KR20110075742A - 하수오 추출물, 대추 추출물 및 황촉규 추출물을 함유하는 피부보습용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하수오 추출물, 대추 추출물, 황촉규 추출물을 함유하는 항노화 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 하수오 추출물, 대추추출물 및 황촉규 추출물을 함유한 화장료 조성물이 SIRT-1 합성을 촉진시키고 뛰어난 항산화 효과를 가지며 피부 수분량을 상승시키고 표피의 수분증발을 억제시켜 피부 보습을 향상시키는 것이다.

하수오 추출물, 대추 추출물, 황촉규 추출물, 보습, 항산화, 화장료

Description

하수오 추출물, 대추 추출물 및 황촉규 추출물을 함유하는 피부보습용 화장료 조성물{Cosmetic composition containing Polygonum multiflorum extracts, jujube extracts and Hibiscus manihot extracts for moisturizing skin}

본 발명은 하수오 추출물, 대추 추출물, 황촉규 추출물을 함유하는 항노화 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 하수오 추출물, 대추추출물 및 황촉규 추출물을 함유한 화장료 조성물이 SIRT-1 합성을 촉진시키고 뛰어난 항산화 효과를 가지며 피부 수분량을 상승시키고 표피의 수분증발을 억제시켜 피부 보습을 향상시키는 것이다.

노화는 세포 복제와 관련하여 사람의 정상 체세포가 가지는 한정된 복제 수명 즉, 한정된 세포분열 후에 더 이상 세포 분열을 할 수 없는, 결국 역행할 수 없는 성장의 멈춤 단계를 노화로 정의한다 (Tominaga et al., Mech. Ageing Dev. 123: 927936 (2002)). 노화는 신경퇴화 질환, 암 또는 당뇨병등의 대사증후군 등의 질병과 관련이 있으며, 이러한 노화와 관련된 원인으로 유전학적 원인, DNA손상의 축적(Sedelnikova et al., Nat. CellBiol. 6: 168-170 (2004)), 산화적 스트레스에 대한 반응(Campisi et al., Exp. Gerontol. 36: 607-618 (2001)), 텔로미어의 손 상(Harrington and Robinson, Oncogene 21: 592-597 (2002))등이 알려져 있다.

특히, 끊임없이 생성되는 O₂ ^-, H₂O₂, ·OH와 같은 활성 산소종 (reactive oxygen species, ROS)이 노화과정에서 중요한 역할을 한다. 이러한 ROS는 미토콘드리아, 퍼옥시좀과 xanthine oxidase (XOD)를 포함하는 oxidase, NADPH dehydrogenase, cyclooxygenase (COX) 등의 다양한 효소들로부터 생성된다. 또한, Macrophage, Neutrophils과 다른 면역 세포들에서 NO, NO₂, HNO₂, ONOO^-와 같은 활성질소종 (reactive nitrogen species, RNS)들이 염증반응 시 이물질을 공격하기 위해 다량의 RNS와 ROS를 생성한다.

한편으로, 식이제한 (Calories Restriction, CR)은 노화를 지연시키고 수명을 연장시킬 뿐만 아니라, 노화와 관련된 질환의 발병을 감소시키는 것으로 보고되어 있다. 또한 식이제한은 스트레스에 대한 저항력을 증가시키며, 항상성 유지에 중요한 역할을 하며, 대사의 효율성을 증가시킨다. 최근에는 식이제한에 의한 동물 조직의 유전자 발현 프로파일 분석을 통하여, 식이제한이 산화적 스트레스 및 염증반응에 관련되는 유전자의 발현 조절에 중요한 영향을 미치고 있음이 확인되었다.

최근에는 특정 질병 또는 노화와 관련이 있는 유전자의 발현을 조절할 수 있는 물질을 개발함으로써 질병을 예방 또는 개선하는 물질 또는 노화방지 물질을 개발하는 방법이 제시되고 있다. 식이제한 상태에서 우리의 몸은 sirtuins 유전자를 발현시켜 항노화 작용을 일으킨다. 효모나 초파리같은 생물의 경우 Sir2 유전자 (sirtuin의 종류)가 과발현 되면 수명이 연장됨을 알 수 있었고 Sir2 유전자를 knockout 시키면 그 수명이 짧아지는 것으로 나타났다. 포유류에서는 SIRT1이라는 유전자로 몸속에 존재하며 이 SIRT-1은 히스톤과 비히스톤 단백질을 탈아세틸화하여 항염증, 항노화 작용을 한다고 알려져 있다(Milne JC et al., Nature. 450: 712-716 (2007)). SIRT1를 활성화 시키는 방법은 식이제한뿐만 아니라 레스베라트롤(Resveratrol)이라는 적포도주 껍질에 들어 있는 물질로도 SIRT-1이 활성화되어, 근래 각광받는 항노화 물질 혹은 과장하여 불로장생의 묘약으로 표현되고 있다(Milne JC et al., Nature. 450: 712-716 (2007)).

