KR101949430B1 - 번행초 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 및 항노화용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 번행초(Demidovia tetragonoides Pall)의 플로럴워터(floral water), 추출물 또는 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 염증 반응의 지표인 일산화질소(NO), 프로스타글란딘(PGE2), 사이토카인(IL-1β 및 IL-6), iNOS 및 COX-2의 생성이 효과적으로 억제됨을 확인하여, 번행초의 플로럴워터(floral water), 추출물 또는 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

번행초 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 및 항노화용 조성물{COMPOSITION FOR ANTIINFLAMMATORY AND ANTIAGING COMPRISING TETRAGONIA TETRAGONOIDES EXTRACT}
본 발명은 번행초(Demidovia tetragonoides Pall)추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 및 항노화용 약학적 조성물에 관한 것이다.
염증반응(inflammation)은 생체 또는 조직에 물리적 작용, 화학적 물질, 세균감염 등의 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려는 기전이다. 일단 자극이 가해지면 국소적으로 히스타민(histamine), 세로토닌(serotonine), 브라디키닌(bradykinin), 프로스타글란딘(prostaglandins), 히드록실-에이코사테라에노익 산(hydroxyl-eicosatetraenoic acid, HETE) 및 류코트리엔(leukotriene)과 같은 혈관 활성물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 단핵포식세포(mononuclear phagocytes), 대식세포(macrophage), 호중구(neutrophil), 자연살해세포(NK cell)가 손상부위로 침윤되어 염증을 유발하게 된다.
이중 대식세포 등에서는 리포폴리사카라이드(LPS: Lipopolysaccharide) 같은 외인성 세균 내독소에 반응하여 종양괴사인자-α(TNF-α), 인터류킨(IL)-1β 및 인터류킨(IL)-6등의 염증성 사이토카인을 생산하기도 하며(Berenbaum, 2000; Karpurapu et al., Blood 118:52555266, 2011), 일련의 면역 반응을 통해 자극되는 유도성 산화질소 합성효소(iNOS)에 의해 생성되는 염증성 분자인, 산화질소(NO)를 통해서 다양한 염증성 질환을 일으키기도 한다(McCartney-Francis et al.,J. Exp. Med. 178, 749754, 1993; Szabo et al., New Horiz. 3, 232, 1995). 또한 염증 반응의 마커로써, 시클로옥시게나제-2(COX-2) 효소에 의해 합성되는 프로스타글라딘 E2(PGE2)이 발열과 통증 같은 염증 증상의 중요한 매개체로 작용하여, 종합적인 면역 반응을 조절하므로(Samuelsson et al., Pharmacol. Rev. 59:207224, 2007; Simmons et al., Pharmacol. Rev. 56:387437, 2004), 이들 염증성 매개체의 생산 억제 및 조절 방식은 다양한 염증질환의 치료에 유용한 방법이 될 수 있다.
번행초(Demidovia tetragonoides Pall 또는 Tetragonia tetragonoides , T. tetragonoides)는 갯상추 또는 뉴질랜드 시금치로도 불리는 석류풀과(Aizoaceae)에 속하는 다년생 풀로, 뉴질랜드, 중국, 일본, 남아시아, 오스트레일리아, 남아메리카 등지에도 분포하고 있고, 생명력이 강하여 자갈밭이나 바위틈 등 몹시 척박하고 물기가 없는 곳에서도 잘 자라며, 우리나라 남부지방 및 제주도의 바닷가 모래땅에서 군락지를 형성하고 있다. 옛날 우리나라에서는 번행초를‘바다의 상추’라고 할 정도로 귀하게 여긴 약초이며, 번행초는 생채를 샐러드해서 먹거나 데쳐서 나물로 식용할 수 있다. 또한 산에서 나는 약초인‘삽주뿌리, 나무인‘예덕나무’와 함께, 위장을 튼튼하게 하는‘3대 약초’로 알려져 왔다. 번행초의 이러한 알려진 효능 덕분에 최근 위암, 위염, 위궤양, 위산과다, 소화불량 등 갖가지 위장병에 치료 및 예방 효과가 높은 식물로 한방에서 귀한 약재로 취급받고 있다.
