KR102032110B1

KR102032110B1 - 인삼 발효 추출물을 포함하는 알레르기성 피부질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102032110B1
Application number: KR1020180082876A
Authority: KR
Inventors: 이광호; 황선원; 손효
Original assignee: 건국대학교 글로컬산학협력단; 주식회사 알파크립텍
Priority date: 2018-07-17
Filing date: 2018-07-17
Publication date: 2019-10-15

Abstract

본 발명은 인삼 발효 추출물을 포함하는 알레르기성 피부질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 인삼 발효 추출물은 FcεRI 매개 신호전달물질인 JNK의 인산화를 억제하며, 과립(β-hexosaminidase)의 방출 및 사이토카인(IL-4)의 방출을 억제하는 효과를 가지고 있으며, 수동 피부아니필락시스에 대한 치료 효과가 우수함을 확인함에 따라 알레르기 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인삼 발효 추출물을 포함하는 알레르기성 피부질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for prevention or treatment of allergic skin diseases comprising fermented extract of ginseng}

본 발명은 인삼 발효 추출물을 포함하는 알레르기성 피부질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

알레르기 질환은 알러젠에 반복적으로 접촉되어 기억세포(memory cell)에 의환 과도한 면역반응으로 발생하며, 항원과 결합하는 IgE는 조직의 비만세포(mast cells)의 수용체(FcεRI)에 결합하여 비만세포의 탈과립을 유도한다. 비만세포의 탈과립은 히스타민(histamine), 헤파린(heparin), 류코트리엔(leukotrienes), 프로스타글란딘(prostaglandine) 및 다른 과민증인자(anaphylatic agents) 등을 분비하게 된다. 이렇게 분비된 면역활성 인자들이 면역체계를 활성화시키며 염증(inflammation) 및 알레르기 반응(allergic reactions)을 발생시키는 원인이다.

알레르기 반응은 신체부위에 대해 다양한 형태로 나타나며, 발생부위에 따라 비염, 결막염, 천식, 두드러기, 알레르기성 피부염, 아나필락시스 등의 증상으로 나타난다. 특히, 피부에 나타나는 알레르기 반응은 알레르기 면역반응에 의해 나타나는 피부증상으로 아토피 피부염, 접촉성 알레르기 피부염, 건선, 두드러기, 식품 또는 약품 알레르기 등이 포함된다. 아토피성 피부염의 경우, 알레르겐(allergen) 노출의 영향은 즉각적일 수 있으며, 가려움증을 비롯하여 피부건조, 두드러기, 발진, 염증반응에 이르기까지 경증 또는 중증의 다양한 증상이 나타나게 된다.

이들 질환을 개선, 치료하기 위해서는 우선 알레르기 유발 요인에 노출 및 접촉을 피하고 피부를 청결하게 유지하면서 적절한 약효성분을 피부염 발병 부위에 도포하거나 전신에 투여하는 방법이 있다. 그러나 합성 알레르기성 피부염 억제제는 가격이 고가이고, 의약품 및 화장품적인 방법 모두 아직까지는 병변의 재발을 막을 수 없어 외부 항원 노출 시 재발이 빈번하게 일어나며 부작용이 검증되지 않는 등의 문제점을 지니고 있어 이를 보완하기 위해 천연소재를 이용한 치료제 개발 필요성이 절실한 실정이다.

이에 본 발명자들은 인삼 발효 추출물의 FcεRI 매개 신호전달물질인 JNK의 인산화를 억제하며, 과립(β-hexosaminidase)의 방출 및 사이토카인(IL-4)의 방출을 억제하는 효과를 가지고 있으며, 수동 피부아니필락시스에 대한 치료 효과가 우수함을 확인함에 따라 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허공보 제10-1816742호 한국등록특허공보 제10-0794360호

