KR101673664B1 - 잔잎쑥 식물 세포 배양 추출물을 함유한 항염, 수렴효과 및 항노화 효과를 지닌 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 잔잎쑥(Artemisia annua L.) 식물 세포 배양 추출물을 함유한 항염, 수렴효과 및 항노화 효과를 지닌 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 희귀식물인 잔잎쑥 식물체로부터 유도된 식물 세포 배양물, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 함유한 항염, 피부 수렴, 항노화 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 잔잎쑥 식물 세포 또는 부정근 배양물 또는 그 추출물을 함유한 피부 외용제 조성물은 피부 세포에 독성이 없으면서도 피부 수렴, 미백, 항염, 창상 치유를 비롯한 항노화 효능 등을 가지고 있다.

Description

잔잎쑥 식물 세포 배양 추출물을 함유한 항염, 수렴효과 및 항노화 효과를 지닌 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법 {Anti-aging, Anti-inflammatory and Skin-Astriction composition for skin external application comprising Artemisia annua L. Cell Culture Extract and Methods for preparing the Same}

본 발명은 잔잎쑥(Artemisia annua) 식물 세포 배양 추출물을 함유한 항염, 수렴효과 및 항노화 효과를 지닌 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 희귀식물인 잔잎쑥 식물체로부터 유도된 식물 세포 배양물, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 함유한 피부 수렴, 항노화 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

인간의 피부는 시간이 지남에 따라 내적으로는 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 면역 세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되어 생체에 필요한 면역 단백질 및 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 되어 생기는 내인성 노화(intrinsic aging)와, 외적으로는 각종 오염물질과 자외선에 의한 광노화(photoaging)에 의해, 피부가 얇아지며 (내인성 노화의 경우), 탄력이 감소하게 되며 자외선 조사에 노출됨에 따라 표피 내 각질형성세포와 멜라닌세포가 UVB에 의해 세포손상을 받게 된다. 피부 노화는 태양광선에 노출되지 않는 부위에서 나타나는 연대학적 노화 (chronologic aging)와 태양광선의 노출부에서 일어나는 퇴행성 변화가 연대학적 노화와 복합되어 일어나는 광인성 노화 (actinic ageing) 로 구분된다. 연대학적 노화에서는 특징적인 임상 피부소견으로 미세한 주름, 진피의 위축, 피하지방층의 감소 등이 관찰된다. 광노화 과정에서는 거칠고 깊은 주름 (coatse wrinkling and furrowing)이 나타나고 비정상적인 탄력질양 물질(elastotic material)이 축적되어 피부가 가죽같이 두터워지며 느슨해진다. 만성적 일광손상을 입은 피부에서 볼 수 있는 현상은 진피의 상부 쪽 교원질의 비정상적인 탄력질양 물질의 침착 (solar elastosis)과 프로테오글리칸 (proteoglycan)이 증가되고 진피의 주단백질인 콜라겐이 현저히 감소되는 것이다. 콜라겐은 피부에 강도와 장력을 부여하며 이로 인해 외부의 자극이나 힘으로부터 피부를 보호하는 역할을 하며 진피층의 90%를 차지하고 있어 콜라겐의 감소는 피부와 노화와 밀접한 관계를 가지고 있다.피부를 구성하는 세포에서는 내인성 노화나, 광노화에 의해 세포활성이 떨어지고, 신호전달체계가 불완전해지면서 피부조직을 분해하는 효소인 MMPs (matrix metalloproteinases)의 생합성이 증가하고, 콜라겐의 생합성이 감소하여 주름살이 생기고 탄력이 감소하고, 피부흑화를 초래하는 멜라닌생성이 증가하는 것으로 알려져있다. 따라서 피부 세포를 증식시키거나, 피부를 구성하는 기질물질을 증가시킴으로써 피부를 두껍게 할 수 있는 물질, 피부를 구성하는 기질 물질인 콜라겐을 분해하는 MMPs의 생합성을 억제할 수 있는 물질, 멜라닌 생합성을 억제할 수 있는 물질 등이 주름, 탄력 상실, 피부흑화 등의 피부 증상을 완화시키는 것으로 밝혀져 있다.

미백, 노화방지, 항염 효과를 가진 물질들에 관한 연구가 활발히 진행되었으나, 기존의 화학물질들은 독성, 저활성, 용도의 한계성 및 과량복용에 따른 부작용 등의 여러 가지 문제로 사용에 제한을 받고 있어 부작용 가능성이 적은 소재를 개발하려는 일환으로 천연 식물에서의 유효 성분 추출하는 연구가 활발하다. 하지만 천연물 경우에도 안전성, 안정성 변색 가능성 등의 측면에서 화장품이나 의약품에 유효농도 이상으로 사용하는 데는 많은 문제점이 있으며, 만족할 만한 효과를 내지 못하는 실정이다.

한편, 희귀식물로써 잔잎쑥(Artemisia annua)은 개똥쑥 또는 개땅쑥이라고도 한다. 길가나 빈터, 강가에서 자라고, 높이 약 1m로, 풀 전체에 털이 없고 특이한 냄새가 나며, 줄기는 녹색으로 가지가 많이 갈라진다. 꽃은 6~9월에 녹황색으로 피며, 작은 두상화가 이삭처럼 달려서 전체가 원추꽃차례를 이루며, 열매는 수과로 길이 약 0.7mm이다.

최근 들어 식물성 자원을 이용한 기능성 식품 개발 및 화장품 소재로써의 활용에 많은 연구가 이루어지고 있으나, 잔잎쑥에 관해서는 잔잎쑥 추출물을 구취제거에 사용하는 선행 특허 기술(특허문헌 1) 또는 탈모방지, 발모에 이용하는 선행특허기술(특허문헌 2)이 있을 뿐, 그로부터 배양한 식물 세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물에 관한 화장품 소재로써의 연구는 전무한 수준이다.

특허문헌 1: 대한민국등록특허 제10-1102476호 특허문헌 2: 대한민국등록특허 제10-0930839호

본 발명자들은 잔잎쑥의 식물세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물이 항염, 창상 치유를 비롯한 항노화, 피부 수렴, 미백에 효능이 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 잔잎쑥(Artemisia annua)의 식물세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명에 있어서, 상기 피부개선용은 피부 상태의 개선을 의미하며, 예컨대, 피부 수렴용, 미백용을 포함한다.

