KR20230105817A - 금창초 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 금창초(Ajuga decumbens, AD) 캘러스 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증성 조성물 및 상기 조성물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 blue LED가 조사된 금창초 캘러스 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물, 식품 조성물 또는 화장품 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 blue LED가 조사된 금창초 캘러스 추출물은 염증매개체들을 효과적으로 억제하고 세포독성 없이 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 천연물 소재로서, 다양한 항염증용 제품들에 적용될 수 있어 효과적이다.
Description
본 발명은 금창초(Ajuga decumbens, AD) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 블루 LED 조건에서 배양된 금창초 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항염증용 의약, 식품 및 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
현대사회는 경제수준의 향상과 지속된 고령층의 인구 증가로 건강에 대한 관심이 다양한 연령층에서 높은 수준으로 증가하고 있다. 건강을 증진시키고 노화 과정을 지연시키고자 하는 목적에 따라 많은 의약품, 건강기능식품 및 기능성 화장품 들이 개발되고 있고, 특히 천연물 소재를 이용하여 안전성 문제를 해결하고 부작용이 적은 염증 억제와 피부개선을 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.
천연물은 오래 전부터 의약품, 식품, 화장품 원료, 향료, 색소 등의 유효성분이 되는 다양한 천연생리활성 물질들의 공급원이었다. 이들 천연생리활성 물질은 매우 적은 양으로 현저한 활성을 나타내는 고부가가치 물질로서 현재 수많은 종류가 유용하게 이용되고 있으며, 다양한 유용식물 유래의 기능성 물질을 함유하고 있는 천연물 소재들에 대한 연구가 계속 진행되고 있다.
금창초(Ajuga decumbens, AD)는 쌍떡잎식물 통화식물목 꿀풀과 조개나물속에 속하는 다년생 식물로서 길이가 4~6 센티미터이고 원줄기가 옆으로 뻗고 전체에 흰 털이 많으며, 잎은 긴 타원형 또는 달걀 모양이고, 꽃은 오뉴월에 짙은 자주색으로 잎겨드랑이에 달려 피는 식물이다. 한국 일본, 중국에 분포하며 국내에서는 제주도, 경상도, 전라에서 자란다.
금창초는 꽃필 때 전초를 채취하여 약용에 사용하는 것으로 백모하고초(白毛夏姑草)라고 하며, 맛이 쓰면서 달고 약성은 찬 편에 독성이 없는 생약이다. 한방에서는 해소, 천식, 기관지염, 인후염, 장출혈,코피,객혈, 유선염, 중이염, 종기, 타박상 등에 처방하고, 약효는 청열 해독, 양혈(凉血), 소종(消腫), 천식, 진해, 거담 등의 효능이 있고 세균에 대한 항균작용이 있으며 기관지염, 토혈(吐血), 적리균 임병(淋病), 인후종통, 종기, 타박상 등을 치료한다..
금창초의 항염증 활성이 간혹 보고되어 있긴 하지만, 금창초의 항염활성을 증가시키기 위한 방법이나 항염활성이 증가된 금창초 추출물을 의약, 식품 또는 화장료 조성물에 이용하고자 하는 연구는 진행된 바 없다.
염증반응은 세균과 같은 외부 물질의 침입이나 물리화학적 손상 등의 해로운 주위 환경으로부터 생체를 보호하려는 생리적인 반응으로서, 면역세포가 생체의 이물질을 인식하여 활성화되고, 활성화된 면역세포에서 염증을 매개하는 많은 인자를 분비함으로써 시작된다. 이러한 염증현상은 여러 종류의 백혈구와 면역 물질의 증가를 초래하며, 증가된 세포들은 염증성 세포 산물인 다양한 종류의 단백질 분해 효소와 사이토카인 등을 분비함으로써 치료 및 방어를 할 수 있게 해준다. 특히, 산화질소(Nitric oxide, NO)는 신경전달, 혈관의 이완 및 세포 매개성 면역반응에 관여하는 높은 반응성을 가진 강력한 염증 매개물질이고, NO synthase에 의해 L-argine으로부터 생성된다. Nitric oxide(NO)는 대식세포를 활성화시킴으로써 인터루킨-1β(interleukin(IL)-1β), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(IL-8), tumor necrosis factor(TNF)-α와 같은 전-염증성 사이토카인(Pro-inflammatory cytokine)을 생성하게 된다.
