KR101523631B1 - 항염증 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항염증 조성물에 관한 것이다. 한 구체예에서 상기 항염증 조성물은 할미꽃 추출물, 인도 유향나무 추출물, 후박나무 추출물 및 봉삼 추출물을 유효성분으로 포함하며, 상기 할미꽃 추출물, 인도 유향나무 추출물, 후박나무 추출물 및 봉삼 추출물은 할미꽃, 인도 유향나무, 후박나무 및 봉삼을 포함하는 혼합물을 열수, 유기용매 또는 발효 추출하는 것이며, 상기 할미꽃, 인도 유향나무, 후박나무 및 봉삼은 1:0.1~5:0.1~5:0.1~5의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 한다.

Description

항염증 조성물 {A composition for anti-inflammation}
본 발명은 항염증 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 발효, 열수 또는 유기용매 추출을 이용하여 추출된 할미꽃 추출물, 인도 유향나무 추출물, 후박나무 추출물 및 봉삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물에 관한 것이다.
염증은 생체 조직이 손상을 입었을 때에 체내에서 일어나는 방어적 반응을 의미하며 의학의 고전적 개념으로 열, 통증, 발적, 부종을 의미하는 라틴어 calor, dolor, rubor, tumor로 각각 정의된다. 이러한 염증의 원인은 기계적 상해작용, 온도 및 방사선 등의 물리적 인자, 독물 등의 화학적 인자, 세균감염 등의 기생체에 의한 것 등이 있다.
LPS는 그람음성균의 세포벽을 구성하는 물질로 세포에 염증반응을 일으키며, Macrophage(대식세포)에 의해 인식되며 국소염증, 항체생산, 폐혈증과 같은 반응을 일으킨다. 특히 LPS로 유발된 염증반응으로는 Nitric oxide(NO), prostaglandin E2(PGE2), interleukin 1β(IL-1β), tumor necrosis factor-α(TNF-α), matrix metalloprotease-9(MMP-9) 등이 증가하는 것으로 알려져 있다.
이러한 LPS에 의한 염증반응으로 iNOS(inducible Nitric Oxide Synthesis)에 의해 Nitric oxide(NO)가 증가되면 prostaglandins(PGs)의 증가로 통증, 열 등의 증상을 유발하게 된다. PGs는 COX-1, COX-2 등에 의해 합성되며 이로 인해 혈류의 증가, 부종 등의 증상이 나타난다. 또한 LPS로 자극된 macrophage는 여러 pathway를 활성화 시키는데 NFB pathway나 MAPK(mitogen-activated protein kinase) pathway를 통해 COX-2를 생산해서 PGE2를 증가시킨다. 따라서 NO나 PGE2가 감소하면 염증이 완화가 되었음을 알 수 있다.
한편 발효는 유기물이 미생물작용에 의해 분해 및 변화하는 현상으로, 당질이 미생물에 의해 혐기적 조건으로 분해되는 현상이며 미생물에 의해 유용한 물질을 생산한다. 발효는 오래전부터 식품을 만드는데 사용되었고, 우리가 애호하는 수많은 전통 식품들이 발효의 방법을 통해 맛, 취, 물성 향상 및 저장성을 증진시켰다. 또한, 고도의 발효 기술을 통해 특정 미생물을 이용하여 유용한 생리활성 물질을 대량으로 생산할 수 있으며, 친환정적이고 경제적이다. 이를 이용하여 염증을 완화하는 친환경적이고 저자극성 물질을 만들어 낼 수 있다.
할미꽃( Pulsatilla koreana )은 쌍떡잎식물 미나리아재비목 미나리아재비과의 다년생 초본으로 한국, 중국 북동부, 우수리강, 헤이리강에 분포하며, 노고초(老姑草) 혹은 백두옹(白頭翁)이라고도 한다. 곧게 들어간 굻은 뿌리 머리에서 잎이 무더기로 나와서 비스듬히 퍼진다. 흰 털로 덮인 열매의 덩어리가 할머니의 하얀 머리카락같이 보여서 할미꽃이라는 이름이 붙었다. 뿌리는 한의학에서 해독, 수렴, 소염, 살균 등의 작용이 있는 약재로 쓰이거나 이질 등의 지사제로 사용하고, 온학한열(溫虐寒熱), 신경통, 혈리, 치질출혈, 월경곤란, 임파선염 등에 쓰인다. 항아메바원충, 항트리코모나스, 항균작용이 있으며, 대장, 간, 위, 심, 신경에 작용하며, 해열하고 혈을 식히며 해독하는 효능이 있다. 분획물에 대한 항산화 연구와 치주 병인균에 대한 항균효과, 치주 조직 세포의 항염 효과에 관한 연구 등이 보고되었다. 특히, 대한민국 공개특허 제2009-0091492호 등에는 할미꽃 추출물 등의 식물추출물을 혼합하여 항균효과를 갖는 조성물을 제조하는 방법이 개시되고 있다.