본 발명의 다른 목적은, 잔잎쑥(Artemisia annua)의 식물세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염 피부 외용제 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 잔잎쑥(Artemisia annua)의 식물세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 창상, 상처 치유용 피부 외용제 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 잔잎쑥의 식물세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용,항염 또는 창상치유용 피부 외용제 조성물의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 잔잎쑥(Artemisia annua L.)의 식물세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 잔잎쑥(Artemisia annua L.)의 식물세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 수렴용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 잔잎쑥(Artemisia annua L.)의 식물세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 잔잎쑥(Artemisia annua L.)의 식물세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 잔잎쑥(Artemisia annua L.)의 식물세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 창상, 상처치유용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 잔잎쑥 (Artemisia annua L.) 식물의 식물 세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 함유한 피부개선용, 항염 또는 창상치유용 피부 외용제 조성물의 제조방법을 제공한다:

(a) 잔잎쑥 식물의 잎 또는 줄기 조직을 분리하여 식물 세포 또는 부정근으로 배양하는 단계; 및 (b) 상기 잔잎쑥 식물세포 배양물 또는 부정근 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물을 제조하는 단계.

본 발명에 따른 잔잎쑥 식물 세포 또는 부정근 배양물 또는 그 추출물을 함유한 피부 외용제 조성물은 피부 세포에 독성이 없으면서도 피부 수렴, 미백, 항염, 창상 치유 효능 등을 가지고 있다.

도 1은 잔잎쑥 식물체로부터 식물세포 유도과정을 나타낸 그림이다.
도 2는 잔잎쑥 식물체로부터 유도된 식물 세포 배양 추출물들의 HPLC 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3 및 도 4는 COX-2, iNOS 발현 증가를 확인한 실험 결과이다.
도 5 는 잔잎쑥 식물체로부터 유도된 식물 세포 배양 추출물들의 창상 치유 기능을 확인하기 위한 실험 결과이다.
도 6은 잔잎쑥 식물체로부터 유도된 식물 세포 배양 추출물들의 창상 치유 기능을 확인하기 위하여, healing area 확인한 그래프이다.

본 발명은 잔잎쑥(Artemisia annua L.)의 식물 세포 또는 부정근 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 일 관점에서, 잔잎쑥(Artemisia annua L.)의 식물 세포 또는 부정근 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 개선용 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, "피부 개선용"이란, 피부의 상태를 개선, 예컨대, 피부 수렴, 항노화, 피부 주름 개선, 피부 탄력 증진, 피부 장벽 기능 보호 또는 강화 등을 모두 포함하는 것이다.

본 발명에 있어서, "유효성분으로 함유하는" 의 의미는, 피부 외용제 조성물로써 상기와 같은 다양한 피부 개선 효과, 미백, 피부수렴, 항염, 창상치유능을 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 잔잎쑥 식물 세포 배양물은 잔잎쑥 식물체의 일부, 예컨대, 줄기, 꽃잎, 뿌리, 잎의 전체 또는 일부를 잘라 유도 배지에서 배양을 통해 얻어지는 것이다.

이와 같은 배양 유도는 식물 조직 배양에 관한 것으로, 식물조직배양은 살아있는 작은 식물 조직을 기내(in vitro)에서 무균적으로 배양하여 배양 목적에 따라서 식물 세포, 기관 및 식물체를 증식 시키는 기술이다. 식물조직배양에는 식물이 지니는 기본적인 특성을 이용한다고 볼 수 있다. 식물조직배양 기술은 식물이 지니는 독특한 특징인 식물의 체세포로부터 식물체를 재생시킬 수 있는 분화전능성(totipotency)을 이용하는 것을 기반으로 하는 기술이다. 즉, 식물의 단세포(원형질체 포함), 잎 및 뿌리 절편을 특정 영양물질 및 생장 조절제가 첨가된 배지에 배양하면 이들 세포 및 조직으로부터 식물체가 재생될 수 있다. 이러한 식물이 분화전능성(totipotency)을 지니는 능력은 식물이 지니는 특성인 고착 생활과 장기간 생존을 위하여 열악한 환경 및 초식동물의 피해로부터 생존을 하기 위한 전략이다. 따라서 식물은 잃어버린 기관을 다시 재생시키기 위한 능력을 갖게 되었다고 볼 수 있다. 모식물체로부터 분리된 식물조직세포는 적정배양환경에서 배양하면 완전한 식물체로 재생될 수 있는 잠재력 즉, 전형성능을 가지고 있는 식물은 발생학 등의 학술적인 중요성은 물론이지만 화장품 원료 등의 실용화를 위해서도 활용가치가 크다.

"식물 세포 배양물"은 식물체에서 잘라낸 조직을 옥신을 함유한 배지에서 배양하거나, 어떤 종류의 식물에 상처를 내거나, 상구를 옥신으로 처리하거나 할 때에 생기는 특수한 조직 또는 세포덩어리를 말한다. 보통 캘러스는 정상적인 기관형성이나 조직분화를 일으키는 능력을 잃은 무정형의 조직 또는 세포덩어리로 대부분 유세포로 되어 있다. 넓은 의미로는 아그로박테리움(agrobacterium) 등의 감염에 의해서 생기는 식물종양조직도 포함시키기도 한다.

따라서, 본 발명에 따른 잔잎쑥의 줄기, 잎 등의 어느 부위로부터 유도된 것이든 모두 가능하나, 일 구체예로, 잔잎쑥의 줄기와 잎의 조직 일부, 또는 잔잎쑥 종자의 발아된 유묘로부터 자엽을 절취하여 유도시킨 식물세포일 수 있고, 잔잎쑥의 어느 조직이든지 일부 잘라내어 옥신 및 사이토키닌의 함량을 조절한 배지에 놓아두면 식물세포가 형성될 수 있다. 부정근 배양의 경우는 식물 세포 배양 과정과 동일하게 진행되나, 다만, 부정근이 유도될 수 있도록 식물 호르몬의 조합을 달리한다. 예컨대, 유도 배지에 포함되는 식물 호르몬이 식물 세포 배양물의 경우, p-클로로페녹시아세트산과 키네틴(Kinetin)의 조합이나, 부정근의 경우에는 p-클로로페녹시아세트산과 제아틴(Zeatin)을 함유시켜 유도 배양한다.

