글리코 실화(glycosylation) 등의 구조적 변화를 유도한 화합물을 제조하는 방법을 말한다. 인산화란 인산화효소(kinase)의 작용에 의하여 인산기(phosphoric acid group, HOPO(OH)O-)가 기질의 수소 원자와 치환됨으로써 기질에 결합하는 것을 의미하며, 글리코실화란 기질에 단당체, 다당체 등의 당류(glucoside)가 첨가되는 것을 의미한다.

또한, 본 발명에서 상기 균주는 바실러스 속의 균주일 수 있으며, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)일 수 있고, KCTC 43033인 바실러스 아밀로리퀘파시엔스가 특히 바람직하다.

본 발명의 화장료 조성물은, 상술한 바와 같이, 금창초 및 제주상사화 중 하나 이상의 추출물을 포함하나, 금창초 및 제주상사화의 혼합물의 추출물을 포함하는 것이, 미백 및 보습효과 측면에서 바람직하고, 상기 금창초 및 제주상사화의 혼합 추출후, 상기 방법대로 생물전환한 추출물이 가장 바람직하다.

일 구체예에서 상기 화장료 조성물은 화장료, 의약품 또는 의약외품 용도로 사용될 수 있다. 상기 조성물은 상기 화장품, 의약품 또는 의약외품 용도로 사용되어 미백 및 보습 목적의 예방, 치료 등에 이용할 수 있다.

또한 상기 화장료 조성물은 약제학적, 또는 화장품학적으로 허용되는 성분을 추가로 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물을 상기 화장품에 사용 시 통상적인 화장품에 포함되는 성분으로는 담체, 부형제 또는 희석제로 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알코올, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제(thickening agent), 항산화제, 점도 안정화제(viscosity stabilizer), 킬레이팅제, 완충제 및 저급 알코올 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물을 포함하는 상기 화장품의 제형으로는 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있고, 바람직하게는 페이스트, 유액, 크림, 겔, 파우더, 스프레이, 용액, 유탁액, 현탁액, 팩, 파운데이션, 로션, 미용수 및 계면활성제를 함유하는 클린징 제형으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 제형일 수 있다. 보다 구체적으로는 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 크림, 맛사지크림, 영양크림, 모이스쳐크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저로 이루어진 군에서 선택된 1종의 제형을 포함한다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물을 상기 의약품에 사용 시 고형제, 반고형제, 용액제, 유제, 분산제, 미셀, 리포좀 등의 형태로 사용될 수 있다.

상기 제형은 예를 들어, 멸균수에 용해보조제, 유화제, pH 조절을 위한 완충제 등을 첨가하여 제조할 수 있다. 상기 비수성용제 또는 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 올리브 오일과 같은 식물성 기름 및/또는 에틸올레이트 등이 사용될 수 있다. 한편, 좌제 제형은 예를 들어, 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61(tween 61), 카카오지, 라우린지, 글리세로 젤라틴 등이 첨가되어 제조될 수 있고, 이를 제형화하기 위한 담체를 포함할 수 있으며, 상기 담체로써 결합제, 활탁제, 현탁용제, 가용화제, 완충제, 보존제, 윤활제, 등장제, 안정화제, 분산제, 현탁화제, 색소, 향료 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 바람직한 투여량은 투여 대상의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화장료 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001 내지 1000 ㎎/kg일 수 있다. 하루에 1회 또는 수 회 나누어 투여될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 생물전환된 추출물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01 내지 20 중량%로 포함될 수 있고, 바람직하게는 0.1 내지 5 중량%일수 있으며, 가장 바람직하게는 0.1 내지 0.5 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

< 화장료 조성물 제조방법 >

본 발명은 상술한 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 화장료 조성물의 제조방법은, 본 발명의 화장료 조성물에 대하여 기술된 내용을 모두 적용할 수 있으며, 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 그 설명이 생략되었더라도 동일하게 적용될 수 있다.

구체적으로, 본 발명은, 금창초, 제주상사화 또는 이들의 혼합물로부터 추출물을 제조하는 단계; 및 상기 추출물을 균주로 생물전환하는 단계를 포함하는 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.

상기 균주는, 바실러스 속의 균주일 수 있고, 상기 바실러스 속의 균주는, 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)일 수 있고, 바람직하게는, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 KCTC 43033 (Bacillus amyloliquefaciens KCTC 43033)일 수 있다.