본 발명의 목적은 인삼 발효 추출물을 포함하는 알레르기성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 인삼 발효 추출물을 포함하는 알레르기성 피부질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 인삼 발효 추출물을 포함하는 알레르기성 피부질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 인삼을 유기용매로 추출하여 인삼 추출물을 제조하는 단계(단계 1); 상기 인삼 추출물을 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HSW-01 균주(기탁번호:KCTC13572BP) 배양액과 혼합하여 0-10℃에서 50-150일 동안 발효하여 인삼 발효물을 제조하는 단계(단계 2); 및 상기 인삼 발효물을 유기용매로 추출하는 단계(단계 3); 를 포함하여 제조한 인삼 발효 추출물을 포함하는 알레르기성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 인삼을 유기용매로 추출하여 인삼 추출물을 제조하는 단계(단계 1); 상기 인삼 추출물을 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HSW-01 균주(기탁번호:KCTC13572BP) 배양액과 혼합하여 0-10℃에서 50-150일 동안 발효하여 인삼 발효물을 제조하는 단계(단계 2); 및 상기 인삼 발효물을 유기용매로 추출하는 단계(단계 3); 를 포함하여 제조한 인삼 발효 추출물을 포함하는 알레르기성 피부질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

나아가 본 발명은 인삼을 유기용매로 추출하여 인삼 추출물을 제조하는 단계(단계 1); 상기 인삼 추출물을 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HSW-01 균주(기탁번호:KCTC13572BP) 배양액과 혼합하여 0-10℃에서 50-150일 동안 발효하여 인삼 발효물을 제조하는 단계(단계 2); 및 상기 인삼 발효물을 유기용매로 추출하는 단계(단계 3); 를 포함하여 제조한 인삼 발효 추출물을 포함하는 알레르기성 피부질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 인삼 발효 추출물은 FcεRI 매개 신호전달물질인 JNK의 인산화를 억제하며, 과립(β-hexosaminidase)의 방출 및 사이토카인(IL-4)의 방출을 억제하는 효과를 가지고 있으며, 수동 피부아니필락시스에 대한 치료 효과가 우수함을 확인함에 따라 알레르기 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 인삼 발효 추출물과 인삼 추출물의 농도별 RBL-2H3에 대한 세포 독성을 확인한 그림이다(NT : 시료를 처리하지 않고 배양액만 넣어준 대조군, FPG : 인삼 발효 추출물, PG : 인삼 추출물).
도 2는 인삼 발효 추출물과 인삼 추출물의 FcεRI 매개 알레르기 반응 억제 효과를 확인한 그림이다(2A. FcεRI 매개 β-hexosaminidase 방출 측정, 2B. 사이토카인 IL-4 방출 측정, 2C.Ca++ 매개 β-hexosaminidase 방출 측정).
도 3은 인삼 발효 추출물과 인삼 추출물의 알레르기 유발 물질 매개 신호전달 물질 억제 효과를 확인한 그림이다(3A. FcεRI 매개 신호 전달물질 MAPK, 3B. FcεRI 매개 미토겐활성화단백질키나아제 4, 3C FcεRI 매개 β-hexosaminidase).
도 4는 인삼 발효 추출물과 인삼 추출물의 in vivo에서 수동 피부아나필락시스(passive cutaneous anaphylaxis)의 완화 효과를 확인한 그림이다(4A. 수동피부아나필락시스의 유발 과정, 4B. 에반스 블루 염색, 4C. 에반스 블루 염료 누출 결과).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

알레르기성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

본 발명은 인삼을 유기용매로 추출하여 인삼 추출물을 제조하는 단계(단계 1);

상기 인삼 추출물을 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HSW-01 균주(기탁번호:KCTC13572BP) 배양액과 혼합하여 0-10℃에서 50-150일 동안 발효하여 인삼 발효물을 제조하는 단계(단계 2); 및

상기 인삼 발효물을 유기용매로 추출하는 단계(단계 3);

를 포함하여 제조한 인삼 발효 추출물을 포함하는 알레르기성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 알레르기성 피부질환은 아토피 피부염, 건선, 접촉성 알레르기 피부염 및 두드러기로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 아토피 피부염일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 인삼은 장뇌삼, 수삼, 건삼, 산삼, 백삼, 산양삼, 흑삼, 재배삼 및 서양삼으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 장뇌삼 일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계 1 또는 단계 3의 유기용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매일 수 있으며, 바람직하게 상기 단계 1의 유기용매는 70% 에탄올을 사용할 수 있으며, 상기 단계 3의 유기용매는 95% 에탄올을 사용하여 추출할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계 2의 인삼 추출물 100 중량부 기준 락토바실러스 플란타럼균(Lactobacillus plantarum) 배양액을 800 내지 1200 중량부로 혼합하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 상기 단계 2의 인삼 추출물 100 중량부 기준 락토바실러스 플란타럼균(Lactobacillus plantarum) 배양액을 1000 중량부 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어, "추출물(extract)"은 통상의 기술 분야에 공지된 일반적인 추출방법, 분리 및 정제방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 인삼 발효 추출물은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 인삼 발효 추출물의 인체에 대한 효과적인 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 약 0.001-100 mg/kg/일이며, 바람직하게는 0.01-35 mg/kg/일이다. 몸무게가 70㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.07-7000 mg/일이며, 바람직하게는 0.7-2500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