본 발명에 있어서, 상기 잔잎쑥의 식물 세포 또는 부정근 배양물 또는 그 추출물은 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 10 중량%로 함유할 수 있다.

이러한 비율은 단지 바람직한 범위일 뿐이며, 예컨대, 하기 실시예에서는 1 중량%,또는 2중량%의 경우를 실험한 결과를 포함하고 있으나, 5%, 10%에서도 우수한 효능을 가지고 있는 것을 확인하였으며, 세포 생존율 또한 10%에서도 영향이 없음을 확인하였다. 이 이외에 20%, 30% 이상 경우도, 우수한 피부개선효과, 피부 수렴, 항염, 창상치유 기능 등을 가짐은 당업자에게 자명하다.

본 발명에 있어서, 상기 피부개선용은 피부수렴용, 미백용을 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 잔잎쑥의 식물 세포 또는 부정근 배양물 (배양체) 자체를 사용하거나, 배양물을 여과하여 사용하거나, 배양물을 파쇄하여 사용하거나, 배양물을 건조시켜 분말화한 다음, 정제수에 녹여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, "추출물"은 상기 잔잎쑥의 식물 세포 또는 부정근 배양물 추출물을 분말화하거나, 냉수추출법, 열수추출법, 에탄올, 호호바오일 추출법 등 종래 알려진 다양한 추출법에 의해 수득한 추출물을 의미한다.

본 발명에서 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 추출, 열수 추출, 호호바오일 추출 등이 있다. 여기서, 열수추출의 경우, 열탕증류기에서 8∼48시간동안, 80∼100℃로 가열하여 열수 추출물을 얻는다.

냉수 추출의 경우, 예컨대, 냉수 (15∼25℃)에 상기 배양물 자체 또는 그것의 건조된 분말을 혼합하여 3일동안 추출하여 냉수추출물을 얻는다.

또는, 물, 유기 용매, 또는 이의 혼합 용매를 사용하여 추출하는 방법으로 제조될 수 있다. 추출한 액은 바로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 유기용매를 사용하여 추출하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매인 유기용매를 사용하며 생약의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 약제의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 특히, 본 발명에 있어서는 에탄올 추출물, 바람직하게는 20-50% 에탄올 추출물, 일 구체예로써 50% 에탄올 추출물이 바람직하며, 추출방법은 실시예에 기재된 바와 같이, 50% 에탄올에 섞은 후 3일동안 교반하여 얻는다.

본 발명에 있어서, 상기 추출물은 농축, 또는 희석하여 사용할 수 있고, 추출물의 증류액을 사용할 수도 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 잔잎쑥(Artemisia annua L.) 식물의 식물 세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 함유한 피부개선용, 항염 또는 창상 치유용 피부 외용제 조성물의 제조방법을 제공한다:

(a) 잔잎쑥 식물의 잎 또는 줄기 조직을 분리하여 식물 세포 또는 부정근으로 배양하는 단계; 및

(b) 상기 잔잎쑥 식물세포 배양물 또는 부정근 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물을 제조하는 단계.

상기 (a)단계는 잔잎쑥 식물로부터 분리된 일부 조직을 가지고, 식물 조직배양물, 즉, 식물 세포 배양물, 또는 부정근 배양물을 얻는 과정이다.

본 발명에 있어서, 상기 잔잎쑥 식물체의 잎, 줄기, 꽃잎, 또는 뿌리 조직을 분리하여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 분리한 조직으로부터 식물 세포 배양물, 부정근 배양물을 유도를 위해서 적절한 배지를 선택할 수 있다. 상기 (a)단계에서, 구체적으로는 잔잎쑥 식물 세포 또는 부정근 배양하기 위해 적절한 배지를 선택할 수 있다. 기술 분야에서 식물조직배양에 일반적으로 사용되고 있는 배지가 있다면, 제한 없이 사용가능하다. 식물에서는 일반적으로 MS배지, B5배지 등을 주로 사용하고, 일 예로, MS배지의 조성(1L기준시)은 NH₄NO₃ 1650 mg, KNO₃ 1900 mg, CaCl₂.2H₂O 440 mg, MgSO₄.7H₂O 370 mg, KH₂PO₄ 170 mg, KI 0.83 mg, H₃BO₃ 6.2 mg, MnSO₄.4H₂O 22.3 mg, ZnSO₄.7H2O 8.6 mg, Na₂MoO₄.2H₂O 0.25 mg, CuSO₄,5H₂O 0.025 mg, CoCl₂.6H₂O 0.025 mg, FeSO₄.7H₂O 27.8 mg, Na₂EDTA.2H₂O 37.3 mg, Myoinositol 100 mg, Nicotinic acid 0.5 mg, Pyridoxine-HCl 0.5 mg, Thiamine-HCl 0.5 mg, Glycine 2 mg, Sucrose 30000 mg 이다.

식물 잎 유래, 식물 줄기 유래, 식물 꽃잎 유래 등으로부터의 식물 세포 배양 유도시, 기본적인 MS 배지 조성의 차이는 거의 없으나, 식물 세포, 부정근 유도에 있어서 가장 중요한 식물 생장 호르몬의 종류는 상이하다.

본 발명에 따른 식물 세포 배양의 경우, 잎 또는 줄기 유래의 식물 세포 배양의 경우, p-클로로페녹시아세트산(p-chlorophenoxyacetic acid) 및 키네틴(kinetin)을 함유시켜 배양함으로써 식물 세포 배양물을 얻을 수 있다.

각각의 호르몬의 조합 비율은 p-클로로페녹시아세트산(p-chlorophenoxyacetic acid) 및 키네틴(kinetin)이 1:0.01~0.1, 또는 1:0.03~0.0.07인 것을 특징으로 할 수 있다.

한편, 부정근 배양의 경우에는, p-클로로페녹시아세트산(p-chlorophenoxyacetic acid) 및 제아틴(zeatin)을 함유시켜 배양함으로써 부정근 배양물을 얻을 수있다.