번행초에 대한 효능은 항암, 청열, 해독, 부종, 패혈증, 풍열, 장염, 항궤양 등이 있으며, 현재까지 번행초에서 분리된 성분은 베타 카로틴(β-carotene), 디테르페노이드(diterpene), 플라본(flavone), 세레브로사이드(cerebrosides), 올릭산(oxilic acid), 스테릴글루코시드(sterylglucoside)와 폴리사카라이드(polysaccharide) 등이 보고된 바 있으며, 페닐 프로판 타입(phenyl propane type)으로는 페룰산(ferulic acid), 트랜스페룰산(transferulic acid), p-메톡시 계피산(p-methoxy cinnamic acid), 4-메톡시 계피산(4'-methoxy cinnamic acid), 트랜스 이소페룰산(trans isoferulic acid) 등이 알려져 있으나, 현재까지 국내 자생 번행초의 활성 성분의 분리 및 분석에 관한 연구가 활발하지 못한 상황이고, 항염증 효과를 통한 기능성 천연 원료로서의 연구는 아직 미비한 실정이다.
이에 본 발명자들은, 본 발명의 번행초(Demidovia tetragonoides Pall)의 플로럴워터(floral water) 또는 추출물의 발효물이 상기 염증반응 마커들의 발현 또는 활성을 억제하여 항염증 효능을 가짐을 확인하여, 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로써 유용하게 이용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 번행초(Demidovia tetragonoides Pall)의 플로럴워터(floral water), 추출물 또는 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 번행초(Demidovia tetragonoides Pall)의 플로럴워터(floral water), 추출물 또는 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 번행초(Demidovia tetragonoides Pall)의 플로럴워터(floral water), 추출물 또는 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 개선용 건강기능식품을 제공한다.
아울러, 본 발명은 번행초(Demidovia tetragonoides Pall)의 플로럴워터(floral water), 추출물 또는 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 번행초(Demidovia tetragonoides Pall)의 플로럴워터(floral water), 추출물 또는 추출물의 발효물을 세포에 처리하였을 때, 염증 반응의 지표인 일산화질소(NO), 프로스타글란딘(PGE2), 사이토카인(IL-1β 및 IL-6), iNOS 및 COX-2의 생성이 효과적으로 억제됨을 확인하여, 본 발명의 번행초의 플로럴워터, 추출물 또는 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 번행초의 플로럴워터(floral water: 하이드로졸(hydrosol)) 및 번행초 추출물의 발효물을 얻기 위한 추출 공정을 나타낸 도이다.
도 2는 번행초 플로럴워터(floral water)의 세포독성 효과를 나타낸 도이다.
도 3은 번행초 플로럴워터(floral water)의 일산화질소(NO) 생성 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 4는 번행초 플로럴워터(floral water)의 프로스타글란딘(PGE2) 생성 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 5는 번행초 플로럴워터(floral water)의 사이토카인(IL-1β 및 IL-6) 생성 억제 효과를 나타낸 도이다:
A: 사이토카인(IL-1β) 억제효과; 및
B: 사이토카인(IL-6) 억제효과.
도 6은 번행초 플로럴워터(floral water)의 iNOS 및 COX-2 생성 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 7은 번행초 추출물 발효물의 세포독성 효과를 나타낸 도이다.
도 8은 번행초 추출물 발효물의 일산화질소(NO)의 생성 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 9는 번행초 추출물 발효물의 라디칼(radical) 포집 활성능력(scavenging activity)을 측정한 도이다:
A: DPPH 라디칼 포집활성;
B: 알킬 라디칼 포집활성;
C: 히드록실 라디칼 포집활성; 및
D: 번행초 추출물 발효물 및 (열수)추출물에서의 각 라디칼(radical)들의 포집활성 IC50 값.
도 10은 번행초 추출물 발효물 및 플로럴워터(floral water)의 동시 처리에 따른 일산화질소(NO)의 생성 억제 효과를 나타낸 도이다:
A: 번행초의 추출물 발효물(50 ㎍/ml)과 0.5%의 플로럴워터(floral water)를 사용한 조건; 및
B: 번행초의 추출물 발효물(50 ㎍/ml)과 1%의 플로럴워터(floral water)를 사용한 조건.
도 11은 번행초 추출물 발효물의 세포 노화 억제 효능을 알아보기 위해 베타-갈락토시다아제(SA-β-gal)의 발현량 차이를 나타낸 도이다:
A: 각 처리 조건별 베타-갈락토시다아제(SA-β-gal)의 발현량 차이를 보여주는 광학 현미경 사진; 및
B: 각 처리 조건별 베타-갈락토시다아제(SA-β-gal)의 발현 세포의 차이를 나타낸 표.