따라서 SIRT-1 유전자 등과 같이 특정 질환 또는 사람 개체의 수명과 밀접한 상관관계가 있는 유전자를 대상으로 이들 유전자의 발현을 조절할 수 있는 물질을 천연물로부터 개발하려는 요구가 증대되고 있다. 이러한 요구에 따라, SIRT1 유전자의 발현을 조절할 수 있는 천연식물 유래의 물질을 찾으려는 노력이 진행 중에 있다.

본 발명자들은 SIRT1 유전자의 발현을 조절할 수 있는 천연식물에 대한 연구를 지속한 결과 하수오 추출물과 대추 추출물, 황촉규 추출물이 SIRT-1 합성을 촉진시키고 뛰어난 항산화 효과와 피부 수분량을 상승시키고 표피의 수분증발을 억제시켜 피부 보습을 향상시킴을 발견하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 하수오 추출물, 대추 추출물, 황촉규 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부보습용 및 항산화용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 다음과 같은 수단을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 피부보습 증진용 화장료 조성물은 하수오 추출물, 대추 추출물 및 황촉규 추출물을 유효성분으로 함유한다.

본 발명의 다른 실시예에 따른 피부 주름 개선용 화장료 조성물은 하수오 추출물, 대추 추출물 및 황촉규 추출물을 유효성분으로 함유한다.

본 발명의 다른 실시예에 따른 항산화용 화장료 조성물은 하수오 추출물, 대추 추출물 및 황촉규 추출물을 유효성분으로 함유한다.

본 발명의 다른 실시예에 따른 sirt-1 단백질 발현 촉진용 화장료 조성물은 하수오 추출물, 대추 추출물 및 황촉규 추출물을 유효성분으로 함유한다.

상기 하수오 추출물, 대추 추출물, 황촉규 추출물은 조성물 총 중량에 대해 서 각각 0.01~20.0 중량%를 함유하는 것을 특징으로 한다.

상기 화장료 조성물은 화장수, 에센스, 로션, 크림, 팩, 젤, 연고, 패취, 또는 분무제의 제형을 갖는 것을 특징으로 한다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 하수오 추출물, 대추 추출물, 황촉규 추출물을 함유하여 뛰어난 SIRT-1 합성 촉진 및 항산화 효과를 가지고 있어 피부 노화를 효과적으로 방지하며 피부 수분량을 상승시키고 표피의 수분증발을 억제시켜 피부 보습을 향상시키고, SIRT-1 합성 촉진 및 항산화 효과를 가짐으로써 피부의 노화를 효과적으로 방지한다.

본 발명은 하수오 추출물, 대추 추출물, 황촉규 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 및 피부보습증진용 화장료 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명하다.

하수오(Polygonum multiflorum)는 중국에서 들어온 것으로 알려져 있으며 오랫동안 재배되고 있는 덩굴성 약용식물이다. 키는 3~4m에 이르며 뿌리는 옆으로 길게 뻗어 종종 덩이뿌리를 형성한다. 심장형의 잎은 길이가 약 3~6㎝, 너비가 2.5~4.5㎝ 정도로 어긋나며, 잎자루와 턱잎[托葉]이 있지만 가장자리에 톱니가 없다. 꽃은 8~9월에 원추(圓錐)꽃차례를 이루며 핀다. 꽃잎은 없고 꽃받침은 5장이다. 열매는 길이가 2.5㎜ 정도로 세모진 난형이고 윤기가 난다.

붉은빛을 띤 갈색 덩이뿌리를 한방에서 하수오라고 하며 하수오는 신장기능 을 튼튼하게 하여 정력을 높이고 머리카락을 검게 하며 병 없이 오래 살게 하는 약초로 이름이 높다.　 간장의 기능을 좋게 하여 피곤함을 없애고, 살결을 곱게 하며, 뼈와 근육을 튼튼하게 하고, 심장을 튼튼하게 하여 신경쇠약이나 불면증 같은 데에도 효과가 있다.　조혈 작용이 뛰어나 빈혈치료에도 좋고 여성의 생리불순, 자궁염, 만성변비 등에도 두루두루 널리 쓰인다.　또 하수오는　 노인들의 기력을 돋구는 데 매우 좋은 약이다. 신장기능을 좋게 하여 머리카락이　 희어지지 않게 하고 머리카락이 빠지지 않게 하며 오래 먹으면 노화를 예방한다. 중국 사람들은 하수오를 인삼, 구기자와 함께 3대 명약으로 여긴다.

본 발명에서 이용되는 대추는 식물분류학적으로 갈매 나무 과 대추나무속에 속하는 교목 성과수로서 중국계 대추(학명 Zizyphus jujuba Miller. 영명 Chinese jujube)와 인도계 대추(학명 Zizyphus mauritiana LA M. 영명 Indian jujube) 등이 있고 열매는 가을에 수확하며 적갈색, 타원형으로 길이 1.5㎝ 내지 2.5㎝에 달하며 빨갛게 익히면 단맛이 있다.