인삼 발효 추출물을 포함하는 알레르기성 피부질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 또는 건강식품 조성물

상기 인삼 발효물을 유기용매로 추출하는 단계(단계 3);

를 포함하여 제조한 인삼 발효 추출물을 포함하는 알레르기성 피부질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 또는 건강식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 인삼 발효 추출물을 건강기능식품 또는 건강식품 조성물로 사용하는 경우, 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 인삼 발효 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품, 유가공 제품, 캡슐제, 환제, 후레이크 또는 액제 형태의 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품 또는 건강식품 조성물을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 인삼 발효 추출물을 함유하는 건강기능식품 또는 건강식품 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 인삼 발효 추출물의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 또는 건강식품 조성물 중의 상기 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 유지를 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 인삼 발효 추출물은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 또는 건강식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명 인삼 발효 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트라이톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강기능식품 또는 건강식품 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 인삼 발효 추출물을 함유하는 건강기능식품 또는 건강식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품 및 건강식품 조성물은 천연 과일쥬스 및 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 인삼 발효 추출물을 함유하는 건강기능식품 또는 건강식품 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<시약 및 항체>

실험에 사용된 재료는 세포 배양액인 minimum essential media(MEM), fetal bovine serum(FBS), opti-MEM과 페니실린-스트렙토마이신, phosphate buffer salin(PBS) 등의 세포 배양액들은 모두 gibco(Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. MRS(De Man, Rogasa and Sharpe) 배지 및 rat IL-4 ELISA kit는 BD Biosciences (Franklin Lakes, SD, USA)에서 구입하였다. 세포독성 검사를 위한 LDH cytotoxicity assay kit(CytoTox 96)은 Promega (Madison, WI, USA)에서 구입하였다. 항체 β-actin은 Santa Cruz(CA, USA)에서, MAPK들은 Cell Signaling Technology Inc(Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. 시약 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide), Evans blue, formamide, anti-dinitrophenyl (DNP)-IgE, dinitrophenyl-conjugated human serum albumin (DNP-HSA), 4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide, JNK 억제제 SP600125 및 그 외 시약들은 모두 Sigma Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

<세포 배양>

본 실험은 RBL(Rat Basophile leukemia)-2H3 세포를 미국 세포은행 (American Type Culture Collection (ATCC); Manassas, VA, USA)으로부터 수득하여 이용하였다. 배지는 15% FBS, 항생제(100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신)이 포함된 MEE 배지로 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양되었다.

<실시예 1> 인삼 발효 추출물의 제조

<1-1> 인삼 추출물의 제조

경상남도 지리산에서 2년근 장뇌삼(woods grown ginseng)을 채취하였다. 세척, 건조 및 파쇄 후 장뇌삼 100g에 70% 에탄올을 1,000㎖를 첨가하여 4시간 동안 추출하였다.

<1-2> 인삼 발효물의 제조

락토바실러스 플란타룸균(Lactobacillus plantarum)HSW-01 균주(기탁번호:KCTC13572BP)을 MRS(de Man, Rogosa and Sharpe) 액체 배지로 30℃에서 배양하였다. 상기 실시예 1-1의 인삼 에탄올 추출물과 락토바실러스 플란타럼균 배양액을 1:10의 비율로 혼합하여 4℃에서 100일 동안 발효하였다. 발효 완료 후 여과포(Advantec, 5㎛)로 여과 후 당도 10brix 되게끔 농축하였다.

상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)HSW-01 균주는 2018년 07월 04일에 생물자원센터(KCTC)에 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC13572BP를 부여받았다.

<1-3> 인삼 발효 추출물의 제조

상기 실시예 1-2에서 제조한 농축물과 95% 에탄올 1:10으로 투입하여 3시간 교반 추출을 3번 반복 진행하였다. 얻은 에탄올 액층을 농축하고 농축물을 200mL 40% 부틸렌글리콜 용액에 용해 후 여과하여 인삼 발효 추출물을 획득한다. 획득한 인삼 발효 추출물을 농축 및 동결건조하여 분말로 만든 후 생리식염수로 희석하여 실험에 사용하였다.