도 12는 번행초 추출물 발효물의 활성산소종(ROS)의 발생 억제 효과를 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 번행초(Demidovia tetragonoides Pall)의 플로럴워터(floral water), 추출물 또는 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 추출물은 번행초의 열수 추출물인 것인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 추출물의 발효물은 락토바실러스(LactoBacillus bravis) 발효균에 의한 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 조성물은 일산화질소(NO) 또는 프로스타글란딘(PGE2)의 생성을 억제하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지는 않으며, 인터류킨(IL)-1β, 인터류킨(IL)-6, iNOS(유도형 NO 생성효소)), COX-2(사이클로옥시게나제)의 발현을 억제하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 사용된 LPS는 리포폴리사카라이드Lipopolysaccharide)로써, 생체 및 시험관 내 연구에 있어서 면역자극 유도제로서 널리 사용되어왔다. 이전의 연구에 의하면, LPS는 세포의 면역반응을 유발하여 일산화질소(NO), 유도성 질소 산화물 합성(iNOS), 활성산소종(ROS), 인터류킨(IL)-1, 프로스타글란딘(PGE2), 종양 괴사 인자 (TNF-a) 및 COX-2(사이클로옥시게나제) 등을 생산하는 것으로 잘 알려져 있다.
본 발명의 구체적인 실시예 및 실험예에서, 본 발명자들은 번행초의 플로럴워터(floral water: 하이드로졸(hydrosol))를 생쥐(murine)유래의 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 전처리(pre-treat)한 후, 상기의 LPS로 염증반응을 유도하였을 때, 세포에 독성을 주지 않으면서(도 2), 염증 반응의 지표인 일산화질소(NO)(도 3), 프로스타글란딘(PGE2)(도 4), 사이토카인(IL-1β 및 IL-6)(도 5), iNOS 및 COX-2(도 6)의 생성이 효과적으로 억제됨을 확인하였다. 또한, 본 발명의 번행초의 추출물 발효물을 LPS와 함께 처리하였을 때, 세포에 독성 영향을 주지 않으면서(도 7), 염증 및 산화 반응의 지표인 일산화질소(NO)(도 8)의 생성 억제뿐만 아니라, 세가지 라디칼(radical) 종류인 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼(radical), 알킬 라디칼(allkyl radical) 및 히드록실 라디칼(hydroxyl radical)의 포집 활성(scavenging activity)(도 9) 또한 증가시킴을 확인하여, 라디칼의 제거를 통한 본 발명의 항산화 효과를 확인하였다. 이뿐만 아니라, 세포의 노화 마커인 베타-갈락토시다아제(SA-β-gal)(도 11) 및 활성산소종(ROS)(도 12)의 생성도 억제됨을 확인하였으며, 번행초의 추출물 발효물 및 플로럴워터(floral water)를 동시에 처리하였을 때에는 일산화 질소(NO)의 생성 억제능력이 번행초의 플로럴워터(floral water)를 단독으로 처리하였을 때보다 더욱 크게 향상됨을 확인하였다(도 10).
따라서, 본 발명의 번행초 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 상기 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
경구 투여를 위한 고형제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.
비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 81, 카카오지, 타우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.1 mg 내지 100 mg, 바람직하게는 0.5 mg 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 번행초(Demidovia tetragonoides Pall)의 플로럴워터(floral water), 추출물 또는 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 명세서의 "건강기능식품"이란 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 인체에 유용한 기능을 가진 원료나 성분(기능성 원료)을 사용하여 제조한 것으로, 인체의 정상적인 기능을 유지하거나 생리기능 활성화를 통하여 건강을 유지하고 개선하는 식품으로 식품의약품안전처장이 정한 것을 의미하나, 이에 한정되지 않으며 통상적인 의미의 건강식품을 배제하는 의미로 사용된 것이 아니다.
본 발명의 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취 시에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 조성물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 단당류, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 이당류, 예를 들어 말토스, 수크로스 등; 및 다당류, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제{타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)} 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 g 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
아울러, 본 발명은 번행초(Demidovia tetragonoides Pall)의 플로럴워터(floral water), 추출물 또는 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 라디칼(radical)또는 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase)의 생성 또는 발현을 억제하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 활성산소종(ROS)의 생성을 억제하는 것 또한 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 사용된 화장료에는 상기 원료 이외에 화장품에서 흔히 사용되어지는 타르계색소나 착색안료, 파라벤과 페녹시에탄올등의 방부제, 스테아린산, 아라키딘산, 베헤닌산등의 고급지방산, 세틸알콜, 스테아릴, 베헤닐 알코올 등의 고급지방알콜, 다가 알코올 지방산에스테르, 폴리글리세린 지방산에스테르, 유동파라핀, 스쿠알란, 파라핀, 바셀린등의 탄화수소, 탄소 길이가 10 내지 24인 고급알콜과 탄소 길이가 10 내지 24인 고급지방산의 축합반응으로 만들어지는 에스테르 유성성분 , 글리세린에 탄소길이가 8 내지 24인 고급지방산의 축합반응으로 생성되는 에스테르 유성성분, 휘발성실리콘, 변성실리콘등의 오일성분, 글리세린, 1,3 부틸렌글리콜,디 프로필렌글리콜, 프로필렌 글리콜, 말티톨, 솔비톨 등의 다가알콜, 산탄검, 카르복시 비닐 폴리머, 알킬변성 카르복시 비닐 폴리머, 팩틴등의 점증제, 트리에탄올 아민,수산화칼륨등의 중화제, 자외선 차단제, 각종 비타민과 그 유도체등 본 발명 목적을 달성하기 위한 범위내에서 상기 원료의 적절한 배합이 가능하다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 번행초의 플로럴워터 (floral water) 추출
본 발명에서 사용된 번행초의 하이드로졸(hydrosol)인 플로럴워터(floral water)를 얻기 위하여 본 발명자들은 재배된 번행초를 그늘에서 건조한 후, 번행초 2kg과 물 40 L를 대한메디안(주)에서 제작된 초고속 진공저온추출기(DM - 3000)에서 121℃에서 4 시간 동안 증류하는 방법을 사용하였으며, 추출된 플로럴워터(하이드로졸)는 -20℃에서 보관하였다. 번행초 추출물의 처리 공정을 도 1에 나타내었다.