유향나무(B. carterii , B. sacra , B. meglecta , B. thurifera 등)는 소말리아, 오만, 예멘이 원산인 쌍떡잎식물 운항목 관람과의 관목으로 열대 식물이다. 높이 4~5m이며, 꽃은 연한 노란색이다. 봄에서 여름에 걸쳐 나무줄기에 상처를 내면 젖빛의 수액이 흘러나오는데, 이것을 응고하여 방향 고무 수지를 얻는다. 이를 유향이라 하며, 프랑킨센스(frankincense) 또는 올리바늄(olibanum)이라고도 부른다. 맵고 쓴 맛이며 훈향료(薰香料)나 향수의 재료로 쓰인다. 한방에서는 유향 또는 훈육향(薰陸香)이라고 하는데, 기(氣)의 순환을 조절하고 혈액 순환을 촉진시키며 해독 작용과 통증을 가라앉게 하고 종기를 없애는 효능이 있어, 복통, 산후복통, 월경통, 타박상, 근육경련통, 악성종양 등을 개선시키고, 혈행개선, 어혈제거, 피부궤양 등에 쓰인다.
인도 유향나무(Boswellia serrata)는 유향나무와 같은 보스웰리아속의 나무로서 인도의 건조한 지대에 자생하며, 나무에서 얻어지는 수지는 유향과 비슷하되 향이 좀 더 부드럽다. 고대 이집트인들과 마찬가지로 인도에서도 이 향을 피우면 악령을 쫓아낸다고 믿었으며 미용의 목적으로 사용하기도 하였다. 수지는 흥분제, 류마티즘 치료제로 사용하며 수지에서 얻어진 오일은 진통제, 이뇨제로서 사용하기도 하는데, 이 식물이 지닌 의학적 효능이 인도 학자들에 의해 많이 연구되고 있으며 항염제와 천식치료제로서의 효능이 큰 것으로 밝혀졌다. 성분은 수지(樹脂)가 60~70%이고, 알파베타보스웰릭애시드(α-Boswellic acid) 약 33%, 오리바노레진(olibanoresene) 약 33%이며, 아라빅애시드(arabic acid) 등도 함유하고 있다. 특히 보스웰산은 항염증 작용이 있어 관절염 치료제로 잘 알려져 있으며, 면역조절 기능, 항암 기능, 천식 치료제로서의 효능을 지니고 있다.
후박나무( Machilus thunbergii )는 쌍떡잎식물 미나리아재비목 녹나무과의 상록교목이다. 나무껍질이 비늘처럼 떨어지는 특징이 있다. 꽃은 5~6월에 피고 황록색이다, 열매는 지름 1cm의 둥근 형태로 흑자색이다. 나무껍질이 염료로 사용되기도 한다. 한국, 중국, 필리핀, 일본 등지의 따뜻한 지역에서 자란다. 한국에서는 울릉도 및 남쪽 바닷가의 산기슭에서 자란다. 약효로는 이질, 해독, 이뇨, 근육통, 순환장애에 유효한 약재이며, 염증치료, 해수, 천식, 혈압강화, 항균에 효능이 있는 것으로 알려져 있다.
봉삼(Dictamnus dasycarpus)은 운향과의 여러해살이식물로 백선(白鮮)이라고도 부른다. 북아프리카, 남유럽, 한국, 일본, 중국 북동부, 시베리아 동부 일대에 자생하며, 우리나라 각처 산록에서 자란다. 생육환경은 반그늘 혹은 햇볕이 잘 드는 습기가 많은 곳에서 잘 자란다. 키는 50~90 센티미터 가량이고, 뿌리는 곧고 굵다. 줄기는 곧게 서며 튼튼하다. 꽃은 5~6월에 흰색이나 연한 붉은색으로 피고, 줄기 끝에서 달리고 작은 꽃자루에 털과 선모(腺毛)가 있어 강한 향기가 난다. 열매는 8월경에 갈색으로 된 껍질 안에 검고 광택이 나는 종자가 들어있다. 식물자체는 타오르는 덤불로도 알려져 있으며, 한방에서는 뿌리를 통경, 황달, 구축에 약으로 사용한다.
본 발명자들은 염증 완화 효과가 있는 천연 식물 추출물에 대한 연구를 수행하던 중 발효, 열수 또는 유기용매를 이용하여 추출된 할미꽃 추출물, 인도 유향나무 추출물, 후박나무 추출물 및 봉삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 도출하였으며, 상기 조성물은 전반전인 생리활성 효과가 우수하고, 단백질 수준에서도 염증을 완화시키는 효과가 우수하며, 또한 화장품, 의약 및 의약부외품의 피부외용제에 포함되어 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 염증의 치료, 개선, 예방 및 완화효과 및 항산화 효과가 우수한 항염증 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 세포독성이 없고 인체에 무해하며, 피부자극이 적은 항염증 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 경제성이 우수한 항염증 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 화장품, 의약품 및 의약부외품의 피부외용제 등의 분야에서 사용될 수 있는 항염증 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 관점은 항염증 조성물에 관한 것이다. 한 구체예에서 상기 항염증 조성물은 할미꽃 추출물, 인도 유향나무 추출물, 후박나무 추출물 및 봉삼 추출물을 유효성분으로 포함하며, 상기 할미꽃 추출물, 인도 유향나무 추출물, 후박나무 추출물 및 봉삼 추출물은 할미꽃, 인도 유향나무, 후박나무 및 봉삼을 포함하는 혼합물을 열수, 유기용매 또는 발효 추출하는 것이며, 상기 할미꽃, 인도 유향나무, 후박나무 및 봉삼은 1:0.1~5:0.1~5:0.1~5의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 한다.
