KR20220074501A - 항염/항진 화장품 조성물 및 이를 포함하는 화장품 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 뱀독의 독성을 중화시켜 무독화 시킨 뱀독의 무독화 물을 유효성분으로 하는 항염/항진 화장품 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 칠점사 또는 살모사로부터 추출된 생독을 중화시켜 무독화 시킨 무독화물을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 하는 항염/항진 화장품 조성물 및 이를 포함하는 화장품이 개시된다.
Description
본 발명은 항염/항진 화장품 조성물 및 이를 포함하는 화장품에 관한것으로, 보다 구체적으로 뱀독의 독성을 중화시켜 무독화 시킨 뱀독의 무독화 물을 유효성분으로 하는 항염/항진 화장품 조성물 및 이를 포함하는 화장품에 관한 것이다.
피부는 신체의 최외각에 존재하는 기관으로 인체를 외부의 환경으로부터 보호하는 역할을 한다. 피부는 성인의 경우, 몸무게의 약 7%를 차지하며, 외부로부터 오는 물리적, 화학적 자극으로부터 인체를 보호하는 기능을 수행하고 있다. 또한 혈관을 통하여 체온 조절을 하고, 면역세포를 이용하여 면역 반응을 수행하고 있다. 이 외에도 수분의 증발 방지, 외부 자극에 대한 감각 기능, 노폐물 분비 및 배설, 대사, 흡수 등의 다양한 기능을 가지고 있으므로 피부는 인체의 정상적인 생리활성을 유지하는데 핵심적 역할을 하고 있다. 그러나 피부는 스트레스, 햇빛, 대기오염, 담배 등의 외부환경에 노출되어 활성산소종(reactive oxygen species; ROS)이 발생하여, 과산화 지질이 생성되고 콜라겐과 엘라스틴 등의 피부 구성 단백질이 변형이 된다. 또한 나이가 들어감에 따라 피부 세포의 활성이 저하되면서 콜라겐과 엘라스틴의 생성 능력이 저하되고, 그 결과로 피부의 진피층이 파괴되면서 피부 내부 구조가 약해지고 피부가 얇아지게 되면서, 지방층이 엷은 얼굴에 주름의 형성이 촉진된다.
또한 진피층 내에서 피부보습을 담당하는 점다당질(Glycosaminoglycans; GAGs)이 피부노화로 인하여 감소하게 되어 피부가 건조해지며 색소 침착, 탄력 감소 등의 노화 피부의 특징이 나타나게 된다. 피부노화에서 가장 두드러진 점은 피부 주름 생성이다. 피부 주름은 진피층과 관련이 깊으며, 특히 진피층에 존재하는 콜라겐(collagen)과 엘라스틴(elastin)이 항노화의 중요한 인자로 알려져 있다. 따라서 주름개선 문제에 가장 많이 이용되는 방법으로는 콜라겐 및 엘라스틴의 합성을 촉진 하거나 또는 이들의 분해를 억제하여 주름 및 탄력을 개선하는 연구개발이 기존에 주로 이루어져 왔다.
한편, 독이란 생체에서 물리, 화학적 반응을 통해서 생리적으로 어떤 해로운 변조(變調)를 일으키는 물질로, 이로운 효능을 나타내면 약이 되고 그 반대이면 독이 된다. 독을 이용한 연구로서 전갈, 지네 등의 독소 중 특정 성분을 마취제로 사용하는 연구가 진행되었으며, 뱀독 성분을 동맥경화증 예방을 위한 약학조성물으로 활용 하기 위한 연구개발도 활발하게 진행되고 있으며, 독 개구리에서 추출한 물질인 '에피바티딘'은 모르핀보다 200배 강한 진통제로 활용되고 있다.
더불어, 독을 이용한 기능성 화장품 조성물에 관한 선행기술을 보면 대한민국 등록특허 제10-1508614호는 스파이더 실크 단백질, 거머리 추출물, 봉독 추출물 및 뱀독 유사 펩타이드 복합물로 제조된 포이즌 콤플렉스를 유효성분으로 함유하는 항노화 화장품 조성물을 개시하고 있고, 대한민국 등록특허 제10-1374327호는 장수말벌독 추출물을 이용한 기능성 화장품 조성물을 개시하고 있다.