상기 금창초, 제주상사화 또는 이들의 혼합물로부터 추출물을 제조하는 단계는, 금창초 또는 제주상사화의 잎, 줄기 및 뿌리 중 하나 이상의 부위에서로부터 캘러스를 유도하는 단계를 포함할 수 있으며,

상기 추출은, 물을 이용한 열수 추출인 것이 바람직하다. 상기 열수 추출은 상기 금창초, 제주상사화 또는 이들의 혼합물의 10 내지 200배 중량의 물을 가하여, 80℃ 내지 150℃에서 수행되는 것이, 미백 및 보습 효과 측면에서 바람직하다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물의 제조방법은 약제학적, 또는 화장품학적으로 허용되는 첨가제를 추가하는 단계를 더 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

참조 예 1: 조직 배양한 금창초( Ajuga decumbens ) 및 제주상사화 ( Lycoris chejuensis ) 캘러스 준비

본 발명에 사용된 금창초 및 제주상사화 캘러스는 한국생명공학연구원에서 제공 받아 사용하였다.

본 발명에 사용된 금창초 캘러스는, 기내 배양을 위한 무균 시료를 확보하기 위해 전라북도 내장산 인근에서 자생중인 금창초 식물체를 채집하였다. 식물체 표면에 부착된 오염 물질을 제거하고 흐르는 물에서 30분~1시간 동안 세척한 후 물기를 제거하였다. 이후, 잎자루(petiole)를 잘라 유리 배양병에 넣고 70%(v/v) 에탄올 용액에서 1분 동안 흔들어 주면서 소독한 후, 멸균수로 1~2회 세척하고 상업용 하이포아염소산나트륨(sodium hypochlorite) 용액을 0.4~0.8%(v/v)로 희석한 용액에 넣고 잘 흔들어 주면서 20분 동안 표면살균을 실시하여 무균 시료를 준비하였다. 표면살균이 이루어진 금창초 잎자루 시료는 살균된 여과지로 남아 있는 수분을 제거한 다음 무균작업대 내에서 길이가 약 5 mmm 내외의 적절한 크기로 절취하여 절편들을 준비한 다음 미리 준비한 배양 배지에 10개 씩 3반복으로 치상하여 25℃, 암조건에서 배양하였다. 배양 배지는 MS 배지(Murashige and Skoog, 1962)에 3%(w/v) 수크로스(sucrose), 0.4%(w/v) 겔라이트(gelrite), 0.4 ㎎/ℓ 티아민(thiamine), 100 ㎎/ℓ 미오이노시톨(myo-inositol) 및 식물생장조절제로 0.1 ㎎/ℓ NAA(α-naphthaleneacetic acid)가 첨가된 배지를 121℃에서 15분간 멸균 후 사용하였다.

금창초 잎자루 절편 시료들은 배양개시 2주 후부터 조직 절단면에서 팽창이 이루어지면서 연백색의 부정형의 뿌리들이 형성되기 시작하였다. 4주 배양 후에는 부정근의 증식과 함께 구조물의 크기 신장이 이루어지면서 크기가 약 5 mm 정도에 이르렀다. 6주 후에는 형성된 다수의 부정근들이 더욱 증식이 활발해지는 것을 관찰하였다. 상기 부정근은 동일 조성의 새로운 배지에 4주 주기로 계대배양하여 금창초 잎자루 유래 식물세포주를 확보하였다.