<실험예 1> 세포 생존율 검사

세포 독성을 확인하기 위해 MTT assay 및 LDH assay를 이용하여 측정하였다. RBL-2H3 세포를 96 well plate에 1×10⁴cell/100㎕/well로 분주하여 12시간 동안 배양하였다. 시료를 12.5, 25, 50, 100㎍/ml의 농도로 처리하고 8시간 동안 배양한 후, 상등액으로 LDH 분석을, 세포로 MTT 분석을 통해 세포 생존율을 확인하였다.

상기 실시예 1-1의 인삼 추출물과 상기 실시예 1-3의 인삼 발효 추출물의 독성과 유효 농도를 확인하기 위하여, 큰쥐 호염기구성 백혈구 세포 (rat rasophilic leukemia cells, RBL-2H3)를 이용하여 세포 생존 분석을 수행하였다.

그 결과, 상기 인삼 추출물 및 인삼 발효 추출물 모두 농도 100㎍/ml까지는 RBL-2H3의 세포 생존율에 영향이 없음을 확인할 수 있었다(도 1).

<실험예 2> 인삼 발효 추출물의 FcεRI 매개 알러지 반응 억제능 확인

<2-1> FcεRI 매개 베타-헥소사미니데이즈(β-hexosaminidase) 방출 측정

RBL-2H3 세포를 24well plate에 1.5×10⁵cell/well 농도로 12시간 동안 배양하여 부착 시킨다. IgE(110ng/ml 최종 농도)를 넣고 37℃ 5% CO₂incubator에서 2시간 배양하였다. 각 well의 세포들을 생리식염수로 2번 세척한 다음 각 well 당 sample을 opti-MEM에 희석하여 농도별로 처리한 후 1시간 동안 반응시켰다. 이후 DNP-HSA (25 ng/ml 최종 농도)로 15분 동안 자극하고 ice bath에서 5분간 incubation 시켜 반응을 종결시켰다. 상층액 150㎕를 튜브로 옮겨 3000rpm에서 3분 동안 원심분리한 후 30㎕를 96 well plate로 옮기고 substrate buffer(4-p-Nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide 1mM, 0.1M citrate buffer PH 4.5) 30㎕를 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응 시킨 다음 각 well 당 stop solution(0.1M NaHCO3) 250㎕ 를 첨가하여 반응을 정지시키고 microplate reader(molecular devices)를 사용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료와 대조군의 흡광도 값으로 다음 식에 의해 degranulation percent(%)를 계산하였다.

degranulation percent(%) = (sample 처리한 OD - blank OD)/(control OD - blank OD) × 100

<2-2> Ca++ 매개 β-hexosaminidase 방출 측정

RBL-2H3 세포를 24well plate에 1.5×10⁵cell/well 농도로 12시간 동안 배양하여 부착 시킨다. 각 well의 세포들을 생리식염수로 2번 세척한 다음 각 well당 sample을 opti-MEM에 희석하여 농도별로 처리한 후 1시간 동안 반응시켰다. 이후 A23187 (750 ng/ml 최종 농도)로 10분 동안 자극하고 ice bath에서 5분간 incubation 시켜 반응을 종결시켰다. β-hexosaminidase 방출 측정은 위와 동일한 방법으로 진행하였다.

<2-3> 사이토카인 IL-4 방출 측정

RBL-2H3 세포를 24well plate에 1.5×10⁵cell/well 농도로 12시간 동안 배양하여 부착 시킨다. IgE(110ng/ml 최종 농도)를 넣고 37℃ 5% CO₂incubator에서 2시간 배양하였다. 각 well의 세포들을 생리식염수로 2번 세척한 다음 각 well 당 sample을 MEM 배지에 희석하여 농도별로 처리한 후 1시간 동안 반응시켰다. 이후 DNP-HSA (25 ng/ml 최종 농도)로 4시간 동안 자극하고 ice bath에서 5분간 incubation 시켜 반응을 종결시켰다. 이후 상등액 50㎕를 12시간 동안 capture 항체로 코팅된 96well plate에 50㎕씩 옮기고 2시간 배양시켰다. Washing buffer로 4회 세척하고 100㎕의 biotinylated antibody reagent과 streptavidine-HRP solution을 각각의 well에 처리해서 1시간 동안 상온에서 반응시킨 후 7회 washing 한 다음 di(2-ethylhexyl)-2,4,5trimethoxybenzalmalonate(TMB) 기질을 50㎕씩 처리하여 20분간 반응시킨 후 50㎕의 H₂SO₄용액을 처리하고 microplate reader(molecular devices)로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