본 발명에서는 칠점사 또는 살모사로부터 수득되는 뱀독을 중화시켜 무독화함으로써, 화장품의 기능성원료로 사용될 수 있는 기능성물질을 확보함으로써 피부의 항염/항진 효능을 확보한 항염/항진 화장품 조성물 및 이를 포함하는 화장품을 제공하는 것을 그 해결과제로 한다.
상기한 과제를 해결한 본 발명의 항염/항진 화장품 조성물은 칠점사 또는 살모사로부터 추출된 생독을 중화시켜 무독화 시킨 무독화물을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 화장품 조성물은 천연물 추출물 99.99 ~ 99.85중량% 및 무독화물 0.01~ 0.15중량%를 포함하는 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 천연물 추출물은 상황버섯추출물, 국화추출물, 황금추출물, 포트마리골드 추출물, 콩발효추출물, 겨우살이추출물을 1:1:1:1:1:1의 중량비로 혼합한 혼합물인 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 무독화물은 하기의 방법으로 중화시켜된 것을 특징으로 한다.
칠점사 또는 살모사로부터 생독을 추출하고, 추출 후 30분 이내에 추출된 생독을 -50~-60℃에서 냉동 보관하는 생독추출공정;
상기 냉동 보관된 생독을 상온에서 일정시간 녹인 후, 용기에 상기 생독과 주정도 15%~85%의 주정을 1~3:10의 중량비로 혼합한 다음, 그 주정혼합물을 온도 50~90℃ 범위에서 30~60분간 중탕하여 생독을 중화하는 생독중화공정;
상기 생독중화공정이 완료된 주정혼합물을 건조기에서 70~80℃ 온도조건으로 30~60분간 건조하여 중화독을 얻는 건조공정;
상기 건조공정이 완료된 중화독에 오일 및 천연물추출물을 중화독, 오일 및 천연물추출물은 1~10:1~180:3~30의 중량비로 혼합하여 피부트러블인자를 상쇄시켜 무독화하여 무독화 독을 얻는 증폭공정;
상기 증폭공정이 완료된 후, 밀랍, 개구리기름, 백목이 버섯추출물, 글리세린으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 부재료를 상기 무독화 독과 부재료의 혼합비는 1:9~400의 중량비로 혼합하여 융합시키는 융합공정; 및
상기 융합공정이 완료된 후, 수득되는 원료를 무균실에서 7~15일간 숙성시키는 숙성공정을 포함하여 이루어지며,
상기 건조공정의 오일은 식물성 오일 및/또는 동물성 오일을 사용하며, 상기 천연물추출물은 건조된 고삼, 국화, 황금, 연교, 감초, 생선 비늘, 송진, 뱀 허물, 금은화, 어성초 및 상황버섯을 일정중량비로 혼합한 혼합물을 열 추출하여 얻어지는 추출액을 농축하여 된 천연물추출물 농축물을 사용하며,
상기 천연물추출물 농축물은 건조된 고삼, 국화, 황금, 연교, 감초, 생선 비늘, 송진, 뱀 허물, 금은화, 어성초 및 상황버섯을 1:1:1:1:1:1:1:1:1:2:2의 중량비로 혼합한 천연물혼합물인 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 천연물추출물 농축물은 하기의 단계로 이루어지는 제조방법에 의해 얻어지는 것을 특징으로 한다.
천연물혼합물 대비 4~6배의 중량비로 정제수를 고압용기에 담아 끓이는 단계;
상기 단계의 끓인 물에 상기 천연물혼합물을 넣고 용기의 덮게를 닫고 60~90분간 침지시켜 방치시키는 단계;
방치 후, 여과기로 여과하여 고형물을 제거하고 여과액을 수득하는 단계;
상기 수득된 여과액을 용기에 담아 열을 가하여 기화하는 수증기를 냉각시켜 증류수를 수득하는 단계; 및
상기 수득되는 증류수를 일정 온도범위에서 농축하는 단계.
또한, 본 발명에서는 이상의 본 발명에 따른 화장품 조성물을 포함하는 항염/항진 화장품을 제공한다.