본 발명에 사용된 제주상사화 캘러스는, 제주도에서 채집한 제주상사화 식물체를 이용하여 캘러스를 제조하였다. 제주상사화 식물체로부터 오염 물질을 제거하고 흐르는 물에서 30분~1시간 동안 세척한 후 물기를 제거하였다. 이후, 잎(leaf)를 잘라 유리 배양병에 넣고 70%(v/v) 에탄올 용액에서 1분 동안 흔들어 주면서 소독한 후, 멸균수로 1~2회 세척하고 상업용 하이포아염소산나트륨(sodium hypochlorite) 용액을 0.4~0.8%(v/v)로 희석한 용액에 넣고 잘 흔들어 주면서 20분 동안 표면살균을 실시하여 무균 시료를 준비하였다. 표면살균이 이루어진 제주상사화 식물체 잎 시료는 살균된 여과지로 남아 있는 수분을 제거한 다음 무균작업대 내에서 가로 세로 1 cm 내외의 적절한 크기로 절취하여 절편들을 준비한 다음 미리 준비한 배양 배지에 10개 씩 3반복으로 치상하여 25℃, 암조건에서 배양하였다. 배양 배지는 1/2MS 배지(Murashige and Skoog, 1962)에 3%(w/v) 수크로스(sucrose), 0.4%(w/v) 겔라이트(gelrite), 0.4 ㎎/ℓ 티아민(thiamine), 600 ㎎/ℓ 미오이노시톨(myo-inositol) 및 식물생장조절제로 1 ㎎/ℓ BA(6-benzylaminopurine) 및 0.3 ㎎/ℓ 2,4-D(2,4-dichlorophenoxy acetic acid)가 첨가된 배지를 121℃에서 15분간 멸균 후 사용하였다.

제주상사화 잎 절편 시료들은 배양개시 2주 후부터 조직 절단면에서 팽창이 이루어지면서 연황색의 구형 돌기구조가 형성되기 시작하였다. 4주 배양 후에는 돌기구종의 팽창과 함께 작은 돌기구조가 다수 형성되었다. 배양 6주 후에는 형성된 다수의 돌기구조들이 더욱 증식이 활발해지는 것을 관찰하였다. 상기 캘러스는 동일 조성의 새로운 배지에 4주 주기로 계대배양하여 제주상사화 절편 유래 식물세포주를 확보하였다.

제조예: 금창초 캘러스 및 제주상사화 캘러스 추출물의 제조

제조예 1. 금창초 캘러스의 추출물 제조

상기 참조예 1에 따라 조직 배양한 금창초 캘러스의 건조 된 시료에 100배 중량의 증류수를 넣고 120℃에서 1시간 동안 열수 추출한 후 여과지(5C, 185㎜, Toyo toshi Kaisha, Ltd, Japan)로 여과시켜 얻은 여액을 감압 농축하여 금창초 캘러스 추출물을 수득하였다.

제조예 2. 제주상사화 캘러스의 추출물 제조

상기 참조예 1에 따라 조직 배양한 제주상사화 캘러스의 건조 된 시료에 100배 중량의 증류수를 넣고 120℃에서 1시간 동안 열수 추출한 후 여과지(5C, 185㎜, Toyo toshi Kaisha, Ltd, Japan)로 여과시켜 얻은 여액을 감압 농축하여 제주상사화 캘러스 추출물을 수득하였다.

제조예 3. 금창초 캘러스 추출물의 생물전환(biorenovation)

3-1. 미생물 현탁액 제조

미생물은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens, KCTC 43033) 균주이며 미생물센터에서 분양받아 Nutrient broth (Beef extract 3.0 g/L, Peptone 5.0 g/L)에서 최적 생육 조건에 맞추어 20시간 동안 배양 후, 10분 동안 5,000 rpm으로 원심분리하여 미생물 펠렛(pellet)을 수득하였다. 수득된 펠렛을 PG 버퍼 (50 mM Phosphate buffer, 2% Glycerin)로 2회 세척한 후, 동일 버퍼에 현탁하여 미생물 현탁액을 수득하였다.

3-2. 금창초 캘러스 추출물의 생물전환(Biorenovation)

상기 제조예 1에 따라 제조한 금창초 캘러스 추출물 및 상기 3-1의 미생물 현탁액을 30℃에서 72시간 반응 후, 원심분리하여 얻어진 상등액을 회수하여 생물전환된 금창초 캘러스 추출물(Ajuga decumbens Biorenovate Extract, ADB)을 수득하였다.

제조예 4. 제주상사화 캘러스 추출물의 생물전환(biorenovation)

상기 제조예 2에 따라 제조한 제조한 제주상사화 캘러스 추출물 및 상기 3-1의 미생물 현탁액을 30℃에서 72시간 반응 후, 원심분리하여 얻어진 상등액을 회수하여 생물전환된 제주상사화 캘러스 추출물(Lycoris chejuensis Biorenovate Extract, LCB)을 수득하였다.