< 실시예 2> 번행초 추출물의 발효물 추출
본 발명자들은 번행초 추출물의 발효물을 얻기 위하여, 상기 <실시예 1>의 번행초의 플로럴워터(floral water)를 추출하는 과정에서 얻은 열수 추출물 1L를 사용하였다. 열수 추출물은 번행초 2kg과 물 40L를 초고속 진공저온추출기(DM-3000)(대한메디안(주))에서 121℃에서 4시간 동안 추출하여 얻었으며, 이 열수 추출물을 바실러스(LactoBacillus bravis) 발효균 10 ml와 함께 혼합하여 48시간 동안 발효시켰다. 제조된 추출물의 발효물은 동결건조하여 보관하였다. 번행초 추출물의 처리 공정을 도 1에 함께 나타내었다.
< 실시예 3> 세포의 배양
<3-1> RAW 264.7 세포의 배양
생쥐(murine) 대식세포주인 RAW 264.7은 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)로부터 구입하여, 10% FBS(fetal bovine serum), 페니실린(penicillin) 100 units/mL, 및 스트렙토마이신(streptomycin) 100 ㎍/mL을 첨가하여 Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM; GIBCO Inc.)에서 배양하였다. 이들 세포들은 37℃에서 5%의 CO2 조건 속에서 포화 상태(sub confluence)로 배양하였으며, 3일 마다 계대배양(sub culture)하였다.
<3-2> CCD-986sk 세포의 배양
인간 섬유아세포인 CCD-986sk는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)로부터 구입하여, 10% FBS(fetal bovine serum), 페니실린(penicillin) 100 units/mL, 및 스트렙토마이신(streptomycin) 100 ㎍/mL을 첨가하여 Dulbecco’s Modified Eagles Medium(DMEM; GIBCO Inc.)에서 배양하였다. 이들 세포들은 37℃에서, 5%의 CO2 조건 속에서 포화 상태(sub confluence)로 배양하였으며, 3일 마다 계대배양(sub culture)하였다.
< 실험예 1> 번행초 플로럴워터(floral water)의 항염증 효과
<1-1> MTT 어세이 (assay) 세포독성 평가
상기의 <실시예 1>에서 추출한 번행초의 플로럴워터(floral water)의 항염증 효과를 확인하기에 앞서 우선, 세포에서의 독성을 평가하기 위한 실험 방법인 MTT 어세이(assay)를 다음과 같이 수행하였다.
생쥐(murine)유래의 대식세포주인 RAW 264.7 세포 1.5×105 cells/㎖를 96 웰 플레이트(well plate)의 각 웰(well)에 분주하고, 번행초의 플로럴워터(floral water)를 2시간 동안 농도별로 전처리 후 염증반응의 유도를 위해 LPS(1 ㎍/㎖)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 3-(4,5-dimethylthiazol)-2, 5 diphenyltetrazolium bromide (MTT; Sigma, St. Louis, MO, USA) 100㎍을 첨가하고 4시간 동안 더 배양한 후, 플레이트(plate)를 1,000rpm에서 10분간 원심분리하여 조심스럽게 배지를 제거하였다. DMSO(dimethylsulfoxide)(Sigma, St. Louis, MO, USA) 150㎕를 가하여 MTT의 환원에 의해 생성된 포르마잔(formazan) 침전물을 용해시킨 후, ELISA 리더기(reader)를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 번행초의 플로럴워터(floral water)는 세포독성을 유발하지 않음을 확인하였다(도 2).