말린 대추의 주성분은 60%의 당질로서 과당이 주로 포함되어 있고 대추씨에는 5%의 단백질과 8%의 지질로 구성되어 있다. 대추 과실 가운데 가장 풍부하게 함유되어 있는 성분은 당질로 생과는 과중의 24 내지 31% 건과는 58 내지 65% 정도가 단당류와 다당류로 되어 있어서 일반과 종에 비하여 월등히 높다. 건조 대추의 수용성 추출액 가운데 당질의 성분을 분석한 결과 일본산과 중국산 대추가 주로 과당 포도당 올리고당으로 조성되어 83.4 내지 76.4%를 차지하고 있다. 아라비난 (Arabinan)과 갈락트로난(Galactronan)은 각각 소량씩 함유되어 있고 설탕은 중국 에서만 8% 정도 들어 있는데 일본산 대추에서는 전혀 검출되지 않았다. 또한, 약리적으로 중요한 작용을 하는 배당체(配糖體)의 구성성분이면서 대추에만 함유되어 있는 대추 당(zizyphoside)이 상당량 들어 있다.

대추의 신맛은 주로 사과산(malic acid)이며 소량의 타닌도 함유되어 있다. 대추는 비타민도 비교적 풍부하게 함유되어 있는데 건조 대추 100g중 비타민A 69 I.U, 비타민B1 0.23㎎ 비타민B2 0.57㎎ 비타민C 188 내지 544㎎ 비타민P 354 내지 888㎎ 정도이다. 그 밖에도 비타민B6 비타민K등도 풍부하게 함유되어 있다. 특히 비타민P 가운데는 루틴(Rutin)과 플라본(Flavone) 및 플라본 글리코사이드(Flavone glycoside)가 들어 있어서 약리효과가 높다. 사포닌(Saponin)도 대추의 주요 성분으로서 과실, 종자, 잎, 줄기, 뿌리 등 대추 전체에 골고루 함유되어 있다. 그 밖에도 과실에는 에피카테친(epicatechin) 로코시아니딘(leucocyanidin) 트리메칠로레진 산(trimethylolagic acid) 마스리닌 산(maslinic acid)의 쿠마로이레이트(comaroylate)일종인 베튜로닌 산(betulonic acid) 오레아노린 산(oleanolic acid) 마스린 산(maslinic acid) 쿠마로일마스린 산(comaroylmaslinic acid) 알피토린 산(alphitolic acid) 하이드록시우르소린 산(hydroxyursonic acid) 등이 있다. 예로부터 대추는 쇠약한 내장의 기능을 골고루 회복시키고 전신을 튼튼하게 해주는 것은 물론 신경을 안정시키고 노화를 방지하는 효과가 있다고 한다. 대추의 단맛은 긴장을 풀어주는 신경안정작용이 있기 때문에 밤에 잠을 못 자고 꿈을 많이 꾸는 사람이나 히스테리증상으로 화를 잘 내고 짜증을 자주 부리는 사람에게 좋다. 특히 신경이 예민한 수험생에게 대추 차를 꾸준히 마시게 하면 정신피로를 쉽게 풀 수 있을 뿐만 아니라 머리를 맑게 해주고 기억력을 증진시켜주는 효과를 볼 수 있다. 한방에서는 자양, 강장, 진해, 해독 등의 효능이 있어 기력부족, 전신통증, 불면증, 근육 경련, 약물중독 등에 쓴다.

본 발명에서 이용되는 황촉규(黃蜀葵;Hibiscus manihot)는 쌍떡잎식물 아욱목 아욱과의 한해살이풀로 닥풀이라고도 한다. 중국이 원산지이며 밭에서 재배한다. 전체에 털이 있고, 줄기는 둥근 기둥 모양이며 곧게 서고 가지를 치지 않으며 높이가 1∼1.5m이다. 잎은 어긋나고 잎자루가 길며, 잎몸은 손바닥 모양으로 5∼9개로 깊게 갈라진다. 갈라진 조각은 바소 모양 또는 거꾸로 선 바소 모양이고 가장자리에 거친 톱니가 있다. 턱잎은 바소 모양으로 가늘고 작다. 꽃은 8∼9월에 가운데 부분이 짙은 자주색을 띠는 노란 색으로 피고 줄기 끝에 총상꽃차례를 이루며 달린다. 꽃 밑에 있는 작은 포는 4∼5개로 넓은 바소 모양이다. 꽃의 지름은 10∼15cm이고, 화관은 종 모양이며, 꽃잎은 5개이고 서로 겹쳐지며 세로 맥이 있다. 수술은 여러 개의 수술대가 합쳐진 단체수술이며, 암술머리와 꽃받침은 5개로 갈라진다. 열매는 삭과이고 긴 타원 모양이며 5개의 모가 난 줄과 굳센 털이 있고 10월에 익는다. 뿌리는 점액이 많기 때문에 종이를 만드는 데 중요한 풀 감이 된다. 점액 내에 함유되어 있는 당류는 rhamnose, xylose, arabinose, glucose, galactose 그리고 3종의 uronic acid이다. 한방에서는 꽃을 황촉규화(黃蜀葵花), 뿌리를 황촉규근(黃蜀葵根), 종자를 황촉규자(黃蜀葵子)라는 약재로 쓴다. 황촉규화는 통증 때문에 소변을 잘 못 보는 증세를 치료하고 종기·악창·화상에 외용하며, 황촉규근은 임질·유즙 분비 부족·볼거리염·종기에 효과가 있고 이뇨 작용이 있으며. 황촉규 자는 소변을 잘 통하게 하고 유즙 분비를 촉진하며 타박상에 가루를 내어 술에 타서 마신다.