제조예 5. 금창초 캘러스 및 제주상사화 캘러스 혼합추출물 제조

상기 참조예 1에 따라 건조 된 조직 배양한 금창초 캘러스 1g 및 제주상사화 캘러스 1g을 혼합한다. 그 100배 중량의 증류수를 넣고 120℃에서 1시간 동안 열수 추출한 후 여과지(5C, 185㎜, Toyo toshi Kaisha, Ltd, Japan)로 여과시켜 얻은 여액을 감압 농축하여 금창초 및 제주상사화 캘러스 추출물을 수득하였다.

제조예 6. 금창초 및 제주상사화 캘러스 혼합추출물의 생물전환(biorenovation)

상기 참조예 1에 따라 건조 된 조직 배양한 금창초 캘러스 1g 및 제주상사화 캘러스 1g을 혼합하여 그 100배 중량의 증류수를 넣고 120℃에서 1시간 동안 열수추출물을 추출한다. 이렇게 제조한 금창초, 제주상사화 캘러스 추출물 및 상기 3-1의 미생물 현탁액을 30℃에서 72시간 반응 후, 원심분리하여 얻어진 상등액을 회수하여 생물전환된 금창초, 제주상사화 캘러스 추출물을 수득하였다.

실험예 1. 본 발명에 따른 세포생존율 측정

MTT tetrazolium은 노란색 수용성 용액으로서 세포에 처리하면, 대사 과정이 온전한 세포의 미토콘드리아에 있는 탈수소 효소에 의해서 tetrazolium의 ring 구조가 끊어지면서 청자색을 띄는 비수용성의 MTT formazan 결정으로 환원되는 원리를 이용한다. 시료에 대한 세포의 생존율을 평가할 때 주로 사용되는 실험법이다. 본 발명에 따른 세포생존율 측정은 MTT formazan 을 흡광도로 측정하여 평가하였다.

상기 제조예 1 내지 제조예 6에서 제조한 (생물전환) 추출물의 세포 생존율을 측정하기 위해 인간각질형성세포(HaCaT) 에 배양하였다. 인간 각질형성세포(HaCaT)는 10% 우태아혈청(FBS, Gibco, USA) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin, Gibco, USA)이 첨가된 Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM, Welgene, Korea) 에서 배양 되었다.

인간 각질 형성세포를 96well plate 에 각각 1Ⅹ10⁴cells/well 분주하고 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양하였다. 그 후, 제조예 1 내지 제조예 4 에서 제조한 추출물을 DMEM 배지에 희석하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 추가로 24시간 배양하였다. 배양 후 MTT 용액을 0.5 mg/ mL 의 농도가 되게 각 well 에 첨가하였다. 4시간 후, 형성된 MTT formazan 을 DMSO(Dimethyl sulfoxide) 100μl로 녹인 후 420nm 에서 흡광도 (SpectraMax i3, Molecular devices, CA, USA) 를 측정하였다. 세포 생존율(cell viability)은 하기 수학식 1에 의하여 측정 하였으며, 그 결과(Cell viability (%))를 하기 표 1 및 도 1에 나타내었으며, 표 1의 결과값에 대한 표준편차를 표 2에 나타내었다.

< 수학식 1 >

세포 활성도(%) = (시료처리군의 흡광도/시료무처리군의 흡광도)*100

	Cell viability (%)
농도 (mg/ml)	0	0.625	1.25	2.5	5	10
제조예1	100.1722	95.94314	89.06508	85.25918	75.02218	73.21234
제조예2	100.3995	93.83272	88.32264	85.52704	78.02566	72.02566
제조예3	101.4435	99.85056	101.169	97.30706	92.02536	80.325
제조예4	101.6123	97.39565	98.53385	93.91989	90.43804	83.55193
제조예5	100.2101	95.09482	94.59094	92.36928	89.84404	82.03364
제조예6	101.4218	98.58608	96.94564	94.41423	91.54808	84.15983

	STD
농도 (mg/ml)	0	0.625	1.25	2.5	5	10
제조예1	100.1722	95.94314	89.06508	85.25918	75.02218	73.21234
제조예2	100.3995	93.83272	88.32264	85.52704	78.02566	72.02566
제조예3	101.4435	99.85056	101.169	97.30706	92.02536	80.325
제조예4	101.6123	97.39565	98.53385	93.91989	90.43804	83.55193
제조예5	100.2101	95.09482	94.59094	92.36928	89.84404	82.03364
제조예6	101.4218	98.58608	96.94564	94.41423	91.54808	84.15983

상기 결과에서, 제조예1 내지 제조예 6 의 (생물전환) 추출물은 세포의 생존율에는 영향을 주지 않는 것을 확인 할 수 있었다.