각각의 호르몬의 조합 비율은 p-클로로페녹시아세트산(p-chlorophenoxyacetic acid) 및 제아틴(zeatin)이 1:0.01~0.1, 또는 1:0.03~0.07인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 항염, 창상 치유, 미백, 피부 수렴의 효능을 증가시키기 위한 추가적인 단계를 포함할 수 있으며, 이러한 추가적인 처리로는 크게 4가지- 광주기, UVA 처리, 자스몬산, 시킴산 처리를 포함하며, 이러한 처리를 통하여 배양물 내 페놀성 화합물, 카로티노이드, 플라보노이드 함량 증가 또한 가능하다.

본 발명에 있어서, 상기와 같은 추가적인 처리 단계는, 상기 (a)단계에서 배양시, 명/암을 각각 9시간~15시간/15시간~9시간 주기로 광처리하거나, UVA를 3 내지 6시간 처리하거나, 시킴산 또는 자스몬산을 150μM~400μM 배지에 추가하여 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.

일 예시로써,

(1). 광주기 : 매일 30 molm^-2s^-1 광도로 조절된 생장상에 3시간/21시간, 6시간/18시간 및 12시간/12시간(명/암)로 처리하며 배양한다.

(2). UVA: 물리적 유인제인 UV-A 형광 램프(20W, Sankyo Denki, Japan)를 매일 0.5 ~ 8시간 씩 처리하며 배양한다.

(3). 시킴산: 200 ~ 600 μM 시킴산(Shikimic acid)을 MS배지에 넣어서 배양한다.

(4). 자스몬산: 100 ~ 500 μM 자스몬산(Jasmonic acid)을 MS배지에 넣어서 배양한다.

- 광주기 처리 -

MS 기본배지에 p-Chlorophenoxyacetic acid (4-CPA) 2 mg/L, Kinetin 0.1 mg의 생장조절물질을 첨가하여 25℃ 배양 온도와 30 molm^-2s^-1 광도로 조절된 생장상에 광주기를 0시간/24시간, 3시간/12시간, 6시간/18시간, 12시간/12시간으로 처리한 후 8주간 배양한다.

- 물리적 유인제인 UV-A -

MS 기본배지에 p-Chlorophenoxyacetic acid (4-CPA) 2 mg/L, Kinetin 0.1 mg 의 생장조절물질을 첨가하여 25℃ 배양 온도로 5 주간 배양한다.배양 제 6주부터는 UV-A 형광 램프(20W, Sankyo Denki, Japan) 를 이용하여 매일 0시간, 0.5시간, 2시간, 4시간 및 8시간으로 조사한다.

- 시킴산 (Shikimic acid) 처리 -

MS 기본배지에 p-Chlorophenoxyacetic acid (4-CPA) 2 mg/L, Kinetin 0.1 mg의 생장조절물질을 첨가하여 25℃ 배양 온도로 5 주간 배양한다. 시킴산을 배양 제 6주에 50, 100, 250 및 500 μM의 농도로 각각 배지에 첨가하여 배양한다.

- 자스몬산(Jasmonic acid)의 처리 -

식물 방어기작의 발현에 관여하는 신호전달 물질의 일종인 jasmonate와 methyl jasmonate는 식물체의 생리활성물질 함량 증가 뿐만 아니라 식물체의 생장, 발달, 잎의 노화 및 식물체 전체의 방어기작에 관여하는 물질이다. MS 기본배지에 p-Chlorophenoxyacetic acid (4-CPA) 2 mg/L, Kinetin 0.1 mg의 생장조절물질을 첨가하여 25℃ 배양 온도로 5주간 배양한다. 자스몬산은 배양 제 6주에 100, 250 및 500 μM의 농도로 각각 배지에 첨가하여 배양한다.

본 발명에 있어서, 상기 (b)단계에서 있어서, (a)단계의 배양을 통해 얻어진 식물 세포 또는 부정근 배양물 그대로를 포함하는 조성물을 적절한 형태의 피부 외용제 조성물로 제조하거나, 또는 상기 배양물을 공지된 추출 방법을 통해 추출물 형태로 수득하여 적절한 형태의 피부 외용제 조성물로 제조할 수 있다.

예컨대, 상기 (b)단계는, (a)단계에서 얻어진 잔잎쑥의 식물 세포 또는 부정근 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시켜 조성물을 제조하거나,

(a)단계에서 얻어진 잔잎쑥의 식물 세포 또는 부정근 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시킨 다음, 냉수 추출, 열수 추출, 호호바오일을 비롯한 식물성 오일을 이용한 추출, 무기용매를 이용한 추출 또는 에탄올을 비롯한 알코올 등의 유기용매를 이용한 추출하여 조성물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

또 다른 예로, 상기 (a)단계에서 얻어진 배양물을 열풍 건조후 분말화하여 수분을 증발시켜 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서, 피부 수렴 작용의 원리는 피부 단백질의 고분자 flavonoids와 결합하여 가교결합을 형성하여 피부가 수축되는 현상을 말한다. 수렴이란 뜻에는 기본적으로 주름이 지고 혹은 움츠린다는 의미가 있으며, 수렴제는 피부와 점막 혈관 등을 수축시키는 작용이 있고, 세포간극 및 림프간극을 가로막아 점액의 분비를 억제시키는 효과가 있다. 또한 수렴제는 단백질과 결합하는 성질을 가지기 때문에 일반적으로 헤모글로빈의 단백질이 추출물과 결합하는 정도에 따라서 수렴효과 정도를 판단할 수 있다. 이러한 수렴작용에는 외용 혹은 내용에 의해서 피부와 점막의 표면에 난용성의 피막을 형성하고 그 결과 국소를 보호하거나, 혹은 조직을 조밀하게 하여 세포막의 투과성을 감소시키는 효과가 있다고 할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 잔잎쑥 식물 세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물은 우수한 멜라노생성 저해능을 가져, 미백용으로써 활용될 수 있다.

또한 본 발명에 따른 잔잎쑥 식물 세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물은 각질형성세포의 증식 및 이동을 촉진하여, 창상 치유, 항노화 효능을 가진다.

또한 본 발명에 따른 잔잎쑥 식물 세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물은 COX-2 및 iNOS 활성 저해를 통한 항염 효과를 가진다.

본 발명에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물 또는 약제학적 조성물일 수 있다.