본 발명에 따라 제공되는 항염/항진 화장품 조성물은 특히 뱀독을 특별한 방법으로 중화시켜 무독화 시킨 무독화 독을 유효성분으로 포함하고, 항염/항진에 효능이 있는 천연물추출물을 혼합하여 구성함으로써 피브트러블, 아토피, 피부염증 등 피부질환에 효과가 있는 화장품을 제공할 수 있는 장점이 있다.
도 1 은 본 발명에 따른 화장품 조성물을 로션형태로 제조한 셈플시료를 도시한 사진이다.
도 2 는 본 발명에 따른 화장품 조성물을 사용하여 제조된 시료(로션)의 경시적 변화에 따른 pH측정결과를 도시한 그래프이다.
도 3 은 본 발명에 따른 화장품 조성물을 사용하여 제조된 시료(로션)의 경시적 변화에 따른 따른 점도측정결과를 도시한 그래프이다.
도 4 내지 12는 본 발명에 따른 일실시예에 따른 실험결과를 도시한 그래프들이다.
도 2 는 본 발명에 따른 화장품 조성물을 사용하여 제조된 시료(로션)의 경시적 변화에 따른 pH측정결과를 도시한 그래프이다.
도 3 은 본 발명에 따른 화장품 조성물을 사용하여 제조된 시료(로션)의 경시적 변화에 따른 따른 점도측정결과를 도시한 그래프이다.
도 4 내지 12는 본 발명에 따른 일실시예에 따른 실험결과를 도시한 그래프들이다.
이하, 본 발명을 바람직한 실시형태를 들어 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
본 발명은 항염/항진 화장품 조성물 및 이를 포함하는 화장품에 관한것으로, 보다 구체적으로 뱀독의 독성을 중화시켜 무독화 시킨 뱀독의 무독화 물을 유효성분으로 하는 항염/항진 화장품 조성물 및 이를 포함하는 화장품을 제공하는 것을 그 목적으로 하고 있는 것으로,
상기 목적을 달성한 본 발명의 본 발명의 항염/항진 화장품 조성물은 칠점사 또는 살모사로부터 추출된 생독을 중화시켜 무독화 시킨 무독화물을 유효성분으로 하는 것을 그 기술적 구성으로 하고 있다.
보다 구체적으로, 상기 화장품 조성물은 천연물 추출물 99.99 ~ 99.85중량% 및 무독화물 0.01~ 0.15중량%를 포함하는 것이다.
본 발명에 따르면, 상기 화장품 조성물을 구성하는 상기 천연물 추출물은 항염/항진 효과가 있는 천연물이라면 어느 것을 사용하여 추출한 추출물을 사용하여도 무방하다. 바람직하게는 본 발명을 구성하는 상기 천연물추출물은 상황버섯추출물, 국화추출물, 황금추출물, 포트마리골드 추출물, 콩발효추출물, 겨우살이추출물을 1:1:1:1:1:1의 중량비로 혼합한 혼합물을 사용하는 것이다.
이때, 상기 천연물 추출물은 통상의 방법에 따라 열수추출 또는 주정을 이용한 추출물을 사용한다.
본 발명에 따르면, 상기 무독화물은 하기의 개시되는 방법으로 중화시켜된 것을 사용한다.
[뱀독의 무독화 방법]
칠점사 또는 살모사로부터 생독을 추출하고, 추출 후 30분 이내에 추출된 생독을 -50~-60℃에서 냉동 보관하는 생독추출공정;
상기 냉동 보관된 생독을 상온에서 일정시간 녹인 후, 용기에 상기 생독과 주정도 15%~85%의 주정을 1~3:10의 중량비로 혼합한 다음, 그 주정혼합물을 온도 50~90℃ 범위에서 30~60분간 중탕하여 생독을 중화하는 생독중화공정;
상기 생독중화공정이 완료된 주정혼합물을 건조기에서 70~80℃ 온도조건으로 30~60분간 건조하여 중화독을 얻는 건조공정;
상기 건조공정이 완료된 중화독에 오일 및 천연물추출물을 중화독, 오일 및 천연물추출물은 1~10:1~180:3~30의 중량비로 혼합하여 피부트러블인자를 상쇄시켜 무독화하여 무독화 독을 얻는 증폭공정;
상기 증폭공정이 완료된 후, 밀랍, 개구리기름, 백목이 버섯추출물, 글리세린으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 부재료를 상기 무독화 독과 부재료의 혼합비는 1:9~400의 중량비로 혼합하여 융합시키는 융합공정; 및
상기 융합공정이 완료된 후, 수득되는 원료를 무균실에서 7~15일간 숙성시키는 숙성공정을 포함하여 이루어지며,
바람직하게 상기 건조공정의 오일은 식물성 오일 및/또는 동물성 오일을 사용하며, 상기 천연물추출물은 건조된 고삼, 국화, 황금, 연교, 감초, 생선 비늘, 송진, 뱀 허물, 금은화, 어성초 및 상황버섯을 일정중량비로 혼합한 혼합물을 열 추출하여 얻어지는 추출액을 농축하여 된 천연물추출물 농축물을 사용하며,
상기 천연물추출물 농축물은 건조된 고삼, 국화, 황금, 연교, 감초, 생선 비늘, 송진, 뱀 허물, 금은화, 어성초 및 상황버섯을 1:1:1:1:1:1:1:1:1:2:2의 중량비로 혼합한 천연물혼합물을 사용한다.