인삼 추출물과 인삼 발효 추출물의 알레르기 반응에 대한 영향을 확인하기 위하여, 급성 알레르기 반응(FcεRI 매개 알레르기반응) 또는 만성 알레르기 반응(Ca++매개 알레르기 반응)의 활성화제를 처리하고 인삼 추출물과 인삼 발효 추출물의 존재 여부에 따른 과립의 방출에 대한 영향을 확인하였다. 히스타민 과립의 방출은 알레르기 반응의 주요 유발 물질이다. 본 발명에서는 히스타민과 동반 방출되는 β-hexosaminidase의 양을 확인하였다.

그 결과, 인삼 발효 추출물이 FcεRI 매개 탈과립율을 농도 의존적으로 억제 한다는 것을 확인하였다. 반면에 인삼 추출물은 FcεRI 매개 탈과립율을 억제하지 못하였다(도 2A). 만성 알레르기 반응(Ca++ 매개 알레르기 반응)으로 인한 탈과립율을 인삼 추출물과 인삼 발효 추출물 모두 억제하지 못하였다(도 2C).

또한, FcεRI 매개 사이토카인인 IL-4의 방출은 Th2 타입의 사이토카인으로서 알레르기의 활성화를 촉진시키는 작용을 한다. 따라서 인삼 추출물과 인삼 발효 추출물의 IL-4 사이토카인 방출 억제능을 측정하였다. 그 결과, 인삼 발효 추출물은 FcεRI 매개 IL-4 사이토카인 방출을 농도 의존적으로 억제하는 반면 인삼 추출물은 사이토카인의 방출을 억제하지 못하였다(도 2B).

<실험예 3> 인삼 발효 추출물의 FcεRI 매개 JNK의 인산화에 대한 억제능 확인

반응시킨 RBL-2H3 세포들은 50mM Tris-HCl (pH 8.0), 1% Nonidet P-40 (NP-40), 150mM 소듐 클로라이드(sodium chloride), 0.5% 소듐 디옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), 프로테이즈 및 포스파테이즈 저해제 칵테일을 함유하는 버퍼에서 용해시켰다. 세포 파쇄액은 동량의 샘플을 10% SDS-PAGE 젤 전기영동에 의하여 분리하고 polyvinylidene fluoride (PVDF)로 트랜스퍼하였다. 그 막을 5% 탈지 우유로 1시간 동안 blocking 시킨 후 1차 항체를 넣고 4℃에서 하룻밤 정치시킨 후 PBST로 30분간 세척해주고 면역 복합체를 horseradish peroxidase-부착된 항체로 상온에서 1 시간 동안 배양하였다. 2차 항체의 적용 후, 그 막을 발광성(Luminescent) 이미지 분석 장치 (LAS-3000; Fujifilm, Tokyo, Japan)에 의하여 ECL 검출 키트를 사용하여 시각화하기 위해 현상하였다.

인삼 발효 추출물의 FcεRI 매개 알레르기 활성화 억제 메커니즘을 확인하기 위하여, FcεRI 매개 신호 전달물질 MAPK(MAP 키나아제)에 대한 영향을 확인하였다.

그 결과, 인삼 발효 추출물은 FcεRI 매개 신호 전달물질 MAPK (p38, JNK, ERK) 중 JNK의 인산화만 특이적 및 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 3A).

또한 직접적으로 JNK의 인산화를 매개하는 미토겐활성화단백질 키나아제 4(mitogen-activated protein kinase 4, MKK4)의 활성에 대한 인삼 발효 추출물의 영향을 확인하였다.

그 결과, 인삼 발효 추출물은 FcεRI 매개 미토겐활성화단백질키나아제 4의 활성화를 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인하였다. 기존 억제제 SP600125를 처리하였을 때 또한 미토겐활성화단백질키나아제 4의 활성이 억제되는 것을 확인하였다(도 3B). 미토겐활성화단백질키나아제 4의 억제제 SP600125와 인삼 발효 추출물은 모두 FcεRI 매개 β-hexosaminidase의 방출을 억제하는 것을 확인하였다(도 3C). 종합하여, 인삼 발효 추출물은 FcεRI 매개미토겐활성화단백질키나아제 4의 활성화를 억제하여 β-hexosaminidase의 방출을 억제하며 즉, 알레르기 반응을 억제한다는 것을 확인할 수 있었다.