상기 화장료 조성물에 있어서는, 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 피부 외용제 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량 %로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 피부 외용제 조성물이 제조되는 후술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로써, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 상기 잔잎쑥 식물 세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물 이외에 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글키롤, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 에탄올, 트리에탄올아민 등을 포함할 수 있으며, 방부제, 항료, 착색료, 정제수 등을 필요에 따라 미량 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은, 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 화장수, 에센스, 젤, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말, 또는 젤라틴 등의 피막이 있는 캅셀 (소프트 캅셀, 하드 캅셀) 제형 등의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 있어서의 피부는 얼굴 뿐만 아니라, 두피, 전신도 포함되는 개념으로, 이러한 두피에 적용될 수 있는 피부 외용제 조성물로써, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 발모제 등이 있고, 전신에 적용될 수 있는 바디클렌져 등의 용도로써 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 잔잎쑥 식물 세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 함유 피부 외용제 조성물의 제조방법은 전술한 제조방법에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 제조방법을 일부 변형시킨 방법으로도 본 발명에 따른 잔잎쑥 식물 세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물을 함유 피부 외용제 조성물을 제조할 수 있다.

특히, 상기 피부 외용제 조성물은 본 발명에 특별히 개시된 제조방법 이외에도, 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조될 수 있다.

피부 외용제 조성물로 제조될 경우, 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일,염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

이러한, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 피부 수렴, 항염, 창상,상처 치유, 항노화 등의 기능성 화장품의 형태를 포함한다.

본 발명에 있어서, 약제학적 조성물의 경우, 하기 실시예에서 제시하는 피부 상태 개선을 위한 약제학적 조성물로써 기능할 수 있다.

이러한 약제학적 조성물은 유효성분인 잔잎쑥 식물 세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물 외에, "약학적으로 허용가능한 담체"를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제 및 방부제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 약학 조성물은 첨가제를 더 포함할 수 있다. 상기 첨가제로 향료, 비타민, 및 항산화제가 포함될 수 있다. 상기 담체로 약제학적으로 허용 가능한 담체는 모두 가능하며, 예를 들면, 희석제로는 유당, 덱스트린, 타피오카(tapioca) 녹말, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘 또는 탈크, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필셀룰로오스일 수 있다. 또한, 붕해제로는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨, 또는 크로스포비돈, 감미제로는 백당, 과당, 솔비톨, 또는 아스파탐, 안정제로는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 베타-사이클로덱스트린, 또는 잔탄검, 방부제로는 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는 솔빈산칼륨일 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 약제학적 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 경구 투여제제, 주사제, 좌제, 경피 투여제제, 및 경비 투여제제의 제형으로 제제화되어 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 제형은 액제, 현탁제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 또는 엑스제와 같은 경구 투여용 제형일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 이하의 실시예에서는 잔잎쑥 식물 세포, 부정근 배양물 또는 그 추출물에 관한 효능을 확인하였으나, 추출물이 아닌 배양물 자체에 대해서도 이러한 효과가 있음은 당업자에게 자명할 것이다.

1-1. 본 발명에 따른 잔잎쑥 식물체로부터 세포 유도

1.1 잔잎쑥식물체의 식물세포의 유도

잔잎쑥 식물체를 70 % 에탄올 및 0.5 % sodium hypochlorite로 5분간 멸균 소독하고, 멸균수로 여러 차례 씻어줬다. 무균의 예리한 칼로 3~5 cm정도 붙은 자엽을 절취하여 MS 기초배지(Murashige and Skoog 1962, Duchefa 사, Cat No. M0221)에 Sucrose 30.0 g/L, Agar 5~ 10.0 g/L, p-Chlorophenoxyacetic acid (4-CPA) 2 mg/L, Kinetin 0.1 mg을 함유한 pH 5.5 ~ 6.0, 바람직하게는 pH 5.7 ~ 5.8의 MS 고체배지에 치상하였다. 약 4주 경과된 후, 배지에 치상된 절취된 자엽에서 잔잎쑥 식물세포가 유도되었다. 유도된 잔잎쑥 식물세포는 2주간격으로 계대배양하여 증식되었다.

1.2 잔잎쑥식물체의 부정근 유도

잔잎쑥 식물체를 70 % 에탄올 및 0.5 % sodium hypochlorite로 5분간 멸균 소독하고, 멸균수로 여러 차례 씻어줬다. 조심스럽게 핀셋과 날카로운 칼을 이용하여 단번에 잘라, 잘라진 잎 부분이 MS 기초배지(Murashige and Skoog 1962, Duchefa 사, Cat No. M0221)에 Sucrose 30.0 g/L, Agar 5~ 10.0 g/L, p-Chlorophenoxyacetic acid (4-CPA) 2 mg/L, Zeatin 0.1 mg을 함유한 pH 5.5 ~ 6.0, 바람직하게는 pH 5.7 ~ 5.8의 MS 고체배지에 치상하였다. 2~ 3주간 배양하여 부정근을 유도하였다. 유도된 잔잎쑥 부정근은 2주간격으로 계대배양하여 증식되었다.

1-2. 생리활성물질을 높이기 위한 식물 세포, 부정근 배양 및 대량 생산

무균상태로 유도된 잔잎쑥 식물체의 식물세포 및 부정근을 3% Sucrose 및 p-Chlorophenoxyacetic acid (4-CPA) 2 mg/L, Kinetin 0.1 mg가 포함된 MS배지에서 2~ 3주의 일정기간 간격으로 계대 배양하였고, 이후, 풍선형 생물반응기(삼성과학)를 이용하여 Agar를 제외한 동일한 조성의 액체 배지에서 온도 25℃, 공기공급량을 0.1vvm으로 일정하게 조절하며 14일 간격으로 배양하며 증식하였다. 배양 5주차에 매일 30 μmolm^-2s^-1 광도로 12h/12h(명/암) 처리, UV-A를 매일 4h씩 처리, 250 μM 시킴산(Shikimic acid) 및 250 μM 자스몬산(Jasmonic acid)을 MS배지에 추가하여 1주간 추가배양한 후 수확하였다.