바람직하게, 상기 뱀독을 무독화하는 방법에 따라 사용되는 상기 천연물추출물 농축물은 하기의 단계로 이루어지는 제조방법에 의해 얻어지는 것을 사용하는 것이다.
[천연물추출물 농축물 제조방법]
천연물혼합물 대비 4~6배의 중량비로 정제수를 고압용기에 담아 끓이는 단계;
상기 단계의 끓인 물에 상기 천연물혼합물을 넣고 용기의 덮게를 닫고 60~90분간 침지시켜 방치시키는 단계;
방치 후, 여과기로 여과하여 고형물을 제거하고 여과액을 수득하는 단계;
상기 수득된 여과액을 용기에 담아 열을 가하여 기화하는 수증기를 냉각시켜 증류수를 수득하는 단계; 및
상기 수득되는 증류수를 일정 온도범위에서 농축하는 단계.
본 발명에 따르면, 상기 융합공정(공정 5)이 완료된 후, 수득되는 원료를 용기에 담아 무균실에서 7~15일간 숙성시키는 숙성공정에서 상기 무균실에서의 36℃이하의 온도조건에서 이루어지는 것이 좋다. 더 바람직하게 그 온도는 24~36℃의 온도범위를 유지하는 것이 좋다. 이는 36℃를 초과하는 온도환경에서는 숙성과정 중에 단백질 변성이 일어나 부패할 수 있기 때문이다.
또한, 그 숙성시간은 7~15일 이내로 한정하는 이유는 7일 미만일 경우에는 숙성된 무독화독의 기대되는 성질 변화, 즉 유용단백질들의 점도의 확보를 기대하기 어렵고, 15일을 초과할 경우에는 단백질(펩타이드) 변성이 일어나 부패될 수 있는 문제가 있을 수 있기 때문이다.
본 발명에 따르면, 상기 생독추출공정에서 칠점사 또는 살모사로부터 추출된 생독은 상온에 둘 경우, 그 성질이 변화될 수 있기 때문에 바람직하게 추출 후 30분 이내에 냉동보관하는 것이 좋다.
이렇게 냉동보관된 생독은 일반적으로 중탕방식으로 열을 가하거나 끓여서 중화시키는 방법을 채택하는 것이 일반적인 것이나, 이러한 종래의 방법으로 중화시킬 경우 뱀독에 함유된 펩타이드 물성이 다량 유실되는 현상이 발생하는 단점이 있다. 즉, 뱀독에 함유된 펩타이드는 고열에서 오래 가열하면 변성이 일어나고, 기화되어 유실되는 성분들이 발생하여 중화독의 균일한 원료를 얻을 수 없는 단점이 있다. 이러한 단점을 개선하기 위하여 상기 생독중화공정에서 저장된 냉동생독을 용기에 담아 상온에서 녹이고, 그 녹인 생독에 주정을 가하여 혼합함으로써 종래의 중탕방식에서 나타나는 문제점을 개선할 수 있었다.
본 발명에 따르면, 상기 융합공정에서 사용되는 부형재는 극성물질과 비극성물질 즉, 서로 결합될 수 없는 물질을 상호 유화되어 결합되도록 하는 결합촉매역할을 하는 것으로, 바람직하게 상기 무독화 독과 부재료의 혼합비는 1:9~400, 더욱 바람직하게는 1:9~18의 중량비로 혼합하는 것이 좋다.