본 발명에 의한 하수오 추출물은 다음과 같이 제조할 수 있다.

하수오를 물로 깨끗이 세척한 후, 그늘에서 건조한다. 건조한 하수오를 추출용기에 넣고, 적당량의 추출 용매에 적절한 온도에서 일정 시간 추출한다. 추출물은 여과되고, 진공회전증발기 등을 이용하여 농축될 수 있다. 상기 추출 용매의 양은 생약 건조 중량의 2 ~ 10 배로 한다. 상기 추출 방법은 중탕 추출, 환류냉각 추출, 초음파 추출 등의 추출 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 중탕 추출의 추출방법으로 1회 내지 5회 추출될 수 있다. 상기 침적 온도는 30 ~ 70℃ 이며, 보다 바람직하게는 40 ~ 60℃이며, 가장 바람직하게는 50℃ 정도로 유지하는 것이 부패, 변색 및 변취의 예방에 가장 효과적이다. 상기 침적 시간은 5 ~ 20 시간이며, 바람직하게는 10 시간이다. 상기 하수오 추출물을 수득한 후, 거름종이 등을 이용하여 고형분을 제거하고, 현탁액을 원심분리 시키고, 상층액을 감압여과할 수 있다. 상기 여과된 추출물을 진공회전농축기로 20 ~ 100℃, 바람직하게는 50 ~ 70℃에서 감압농축할 수 있다.

본 발명의 대추 추출물은 다음과 같이 제조할 수 있다. 먼저, 대추 추출물은 대추에 물을 일정량 첨가한 후 환류장치하에서 약 30 분 내지 12 시간 동안 끓이면서 추출한 후 여과하여 그 여액을 취하고 물을 첨가하여 총량을 조정한 다음, 조정액을 저온에서 1 내지 12일 간 방치하여 생성된 침전물들을 막여과를 실시함으로써 대추추출물을 수득할 수 있다.

본 발명에서 이용되는 황촉규 추출물은 바람직하게는 황촉규근으로부터 추출, 분리한 점액질에 관한 것으로, 황촉규근으로부터 점액질을 추출, 분리하는 제조방법은 다음과 같다. 먼저, 황촉규근을 건조한 후 건조한 황촉규근에 대해 5∼30배 부피량의 추출용매를 가한다. 추출용매는 물, 인산 완충용액, 탄산나트륨 수용액, 글리세린, 에틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매를 사용한다. 이어서, 용매가 증발되는 것을 방지하기 위해 냉각 콘덴서를 구비한 추출기에서 30∼70℃, 4∼48시간 가열하여 추출하거나 5∼37℃에서 1∼15일간 침적시켜 유효성분을 추출한 후, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 및 아세톤으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매에 침전시켜 제조한다.

한편, 본 발명의 추출물은 상기한 추출 용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 생약 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.

또한, 본 발명의 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 추출물에 포함되는 것이다.

본 발명의 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 피부 노화 방지 효능을 갖는 화장료 조성물은 그 제형에 있 어서 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 화장수, 에센스, 크림, 팩, 젤, 로션, 연고, 패치 또는 분무제 등의 제형으로 제조될 수 있다.　상기 제형에 있어서 추출물의 함량은 조성물의 총 중량에 대하여 각각 0.01 내지 20 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 10 중량%로 함유될 수 있다. 혼합물의 함량은 총 중량에 대하여 0.01 중량% 미만일 경우에는 본 발명에서 목적하는 효과를 기대하기가 힘들며, 20 중량% 이상일 경우에는 제형 안정성에 문제가 생길 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[제조예 1]하수오 추출물의 제조

본 실시예의 하수오는 우리나라에서 채취한 것을 사용하였다.

채취한 식물 50 g을 100% 에탄올 200ml에 침지시켜 50℃ 수욕조에서 10시간 동안 온탕 하였다.　얻어진 추출액을 실온으로 냉각시키고 거름종이로 여과하여 여과액을 취하였다.　질소를 사용하여 여과액에서 에탄올을 증발시켜 농축한 다음, 이를 10% 에탄올에 녹여 추출물을 제조하였다.

[제조예 2]대추 추출물의 제조

대추 건조중량 50 g에 추출 용매로서 물을 10 ~ 20 배 부피량 가하였다.　이를 70℃에서 1시간 가량 가열하였다.　이어, 여과한 후 상온에서 식힌 다음 4℃에서 7일간 저온 숙성시킨 다음 여과하여 사용하였다.