1-3. 본 발명에 따른 잔잎쑥 식물체로부터 유도된 식물 세포, 부정근 배양 추출물 제조

증식된 잔잎쑥 식물세포, 부정근을 수확하여 깨끗한 티슈로 충분히 수분을 제거한 후 60℃로 2일 동안 건조기에서 건조하였다. 건조된 배양체 100g을 용기에 담고, 정제수 10 L(혹은 70% 에탄올 10L)를 넣은 후, 열탕증류기에서 8 ~ 48시간동안, 80 ~100℃ 로 가열하여 열수 추출물을 얻었다. 추출 후, mesh로 여과하고 고형분을 제거하여, 잔잎쑥 식물세포배양추출물 및 부정근 추출물을 제조하였다.

1-4. 배양 추출물의 HPLC 성분 분석

잔잎쑥 식물세포 및 부정근 배양추출물을 HPLC로 성분분석을 수행하였다. 분석조건은 다음과 같았다.

구 분	분 석 조 건
HPLC 기기 종류	Waters 1525 Binary HPLC Pump
Column 종류	Gemini 5 C18 110 A (Phenomenex 사)
Column 규격	250 * 4.60 mm, 5 micron
용매 조건	- 용매 A : Water (0.1 % TFA (Trifluoro acetic acid) 함유) - 용매 B : Acetonitrile (0.1 % TFA (Trifluoro acetic acid) 함유)
파장	234 nm (UV 램프)
유속	1 ml/min

식물 세포 배양물의 추출물 성분 분석 결과, 도 2와 같은 HPLC 분석 피크 결과를 얻을 수 있었으며, 부정근 배양 열수 추출물, 에탄올 추출물도 유사한 피크값을 가지는 것으로 확인되었다. 잔잎쑥의 배양이 아닌, 성체로부터 얻은 추출물은 상기 잔잎쑥 성체 식물체를 60℃로 2일동안 건조기에서 건조한 후 건조된 배양체를 100g을 용기에 담고 정제수 10L(혹은 70% 에탄올 10L)를 넣은 후, 열탕 증류기에서 8~48시간, 80~100℃로 가열하여 열수 추출물을 얻은 후, mesh로 여과하고 고형분을 제거하여, 잔잎쑥 성체 추출물을 제조하였다. 이러한 성체 추출물과 상기 잔잎쑥 식물세포 배양 추출물은 상이한 피크값을 가지는 것으로 나타났다.

실험예 1: 본 발명에 따른 잔잎쑥 식물세포 및 부정근 배양추출물의 COX -2 및 iNOS 활성 저해를 통한 항염 효과 시험

인간 각질 형성세포주 HaCaT(human keratinocyte)를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% Fatal bovine serum(FBS), 1% Antibiotic-Antimycotic (GIBCO, Cat.#15240-062)과 함께 100 mm/60.1 cm culture dish에서 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다. HaCaT이 90%정도 confluence 될 때 100 mm/60.1 cm² culture dish에 1×10⁵cells/dish 분주한 후 24시간 배양하고, 1%의 시험물질 농도로 처리하였다. 물질처리 후 4시간동안 추가배양 후 cell lysis buffer(0.1% SDS, 1% NP40, 150 mM NaCl, 0.5% sodium deoxycholate, 50 mM Tris-Cl(pH 7.5) and protease inhibitors [Roche,Mannheim, Germany])를 이용해 단백질을 추출하고 BCA assay로 단백질을 정량하였다. 정량한 단백질의 일정량을 SDS-polyacrylamide gel에 loading하여 전기영동으로 분리하고, NC membrane으로 분리된 protein을 transfer 시키고 이 membrane을 blocking solution(5% skim milk in TBST(Tris-buffered saline with 0.1% Tween 20))에 담가 30분이상 blocking 시키고 TBST로 washing 후 primary antibody (COX-2, Abcam, Cat.# ab-6665) solution에 담가 4에서 overnight으로 반응시켰다. 그 후에 TBST로 10분간 3번 washing하고 Primary antibody conjugated secondary antibody (COX-2 : rabbit, iNOS: mouse)를 2시간동안 반응시켰다. 이렇게 완성된 blot은 ECL solution kit(amersham, UK)으로 발색하여 분석하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제시된 바와 같은 방법으로 토마토 식물세포, 함초 식물세포, 풍난 식물세포를 유도한 결과물들은 COX-2, iNOS 유전자 발현을 감소시키지 못하는 것으로 나타났다. 또한, 도 4에 나타난 바와 같이, 잔잎쑥의 식물세포 및 부정근 추출물을 처리하여 COX-2 및 iNOS 단백질 발현에 미치는 영향을 관찰한 결과, (양성대조군으로 5uM hydrocortisone을 사용), 열수 추출 및 에탄올 추출에 의한 식물세포 및 부정근 배양추출물 모두 COX-2, iNOS 발현을 감소시킴을 확인하였다.

이로써, 본 발명에 따른 잔잎쑥 식물 세포, 부정근 배양 추출물은 항염, 염증 억제 효능이 있으며, 제조 방법에 있어서도 유인제의 처리과정이 다른 종 유래 식물세포 배양물에는 맞지 않는 잔잎쑥의 항염 효능을 증대하는 특유의 유인제 처리임을 알 수 있었다.

실험예 2: Wound healing assay 를 이용한 창상치유 , 항노화 효능 시험

인간 각질형성세포주 HaCaT(human keratinocyte)를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 10% Fatal bovine serum (FBS), 1% Antibiotic-Antimycotic (GIBCO) 과 함께 100 mm/60.1 cm² culture dish에서 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다. HaCaT이 90%정도 confluence 될 때 100 mm/60.1 cm² dish에 1.5×10⁵ cells/12well plate 분주한 후 24시간 배양하고, FBS를 포함하지 않는 배지로 교체한 후 각 well에 200P tip을 이용해 #모양으로 스크레치를 내고 시험물질 즉, 잔잎쑥식물체로부터 유도된 식물세포, 부정근 배양 추출물 1%를 각각 처리하였다. 물질처리 후 0시간대에 cell image를 현미경 사진으로 찍고 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다. 물질처리 후 18-20 시간동안 추가배양 후 배지를 제거하고 fixing solution(4% paraformaldehyde)으로 넣고 15분간 상온에서 incubation하고 PBS로 3번 washing하였다. Fixed cells은 4℃에서 한달 동안 보관이 가능하였다. Wound healing이 된 정도는 현미경으로 사진을 찍어 Image J라는 프로그램을 이용하여 계산하였다. 양성 대조군은 300ng/ml EGF를 사용하였다.