염증은 일종의 면역반응 중 하나이지만, 염증을 자극하는 자극제가 없어지지 않거나 계속해서 만들어질 경우에는 만성 염증이 일어나게 되어 심각한 조직의 손상을 가져오고, 이는 다양한 질병의 원인이 된다. 만성염증 또는 과다염증은 단백질 분해 효소들에 의해 세포 및 결합조직의 손상을 일으키고, 세포의 재생 및 증식에도 나쁜 영향을 미치게 된다. 특히, 결합 조직의 손상은 피부의 탄력을 감소시켜 주름의 원인이 될뿐 아니라, 정상적인 조직구조와 기능을 상실하게 되어 심각한 상태를 초래하게 된다.
이에, 인체에 자극이 없는 안전성이 보장되는 천연물 유래의 소재로서 독성이 없을 뿐 아니라, 항염 활성이 기존의 천연물 소재들과 비교하여 탁월하여 의약, 식품 또는 화장품에 바로 적용할 수 있는 신소재의 개발이 절실히 필요한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 요구를 해결하고 종래기술의 문제점을 극복하기 위한 것으로, blue LED가 조사된 금창초 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물 및 이를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 blue LED가 조사된 금창초 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증성 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 blue LED가 조사된 금창초 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증성 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물 또는 식품 조성물을 제공하는 것이 목적이다.
본 발명은 또한, LED를 조사하여 식물의 캘러스를 배양하는 단계를 포함하는 식물 줄기세포 배양 방법을 제공하고자 한다.
본 출원의 다른 목적 및 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 목적에 제한되지 않으며, 본 명세서에 기재된 청구범위 및 도면과 함께 하기의 발명의 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 또한 본 명세서에 기재되지 않은 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자(이하'통상의 기술자'라 함)가 명확하게 이해하고 유추할 수 있는 것을 포함한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 부작용이 적고 무독성이며 고효율인 천연물 유래 소재를 포함하는 항염증용 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, blue LED가 조사된 조건에서 배양된 금창초 캘러스가 기존 암(dark) 배양 조건에서 배양한 금창초 캘러스보다 우수한 항염증 활성이 더욱 강화됨을 확인하였다.
또한, blue LED가 조사된 금창초 캘러스 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물은 염증매개체로 알려진 PGE2 및 전-염증성 사이토카인(Pro-inflammatory cytokine)인 TNF-α, IL-6, IL-1β에 대한 우수한 억제활성을 나타냈고, iNOS, COX-2, ERK, JNK 또는 P38의 발현 또는 인산화를 농도-의존적으로 저해하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 염증을 예방, 개선 또는 치료하기 위해 다음의 발명을 제공한다.
본 발명은 blue LED가 조사된 금창초 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공한다.
일 구현예로, 상기 추출물은 blue LED 400nm 내지 500nm 단색광이 조사된 배양 조건에서 배양된 금창초 캘러스 추출물일 수 있다. 또한 상기 금창초의 캘러스 추출물은 열수 추출하여 사용하는 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 조성물은 염증매개체로 알려진 PGE2 또는 전-염증성 사이토카인(Pro-inflammatory cytokine)에 대한 억제활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 것일 수 있고, 여기서 상기 전-염증성 사이토카인(Pro-inflammatory cytokine)은 TNF-α, IL-6 및/또는 IL-1β일 수 있다.