이상의 본 발명에 따라 제공되는 화장품 조성물은 통상의 화장품을 제조하는 방법에 따라 그 기능성 물질로서 사용되어 특히 피부의 항염/항진 효과가 우수한 기능성 화장품을 제조할 수 있는 것이다. 이때, 본 발명에 따른 화장품 조성물을 주요 기능성 물질로서 사용하되, 그 사용량(배합비율) 등은 제조자의 적의 선택에 따라 결정되어질 수 있다.
이하에서는 본 발명을 화장품 조성물의 항염/항진 효과를 알아보기 위하여 실시한 실험예를 들어 설명하기로 한다. 단, 이하에서 설명되는 실험예들은 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이하의 실험예로 본 발명을 한정하는 것은 아니며, 통상의 기술자라면 특허청구범위에 기재된 기술적구성의 범위 내에서 얼마든지 변형가능한 것이다.
본 발명에 따라 준비된 화장품 조성물의 기능성을 실험하기 위하여 도 1에 도시된 바와 같이 로션형태로 그 시료를 준비하고, 각각의 시료를 다른 환경하에서 그 효능/효과를 시험하여 보았다. 이때 사용된 뱀독은 칠점사로부터 수득된 생독을 이상에서 설명되는 생독중화방법에 따라 중화시켜 된 무독화물을 사용하였다.
도 1은 본 발명에 따른 화장품 조성물을 사용하여 제조 준비된 로션타입의 시료에 대한 사진이다.
[실험방법]
1. 안정성 및 안전성 실험
1) 경시적 변화에 따른 pH측정
도 1의 시료별 경시적 변화에 따른 제품 안정성을 확인하기 위한 pH변화를 측정하기 위하여 pH meter(Starter3100, OHAUS, USA)를 이용하였다.
- pH 측정은 유리전극을 정확한 보정을 위해 pH 전극보관액인 전해질용액(Electrolyte Solution, 제품명 FRISCOLYT-B)을 사용하였으며, 전극보관액이 없을시, 염기성 완충액이나 증류수에 수 시간 넣어두고 pH meter는 전원에 연결하고 10분 이상 두었다가 사용하였으며, pH meter의 보정(Calibration)을 위해 pH 4.01, 7.00, 10.01의 3 포인트를 이용하였다.
- 도 1에 도시된 바와 같이, 준비된 로션을 샘플 용기(40㎖)에 담아 내용물온도가 25℃가 될 때까지 상온에서 방치하였고, 검출부는 증류수로 잘 씻고 가볍게 닦아 낸 다음 사용하여 pH를 측정하였으며, 3회 반복 실험에 대한 평균값(mean)으로 나타내었다.
- 측정한 pH 수치는 도 2에 나타내었으며, 시료로 준비된 로션은 pH 5.41~5.49 (5.45±0.04)의 값으로 측정되었으며 56일 동안 측정한 결과 안정한 것을 확인할 수 있었다.
2) 경시적 변화에 따른 점도 측정
- 준비된 시료(로션)의 각 조건별 경시적 변화에 따른 제품 안정성을 확인하기 위한 점도 변화를 확인하기 위해서 Viscometer(DV-Ⅱ+ Pro viscometer, Brookfield, USA)를 사용하였다.
- 시료(로션)을 샘플 용기(40㎖)에 담아 내용물 온도가 25℃가 될 때까지 상온에서 방치하였고, Spindle은 No. 6(범위: 0~166,700cP)을 사용하여 6.0RPM(Revolution per minute, 분당 회전수)에서 1분간 회전 시킬 때 발생하는 Torque값을 측정하였으며, 3회 반복하여 평균값을 산출하였다.
- 점도단위는 센티포아즈(cP, Centipoise)이고, 1 cpoise = 10-3kg/sec·m. 20℃에서의 순수한 물의 점성도는 1.005 cpoise이며, 순수한 물의 점도를 기준으로 측정된 수치를 이용하여 점도를 비교하였다.
- 측정한 점도 수치는 도 3에 나타내었으며, 시료의 점도는 12,100~12,900cP (12,500±400cP)의 값으로 측정되었으며 56일 동안 측정한 결과 안정한 것을 확인할 수 있었다.