한 구체예에서 상기 할미꽃 추출물은 할미꽃의 꽃, 잎, 줄기 및 뿌리 중 하나 이상의 부위에서 추출되고, 상기 인도 유향나무 추출물은 인도 유향나무의 줄기 및 뿌리 중 하나 이상의 부위에서 추출되고, 상기 후박나무 추출물은 후박나무의 줄기 및 뿌리 중 하나 이상의 부위에서 추출되고, 그리고 상기 봉삼 추출물은 봉삼의 잎, 줄기 및 뿌리 중 하나 이상의 부위에서 추출되는 것을 특징으로 한다.
한 구체예에서 상기 유기용매추출은 여과액 100 중량부, 물 10~100 중량부 및 유기용매 100~350 중량부를 포함하는 추출액에 의해 추출되며, 상기 여과액은 할미꽃, 인도 유향나무, 후박나무 및 봉삼 100 중량부 및 유기용매 50~200 중량부를 첨가하고 숙성한 다음 여과된 것이며, 상기 유기용매는 아세톤, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 벤젠, 클로로포름, 헥산 및 탄소수 1~10의 알코올 중에서 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 한다.
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한 구체예에서 상기 열수 추출은 상기 할미꽃, 인도 유향나무, 후박나무 및 봉삼 100 중량부에 대하여 물 100~500 중량부를 포함하는 혼합물을 30~100℃에서 가열하여 추출된 것을 특징으로 한다.
한 구체예에서 상기 발효 추출은 상기 유기용매 또는 열수에 의해 추출된 추출물에 균주를 접종하여 20~40℃에서 1~10일간 배양한 것을 특징으로 한다.
상기 균주는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실러스 퓨지포미스(Bacillus fusiformis), 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 불가리스(Bacillus vulgaris), 및 바실러스 웨이헨스테판넨시스(Bacillus weihenstephanenesis)중에서 1종 이상 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 구체예에서 상기 할미꽃 추출물, 인도 유향나무 추출물, 후박나무 추출물 및 봉삼 추출물은 상기 항염증 조성물 총 중량에 대하여 0.01~20 중량%로 포함되는 것을 특징으로 한다.
한 구체예에서 상기 항염증 조성물은 화장료, 의약품 또는 의약부외품용으로 사용되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 항염증 조성물은 염증의 치료, 개선, 예방 및 완화효과가 우수하고, 단백질 수준에서도 염증을 완화시키는 효과가 우수하며, 대식세포에 대한 독성이 없어 인체에 무해하고, 피부자극이 적고, 항산화 효과가 우수하고, 낮은 생산단가 및 높은 생산성을 가져 경제성이 우수하며, 화장품, 의약품 및 의약부외품의 피부외용제 등의 분야에서 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 대한 실시예 및 비교예의 세포독성정도를 비교한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예 및 비교예의 대식세포에서의 NO 생성량의 저해활성을 측정하여 비교한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예 및 비교예의 항산화 효과와 관련하여 자유라디칼 소거활성을 비교한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예 3의 농도 변화에 따른 대식세포에서의 COX-2 발현양의 저해활성을 측정하여 나타낸 사진 및 그래프이다.
본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략할 것이다.
그리고 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로써 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관례 등에 따라 달라질 수 있으므로 그 정의 는 본 발명을 설명하는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.
본 발명의 하나의 관점은 항염증 조성물에 관한 것이다. 한 구체예에서 상기 항염증 조성물은 할미꽃 추출물, 인도 유향나무 추출물, 후박나무 추출물 및 봉삼 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 할미꽃 추출물, 인도 유향나무 추출물, 후박나무 추출물 및 봉삼 추출물은 상기 할미꽃, 인도 유향나무, 후박나무 및 봉삼의 모든 부위를 사용하여 추출할 수 있다.
바람직하게 상기 할미꽃 추출물은 상기 할미꽃의 꽃, 잎, 줄기 및 뿌리중 하나 이상의 부위를 사용하여 추출할 수 있고, 상기 인도 유향나무 추출물은 상기 인도 유향나무의 줄기 및 뿌리중 하나 이상의 부위를 사용하여 추출할 수 있고, 상기 후박나무 추출물은 상기 후박나무의 줄기 및 뿌리중 하나 이상의 부위를 사용하여 추출할 수 있고, 그리고 상기 봉삼 추출물은 상기 봉삼의 잎, 줄기 및 뿌리중 하나 이상의 부위를 사용하여 추출할 수 있다. 상기와 같이 추출시 상기 할미꽃, 인도 유향나무, 후박나무 및 봉삼에 포함된 유용성분이 용이하게 추출될 수 있다.