일 구현예로, 상기 조성물은 iNOS 또는 COX-2의 발현을 억제하거나, ERK, JNK 또는 p38의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명은 blue LED가 조사된 금창초 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증성 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물을 제공한다.
일 구현예로, 상기 항염증성 질환은 염증성 장질환, 비알콜성 만성 간염, 만성 간염, 크론병, 췌장염, 식도염, 위염, 대장염, 궤양성 대장염, 폐렴, 기관지염, 인후염, 심근경색, 심부전, 관절염, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 신부전, 건선, 빈혈, 당뇨, 섬유화증, 다발성 경화증, 전신 홍반 루프스, 강직성 척추염, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 치주염, 신경병증 통증 및 특발성 염증성 근육병증으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 할 수 있다.
일 구현예로, 상기 약학 조성물은 목적하는 바에 따라 경구용 제제 또는 정맥 제제로 투여할 수 있다. 경구용 고체 또는 액체에 널리 사용되는 약제학적 부형제 또는 담체를 적절히 사용할 수 있으며, 경구투여용 고체 제형으로는 정제, 환제, 산제 및 입제 등의 형태를 취할 수 있고, 액상 제형으로는 물이나 유기용매, 물과 유기용매의 혼합물, 약제학적으로 적합한 오일 또는 지방 등의 액체부형제를 추가할 수 있다.
또한, 본 발명은 blue LED가 조사된 금창초 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증성 질환을 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
일 구현예로, 상기 화장료 조성물은 통상의 화장품용 부형제 또는 담체를 사용하여 조성한 용액이나 크림, 로션에 사용할 수 있다.
또한, 상기 화장료 조성물은 화장품 재료에 일반적으로 사용되는 각종 첨가제 또는 유기 용매를 더 추가할 수 있다. 예들들어, 에탄올, 이소프로필 알코올, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 라우릴 알코올, 세탄올, 스테아릴 알코올, 올레일 알코올 및 기타 각종 동, 식물성 오일 등을 사용하여 용해성, 혼화성, 사용성 등을 좋게 할 수 있다.
본 발명은 또한, blue LED가 조사된 금창초 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증성 질환을 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
일 구현예로, 상기 식품 조성물은 감미제로서 통상의 감미제가 추가될 수 있으며, 합성 또는 천연의 비발효성 당 등을 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들어, 삭카린나트륨, 아스파탐, 락토오스, 말토오스 또는 자이리톨 등이 첨가될 수 있다.
본 발명은 또한, blue LED가 조사된 금창초 추출물을 이용하는, 항염증용 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
일 구현예로, 상기 방법은
(a) blue LED 400nm 내지 500nm 단색광을 처리하는 조건에서 금창초 캘러스를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양된 캘러스에 증류수를 첨가하여 열수 추출하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.
여기서 열수 추출은 25℃ 내지 130℃ 온도에서 5시간 내지 24시간 수행되는 것으로, 열수 추출이 일어날 수 있는 온도와 시간이라면 제한되지 않는다.
일 구현예로, 상기 방법은 시험관 내 또는 생체 외에서 일어나는 방법일 수 있다.
본 발명은 LED를 조사하여 식물의 캘러스를 배양하는 단계를 포함하는, 식물 줄기세포 배양 방법을 제공한다.
일 구현예로, 상기 LED는 블루 LED, 레드 LED 또는 블루 + 레드 LED일 수 있고, 상기 식물은 금창초일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 blue LED가 조사된 금창초 캘러스 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증성 조성물은 염증매개체로 알려진 PGE2 및 전-염증성 사이토카인(Pro-inflammatory cytokine)인 TNF-α, IL-6, IL-1β에 대한 우수한 억제활성을 나타내고, iNOS, COX-2, ERK, JNK, P38의 발현 또는 인산화를 농도-의존적으로 저해하는 효과를 가지고 있다.