<1-2> 일산화질소(NO)의 생성 억제능력 평가
번행초의 플로럴워터(floral water)가 염증반응의 지표인 일산화질소(NO: nitric oxide)의 생성 억제에 관여하는지 조사하였다.
우선, RAW 264.7 세포 1.5 × 105 cells/㎖ 를 24 웰 플레이트(well plate)에 분주하고, 플로럴워터(floral water)를 2시간 동안 농도별로 전처리 후 염증반응을 유도하기 위해 LPS (1 ㎍/㎖)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 다음으로, 세포 배양액 중에 존재하는 일산화질소를 측정하기 위해, 세포배양 상등액 100 ㎕와 Griess 시약 (1% (w/v) sulfani-lamide, 0.1% (w/v) naphyl-ethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid) 100 ㎕를 혼합하여 96 웰 플레이트(well plate)에서 10분 동안 반응시킨 후 ELISA 리더기(reader)를 이용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 번행초의 플로럴워터(floral water)는 농도의존적으로 일산화질소(NO)의 생성을 억제시킴을 확인하였다(도 3).
<1-3> 프로스타글란딘 ( PGE2 : prostaglandin E2 )의 생성 억제능력 평가
번행초의 플로럴워터(floral water)가 염증 반응의 지표인 프로스타글란딘(PGE2)의 생성 억제에 관여하는지 조사하였다.
세포 배양액 내의 프로스타글란딘(PGE2)의 양을 측정하기 위해 R&D systems(Minneapolis, MN)에서 구입한 commercial competitive enzyme immunoassay kit를 사용하여 분석하였다. 구체적으로 세포 수 약 1.5 × 105 cells/㎖의 RAW 264.7 세포에 플로럴워터(floral water)를 2시간 동안 농도별로 전처리하였고 1 ㎍/㎖의 LPS을 처리하여 염증반응을 유도하였다. 그리고 24시간 처리 후, 세포 배양액을 따로 분리하여 goat anti-mouse 항체(Ab)가 코팅(coating)된 96 웰 플레이트(well plate)에 각각 100㎕ 씩 로딩(loading)하고, 여기에 primary antibody solution 50 ㎕와 PGE2 conjugate 50 ㎕ 씩을 첨가하여 4℃에서 세척하고, 기질 용액(substrate solution)을 200 ㎕씩 처리하여 10분간 반응시킨 다음, 50 ㎕의 정지 용액(stop solution)을 첨가하였다. 그 후 450 ㎚에서 흡광도를 측정하여, 프로스타글란딘(PGE2)의 양을 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 번행초의 플로럴워터(floral water)는 농도의존적으로 프로스타글란딘(PGE2)의 생성을 억제시킴을 확인하였다(도 4).
<1-4> 사이토카인(IL-1β 및 IL-6) 생성 억제능력 평가
다음으로 번행초의 플로럴워터(floral water)가 염증 반응의 사이토카인(cytokine) 마커인 인터류킨(IL)-1β 및 인터류킨(IL)-6의 생성을 억제하는 지를 조사하였다.
약 1.5×105 cells/mL의 RAW 264.7 세포를 24 웰 플레이트(well plate)에 분주하고, 본 발명의 플로럴워터(floral water)를 2시간 동안 농도별로 전처리한 후, LPS (1 ㎍/㎖)를 처리하여 24시간을 배양하여 염증반응을 유도하였다. 배양 후 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3분)하여 얻어진 상층액(supernatant)에서 전 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 생성 함량을 측정하고자 하였다. 모든 시료는 정량 전까지 -20℃ 이하에 보관되었으며, 전 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 정량은 ELISA(mouse enzyme-linked immnunosorbent assay) kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 수행되었으며, 기준(standard)에 대한 표준 곡선의 R2 값은 0.99 이상이었다.
그 결과, 도 5의 A 및 B에 나타낸 바와 같이, 번행초의 플로럴워터(floral water)는 농도의존적으로 인터류킨(IL)-1β(A) 및 인터류킨(IL)-6(B)의 생성을 억제시킴을 확인하였다(도 5의 A 및 B).
<1-5> iNOS 및 COX-2 생성 억제능력 평가
번행초의 플로럴워터(floral water)가 염증 반응과 밀접하게 관여하는 지표인 iNOS(유도형 NO 생성효소: inducible NO synthase) 및 COX-2(사이클로옥시게나제: cyclooxygenase-2)의 생성 억제에 관여하는지를 조사하였다.