또한, 본 발명에서는 추출 효율을 높이기 위해, 상기 할미꽃, 인도 유향나무, 후박나무 및 봉삼을 분절 또는 분쇄한 다음 추출을 실시할 수 있다.
한 구체예에서 상기 할미꽃 추출물, 인도 유향나무 추출물, 후박나무 추출물 및 봉삼 추출물은 할미꽃, 인도 유향나무, 후박나무 및 봉삼을 포함하는 혼합물을 열수, 유기용매 또는 발효를 이용하여 추출할 수 있다. 상기 방법으로 추출시 유용성분이 용이하게 추출될 수 있다.
한 구체예에서 상기 할미꽃, 인도 유향나무, 후박나무 및 봉삼은 1:0.1~5:0.1~5:0.1~5의 중량비로 포함될 수 있다. 바람직하게는 1:0.5~3:0.5~3:0.5~3의 중량비로 포함될 수 있다. 더욱 바람직하게는 1:1:1:1의 중량비로 포함될 수 있다. 상기와 같이 중량비를 포함하는 혼합물을 추출시 상기 각 추출물에 포함된 유용 성분의 상승효과가 우수하여 항산화 효과와 염증의 치료, 개선, 예방 및 완화효과를 더욱 효과적으로 증진시킬 수 있다.
상기 열수 추출은 상기 할미꽃, 인도 유향나무, 후박나무 및 봉삼과 물을 포함하는 혼합물을 가열하여 추출할 수 있다.
한 구체예에서 상기 열수 추출시 할미꽃, 인도 유향나무, 후박나무 및 봉삼 100 중량부에 대하여 물 100~500 중량부를 포함할 수 있다. 바람직하게는 물 200~400 중량부를 포함할 수 있다. 또한, 상기 열수추출은 30~100℃에서 1~10 시간 동안 가열하여 추출할 수 있다. 바람직하게는 60~90℃에서 3~8 시간 동안 가열하여 추출할 수 있다. 상기 조건에서 상기 할미꽃, 인도 유향나무, 후박나무 및 봉삼에 포함된 유용 성분이 손상되지 않으면서 용이하게 추출될 수 있다.
상기 열수추출 이후, 교반추출, 환류 냉각 추출, 냉침 추출, 초음파 추출 또는 초임계 추출 등의 통상적인 추출방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 환류 냉각 추출한 후 수득한 추출액을 여과, 감압농축 또는 건조하여 상기 할미꽃, 인도 유향나무, 후박나무 및 봉삼의 추출물을 얻을 수 있다.
상기 유기용매 추출은 여과액 100 중량부에 물 10~100 중량부 및 유기용매 100~350 중량부를 첨가하여 추출될 수 있다. 바람직하게는 여과액 100 중량부에 물 30~80 중량부 및 유기용매 150~300 중량부를 첨가하여 추출될 수 있다. 상기 조건에서 상기 할미꽃, 인도 유향나무, 후박나무 및 봉삼에 포함된 유용 성분이 손상되지 않으면서 용이하게 추출될 수 있다.
이 때 상기 여과액은 할미꽃, 인도 유향나무, 후박나무 및 봉삼 100 중량부에 유기용매 50~200 중량부를 첨가하고 5~7일 동안 숙성한 다음 여과된 것일 수 있다. 상기 방법으로 여과 시 할미꽃, 인도 유향나무, 후박나무 및 봉삼의 유효 성분을 더욱 효과적으로 추출할 수 있다. 상기 여과는 통상적인 방법으로 실시하며, 예를 들면 여과지를 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 여과된 여과액은 통상적인 방법으로 더 농축할 수 있다. 예를 들면, 회전진공농축장치에 투입하여 상기 여과액을 농축할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 여과액 제조 및 상기 유기용매 추출에서 사용될 수 있는 유기용매로는 아세톤, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 벤젠, 클로로포름, 헥산 및 탄소수 1~10의 알코올 등이 사용될 수 있다. 이들은 단독 또는 2종 이상 혼합하여 사용될 수 있다. 상기와 같은 유기용매를 사용 시 상기 할미꽃, 인도 유향나무, 후박나무 및 봉삼에 포함된 유용성분이 손상되지 않으면서 용이하게 추출될 수 있다.
또한, 상기 유기용매에 사용되는 알코올로는 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 펜탄올, 헥사놀 등의 저급 1가 알코올, 1,2-펜탄디올, 1,5-펜탄디올, 헥산디올, 헵탄디올, 옥탄디올, 데칸디올 등의 중급 2가 알코올, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린 등 저급 3가 알코올 등이 사용될 수 있다. 이들은 단독 또는 2종 이상 혼합하여 사용될 수 있다.