3) 온도조건(0℃, 25℃, 45℃)에 따른 경시적 제품 안정성 분석
- 준비된 시료(로션)를 샘플용 40㎖ 용기에 담아 0℃, 25℃, 45℃의 조건에서 각각 1개월 동안 보관하면서 1일차, 3일차, 5일차, 7일차, 14일차, 28일, 42일 56일차까지 각 조건 별 안정성을 평가하였다.
- 0℃, 25℃, 45℃ 조건에서 1일차에서 56일차까지 경시적 제품 안정성을 측정한 결과 표 1과 같이 나타내었는데, 제품의 성상, 향취, 외관, 상분리 등을 육안으로 관찰한 결과 안정한 것을 확인할 수 있었다.
하기 표 1은 다양한 온도에서 준비된 시료(로션)의 안정성테스트 결과를 나타낸 것이다.
4) 온도순환 (Cycle chamber)에 따른 경시적 제품 안정성 분석
- 뱀독 소재 활용 화장품 3종인 스킨, 로션, 크림을 각각 투명 용기에 담아 0℃-25℃-45℃-25℃에서 각각 24시간 보관한 후 이를 1 cycle로 하여 5회 반복 시행하여 온도순환에 따른 안정성을 평가한다.
- 온도순환 조건에서 5회까지 가혹조건의 안정성을 측정한 결과 표 2와 같이 나타내었는데, 각 제품의 성상, 향취, 외관, 상분리 등을 육안으로 관찰한 결과 안정한 것을 확인할 수 있었다.
- 온도순환 조건에서 5회까지 가혹조건의 pH 안정성을 측정한 결과 시료(로션)의 pH는 pH5.43~5.47 (5.45±0.02)로 안정한 것을 확인할 수 있었다.
- 온도순환 조건에서 5회까지 가혹조건의 점도 안정성을 측정한 결과 시료(로션)의 12,000~12,400cP (12,200±200cP)으로 안정한 것을 확인할 수 있었다.
5) 자연광 조건에서의 광안정성 분석
- 화장품은 출시 후 직접 또는 간접적으로 태양광과 형광등의 빛에 노출되어 변색되는 등 물리.화학적으로 품질의 특성이 변하는 것을 사전에 조사하여 미연에 방지키 위하여 광안정성 실험을 실시하였다.
- 준비된 시료(로션)를 투명한 샘플 용기(40㎖)에 담아 건조되지 않도록 밀봉하여 햇빛이 잘 드는 실내에 1, 3, 5, 7, 14, 28, 42, 56일 동안 보관하면서 성상, 향취, 외관, 상분리 등의 경시적 변화를 관찰하였다.
- 측정한 결과를 표 3와 같이 나타내었는데, 자연광 안정성 조건에서 56일간 보관한 시료(로션)는 아래의 표 3과 같이 성상, 향취, 외관, 상분리 등 경시적 변화가 나타나지 않았다.
<무독화물의 항산화, 항노화 및 항염증 검증>
이하의 검증에 사용된 시료는 칠점사로부터
1. 항산화 검증
1) Electron donating ability assay
[실험방법]
○ DPPH 라디칼 소거능 측정
DPPH는 비교적 안정한 free radical로써, ascorbic acid, tocopherol, polyhydroxy 방향족화합물, 방향족 아민류에 의해 환원되어 짙은 자색이 탈색되는 원리를 이용하여 항산화 활성을 간단히 측정할 수 있는 동시에 식물체의 항산화 활성과도 연관성이 매우 높기 때문에 많이 이용되고 있는 방법이다. DPPH radical activity (Electron donating bilities, EDA)는 다음과 같이 측정하였다. 칠점사로부터 획득한 peptide powder 10, 50, 100, 500, 1000 ㎍/mL 의 농도로 100 ㎕씩 처치한 후 02 mM의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)시약 50 ㎕를 처치하여 30 min간 방치한 다음 517 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능 효과는 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.