Wound healing assay를 이용하여 시험물질에 의한 세포 proliferation 및 migration을 촉진하는지의 유무를 관찰하여 항노화 효능을 평가하고자 하였다. 양성대조군으로 300ng/ml EGF를 사용하였다.

잔잎쑥으로부터 유도된 식물세포, 및 부정근 배양추출물을 1% 농도로 각각 처리하여 실험한 결과 도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, 열수추출 및 에탄올 추출에서 식물세포 및 부정근 추출물 모두에서 대조군과 비교하여 피부세포과 바닥에 붙어 자라면서 healing area가 증가함을 확인하였다. 아울러, 유인제 처리 과정 중 일부 광주기 유인제 처리만 한 경우에 비해, 실시예 1에서와 같은 4가지 유인제 처리를 모두 진행 한 경우 가장 우수한 창상 치유효과를 가지는 것으로 나타났다.

실험예 3: 피부 수렴 효능 시험

수렴작용의 원리는 피부 단백질이 고분자 flavonoids와 결합하여 가교결합을 형성하여 피부가 수축되는 현상을 말한다. 수렴이란 뜻에는 기본적으로 주름이 지고 혹은 움추린다는 의미가 있으며, 수렴제는 단백질과 결합하는 성질을 가지기 때문에 일반적으로 헤모글로빈의 단백질이 추출물과 결합하는 정도에 따라서 수렴효과 정도를 판단할 수 있다. 이러한 수렴작용에는 외용 작용에 의해서 피부와 점막의 표면에 난용성의 피막을 형성하고, 조직을 조밀하게 하여 세포막의 투과성을 감소시키는 효과가 있다고 할 수 있다. 수렴 효과 측정을 위해 피부단백질과 유사한 혈액단백질(hemoglobin, Sigma, Cat.# 08449)을 사용하여 측정하였다. 원심분리관 용기에 각각의 시료용액과 헤모글로빈 용액(500ppm)을 1:1로 넣어서 진탕 혼합한 다음 1,500 rpm에서 3분간 원심분리 후 576 nm에서 흡광도를 측정하였다. 수렴효과의 측정은 시료와 대조군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

[수학식 1]

수렴효과(%) = (1-시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도)×100

		처리농도	수렴 효과 측정 (Astringent activity test) ( % of control)
	대조군	-	0
	Tannic acid	-	37.9
열수 추출	잔잎쑥 식물세포 배양 추출물	0.5 %	3.5
		1 %	16.2
		5 %	33.1
	잔잎쑥 부정근 배양 추출물	0.5 %	2.1
		1 %	11.3
		5 %	18.3
	토마토 식물세포 배양 추출물	0.5 %	0.5
		1 %	1.9
		5 %	3.3
	함초 식물세포 배양 추출물	0.5 %	0.6
		1 %	2.1
		5 %	3.8
	풍란 식물세포 배양 추출물	0.5 %	0.7
		1 %	2.6
		5 %	5.9
에탄올 추출	잔잎쑥 식물세포 배양 추출물	0.5 %	4.5
		1 %	17.2
		5 %	35.1
	잔잎쑥 부정근 배양 추출물	0.5 %	3.1
		1 %	13.3
		5 %	25.3

잔잎쑥의 식물세포 및 부정근 배양추출물의 수렴 효과를 측정한 결과, 대조군과 비교하여 잎에서 유도된 식물세포 및 부정근 배양 추출물에서 농도의존적으로 수렴효과가 뛰어남을 확인하였다.

광주기 조건만을 처리하였을 경우,

		처리농도	수렴 효과 측정 (Astringent activity test) ( % of control)
	대조군	-	100
열수 추출	잔잎쑥 식물세포 배양 추출물	0.5 %	100.1
		1 %	96.2
		5 %	93.1
	잔잎쑥 부정근 배양 추출물	0.5 %	99.5
		1 %	95.3
		5 %	98.3

광주기 12시(명)/12시(암) 조건만을 처리하여 수렴효과를 측정한 결과, 광주기 조건만으로 수렴효과에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.

잔잎쑥의 식물세포 및 부정근 배양추출물의 수렴 효과를 측정한 결과, 대조군과 비교하여 잎에서 유도된 식물세포 및 부정근 배양 추출물에서 농도의존적으로 수렴효과가 뛰어남을 확인하였다.

실험예 4: B16F10 malanoma cell 을 이용한 melanogenesis 저해 측정

Melanin 생성 세포인 B16F10을 10% FBS, 1% antibiotics를 첨가한 DMEM 배지에서 37℃, 5%, CO2 조건에서 배양하였다. 1%의 잔잎쑥 식물세포 및 부정근배양추출물에 의한 melanin 생성량 변화를 확인하기위해 B16F10 cell을 1.5×10³ cells/well의 농도로 10% FBS을 포함하는 DMEM 배지에 현탁시켰다. 현탁세포 (5ml)를 tissue culture flask에 넣은 후 1일간 부착시킨다. 부착한 후에 검정 시료를 첨가한 후, 5% CO2 조건으로 37℃에서 5일간 배양하였다. 배양을 마친 B16F10 cell을 phosphate buffered saline (PBS)로 씻고 trypsinization 하였다. 세포를 corning tube에 모은 후 1×10⁶ cell/ 당 1N NaOH 용액 1ml을 넣어 세포를 녹인 다음, microplate reader로 490nm에서 흡광도를 측정하여 melanogenesis 저해율을 구하였다.

본 발명에서 잔잎쑥 식물로부터 유래된 식물세포 및 부정근 배양추출물이 B16/F10 melanoma cell의 멜라닌 합성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 시험물질 각 농도별로 처리하여 3일간 배양한 후 총 멜라닌 양을 측정하였다.

[수학식 3]

Inhibition of melanogenesis (%) = [1 - (Absample/Abcontrol)]×100

그 결과, 열수 추출 및 에탄올 추출에 의한 잔잎쑥 식물세포배양 추출물과 부정근 배양 추출물 모두 농도의존적으로 멜라닌 합성을 감소시킴을 확인하였다.