본 발명에 따른 blue LED가 조사된 금창초 캘러스 추출물은 염증매개체들을 효과적으로 억제함으로써 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 천연물 소재이고, 다양한 항염증용 제품들인 약학적 조성물, 식품 조성물 또는 화장품 조성물에 적용될 수 있다.
도 1은 LED 처리된 금창초(Ajuga decumbens, AD) 추출물의 세포 생존율 및 NO 억제 효과를 확인한 결과이다.
(a)는 MTT 분석에 의해 결정된 금장초(AD) 추출물의 세포 독성에 대한 결과이고, (b)는 LPS(1 μg/ml)로 자극된 RAW264.7 세포에 대하여 금장초(AD) 추출물 25, 50, 100 μg/ml 농도 처리에 따른 NO 억제 효과를 나타낸다.
도 2는 LED 처리된 금창초(AD) 추출물의 PGE 2 생성 억제 효과를 나타낸다.
도 3은 LED 처리된 금창초(AD) 추출물의 전-염증성 cytokine 생성 억제 활성을 나타낸다.
(a) 내지 (c)는 각각 (a) IL-6, (b) IL-1β 및 (c) TNF-α의 생성량을 측정한 결과이다.
도 4는 LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 LED 처리된 금창초(AD) 추출물의 iNOS 및 COX-2 발현량 감소 활성을 보여준다.
(a)는 iNOS의 단백질 발현양이고, (b)는 COX-2의 단백질 발현양을 나타낸다.
도 5는 LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 ERK, JNK 및 p38의 발현 및 인산화에 대한 LED 처리된 금창초(AD) 추출물의 효과를 확인한 결과이다.
(a) 내지 (c)는 각각 (a) ERK, (b) JNK 및 (d) p38의 단백질 발현양 및 인산화 정도를 나타낸다.
(a)는 MTT 분석에 의해 결정된 금장초(AD) 추출물의 세포 독성에 대한 결과이고, (b)는 LPS(1 μg/ml)로 자극된 RAW264.7 세포에 대하여 금장초(AD) 추출물 25, 50, 100 μg/ml 농도 처리에 따른 NO 억제 효과를 나타낸다.
도 2는 LED 처리된 금창초(AD) 추출물의 PGE 2 생성 억제 효과를 나타낸다.
도 3은 LED 처리된 금창초(AD) 추출물의 전-염증성 cytokine 생성 억제 활성을 나타낸다.
(a) 내지 (c)는 각각 (a) IL-6, (b) IL-1β 및 (c) TNF-α의 생성량을 측정한 결과이다.
도 4는 LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 LED 처리된 금창초(AD) 추출물의 iNOS 및 COX-2 발현량 감소 활성을 보여준다.
(a)는 iNOS의 단백질 발현양이고, (b)는 COX-2의 단백질 발현양을 나타낸다.
도 5는 LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 ERK, JNK 및 p38의 발현 및 인산화에 대한 LED 처리된 금창초(AD) 추출물의 효과를 확인한 결과이다.
(a) 내지 (c)는 각각 (a) ERK, (b) JNK 및 (d) p38의 단백질 발현양 및 인산화 정도를 나타낸다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 부작용이 적고 무독성이며 고효율인, 천연물 유래 소재를 포함하는 항염증용 조성물 및 이를 생산하는 방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명에 따른 blue LED가 조사된 금창초 캘러스 추출물은 기존의 배양 조건인 dark 조건에서 배양한 금창초 캘러스보다 월등한 항염증 활성을 나타내는 것으로, 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물, 식품 조성물 또는 화장품 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 특정한 예시, 실험예 및 실시예를 통하여 상세하게 설명한다. 상기 특정한 예시, 실험예 및 실시예는 발명의 일부 구현예를 포함하는 것으로 모든 구현예를 포함하고 있지는 않다는 점에 유의해야 한다. 본 명세서에 의해 개시되는 발명의 내용은 여기에서 설명되는 특정 실시예로 제한되지 않고, 본 발명이 속한 기술 분야에 있어 통상의 기술자가 다양하게 구현할 수 있다는 것을 포함하는 것은 자명하다.