한 구체예에서 상기 유기용매는 헥산, 부탄올 및 에틸 아세테이트를 1:0.1~5:0.1~5의 부피비로 혼합하여 사용할 수 있다. 상기 혼합비율의 유기용매를 사용하여 상기 할미꽃, 인도 유향나무, 후박나무 및 봉삼의 유용성분을 추출하여 분획(分劃)한 다음 감압농축 또는 건조하여 본 발명의 할미꽃, 인도 유향나무, 후박나무 및 봉삼의 추출물을 얻을 수 있다.
상기와 같이 추출시 상기 할미꽃 추출물, 인도 유향나무 추출물, 후박나무 추출물 및 봉삼 추출물의 유용성분을 효과적으로 추출할 수 있다.
상기 발효 추출은 균주가 배양된 배지에 전술한 유기용매 및 열수에 의해 추출된 추출물을 접종하고 배양하여 발효 추출물을 수득할 수 있다.
한 구체예에서 멸균한 배지에 균주를 접종한 다음, 20~40℃에서 20~50시간 동안 배양하고, 상기 할미꽃, 인도 유향나무, 후박나무 및 봉삼을 전술한 유기용매 또는 열수로 추출된 추출물을 접종하여 20~40℃에서 1~10일간 배양하여 얻을 수 있다. 상기 조건으로 발효 추출시 상기 할미꽃, 인도 유향나무, 후박나무 및 봉삼의 유용 성분을 이용한 발효물을 효과적으로 추출할 수 있다.
상기 배지는 균주의 발효에 통상적으로 사용되고 있는 배지가 있다면, 제한없이 사용 가능하다. 예를 들면, 천연배지, 합성 배지 및 반합성 배지 등을 사용할 수 있다. 더욱 구체적으로, 효모 추출물 배지, 무아미노산 효모 질소원 배지, 맥아추출물 배지, 펩톤 배지, 폴리펩톤 배지, 트립톤 배지, 탈지분유 배지, 카사미노산 배지, 소이톤 배지, 밀기울 배지, 탈염간장 배지, 콘스팁리쿼 배지, 육즙 추출물 배지, 메주가루 배지, 청국장가루 배지, 고춧가루 배지, 영양 배지, 감자 배지, 사브로드포도당 배지, 트립틱콩 배지, 크자펙-독스(Czapek-Dox) 배지, TSA(Trypticase Soy Agar) 배지, TSB(Tryptic Soy Broth) 배지, BHI(Brain heart infusion) 배지, LB(Luria-Bertani) 배지, TBS(Tris-Buffered Saline) 배지, SD(Sabouraud Dextrose) 배지 및 MRS(de Man, Rogosa and Sharpe) 배지 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한 구체예에서는 멸균수를 TBS(Tryptic soy broth)에 15~35 g/L를 첨가하여, pH 6.0~7.5, 온도 30~40℃로 유지시켜 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한 구체예에서 상기 발효에 사용되는 균주로는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실러스 퓨지포미스(Bacillus fusiformis), 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 불가리스(Bacillus vulgaris), 및 바실러스 웨이헨스테판넨시스(Bacillus weihenstephanenesis) 등을 사용할 수 있다. 이들은 단독 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다. 상기 종류의 균주를 사용 시 상기 할미꽃 추출물, 인도 유향나무 추출물, 후박나무 추출물 및 봉삼 추출물의 유용성분을 효과적으로 추출할 수 있다.
본 발명에서 상기 추출물들을 전부 포함 시 상기 할미꽃 추출물, 인도 유향나무 추출물, 후박나무 추출물 및 봉삼 추출물의 유용성분 간에 상승작용이 발생하여 항산화 활성이 증진되고, 염증의 치료, 개선, 예방 및 완화효과를 더욱 효과적으로 증진시킬 수 있으며, 단백질(protein) 수준에서도 염증을 완화시키는 효과가 우수하고, 특히 일정한 중량비율로 포함할 때, 이러한 효능을 더욱 월등하게 증진시킬 수 있다. 또한, 상기 항염증 조성물은 유사한 효과를 갖는 다른 제품과 비교할 때 낮은 생산단가 및 높은 생산성을 가질 수 있어 경제성이 우수할 수 있다.
한 구체예에서 상기 항염증 조성물은 화장료, 의약품 또는 의약부외품 용도로 사용될 수 있다. 상기 항염증 조성물은 상기 화장품, 의약품 또는 의약부외품 용도로 사용되어 항산화 활성과 항염증 활성, 예방, 치료 등에 이용할 수 있다.
이때, 상기 할미꽃 추출물, 인도 유향나무 추출물, 후박나무 추출물 및 봉삼 추출물은 상기 항염증 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~20 중량% 포함할 수 있다. 바람직하게는 0.1~15 중량% 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는 2~10 중량% 포함할 수 있다. 상기 범위에서 피부자극, 세포독성이 없으면서 항산화 효과와 염증의 치료, 개선, 예방 및 완화효과가 우수할 수 있다.