실험예 2. 타이로시네이즈 (Tyrosinase) 활성 저해 효과 확인 실험

타이로시네이즈 (Tyrosinase)는 멜라노좀에서 일어나는 멜라닌 합성의 과정에서 타이로신 (tyrosine) 을 산화 시켜 dopa를 만들고, 다시 dopa를 산화시켜 dopachrome을 생성하는 dopa oxidase 로서 작용한다. 따라서 타이로시네이즈 (Tyrosinase) 의 활성 저해능을 측정함으로써 미백 기능성을 평가할 수 있다. 본 발명에 따른 추출물의 미백 효능은 타이로시네이즈 (Tyrosinase)의 활성 저해능을 측정하여 평가하였다.

상기 제조예1 내지 제조예 4 에서 제조한 (생물전환) 추출물을 농도별로 제조하였다. 0.1M sodium phosphate buffer(pH 6.5)를 제조 후 그 용액으로 1.5mM L-tyrosine, 1000U/ml tyrosinase 를 제조하여 실험에 필요한 시약을 준비하였다. 96 well plate의 각 well 에 제조예1 내지 제조예 4 에서 제조한 (생물전환) 추출물을 170μL 넣은 후에 Tyrosinase (1000U/ml) 10μL를 넣어 37 ℃ 에서 10분 간 반응시켰다. 그 후 1.5mM L-tyrosine 20μL을 넣고 37 ℃ 에서 10분간 반응 후 490nm 에서 흡광도 (SpectraMax i3, Molecular devices, CA, USA) 를 측정하였다. Tyrosinase 활성 저해능은 하기 수학식 3에 의하여 측정하였으며, 그 결과를 시료무처리군 및 L-DOPA만을 처리한 결과와 함께 하기 표 3 (Tyrosinase activity (% of control)) 및 도 2에 나타내었으며, 결과 값의 표준편차를 표 4에 나타내었다.

< 수학식 3 >

Tyrosinase 활성 저해능(%) = (1-시료처리군의 흡광도/시료무처리군의 흡광도)*100

	Tyrosinase Inhibition Assay (% of control)
농도 (mg/ml)	제조예1	제조예2	제조예3	제조예4	제조예5	제조예6
시료무처리군			100
L-DOPA only			607
5	534	548	487	452	521	413
10	461	498	377	337	415	305
20	454	477	207	214	388	154

	S.D.
농도(mg/ml)	제조예1	제조예2	제조예3	제조예4	제조예5	제조예6
시료무처리군			7.913
L-DOPA only			8.756
5	8.621	7.089	10.597	6.813	10.091	5.91
10	6.917	7.19	5.109	5.761	8.386	6.416
20	4.913	11.197	6.798	8.899	6.384	7.901

상기 표 4의 결과에서, 나타낸 바와 같이 금창초, 제주상사화 캘러스 생물전환 혼합 추출물 (제조예 6)은 금창초, 제주상사화 캘러스 생물전환 단독 추출물 (제조예 3 및 4) 과 금창초, 제주상사화 캘러스 단독추출물 (제조예1 및 2)과 비교하여 타이로시네이즈 활성 저해능이 농도 의존적으로 증가하였으며, 우수한 타이로시네이즈 활성 저해능을 보였다.

실험예 3. 본 발명에 따른 보습 효과 확인 실험 - 세포내 히알루론산 생성량 측정 평가

본 실험에는 HDFs는 24-well plate에 5×104 cells/well로 접종하여 24시간 배양한 뒤, 농도별로 희석한 상기 제조예1 내지 제조예 4 에서 제조한 (생물전환) 추출물이 포함된 FBS 미함유 배지로 교환한 후 24시간 배양하였다. 24시간 후 각각의 배양 상층액은 10,000 rpm에서 10분간 원심분리하였고, Debris가 제거된 상층액으로 배지 중 포함된 히알루론산 생성량을 인간 히알루론산 (Human Hyaluronic Acid, HA) ELISA Kit를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 히알루론산 생성 정도는 총 단백질량으로 보정하여 평가하였고, 양성대조군으로는 레티노 산 (Retinoic acid, 0.0015%)를 이용하여 비교하였다. 각각의 실험은 3회 반복하여 그 평균을 구하여 하기 표 5 (HA contents(ng/μg)) 및 도 3에 나타내었다.