따라서 본 명세서에 개시된 발명의 내용은 여기에 기재된 특정 실시예로 제한되지 않으며, 이에 대한 변형 및 다른 구현예들도 청구범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
[실험예]
본 발명에 따른 부작용이 적고 무독성이며 고효율인 멜라닌 생성 촉진용 조성물의 제조 방법 및 상기 조성물의 특성 분석 방법을 세부적으로 설명하면 다음과 같다.
실험예
1. 식물 줄기세포 배양
본 연구에서 사용된 금창초(Ajuga decumbens, AD) 캘러스는 한국생명공학연구원 생물자원센터로부터 제공받았다. 효율적인 생장조절을 위해서 0.43% (w/v) murashige & skoog medium, 100 mg/L myo-inositol, 3% (w/v) sucrose, 0.4% (w/v) gelrite (Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands), 0.1 mg/L α-Naphthaleneacetic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)가 첨가된 배지를 사용하였다. 배지의 수분은 60±2% 내외로 조절한 후 30 g을 입병하여 한 달 주기로 계대배양 하였으며, 25±1℃, 습도 70% 조건의 LED incubator에서 2.10 ± 0.5 μmol/m2S의 광량으로 LED red(660 nm), LED blue(450 nm) 단색광을 처리하였다. 또한, 대조군으로 암배양 조건의 캘러스를 사용하였다.
이후 캘러스 1 g에 대하여 10 배수 증류수를 첨가하여 70 ℃, 6시간 조건으로 열수 추출하였고, 추출액은 paper filter (ADVANTEC, Tokyo, Japan)로 여과한 후 감압 농축하고 -110℃에서 동결건조하여 분말화하였다. Dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 용매로 사용하여 100mM stock을 제조하였고, 이후 Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM, Welgene, Gyeongsan, KOR)으로 희석하여 25, 50, and 100ug/ml 농도로 실험을 진행하였다.
실험예
2. 실험재료 및 세포배양
본 연구에서 사용된 LPS는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, RAW 264.7 세포는 한국세포주은행에서 분양 받아 10% fetal bovine serum (FBS)과 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin을 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, NY, USA)에 첨가한 배양액을 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였으며, 2일을 주기로 계대배양하였다.
실험예
3. Raw 264.7 세포 독성 평가
세포 독성 측정은 24-well plates에 RAW 264.7 세포를 8.0 Х 104 cells/well 만큼 분주하여 37℃, 5%, CO2 조건의 incubator 에서 24시간 전 배양한 후 시료와 LPS (1 μg/mL)를 동시 처리하고, 24시간 동안 배양하였다.
이후 MTT를 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 반응시킨 다음 상층액을 제거한 후 DMSO를 첨가하여 침전물을 용해시킨 후 96-well plates에 옮겨 담아 ELISA reader를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 군에 대한 평균 흡광도를 측정하였으며, 대조군의 흡광도 측정값과 비교하여 세포독성을 평가하였다.
실험예
4. NO 생성 억제 활성 측정
24-well plates에 RAW 264.7 세포를 8.0 Х 104 cells/well 만큼 분주하고 37℃, 5% CO2 조건의 incubator에서 24시간 전 배양 하였다. 이후 시료와 LPS (1 μg/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양한 후 상층액 100 μL와 Griess 시약 [1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphylethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid] 100 μL를 96-well plates에서 동량 혼합하여 10분간 암반 응 시킨 후 ELISA reader를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
실험예
5. Prostaglandin E
2
(PGE
2
) 생성 억제 활성 측정
24-well plates에 RAW 264.7 cell 8.0 Х 104 cells/well 만큼 분주하여 24시간 전 배양한 뒤, 시료와 LPS (1 μg/mL)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 배양 배지를 10,000 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 침전물을 제거한 뒤 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액에서 PGE2의 함량은 mouse enzyme-linked immnunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 측정하였다.