또한 상기 항염증 조성물은 약제학적, 또는 화장품학적으로 허용되는 성분을 추가로 포함할 수 있다.
상기 항염증 조성물을 상기 화장품에 사용 시 통상적인 화장품에 포함되는 성분으로는 담체, 부형제 또는 희석제로 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알코올, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제(thickening agent), 항산화제, 점도 안정화제(viscosity stabilizer), 킬레이팅제, 완충제 및 저급 알코올 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 항염증 조성물을 포함하는 상기 화장품의 제형으로는 예를 들면, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스터로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클린저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이새도우 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 항염증 조성물을 상기 의약품에 사용 시 고형제, 반고형제, 용액제, 유제, 분산제, 미셀, 리포좀 등의 형태로 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 작용을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되지는 않는다. 여기에 기재되지 않은 내용은 이 기술 분야에서 숙련된 자이면 충분히 기술적으로 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략하기로 한다.
실시예 1: 열수추출
할미꽃(Pulsatilla koreana), 인도 유향나무(Boswellia serrata), 후박나무(Machilus thunbergii) 및 봉삼(Dictamnus dasycarpus) 각각의 줄기 및 뿌리를 세척하여 이물질을 제거하고, 음지에서 건조시킨 다음, 분쇄기를 사용하여 약 30초간 분쇄하여 분쇄물을 제조하였다.
이때 상기 분쇄물은 할미꽃(Pulsatilla koreana) 추출물, 인도 유향나무(Boswellia serrata) 추출물, 후박나무(Machilus thunbergii) 추출물 및 봉삼(Dictamnus dasycarpus) 추출물을 1:1:1:1의 중량비로 포함하였다.
상기 제조된 분쇄물 2kg와 증류수 4.5kg를 혼합하고 70℃에서 3시간 동안 가열한 혼합물을 회전진공 농축장치(rotary vacuum evaporator)(Eyela, Japan)를 사용하여 농축하고 동결건조하여 분말 상태의 추출물을 수득하였다.
실시예 2: 유기용매추출
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제조된 분쇄물 2kg을 70% 에탄올 2kg에 첨가하고 1주일 동안 상온에서 숙성한 다음, 여과지로 여과하여 여과액을 수득하였다. 상기 여과액을 회전진공 농축장치(rotary vacuum evaporator)(Eyela, 일본)를 사용하여 농축하였다.
상기 농축된 여과액 1kg과 물 0.5kg 및 유기용매 2kg을 혼합하였다. 이때 상기 유기용매로는 헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올을 1:1:2의 부피비로 혼합하여 사용하였다. 상기 혼합된 여과액을 감압 농축하여 추출물을 수득하였다.
실시예 3: 발효추출
TBS(DIFCO, U.S.A) 배지에 균주(바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens))를 접종하고 pH를 5.7로 조절하여 배양실 온도를 23~37℃로 유지 및 조절되는 환경 하에서 24시간 동안 배양하였다.
상기 실시예 2와 동일한 방법으로 수득된 추출물을 상기 배양된 균주가 포함된 배지에 접종하여 36℃에서 7일 동안 배양하여 발효물을 수득하였다. 상기 발효물을 면필터로 여과한 뒤, 상기 여과물을 원심분리하고 상층액을 취하여 추출물을 수득하였다.
비교예 1
할미꽃(Pulsatilla koreana), 인도 유향나무(Boswellia serrata) 및 후박나무(Machilus thunbergii)의 줄기 및 뿌리를 사용한 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법으로 열수 추출하여 추출물을 수득하였다.
비교예 2
할미꽃(Pulsatilla koreana), 후박나무(Machilus thunbergii) 및 봉삼(Dictamnus dasycarpus)의 줄기 및 뿌리를 사용한 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법으로 열수 추출하여 추출물을 수득하였다.
비교예 3
인도 유향나무(Boswellia serrata), 후박나무(Machilus thunbergii) 및 봉삼(Dictamnus dasycarpus)의 줄기 및 뿌리를 사용한 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법으로 열수 추출하여 추출물을 수득하였다.
비교예 4
할미꽃(Pulsatilla koreana), 인도 유향나무(Boswellia serrata) 및 봉삼(Dictamnus dasycarpus)의 줄기 및 뿌리를 사용한 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법으로 열수 추출하여 추출물을 수득하였다.
실험예
실험예 1: 세포활성 실험
WST 분석법은 살아있는 세포를 측정하는 방법으로 세포 내의 mitochondrial dehydrogenase 활성을 측정한다. WST는 수용성의 tetrazolium salt로서 살아있는 세포와 반응하여 오렌지색 수용성의 formazan을 생성한다. 이 formazan을 측정하여 시료에 대한 세포 독성을 확인한다.