[제조예 3]황촉규 추출물

채취한 황촉규근을 이물질이 없이 잘 세척한 후에 통풍이 되는 음지에서 반건조를 시킨 후 세절한 황촉규근 1kg에 정제수 10kg을 넣고, 상온에서 3일간 침적추출한 후 400 메쉬 여과포로 여과한 후 여액을 3000rpm으로 원심분리 시켜 불순물을 제거한 상층액을 취하여 동결건조시켜 고형분을 얻었다. 이 고형분에 에탄올 1kg을 가하여 천천히 교반하면서 고형분에 존재하는 점액성분 이외의 물질 및 색소물질을 제거한 후 1㎛필터로 여과, 건조하여 고형분을 얻었다. 고형분 1kg에 정제수 9.0kg을 가하여 교반기로 교반하고 용해시켜 황촉규근 추출 고형분을 10 중량% 함유하는 황촉규근 추출물을 얻었다.

[실험예 1]섬유아세포 증식 효과

하수오 추출물이 섬유아세포 증식에 미치는 효과를 알아보기 위하여 인체 정상 섬유아세포(한국세포주은행)를 96-웰 마이크로 플레이트(96-well microplate)의 각 웰에 1 x 10⁴ 세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지(Dulbecco‘s modified eagle medium, 시그마 사)에서 24시간 동안 37℃에서 배양하였다.　이어, 상기 하수오 추출물이 50 ~ 500㎍/㎖로 포함된 혈청이 없는 DMEM 배지로 교체한 실험군과 하수오 추출물이 포함되지 않은 혈청이 없는 DMEM 배지로 교체한 대조군을 24시간 동안 추가로 배양하였다.　그런 다음, MTT 용액(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일) 2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드: 5 mg/㎖)을 각각 10 ㎕씩 첨가하고, 4시간 동안 배양한 후, 배지를 제거하고, 각 웰 당 100 ㎕의 DMSO 용액을 가하여 20분 동안 진탕 시키고, 마 이크로 플레이트 판독기 (microplate reader, Molecular Devices, 미합중국)를 이용하여 570 nm에서 상층액의 흡광도를 측정하였다.　측정값을 하기의 수학식 1에 대입하여 세포 증식 효과를 산출하고, 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다

세포증식효과 (%) = [(실험군 흡광도 - 대조군의 흡광도)/대조군의 흡광도] x 100

하수오 추출물 (㎍/㎖)	세포증식효과(%)
대조군	-
50	17.2
100	31.5
200	50.8
300	62.8
500	69.0

상기 표 1에서 알 수 있듯이, 하수오 추출물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여, 하수오 추출물이 처리된 실험군의 경우 매우 높은 섬유아세포 증식 효과를 나타낸다.

[실험예 2]하수오, 대추, 황촉규 추출물의 Sirt-1 단백질 발현 조사

상기 하수오, 대추, 황촉규 추출물에 대하여 하기 방법에 따라 Sirt-1 단백질 발현 량을 웨스턴 블롯(Western blot)으로 측정하였다. 4~8계대의 인간 섬유아세포(Fibroblast)와 20~30 계대의 인간 섬유아세포를 60 mm 배양접시에 1 x 10⁶의 밀도로 10% 소혈청(Gibco/BRL)을 포함하는 DMEM 배지(Sigma)로 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 하루 동안 키웠다. 그 후 혈청이 없는 배지로 교환해 주고 시료를 0.5, 1.0% 농도로 첨가하여 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그 후, 세포 배양액을 농축필터 밀리포어(Millipore)를 사용하여 단백질을 농축 후 BCA 방법 (시그마(Sigma))에 따라 단백질 정량 하여 웨스턴 블로팅(western blotting)에 사용하였다. 7% 세퍼레이팅 젤(separating gel)과 5% 스테킹 젤(staking gel)로 구성된 SDS-PAGE 젤(gel)에 같은 양의 단백질을 전기영동하고 쎄미-드라이 트랜스퍼(semi-dry transfer) 장치(Biorad)를 사용하여 전기영동 한 단백질을 PVDF 멤브레인(membrane)으로 옮긴 후 일차항체 Anti-SIRT-1 항체를 처리하고 반응이 끝난 다음 HRP가 컨쥬게이트된 이차 항체를 처리하고 ECL (enhanced chemiluminescence, Intron) 반응 후 엑스-레이(X-ray) 필름에 감광시켜 확인하였다. Sirt-1단백질 발현 량은 필름에 감광된 밴드를 이미지 분석기(Image analyzer, Biorad)로 정량 하여 그 실험 결과를 표 2에 나타내었으며, 대조군으로는 1.2mM CaCl₂를 이용하였다.