약 1.5×105 cells/mL의 RAW 264.7 세포를 24 웰 플레이트(well plate)에 분주하고 본 발명의 플로럴워터(floral water)를 2시간 동안 농도별로 전처리 후 LPS (1 ㎍/㎖)를 처리하여 24시간 동안 염증반응을 유도하였다. 이후 세포들을 수집하여 리파버퍼(RIPA buffer)를 사용하여 세포를 용해(lysis)시킨 후, 단백질 샘플들을 10%-SDS PAGE에서 전기영동(electrophoresis) 시킨 다음, polyvinylidene fluoride 멤브레인(membrane)으로 이동(transfer)시켰다. 1/1000로 희석된 1차 항체(Ab)인, iNOS 및 COX-2(Cell Signaling Technology, MA, USA)의 항체를 처리하여 반응시키고, 멤브레인(membrane)을 세척한 후 다시 horseradish peroxidase-linked anti-rabbit IgG(Cell Signaling Technology)을 처리하여 반응시킨 다음, WEST-ZOL plus western blot detection system(intron Biotechnology)을 사용하여 iNOS 및 COX-2 의 양을 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 번행초의 플로럴워터(floral water)는 농도 의존적으로 iNOS(inducible NO synthase) 및 COX-2(cyclooxygenase-2)의 생성을 억제시킴을 확인하였다(도 6).
< 실험예 2> 번행초 추출물 발효물의 항염증 및 항산화 효과
<2-1> MTT 어세이 (assay) 세포독성 평가
상기의 <실시예 2>에서 추출한 번행초의 추출물 발효물의 항염증 효과를 확인하기에 앞서 우선, 세포에서의 독성을 평가하기 위한 실험 방법인 MTT 어세이(assay)를 다음과 같이 수행하였다.
생쥐 유래의 대식세포주인 RAW 264.7 세포 1.5×105 cells/㎖를 96 웰 플레이트(well plate)의 각 웰(well)에 분주하고, 번행초의 추출물 발효물을 농도별로 2시간 동안 전처리 후 염증반응의 유도를 위해 LPS(1 ㎍/㎖)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 3-(4,5-dimethylthiazol)-2, 5 diphenyltetrazolium bromide (MTT; Sigma, St. Louis, MO, USA) 100㎍을 첨가하고 4시간 동안 더 배양한 후, 플레이트(plate)를 1,000rpm에서 10분간 원심분리하여 조심스럽게 배지를 제거하였다. DMSO(dimethylsulfoxide)(Sigma, St. Louis, MO, USA) 150㎕를 가하여 MTT의 환원에 의해 생성된 포르마잔(formazan) 침전물을 용해시킨 후, ELISA 리더기(reader)를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 번행초의 추출물 발효물은 세포독성을 유발하지 않음을 확인하였다(도 7).
<2-2> 일산화질소(NO)의 생성 억제능력 평가
번행초의 추출물 발효물이 염증반응의 지표인 일산화질소(NO: nitric oxide)의 생성을 억제하는지를 조사하였다.
우선, RAW 264.7 세포 1.5 × 105 cells/㎖ 를 24 웰 플레이트(well plate)에 분주하고, 번행초의 추출물 발효물을 농도별로 2시간 동안 전처리 후 염증반응을 유도하기 위해 LPS (1 ㎍/㎖)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 다음으로, 세포 배양액 중에 존재하는 일산화질소를 측정하기 위해, 세포배양 상등액 100 ㎕와 Griess 시약 (1% (w/v) sulfani-lamide, 0.1% (w/v) naphyl-ethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid) 100 ㎕를 혼합하여 96 웰 플레이트(well plate)에서 10분 동안 반응시킨 후 ELISA 리더기(reader)를 이용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 번행초의 추출물 발효물이 농도 의존적으로 일산화질소(NO)의 생성을 억제시킴을 확인하였다(도 8).
<2-3> 라디칼(radical)의 제거능력 평가
번행초의 추출물 발효물의 항산화 효과를 확인해보기 위해 다음과 같이 세 가지의 라디칼(radical) 포집(scavenging) 측정 실험을 수행하였다.
우선, DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼(radical)의 포집활성(scavenging activity) 측정 실험부터 수행하였는데, 이는 항산화 물질의 전자 공여능으로 인해 방향족 화합물 및 방향족 아민류가 환원되어 자색이 탈색되는 정도를 지표로 하여 항산화 능력을 측정하는 실험이다. 이를 위해 번행초 추출물의 발효물을 농도별 용액(60 ㎕)을 메탄올에 용해된 DPPH(60 μM/L) 60 ㎕과 격렬히 10초간 혼합한 후, 상기 용액을 100uL 테플론 모세관으로 이동시켜 ESR 스펙트로미터(JES-FA machine, JOEL, Tokyo, Japan)에 주입시키고, 2분이 경과한 후 중심장 3475G, 변조 주파수 100kHz, 진폭 변조 2G, 마이크로웨이브 파워 5mW, 게인(gain) 6.3×105의 조건 하에서 ESR 스펙트로미터상의 스핀 어덕트(spin adduct)를 측정하였다(도 9의 A).