<실험예 4> 인삼 발효 추출물의 FcεRI 매개 수동피부아나필락시스(passive cutaneous anaphylaxis) 알레르기 반응 억제 확인

6주 령 암컷 BALB/C 실험 쥐는 오리엔트 바이오에서 구매하였고 건국대학교 SPF 실에서 키웠다. 수동피부아나필락시스를 유발하기 위하여 anti-DNP IgE를 0.25mg/kg 농도로 마우스의 귀에 피하주사하였다. 23시간 뒤에 인삼 발효 추출물과 인삼 추출물 및 덱사메타손(dexamethasone; Dex, 항염증제제)을 복강으로 주사하였다. 1시간 후 2% 에반스 블루로 염색한 DNP-HSA를 50mg/kg 농도로 정맥주사하였다. 20분 뒤 마우스를 희생하고 8mm 펀치로 귀 조직을 취하여 폼아마이드(formamide)로 에반스 블루를 석출하였다. 상등액을 620nm 파장에서의 흡광도를 측정하였다.

구체적인 수동피부아나필락시스의 유발 과정은 도 4A과 같다. 에반스 블루 염색약으로 인한 염색은 도 4B에서 확인할 수 있다. 인삼 발효 추출물과 항염증 약물인 덱사메타손의 처리는 에반스 블루 염색약으로 인한 귀 조직의 염색 정도를 억제하는 것을 확인하였다. 반면에 인삼 추출물은 억제하지 못하였다(도 4C). 따라서 인삼 발효 추출물은 FcεRI 매개 수동피부아나필락시스 알레르기반응을 억제한다는 것을 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특히 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

생물자원센터 KCTC

KCTC13572BP

20180704

Claims

인삼을 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 인삼 추출물을 제조하는 단계(단계 1);
상기 인삼 추출물을 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HSW-01 균주(기탁번호:KCTC13572BP) 배양액과 혼합하여 0-10℃에서 50-150일 동안 발효하여 인삼 발효물을 제조하는 단계(단계 2); 및
상기 인삼 발효물을 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하는 단계(단계 3);
를 포함하여 제조한 인삼 발효 추출물을 포함하는 아토피 피부염, 건선, 접촉성 알레르기 피부염 및 두드러기로 이루어진 군으로부터 선택되는 알레르기성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 인삼은 장뇌삼, 수삼, 건삼, 산삼, 백삼, 산양삼, 흑삼, 재배삼 및 서양삼으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 단계 2의 인삼 추출물 100 중량부 기준 락토바실러스 플란타럼균(Lactobacillus plantarum) 배양액을 800 내지 1200 중량부로 혼합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
인삼을 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 인삼 추출물을 제조하는 단계(단계 1);
상기 인삼 추출물을 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HSW-01 균주(기탁번호:KCTC13572BP) 배양액과 혼합하여 0-10℃에서 50-150일 동안 발효하여 인삼 발효물을 제조하는 단계(단계 2); 및
상기 인삼 발효물을 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하는 단계(단계 3);
를 포함하여 제조한 인삼 발효 추출물을 포함하는 아토피 피부염, 건선, 접촉성 알레르기 피부염 및 두드러기로 이루어진 군으로부터 선택되는 알레르기성 피부질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제 6항에 있어서,
상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 형태의 식품인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
인삼을 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 인삼 추출물을 제조하는 단계(단계 1);
상기 인삼 추출물을 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HSW-01 균주(기탁번호:KCTC13572BP) 배양액과 혼합하여 0-10℃에서 50-150일 동안 발효하여 인삼 발효물을 제조하는 단계(단계 2); 및
상기 인삼 발효물을 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하는 단계(단계 3);
를 포함하여 제조한 인삼 발효 추출물을 포함하는 아토피 피부염, 건선, 접촉성 알레르기 피부염 및 두드러기로 이루어진 군으로부터 선택되는 알레르기성 피부질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
제 8항에 있어서,
상기 건강식품은 각종 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제에서 선택되는 것을 특징으로 하는 건강식품 조성물.