시료	sirt-1 단백질 합성량 (%)
	Young fibroblasts	Aged fibroblasts
무처리군	100	76
1.2mM CaCl2	141	111
0.5% 하수오 추출물	112	95
1.0% 하수오 추출물	135	107
0.5% 대추 추출물	108	84
1.0% 대추 추출물	119	93
0.5% 황촉규 추출물	103	81
1.0% 황촉규 추출물	110	86

상기 실험예 2의 결과에서 보듯이, 하수오, 대추, 황촉규 추출물 모두 sirt-1 단백질 합성을 증가시키는 것으로 나타났다. 특히, 하수오 추출물 1.0% 처리 시 sirt-1 단백질 합성 증가율은 젊은 섬유아세포와 노화된 섬유아세포에서 각각 35%, 41%로 젊은 섬유아세포보다 노화된 섬유아세포에서 sirt-1 단백질이 더 많이 발현되는 것으로 나타났다. 대추와 황촉규 추출물에서도 젊은 섬유아세포보다 노화된 섬유아세포에서 sirt-1 단백질 합성 증가율이 더 높은 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 추출물들이 sirt-1 단백질 발현을 효과적으로 활성화 시키는 것으로 나타났다.

[실험예 3] 항산화 효과

본 발명의 제조예에 따라 얻어진 하수오, 대추, 황촉규 추출물의 항산화 효과를 알아보기 위하여 자유라디칼 소거활성 실험(Free Radical Scavenging Activity Test)을 실시하였다.　자유라디칼 소거활성 실험은 Kim 등(Kor. J. Pharmacogn., 24(4), 299-303(1993)) 의 방법을 변형한 것으로써, 안정한 자유라디칼인 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl, 시그마 사) 시약을 사용하였다.　0.2mM DPPH 용액(Blank인 경우는 에탄올) 150 ㎕에 상기 추출물을 다양한 농도로 제작하여, 이들을 각각 150 ㎕ 첨가하여 혼합하고, 실온에서 30분간 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하는 실험군을 설정하였으며, 이에 대한 대조군으로는 정제수를 이용한 경우로 설정하였다.　상기 실험군과 대조군에 대한 흡광도 측정 후, 하기 수학식 2를 이용하여 자유라디칼 소거활성 효과를 구하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

자유라디칼소거효과 (%) = 100 - [(실험군 흡광도 - Blank 흡광도)/대조군의 흡광도] x 100

농도 (㎍/㎖)	자유라디칼소거효과(%)
	하수오 추출물	대추 추출물	황촉규 추출물
100	50.8	17.3	15.3
200	82.1	35.1	30.6

상기 표 3에 나타낸 결과를 통해 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 하수오, 대추, 황촉규 추출물 모두 항산화 효과를 가지고 있으며 특히, 하수오 추출물의 자유라디칼 소거능력이 매우 탁월함을 확인할 수 있었다.

[제조예 4]실시예 및 비교예

상기 본 발명의 구성에 따라 다음 표와 같은 조성의 화장료를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
	실시예	비교예1	비교예2	비교예3	비교예4
바셀린	7.0	7.0	7.0	7.0	7.0
유동파라핀	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
밀납	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
폴리솔베이트-60	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
솔비탄세스퀴올레이트	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
스쿠알란	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
프로필렌글리콜	6.0	6.0	6.0	6.0	6.0
글리세린	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0
트리엔탄올아민	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
카르복시비닐폴리머	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
토코페롤아세테이트	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
정제수	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100
하수오추출물	1.0	3.0	-	-	-
대추추출물	1.0	-	3.0	-	-
황촉규추출물	1.0	-	-	3.0	-
향, 방부제	미량	미량	미량	미량	미량

[실험예 4] 보습 효과

상기 실시예 및 비교예 1~4에서 제조된 각 화장료의 보습력을 평가하기 위하여, 각 화장료가 도포된 피부를 대상으로 하여 수분 보유능 및 수분 증발량을 다음과 같이 측정하였다.

실험예 4-1: 수분 보유 능의 측정

수분 보유능 측정은 Corneometer (Courage + Khazaka, GmbH, Germany)를 사용하여 피부 표면의 전기 전도도를 측정하였으며, 측정온도는 22℃, 45% 상대습도를 유지하는 항온항습실에서 실시예 및 비교예 1~4에서 제조된 각 화장료를 30명의 피시험자 하박 안쪽에 일정량 (0.03g/16cm²)을 도포하고 도포 전, 도포 1시간 후 및 도포 2시간 후의 피부의 수분함량을 측정하였으며, 아무런 처리를 하지 않은 정상 피부를 대조군으로 사용하였다. 그 결과는 다음 표 5에 나타내었다.

구분	실시예	비교예 1	비교예 2	비교예 3	대조예
도포 전 피부 전기전도도	50	50	50	50	50
도포 1시간 후 피부 전기전도도	88	56	71	75	50
도포 2시간 후 피부 전기전도도	80	52	60	65	50

실험예 4-2: 수분 증발량의 측정

팔의 상박 부위에 테이프 스트리핑 (tape stripping)을 실시하여 피부의 방어막을 약화시킨 후, 22℃ 및 상대습도 45%의 항온 항습실에서 상기 실시예 및 비교예 1~4에서 제조된 각 화장료를 30명의 피시험자 하박 안쪽에 일정량 (0.03g/16㎠)을 도포한 후, 수분증발량기(Tewameter TM300, Courage + Khazaka사, 독일연방국)를 이용하여 12 시간마다 1분 간격으로 5회씩 수분 증발량을 측정하여 평균값을 구하였으며, 아무런 처리를 하지 않은 정상 피부를 대조군으로 사용하였다.　그 결과는 하기 표 6에 나타내었다.