다음으로, 본 발명자들은 아조비스염화수소산염으로부터 생성되는 알킬 라디칼(allkyl radical)의 포집활성(scavenging activity)을 측정하였다. 10 mmol/L 아조비스염화수소산염과 10 mmol/L 부틸니트론이 함유된 인산완충식염수(PBS, pH 7.4) 혼합물과 농도별로 처리한 번행초 추출물 발효물은 37℃ 항온 수조에서 30분간 반응시키고, 100 ㎕의 테플론 모세관으로 옮겼다. 중심장 3475 G, 변조 주파수 100 kHz, 진폭 변조 2G, 마이크로웨이브 파워 10 mW, 게인(gain) 6.3×105, 온도, 298 K의 조건에서 JES-FA ESR 스펙트로미터(JEOL, Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였다(도 9의 B).
또한, 본 발명자들은 클로렐라 엘립소이데아 가수 분해물의 히드록실 라디칼(hydroxyl radical) 포집활성(scavenging activity) 측정 실험을 수행하였다. 이를 위해 본 발명자들은 펜톤 반응(Fenton reaction)에 의해 발생된 히드록실 라디칼을 니트론 스핀 트랩 (Nitorne spin trap) DMPO에 격렬히 반응시키고, 그 결과로 얻어지는 DMPO-OH를 ESR 스펙트로미터를 이용하여 측정하는 방식을 사용하였다. ESR 스펙트럼은 중심장 3475G, 변조 주파수 100kHz, 진폭 변조 2G, 마이크로웨이브 파워 1mW, 게인(gain) 6.3×105의 조건 하에서 측정되었는데, 이때, JES-FA ESR 스펙트로미터(JEOL, Tokyo, Japan)를 사용하였으며, 0.3M DMPO 0.2mL, 10mM FeSO4 0.2mL, 10mM H2O2 0.2mL을 PBS(pH 7.4)에 혼합하여 2분 30초가 경과한 후, 측정하였다(도 9의 C).
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이. 번행초의 추출물 발효물이 농도 의존적으로 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼(radical)(도 9의 A), 알킬 라디칼(allkyl radical)(도 9의 B) 및 히드록실 라디칼(hydroxyl radical)(도 9의 C)의 포집 및 제거활성을 나타냄을 확인하였다(도 9의 A, B 및 C).
또한, 도 9의 D에 따로 나타낸 바와 같이, 각 라디칼(radical)들의 포집활성 IC50 값에서, 번행초의 발효 처리 전 단계인 순수 열수 추출물로만 시행된 라디칼 측정 실험에서는 DPPH 라디칼만이 측정되었을 뿐, 다른 라디칼들은 측정되지 않았다. 이는 발효 과정을 통해, 번행초 추출물의 항산화 능력이 크게 향상되었음을 나타낸다(도 9의 D).
< 실험예 3> 번행초의 추출물 발효물 및 플로럴워터(floral water)의 동시처리에 따른 항염증 효과(일산화 질소(NO) 생성 억제능력 평가)
번행초 추출물 발효물 및 플로럴워터(floral water)를 동시에 처리하였을 때, 염증반응에 의해 유도되는 일산화질소(NO)의 소거능력에 주는 영향을 조사하였다.
RAW 264.7 세포 1.5 × 105 cells/㎖ 를 24 웰 플레이트(well plate)에 분주eeding)하고, 번행초의 추출물 발효물(50 ㎍/ml)을 기본으로 하여 각 농도를 달리하여 배합한 플로럴워터(0.5% 및 1%) 혼합물을 각각 2시간 동안 전처리 후, 염증반응의 유도를 위한 LPS(1 ㎍/㎖)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 다음으로, 생성된 일산화질소(NO)를 측정하기 위하여 세포배양 상등액 100 ㎕와 Griess 시약 (1% (w/v) sulfani-lamide, 0.1% (w/v) naphyl-ethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid) 100 ㎕를 혼합하여 96 웰 플레이트(well plate)에서 10분 동안 반응시킨 후 ELISA 리더기(reader)를 이용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 번행초의 추출물 발효물 및 플로럴워터(floral water)를 동시에 처리하였을 때 일산화질소(NO)의 생성이 억제됨을 확인하였으며, 또한 혼합되어 있는 플로럴워터(floral water)의 농도 함량이 증가할수록, 일산화질소(NO) 생성 억제 능력이 더욱 향상됨을 확인하였다(도 10의 A 및 B).