실험예
6. 전-염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 생성 억제 활성 측정
24-well plates에 RAW 264.7 세포를 8.0 Х 104 cells/well의 농도로 분주하여 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 전 배양한 후, 농도별 시료와 LPS (1 μg/mL)를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 이후 배양 배지를 원심분리 (10,000 rpm, 3 min) 하여 침전물을 제거하였고, 상등액을 회수하여 전-염증성 cytokine의 생성량을 측정하였다. 상등액에서의 전-염증성 cytokine 생성량은 Mouse TNF-α ELISA Kit (Invitrogen, California, USA), Mouse IL-6 ELISA Kit (BD Biosciences, California, USA), Mouse IL-1β ELISA Kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 측정하였다.
실험예 7. Western blot analysis
RAW 264.7 세포를 4.0 Х 105 cells/well 만큼 24시간 전 배양한 후 시료와 LPS (1 μg/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양하였다. 이후 세포를 PBS를 이용해 2회 세척하고 lysis buffer [1ХRIPA (Upstate Cell Signaling Solution, NY, USA), 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 μg/mL aprotinin, 1 μg/mL pepstatin, and 1 μg/mL leupeptin]를 이용해 1시간 동안 lysis 시킨 후 원심 분리하여 단백질 상층액을 분리하였다.
단백질 농도는 BCA kit (Bio-Rad, USA)를 사용하여 정량하였다. 정량한 단백질을 10%의 polyacrylamide gel에 전기영동하고 poly-vinylidene difluoride (PVDF) membrane (Milipore, Burlington, MA, USA)에 200mA, 2시간 동안 전이시켰다. 단백질이 전이된 membrane을 5% 탈지분유를 포함한 0.05% Tween 20/Tris-buffered saline (0.05% T/TBS)에 넣고 상온에서 1시간 blocking 시킨 후, 1차 항체와 반응시켰다. 1차 항체 반응은 iNOS antibody (1:5,000, Bio-Rad, USA), COX-2 antibody (1 : 1,000, Rockland Immunochemicals, Inc. USA), β-actin antibody clone AC-74 (1 : 10,000, Sigma, USA), phospho-ERK1/2 antibody, phospho-SAPK/JNK (Thr180/Tyr185) antibody, phospho-p38 antibody, IκB-α antibody, phospho-NF-κB antibody (1 : 1,000, Cell signaling Tech, Danvers, MA, USA)를 이용하여 4℃에서 하루 밤 동안 반응시킨 후 0.05% T/TBS 용액으로 3회 세척 후 2차 항체 (Jackson ImmunoResearch, USA)를 1 : 10,000으로 희석하여 상온에서 1시간 반응한 뒤 0.05% T/TBS 용액으로 3회 세척 하였다.
단백질은 ECL kit (Bio-Rad, USA)를 사용하여 imaging densitometer (model GS-700, Bio-rad, USA)를 통해 측정하였다. 또한, imageJ program (NIH, Bethesda, MD, USA)을 이용하여 β-actin 대비 iNOS와 COX-2, ERK1/2 대비 P-ERK1/2, JNK 대비 P- JNK 그리고 P38 대비 P-P38 단백질 발현량의 면적을 수치화한 뒤 그래프로 나타내었다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 본 발명의 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 이 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 세포독성 및 산화질소(Nitric Oxide, NO) 저해 활성 확인
본 발명에 따른 블루 LED가 조사된 금창초(Ajuga decumbens, AD) 캘러스 추출물이 세포독성 및 NO 저해 활성에 어떠한 효과를 가지는지 확인하였다.
이를 위해, 금창초(AD) 캘러스를 암배양(Dark, 대조군), red LED 660 nm 단색광, blue LED 450 nm 단색광 및 red+blue LED 조사 조건에서 배양하고, 각 금창초 캘러스의 열수 추출물을 얻었다.