구　분	실시예 (%)	비교예 1 (%)	비교예 2 (%)	비교예 3 (%)	대조예 4(%)
0시간 후　수분 증발량	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0
12시간 후 수분 증발량	74.8	90.1	87.3	82.5	92.0
24시간 후 수분 증발량	58.1	82.3	74.5	67.4	84.0
36시간 후 수분 증발량	40.1	74.7	63.9	56.7	77.6
48시간 후 수분 증발량	30.3	67.1	55.2	43.1	70.2

상기 실험예 4-1 및 4-2의 결과에서 보듯이, 황촉규 추출물을 함유한 비교예 3과 대추 추출물을 함유한 비교예 2의 화장료에서 우수한 보습효과를 나타내었다. 반면, 하수오 추출물의 보습효과는 매우 낮은 것으로 나타났다. 또한 실시예의 경우 가장 높은 보습효과를 나타내었다.

[실험예 5]피부주름 개선 효과

본 발명의 하수오, 대추, 황촉규 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 피부주름 개선 효과를 건강한 35세에서 50세의 여성 50명을 대상으로 측정하였다. 먼저 다섯 그룹으로 나누고, A 그룹에는 실시예를, B 그룹에는 비교예 1를, C 그룹에는 비교예 2를, D 그룹에는 비교예 3을, E 그룹에는 비교예 4의 제형을 눈가를 중심으로 하루 2회씩 (아침 및 저녁) 3개월간 도포하였다. 3개월 후 주름의 개선 정도를 피험자의 설문 및 주름의 영상 분석을 통해 평가하였다.

피험자의 설문은 사용전과 비교하여 개선 없음, 약간의 개선, 중등도의 개선, 상당한 개선의 4단계로 판단하였으며 결과는 표 7에 나타내었다.

주름의 영상분석에 의한 평가는 실험이 시작되기 전 눈 밑의 레플리카를 채취하고 실험이 종료된 직후의 레플리카를 눈 밑의 동일 부위에서 채취하여 영상분석을 통해 주름의 2차원적 분석으로 주름의 밀도를 측정하였다. 영상분석에 의한 주름 밀도의 측정 결과는 사용 전에 대한 주름 밀도에 대한 감소율로 표 8에 나타내었다.

시료	개선 없음	약간의 개선	중등도의 개선	상당한 개선
실시예	-	2	4	4
비교예 1	1	3	4	2
비교예 2	4	3	2	1
비교예 3	4	4	1	1
비교예 4	9	1	-	-

시료	주름 밀도 감소율 (%)
실시예	32.5
비교예 1	21.9
비교예 2	12.3
비교예 3	10.2
비교예 4	1.5

표 7, 8의 결과에서와 같이, 하수오 추출물을 단독으로 처리한 비교예 2보다 하수오 추출물과 대추, 황촉규 추출물을 동시에 함유한 실시예가 더 우수한 피부 주름 개선 효과를 나타내었다.

[실험예 6]피부탄력효과

본 발명의 하수오, 대추, 황촉규 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 피부 탄력 증진효과를 측정하였다. 20세 이상의 건강한 여성 50명(평균연령 37세)을 다섯 그룹으로 나누고, A 그룹에는 실시예를, B 그룹에는 비교예 1를, C 그룹에는 비교예 2를, D 그룹에는 비교예 3을, E 그룹에는 비교예 4의 제형을 눈가를 중심으로 하루 2회씩(아침 및 저녁) 12주간 도포한 후, 피부탄력 측정기(Cutometer MPA580, Courage + Khazaka사, 독일연방국)를 이용하여 온도 24-26℃, 습도 75의 조건에서 피부탄력을 측정하였다.　시험결과는 cutometer MPA580의 R5(R5(12주)-R5(0주)) 값으로 기재하였는데, R5 값은 순수탄성도 (Net elasticity)의 성질을 나타내며, 1에 가까울수록 탄력도가 우수함을 나타낸다. 결과는 하기 표 9에 기재되어 있다.

실험 제형	피부탄력효과
실시예	0.15
비교예 1	0.10
비교예 2	0.03
비교예 3	0.03
비교예 4	0.01

표 9의 결과에서와 같이, 하수오 추출물과 대추, 황촉규 추출물을 동시에 함유한 실시예의 피부탄력 효과가 하수오 추출물만을 사용했을 때보다 약 1.5배 높음을 확인할 수 있었다.

[실험예 7] 제형의 안정성 시험

상기 본 발명의 하수오, 대추, 황촉규 추출물을 함유한 화장료에 대한 안정성 시험을 하기의 방법으로 실시하였다.