		처리농도	Melanin Contents ( % of control)
	대조군	-	100
열수 추출	잔잎쑥 식물세포 배양 추출물	0.5 %	95.1
		1 %	76.2
		5 %	83.1
	잔잎쑥 부정근 배양 추출물	0.5 %	91.5
		1 %	81.3
		5 %	78.3
	토마토 식물세포 배양 추출물	0.5 %	101.1
		1 %	98.3
		5 %	97.2
	함초 식물세포 배양 추출물	0.5 %	99.9
		1 %	97.1
		5 %	95.1
	풍란 식물세포 배양 추출물	0.5 %	99.6
		1 %	97.1
		5 %	96.2
에탄올 추출	잔잎쑥 식물세포 배양 추출물	0.5 %	94.5
		1 %	77.2
		5 %	75.1
	잔잎쑥 부정근 배양 추출물	0.5 %	93.1
		1 %	73.3
		5 %	75.3

광주기 조건만을 처리하였을 경우,

		처리농도	Melanin Contents ( % of control)
	대조군	-	100
열수 추출	잔잎쑥 식물세포 배양 추출물	0.5 %	100.1
		1 %	96.2
		5 %	93.1
	잔잎쑥 부정근 배양 추출물	0.5 %	99.5
		1 %	95.3
		5 %	98.3

광주기 조건만을 처리하여 측정한 결과, 광주기 12시(명)/12시(암) 조건만을 처리하여 멜라닌 합성을 감소시키지 못함으로 확인하였다.

피부 외용제 조성물의 제조

본 발명의 잔잎쑥 식물, 부정근 배양 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장품으로 영양화장수, 크림, 에센스 등의 유화 제형의 화장품 및 유연화장수 등의 가용화 제형의 화장품을 제조하였다.

제조예 2-1: 화장수

다음 처방에 따라 통상의 화장수 제조 방법에 따라 제조하였다.

원 료 명	중량 %(w/w)
글리세린	5.0
디프로필렌글리콜	3.0
히아루론산	0.5
폴리옥시에틸렌 경화피마자유	0.1
폴리에틸렌 올레일에틸	0.1
에탄올	5.0
방부제	0.15
항료	적량
착색료	적량
잔잎쑥 식물 세포, 부정근 배양 추출물	2.0
정제수	to 100

제조예 2-2: 에센스

다음 처방에 따라 통상의 에센스 제조 방법에 따라 제조하였다.

원 료 명	중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올	1.0
자기유화형모노스테아린산	1.0
밀납	0.5
스쿠알란	5.0
이소세틸옥타노에이트	3.0
디메틸실록산	0.3
모노스테아린산소르비탄	0.5
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜	8.0
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	0.2
카르복시폴리머	0.22
트리에탄올아민	0.25
방부제	적량
향료	적량
착색료	적량
잔잎쑥 식물 세포, 부정근 배양 추출물	7.0
정제수	to 100

제조예 2-3: 로션

다음 처방에 따라 통상의 로션 제조 방법에 따라 제조하였다.

원료명	중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올	0.8
자기유화형모노스테아린산	1.0
밀납	0.5
스테아린산	0.5
유동파라핀	7.0
스쿠알란	5.0
마카데미아오일	3.0
이소세틸옥타노에이트	2.0
디메틸실록산	0.3
모노스테아린산소르비탄	0.5
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜	1.2
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	4.0
베타인	4.0
카르복시폴리머	0.12
트리에탄올아민	0.15
방부제	0.25
향료	적량
착색료	적량
잔잎쑥 식물 세포, 부정근 배양 추출물	5.0
정제수	to 100

제조예 2-4: 크림

다음 처방에 따라 통상의 크림 제조 방법에 따라 제조하였다.

원 료 명	중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올	3.0
자기유화형모노스테아린산	1.5
친유형모노스테아린산	1.5
밀납	0.5
유동파라핀	8.0
스쿠알란	7.0
이소세틸옥타노에이트	4.0
정제호호바유	4.0
디메틸실록산	0.3
모노스테아린산소르비탄	1.0
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜	1.2
글리세린	6.0
프로필렌글리콜	4.0
베타인	4.0
산탄검	0.06
트리에탄올아민	0.10
방부제	0.25
향료	적량
착색료	적량
잔잎쑥 식물 세포, 부정근 배양 추출물	7.0
정제수	to 100

제조예 2-5: 젤

다음 처방에 따라 통상의 젤 제조 방법에 따라 제조하였다.

원료명	중량 %(w/w)
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	4.0
에탄올	10
폴리옥시에틸렌경화피마자유	0.1
카르복시폴리머	0.30
트리에탄올아민	0.30
방부제	적량
향료	적량
착색료	적량
잔잎쑥 식물 세포, 부정근 배양 추출물	1.0
정제수	to 100

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

1. 다음의 단계를 포함하는 잔잎쑥(Artemisia annua L.) 식물 세포 또는 부정근 배양물 또는 그 추출물을 함유한 화장료 조성물의 제조방법:
   (a) 잔잎쑥 식물의 잎, 또는 줄기 조직을 분리하여 식물 세포 또는 부정근으로 배양하는 단계; 및
   (b) 상기 잔잎쑥 식물세포 배양물 또는 부정근 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제조하는 단계로,
   상기 (a)단계는,
   (i) 상기 잔잎쑥 식물의 잎 또는 줄기 조직을 분리하여 p-클로로페녹시아세트산(p-chlorophenoxyacetic acid) 및 키네틴(kinetin)을 함유한 배지에서 배양함으로써 식물 세포 배양물을 얻는 단계이거나,
   (ii) 상기 잔잎쑥 식물의 잎 또는 줄기 조직을 분리하여 p-클로로페녹시아세트산(p-chlorophenoxyacetic acid) 및 제아틴(zeatin)을 함유한 배지에서 배양함으로써 부정근 배양물을 얻는 단계이고,
   상기 (a)단계에서 배양시, 명/암을 각각 9시간~15시간/15시간~9시간 주기로 광처리하고, UVA를 3 내지 6시간 처리하고, 시킴산 또는 자스몬산을 150uM~400uM 배지에 추가하여 배양하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 (b)단계는, (a)단계에서 얻어진 잔잎쑥 식물세포 배양물 또는 부정근 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시켜 조성물을 제조하거나, 분말화하여 정제수에 혼합시킨 다음, 초음파 추출, 알코올 추출 또는 열수 추출하여 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
   
   
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