LPS (1 μg/ml)로 자극된 RAW264.7 세포에 상기 제조된 각 금창초 캘러스 추출물을 0, 25, 50, 100 μg/ml로 농도로 처리하고, 세포 생존율 및 NO 활성을 조사하였다.
그 결과, 모든 추출물에서 90% 이상의 세포 생존율이 확인되었으며(도 1a), 모든 샘플 처리군 Dark, red LED, blue LED 및 red+blue LED에서 농도-의존적인 NO의 생성억제 활성을 확인하였다(도 1b). blue LED, red+blue LED, red LED, dark의 배양 조건에서 배양된 금창초 캘러스 추출물의 순으로 우수한 NO 억제 활성을 보였으며 특히, blue LED 100 μg/mL에서는 무처리군과 유사한 NO 생성 감소 활성을 나타내었다.
이에, 이후 실험은 LED 조건에서 배양한 캘러스 중에서 가장 높은 NO 저해 활성을 보인 'blue LED 조건에서 배양한 금창초 캘러스 추출물'의 항염 활성을 조사하였고, LED 조사가 캘러스의 항염 활성에 미치는 영향 알아보았다.
실시예 2. Prostaglandin E
2
(PGE
2
) 및 전-염증성 Cytokine의 생성 억제 활성 측정
blue LED 조건에서 배양한 금창초 캘러스 추출물의 항염 활성을 조사하였다. 먼저, 염증매개체로 알려진 PGE2 및 전-염증성 Cytokine인 IL-6, IL-1β 및 TNF-α 생성에 있어 상기 본 발명에 따른 금창초 캘러스 추출물의 효과를 테스트하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, blue LED 조건에서 배양한 금창초 캘러스 추추출물은 농도-의존적으로 염증매개체인 PGE 2 의 생성량을 감소시켰으며, 100 μg/mL 농도에서는 79% PGE 2 의 생성량 억제 활성을 나타냈다.
또한, 전-염증성 cytokine인 IL-6, IL-1β 및 TNF-α 생성에 있어서도, blue LED 처리하여 배양된 금창초 캘러스 추출물은 기존의 암배양 조건에서 배양된 금창초 캘러스 추출물보다 염증인자를 더 우수하게 억제하는 결과를 나타냈다(도 3). 특히, blue LED 처리된 금창초 추출물 50 μg/mL 또는 100 μg/mL 처리 시, 무처리군보다 우수한 IL-6 및 IL-1β 분비량 감소를 확인하였다.
상기 결과들은 본 발명에 따른 blue LED 조건에서 배양한 금창초 캘러스 추출물이 염증 매개체 생성을 저해하여 항염증 활성을 나타내는 것을 의미한다.
다음으로, NO 및 PGE2 의 생성량이 저해된 원인을 밝히기 위해서 상기 blue LED 조건에서 배양한 금창초 캘러스 추출물의 iNOS 및 COX-2 단백질 발현량 조절에 있어서의 영향을 확인하였다.
그 결과 도 4에서 보는 바와 같이, blue LED 조건에서 배양한 금창초 캘러스 추출물은 농도-의존적으로 iNOS 및 COX-2의 발현량을 감소시키는 것을 확인하였다.
즉, blue LED 조건에서 배양한 금창초 캘러스 추출물은 iNOS 및/또는 COX-2 단백질 발현량을 억제함으로써, 염증 매개체인 NO 및/또는 PGE2 의 생성량을 저해하고, 결과적으로 항염증 활성을 나타내는 것을 시사한다.
실시예 3. MAPKs 경로(pathway) 억제 활성 확인
항염활성을 평가하는 중요 경로(pathway) 중 하나인 mitogen-activated protein kinases (MAPK) 경로에서 본 발명에 따른 blue LED 조건에서 배양한 금창초 캘러스 추출물의 영향을 조사하였다.