본 발명물이 염증 악화 등과 같은 자극 없이 면역 활성 효과를 나타낼 수 있는지를 확인하기 위해 대식세포(RAW 264.7)에 대한 독성을 측정하였다. 대식세포를 96well 플레이트에 1 x 104 cells/well 씩 동일하게 hemacytometer를 이용하여 계수한 후, 분주하였다. 24시간 동안 배양한 대식세포에 본 발명의 실시예 1~3 및 비교예 1~4를 0.1(v/v)% 각 well에 넣고, DMEM 배지 100㎕에서 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 상등액을 제거하고 DMEM 배지와 WST solution(EZ-cytox)을 9:1의 비율로 혼합한 뒤, 2 시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 반응시키고, 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 정도(cell viability)는 추출물과 같은 용매를 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율(%)로 표시하였다.
상기 실시예 1~3 및 비교예 1~4의 세포 활성 정도(%)를 하기 도 1 및 표 1에 나타내었다.
구분 세포 활성 정도(%)
대조군 100
실시예 1 103.3
실시예 2 97.2
실시예 3 108.4
비교예 1 111.9
비교예 2 90.7
비교예 3 90.3
비교예 4 92.2
상기 표 1 및 도 1에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1~3에서는 대조군과 유사한 세포 활성도를 나타내며 세포 독성을 보이지 않음을 알 수 있다.
실험예 2: Nitric oxide (NO) 생성 실험
상기 제조된 실시예 1~3의 항염증 활성효과를 측정하기 위해, 염증 반응에 의해 생성되는 Nitric oxide(NO)의 농도를 측정하는 실험을 실시하였다. 대식세포를 LPS(Lipopolysaccharide)로 자극시키면 여러 pathway를 활성화 시키고, NOS(NO 합성효소)에 의해 NO가 발생한다. 생성된 NO의 양은 세포배양액에 중에 존재하는 NO2-의 형태로, 이를 NO kit (Nitric oxide detection kit, iNtRON 21021, Korea)를 이용하여 측정하였다.
실시예 1~3 및 비교예 1~4를 각각 용매에 용해시킨 다음, 적정농도로 희석하여 저장용액을 제조하였다. 이를 LPS (sigma, St. Louis, MOLogan, UT, USA) 1㎍/ml와 함께 대식세포에 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양액 중 100㎕를 취한 후, NO kit의 N1 buffer 50㎕를 첨가하여 10분 방치하고, 이어 N2 buffer 50㎕를 첨가하여 10분간 방치 후, 540nm에서 흡광도를 측정하였다. NO2 -는 Nitrite를 표준용액으로 하여 측정하였다. LPS를 처리하지 않은 대식세포를 양성대조군으로, LPS를 처리한 대식세포를 음성대조군으로 하여, 실시예 1~3 및 비교예 1~4를 각각 처리한 후 NO2 - 생성 농도를 비교하여 도 2에 나타내었다.
도 2를 참조하면, 실시예 1~3은 비교예 1~4보다 NO 생성 감소 효과가 상대적으로 우수한 것을 알 수 있었다.
실험예 3: 항산화 실험
프리라디칼은 활성산소를 말하며, 우리가 호흡한 산소가 에너지를 만들고 물로 환원되는 과정에서 나타나는 산화력이 수 천 배나 높은 물질이다. 동식물의 체내 세포들의 대사과정에서 생성되거나 스트레스, 자외선, 세균 침투에 의해서도 발생되며, 과량의 활성산소가 체내에 존재하면 정상 세포까지 무차별 공격, 각종 질병과 노화의 주범이 된다. 또한, 외부 자극에 민감한 면역 반응을 보이는 병리적 인자로 작용하게 된다. 본 발명의 항염증 조성물이 항산화능을 나타냄으로써 염증 완화 효과를 가지는지를 DPPH의 자유라디칼 소거능으로 확인하였다.
1mM DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl, Sigma D9132-1G, USA)는 에탄올 내에서 프리라디칼을 발생한다. 에탄올을 0.2 ml에 에탄올로 제조된 0.1 mM DPPH 용액 0.25 ml 및 최종농도가 전체 volume의 10%에 해당되도록 실시예 1~3 및 비교예 1~4를 희석하여 0.05 ml를 첨가하였다. 10초간 강하게 교반하고, 냉암소에서 30분간 보관한 다음, 520nm에서 흡광도를 측정하였다. 프리라디칼 소거능의 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 하기와 같이 항산화능을 계산하여 백분율로 표시하였다.
항산화능(%)= [100-(각 시료의 반응 흡광도/대조군의 반응 흡광도)] x 100
구분 항산화능(%)
실시예 1 57.6
실시예 2 61.8
실시예 3 63.7
비교예 1 38.9
비교예 2 1.6
비교예 3 56.1
비교예 4 18.6
상기 표 2 및 도 3에 나타난 바와 같이, 실시예 1~3은 대조군 및 비교예 1~4에 비해 우수한 항산화능을 나타냄을 알 수 있었다.