화장료의 안정성을 시험하기 위해 상기 실시예 및 비교예 1~4를 45℃로 일정하게 유지되는 항온조에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관하고 또한 4℃로 일정하게 유지되는 완전히 차광된 냉장고 내에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관한 후, 변색 및 변취, 분리 정도를 비교 측정하였다.　그 결과는 하기 표 10에 정리되어 있다.　이 때 제품 변색 및 변취, 분리 정도를 다음의 6등급으로 분류하여 평가하였다: 0: 변화 없음; 1: 극히 조금 분리(변색); 2: 조금 분리(변색);　3: 조금 심하게 분리(변색); 4: 심하게 분리(변색); 및 5: 극히 심하게 분리(변색).

구 분	제형의 안정성
	실시예		비교예 1		비교예 2		비교예 3		비교예 4
	45℃	4℃	45℃	4℃	45℃	4℃	45℃	4℃	45℃	4℃
변색	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
변취	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
분리	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0

표 10에서 알 수 있는 바와 같이, 실시예와 비교예 1~4는 45℃에서 변색이나 변취, 분리 현상이 거의 없이 안정하였고 이는 하수오, 대추, 황촉규 추출물이 제형내에서 안정한 상태로 존재함을 나타낸다.

이하 상기한 실험예의 결과를 근거로 하여 본 발명의 하수오, 대추, 황촉규 추출물을 함유하는 화장료를 조성하여 제시한다.　그러나, 본 발명의 조성물을 하기의 제형예들로 한정하고자 하는 것은 아니다.

제형예 1: 유연화장수(스킨로션)

하기 표에 나타난 바와 같이 유연화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

배합 성분	함량 (중량%)
하수오 추출물	0.5
대추 추출물	0.5
황촉규 추출물	0.5
1.3-부틸렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
올레일알코올	0.1
폴리솔베이트 20	0.5
에탄올	15.0
벤조페논-9	0.05
향, 방부제	미량
정제수	to 100

제형예 2. 영양화장수(밀크로션)

하기 표에 나타난 바와 같이 영양화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

배합 성분	함량 (중량%)
하수오 추출물	1.0
대추 추출물	1.0
황촉규 추출물	1.0
프로필렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
트리에탄올아민	1.2
토코페닐아세테이트	3.0
유동파라핀	5.0
스쿠알란	3.0
마카다이아너트오일	2.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	1.0
카르복시비닐 폴리머	1.0
비에치티이	0.01
EDTA-2Na	0.01
향, 방부제	미량
정제수	to 100

제형예 3. 영양크림

하기 표에 나타난 바와 같이 영양크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

배합 성분	함량 (중량%)
하수오 추출물	2.0
대추 추출물	1.0
황촉규 추출물	1.0
세토스테아릴알콜	2.0
글리세릴스테아레이트	1.5
트리옥타노인	5.0
폴리솔베이트 60	1.2
솔비탄스테아레이트	0.5
스쿠알란	5.0
유동 파라핀	3.0
싸이클로메치콘	3.0
비에이치티이	0.05
델타-토코페롤	0.2
농글리세린	4.0
1,3-부틸렌글리콜	2.0
산타검	0.1
EDTA-2Na	0.05
향, 방부제	미량
정제수	to 100

제형예 4. 마사지크림

하기 표에 나타난 바와 같이 마사지크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

배합 성분	함량 (중량%)
하수오 추출물	0.5
대추 추출물	0.5
황촉규 추출물	0.5
프로필렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
트리에탄올아민	0.5
밀납	2.0
토코페릴아세테이트	0.1
폴리솔베이트 60	3.0
솔비탄세스퀴올레이트	2.5
세테아릴알코올	2.0
유동파라핀	30.0
카르복시비닐폴리머	0.5
향, 방부제	미량
정제수	to 100

제형예 5. 팩

하기 표에 나타난 바와 같이 팩을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

배합 성분	함량 (중량%)
하수오 추출물	1.0
대추 추출물	1.0
황촉규 추출물	1.0
프로필렌글리콜	2.0
글리세린	4.0
카르복시비닐 폴리머	0.3
에탄올	7.0
피이지-40 히드로게네이티드 캐스터 오일	0.8
트리에탄올아민	0.3
비에치티이	0.01
EDTA-2Na	0.01
향, 방부제	미량
정제수	to 100

Claims (6)

1. 하수오 추출물, 대추 추출물 및 황촉규 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보습 증진용 화장료 조성물.
2. 하수오 추출물, 대추 추출물 및 황촉규 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
3. 하수오 추출물, 대추 추출물 및 황촉규 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 화장료 조성물.
4. 하수오 추출물, 대추 추출물 및 황촉규 추출물을 유효성분으로 함유하는 sirt-1 단백질 발현 촉진용 화장료 조성물.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 하수오 추출물, 대추 추출물, 황촉규 추출물은 조성물 총 중량에 대해서 각각 0.01~20.0 중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 화장수, 에센스, 로션, 크림, 팩, 젤, 연고, 패취, 또는 분무제의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.