아울러, 상기 결과는 앞서 도 3에 개시한 번행초의 플로럴워터(floral water) 단독처리에 의한 일산화질소(NO) 생성억제 효능보다 더욱 향상된 억제 효과를 보임을 확인하였다.
< 실험예 4> 번행초 추출물 발효물의 세포 노화 억제효과
<4-1> 베타- 갈락토시다아제(SA-β-gal)의 발현 측정
상기의 <실시예 2>에서 추출한 번행초 추출물 발효물의 세포 노화 억제 효능을 알아보기 위해, 노화의 마커(marker)로써 잘 알려져 있는 베타(β)-갈락토시다아제(β-galactosidase: SA-β-gal)의 발현량 차이를 측정하고자 하였다.
우선 인간 섬유아세포인 CCD-986sk 세포의 상대적으로 젊은 세포(passage 15 - 18)들을 24 웰 플레이트(well plate)에 각각 2 x 104 cells/well의 수로 분주(seeding)시키고 하루동안 부착시켰다. 이후 번행초 추출물의 발효물을 농도별로 2시간 동안 전처리한 후, 세포노화 유발물질로 잘 알려져 있는 PPKO(Phenyl 2-pyridyl ketoxime, Sigma St. Louis, MO)을 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 배양 후 PBS(Phosphate Buffer Solution)로 세척한 뒤 4%의 포름알데히드(formaldehyde)로 15분 동안 세포를 고정한 후 다시 PBS로 2번 세척하였다. 이후 40 mM citric acid/sodium phosphate buffer(pH 6.0)에 1 mg/ml X-gal, 5 mM potassium ferrocyanide, 5 mM potassium ferricyanide 및 2 mM MgGl2를 혼합하여 만든 베타(β)-갈락토시다아제 염색시약(Senescence Cells Histochemical Staining kit, Sigma, St. Louis, MO)을 처리하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 독립적으로 세 번 반복하여 실험하였고, 광학 현미경을 이용하여 100배의 배율로 색깔의 변화를 관찰하였다. 그리고 하나의 웰(well)에 대하여 5개 웰(sell)에서의 전체 세포의 수와 푸른색으로 염색된 세포 수를 측정하여 ‘푸른 색으로 염색된 세포의 수’를 ‘전체 세포의 수’의 퍼센트 비율로 계산하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 세포노화 유발물질인 PPKO를 처리한 세포에서는 대조구(control: CON) 대비, 베타(β)-갈락토시다아제(β-galactosidase: SA-β-gal) 양성세포(positive cell)인 푸른색의 세포들의 수가 증가하였으나, 이들 푸른색의 세포 수는 전 처리한 번행초 추출물 발효물의 농도 의존적으로 점점 감소하는 것을 현미경 사진을 통해 직접 확인하였다(도 11의 A). 이들의 계산 결과는 다시 도 11의 B에 그래프로 도식화하였다. 이를 통해 번행초의 추출물 발효물에 의해 세포 노화가 억제됨을 확인하였다(도 11의 A 및 B).
<4-2> 활성산소종 ( ROS )의 발생 억제능력 평가
다음으로, 번행초의 추출물 발효물이 활성산소종(reactive oxygen species: ROS)발생 억제능력이 있는지를 조사하였다.
CCD-986sk 세포를 96 웰 플레이트(well plate)에 세포 수 1×105 cells/ml으로 분주(seeding)한 후, Royall 및 Ischiropoulos에 의해 고안된 방식인 레독스-민감성 형광 DCFH-DA 프로브(probe)를 하루 동안 부착시켰다. 이후 번행초 추출물 발효물을 농도별로 2시간 동안 전처리한 후 세포노화 유발물질인 PPKO(Phenyl 2-pyridyl ketoxime, TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD, Tokyo, Japan)를 처리하여 37℃에서 10분 동안 배양한 후 최종적으로, DCFH-DA(2'7'-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트, 5ug/mL, Sigma, St. Louis, MO, USA)를 각 세포에 처리한 후, 485nm에서는 들뜸 파장(excitation wavelength), 535nm에서는 방출파장(emission wavelength)으로 형광을 측정하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 번행초 추출물 발효물이 PPKO에 의해 유발된 활성산소종(NO)의 발생을 농도 의존적으로 억제함을 확인하였다(도 12).

Claims (9)

  1. 번행초(Demidovia tetragonoides Pall) 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는, 시험관 내(in vitro) 섬유아세포에서 생산되는 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase) 억제용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 번행초의 열수 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 추출물의 발효물은 락토바실러스 브라비스(LactoBacillus bravis)에 의한 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서, 상기 베타-갈락토시다아제는 PPKO(Phenyl 2-pyridyl ketoxime) 자극에 의해 생산되는 것인, 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
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