실험예 4: COX -2 발현 확인 실험
LPS를 처리하지 않은 대식세포를 양성대조군으로, LPS를 처리한 대식세포를 음성대조군으로 하여, 상기 실시예 3에 대하여 대식세포에서 단백질을 수득하여 Cyclooxygenase-2(COX-2) western blot을 실시하였다. 대식세포를 PBS로 세척한 다음, cell lysis buffer(750mM NaCl, 250mM Tris, 5% Igepal, 1M DTT, Protase inhibitor)를 이용하여 용혈시키고, 원심 분리하여 단백질 용액을 얻었다. BCA 정량법을 이용하여 단백질 용액을 정량한 다음, 30㎍를 취하여 sample buffer(NuPAGE LDS Sample buffer(X4), invitrogen, U.S.A.)와 혼합하였다. 100℃에서 5분간 가열하여 단백질 변성을 유도하였다. 변성된 단백질을 10% acrylamide gel에서 전기영동을 수행한 다음 nitrocellulose membrane으로 전위시키고 5% BSA/TBS-T로 상온에서 1시간 동안 반응시켜 비 특이적인 항체 반응을 억제시켰다. COX-2 및 β-actin에 대한 1차 항체를 1% BSA/TBS-T에서 1:2,000으로 희석하여 membrane과 4℃에서 overnight하여 반응시키고 TBS-T buffer로 세척한 다음 Anti-mouse, rabbit 혹은 goat IgG conjugated Horseradish peroxidase 2차 항체를 1% BSA/TBS-T에서 1:10,000으로 희석하여 membrane과 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. TBS-T로 세척한 다음 ECL reagent kit로 발색시키고 chemi-doc XRS+에서 감광시키는 방법으로 분석하여, 농도 변화에 따른 western bloting 결과를 도 4에 나타내었다.
상기 도 4와 같이 본 발명의 실시예 3의 농도가 증가함에 따라 COX-2의 발현이 더욱 낮아진 것을 확인할 수 있었고, 이를 통하여 본 발명의 조성물의 염증 완화효과가 우수함을 확인할 수 있었다. 또한, 단백질 수준에서도 염증을 완화시키는 효과를 확인할 수 있었다.
상기 실험예 1~4의 결과를 종합해보면, 본 발명에 따른 할미꽃 추출물, 인도 유향나무 추출물, 후박나무 추출물 및 봉삼 추출물을 포함하는 상기 항염증 조성물은 세포 독성 시험, NO 감소 시험, 항산화 시험 등 전반전인 생리활성 연구에서 효과가 우수하였으며, protein 수준에서도 염증을 완화시키는 효과를 확인할 수 있었다.

Claims (10)

  1. 할미꽃 추출물, 인도 유향나무 추출물, 후박나무 추출물 및 봉삼 추출물을 유효성분으로 포함하며,
    상기 할미꽃 추출물, 인도 유향나무 추출물, 후박나무 추출물 및 봉삼 추출물은 할미꽃, 인도 유향나무, 후박나무 및 봉삼을 포함하는 혼합물을 열수, 유기용매 또는 발효 추출하는 것이며,
    상기 할미꽃, 인도 유향나무, 후박나무 및 봉삼은 1:0.1~5:0.1~5:0.1~5의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 할미꽃 추출물은 할미꽃의 꽃, 잎, 줄기 및 뿌리중 하나 이상의 부위에서 추출되고,
    상기 인도 유향나무 추출물은 인도 유향나무의 줄기 및 뿌리중 하나 이상의 부위에서 추출되고,
    상기 후박나무 추출물은 후박나무의 줄기 및 뿌리중 하나 이상의 부위에서 추출되고, 그리고
    상기 봉삼 추출물은 봉삼의 잎, 줄기 및 뿌리중 하나 이상의 부위에서 추출되는 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 유기용매추출은 여과액 100 중량부, 물 10~100 중량부 및 유기용매 100~350 중량부를 포함하는 추출액에 의해 추출되며,
    상기 여과액은 할미꽃, 인도 유향나무, 후박나무 및 봉삼 100 중량부 및 유기용매 50~200 중량부를 첨가하고 숙성한 다음 여과된 것이며,
    상기 유기용매는 아세톤, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 벤젠, 클로로포름, 헥산 및 탄소수 1~10의 알코올 중에서 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 열수 추출은 상기 할미꽃, 인도 유향나무, 후박나무 및 봉삼 100 중량부에 대하여 물 100~500 중량부를 포함하는 혼합물을 30~100℃에서 가열하여 추출된 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 발효 추출은 상기 유기용매 또는 열수에 의해 추출된 추출물에 균주를 접종하여 20~40℃에서 1~10일간 배양한 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 균주는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실러스 퓨지포미스(Bacillus fusiformis), 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 불가리스(Bacillus vulgaris), 및 바실러스 웨이헨스테판넨시스(Bacillus weihenstephanenesis)중에서 1종 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 할미꽃 추출물, 인도 유향나무 추출물, 후박나무 추출물 및 봉삼 추출물은 상기 항염증 조성물 총 중량에 대하여 0.01~20 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
  10. 제1항, 제2항 및 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항염증 조성물은 화장료, 의약품 또는 의약부외품 용도로 사용되는 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
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