그 결과 기존 암배양 조건에서 배양된 금창초 캘러스 추출물은 100 μg/mL 농도에서 ERK, JNK 및 p38 신호인자의 인산화를 각각 약 5%, 약 0% 및 약 20% 감소시켰을 뿐이다(도 5a-c).
반면, blue LED가 조사된 배양 조건에서 배양된 금창초 캘러스 추출물은 ERK, JNK 및 p38 신호인자의 인산화를 농도-의존적으로 현저하게 저해하였다(도 5a-c). 특히, 상기 추출물은 100 μg/mL 농도에서 ERK, JNK 및 p38 신호인자의 인산화를 약 30%, 약 40% 및 약 60% 감소시켜 대조군에 비해서 3배 내지 6배 이상의 현저한 감소 효과를 나타냈다.
이러한 결과는 본 발명에 따른 blue LED 조건에서 배양한 금창초 캘러스 추출물가 MAPK 신호 경로에 작용하여 우수한 함염활성을 가진다는 것을 나타낸다.
Claims (11)
- 블루 LED(blue LED)가 조사된 금창초 추출물을 유효성분으로 포함하는, 항염증용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 추출물은 blue LED 400nm 내지 500nm 단색광이 조사된 배양 조건에서 배양된 금창초 캘러스의 추출물인 것을 특징으로 하는, 항염증용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 PGE2 또는 전-염증성 사이토카인(Pro-inflammatory cytokine)을 억제하는 것을 특징으로 하는, 항염증용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 iNOS 또는 COX-2의 발현을 억제하거나, ERK, JNK 또는 p38의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 항염증용 조성물.
- 블루 LED(blue LED)가 조사된 금창초 추출물을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 염증성 질환은 염증성 장질환, 비알콜성 만성 간염, 만성 간염, 크론병, 췌장염, 식도염, 위염, 대장염, 궤양성 대장염, 폐렴, 기관지염, 인후염, 심근경색, 심부전, 관절염, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 신부전, 건선, 빈혈, 당뇨, 섬유화증, 다발성 경화증, 전신 홍반 루프스, 강직성 척추염, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 치주염, 신경병증 통증 및 특발성 염증성 근육병증으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는, 염증성 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물.
- 블루 LED(blue LED)가 조사된 금창초 추출물을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환을 예방 또는 개선하기 위한 식품 조성물.
- 블루 LED(blue LED)가 조사된 금창초 추출물을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환을 예방 또는 개선하기 위한 화장료 조성물.
- (a) blue LED 400nm 내지 500nm 단색광을 처리하는 조건에서 금창초 캘러스를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양된 캘러스에 증류수를 첨가하여 열수 추출하는 단계;를 포함하는, 블루 LED(blue LED)가 조사된 금창초 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제조하는 방법. - LED를 조사하여 식물의 캘러스를 배양하는 단계를 포함하는, 식물 줄기세포 배양 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 LED는 블루 LED, 레드 LED 또는 블루 + 레드 LED이거나, 상기 식물은 금창초인 것을 특징으로 하는, 식물 줄기세포 배양 방법.
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| KR100373928B1 (ko) | 2000-02-01 | 2003-02-26 | 권승룡 | 엑디스테로이드류와 이리도이드류를 함유하는 식물 추출조성물 및 그의 용도 |
| KR101523631B1 (ko) | 2013-06-28 | 2015-06-01 | 주식회사 에스테르 | 항염증 조성물 |
| KR101686994B1 (ko) | 2016-02-02 | 2016-12-16 | 주식회사 아이썸 | 한국의 야생초 추출물을 발효한 항염활성, 피부개선에 유용한 발효 추출물 및 이를 이용한 화장료 조성물 |
| KR102260735B1 (ko) | 2020-11-26 | 2021-06-07 | 주식회사 한국화장품제조 | 금창초 및 제주상사화 중 하나 이상의 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 이의 제조방법 |
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