농도 (%)	제조예 1	S.D	제조예 2	S.D	제조예 3	S.D	제조예 4	S.D	제조예 5	S.D	제조예 6	S.D
0	53.38333	0.51149	53.46	0.23	53.91	0.09	53.74	0.43	53.60	0.29	54.46	0.876217
0.0001	53.61667	0.38517	53.96	0.14	54.90	0.72	54.79	0.37	54.41	0.37	56.89	2.589599
0.0002	54.5	0.368058	54.36	0.29	55.82	0.33	55.98	0.14	54.93	0.07	58.33	3.514487
0.0004	55.15667	0.223656	55.09	0.15	57.08	0.82	57.19	0.30	56.67	0.37	61.58	1.400167
0.0007	55.99	0.107083	56.55	0.39	59.64	0.73	58.82	0.62	57.86	0.16	64.09	1.353276
0.0013	56.76	0.21276	56.61	0.43	61.86	0.66	60.72	0.39	61.01	0.61	66.89	0.939728
0.0025	57.04333	0.114698	56.94	0.64	63.86	0.74	62.85	0.17	61.16	0.47	68.35	1.738895

표 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 따른 금창초, 제주상사화 캘러스 생물전환 혼합추출물 (제조예6)이 다른 추출물과 비교하여 우수한 보습효과를 가졌다.

또한 제조예 5 및 6의 처리 농도별 세포내 히알루론산 생성량 측정 평가 결과를 무처리군과 비교하여, 표 6 (HA contents(ng/μg)) 및 도 4에 나타내었다.

	HA contents(ng/μg)
농도(%)	무처리군	S.D	제조예 5	S.D	제조예 6	S.D
0	53.03	0.094163	53.59667	0.28686	54.46333	0.876217
0.0001	53.36667	0.172498	54.41	0.374166	56.88667	2.589599
0.0002	53.63	0.820894	54.92667	0.069442	58.33333	3.514487
0.0004	53.23333	0.526709	56.67	0.367242	61.58	1.400167
0.0007	54.02667	0.203688	57.86	0.159374	64.09333	1.353276
0.0013	53.68333	0.373839	61.01	0.61259	66.88667	0.939728
0.0025	53.32333	0.907683	61.16333	0.466857	68.35333	1.738895
양성대조군(Retinoic acid) 0.0015			69.2	1.26

Claims

금창초 및 제주상사화 중 하나 이상의 추출물을 포함하는 화장료 조성물로,
상기 추출물은, 금창초 및 제주상사화 중 하나 이상의 추출물을 균주를 사용하여 생물전환하여 수득되는 것이며,
상기 균주는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)인 것인, 화장료 조성물.
삭제
삭제
청구항 1에 있어서,
금창초 및 제주상사화는, 각각 금창초의 캘러스 및 제주상사화의 캘러스인, 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서,
피부 미백 및 보습용인 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 화장료 조성물은, 타이로시네이즈 활성 저해능 및 히알루론산 생성능 중 하나 이상의 효과를 나타내는 것인, 화장료 조성물.
금창초, 제주상사화 또는 이들의 혼합물로부터 추출물을 제조하는 단계; 및
상기 추출물을 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens) 균주로 생물전환하는 단계
를 포함하는, 화장료 조성물 제조방법.
청구항 7에 있어서,
상기 금창초, 제주상사화 또는 이들의 혼합물로부터 추출물을 제조하는 단계는, 물을 이용한 열수 추출인 것인, 화장료 조성물 제조방법.
청구항 8에 있어서,
상기 열수 추출은 상기 금창초, 제주상사화 또는 이들의 혼합물의 10 내지 200배 중량의 물을 가하여, 80℃ 내지 150℃에서 수행되는 것인, 화장료 조성물 제조방법.