[실험 결과]
○ DPPH 라디칼 소거능 측정 결과
Electron donating ability (DPPH radical scavenging activity) 측정은 항산화 효과를 측정하는 가장 보편적인 방법이다. 피부에서 노화를 억제하는 척도로 측정이 가능한 항산화 측정법이며, 화학적으로 안정화 된 수용성 free radical인 DPPH는 517 nm에서 특징적인 광흡수를 나타내는데, 항산화 활성을 갖는물질과 반응하면 진보라색의 DPPH 색이 점점 옅어져 노란색으로 바뀌며 라디칼이 되어 흡광도가 감소되므로 라디칼의 소거 활성을 쉽게 측정할 수 있다. 칠점사로부터 획득한 peptide powder의 DPPH 라디칼 소거능 측정 실험결과 Fig 4와 같이 10, 50, 100, 500, 1000 μg/mL의 농도에서는 활성을 보이지 않았다. 펩타이드 시료의 특성상 용매를 찾기 어려웠으며 생화학적 분석실험 대비 항염증 활성 세포실험에서 보다 정확한 데이터를 얻을 수 있었다.(도 4 참조)
2) ABTS+ radical scavenging assay
[실험 방법]
○ ABTS+ 라디칼 소거능 측정
ABTS 라디칼 소거능은 DPPH 라디칼 소거능과 달리 극성과 비극성 시료의 소거 활성을 모두 확인할 수 있으므로 적용 범위가 넓다. Potassium persulfate와의 반응에 의해 생성되는 ABTS free radical이 시료 내의 항산화 물질에 의해 제거디어 라디칼 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용한 방법이다. ABTS+ radical cation은 74 mM22-Azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfoni- cacid (ABTS)와 26 mM Potassium persulfate (K2S2O8)을 1:1의 비율로 혼합하여 실온에서 차광하여 24시간동안 반응하였다. 사용 전에 ABTS+ 용액을 ethanol에 희석하여 734 nm에서 흡광도 값이 0706±0001이 되게 한 뒤 칠점사로부터 획득한 peptide powder 10, 50, 100, 500, 1000 ㎍/mL 의 농도로 100 ㎕씩 처치한 후 ABTS시약 100 ㎕를 처치하여 1 min간 방치한 다음 734 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 라디칼 소거능 효과는 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.
[실험 결과]
○ ABTS+ 라디칼 소거능 측정 결과
ABTS+ 라디칼 소거능 측정은 DPPH 라디칼 소거능 측정방법과 유사한 방법으로 라디칼의 탈색 원리를 이용하여 항산화 효능을 측정한다. ABTS+는 potassium persulfate와의 반응에 의해 생성되는 짙은 청록색의 free radical이며 734nm에서 광흡수를 나타내어 항산화 활성이 있는 시료에 의해 소거되면 청록색에서 탈색되어 색이 옅어지는 흡광도를 측정하여 항산화 활성을 평가하였다. 칠점사로부터 획득한 peptide powder의 ABTS+ 라디칼 소거능 측정실험 결과는 도 5와 같다. 10, 50 μg/mL의 농도에서는 활성을 보이지 않았으며 500, 1000 μg/mL의 농도에서 각각 240%, 380%의 활성을 보였다.(도 5 참조)
3) Hydrogen peroxide scavenging assay
[실험 방법]
○ Hydrogen peroxide 라디칼 소거능 측정
Hydrogen peroxide는 상대적으로 반응성이 적으나 전이금속 등과 반응하여 세포의 구성성분 손상을 유발하는 반응성이 큰 hydroxyl radical 및 singlet oxygen으로 전환되기 때문에 hydrogen peroxide에 대한 소거 활성 측정은 산화방지제의 기능을 결정하기 위한 유용한 방법 중 하나이다. Hydrogen peroxide 소거 활성 측정은 시료 500 ㎕씩 처치한 후 40mM Hydrogen peroxide 500 ㎕씩 처치하여 37℃에서 10분간 반응시킨 뒤 230 ㎚에서 측정하였다.
[실험 결과]
○ Hydrogen peroxide 소거 측정 결과
활성산소는 세포에 손상을 줌으로써 세포의 퇴화나 사멸을 초래하는데 이 현상의 하나는 활성산소가 세포의 항산화계에 손상을 주어 그 결과 항산화 효소의 활성저해 내지는 방해함으로써 그 결과 불필요한 산소 라디칼이 누적되어 세포 손상을 유도한다. 인체의 신진대사 과정 중 부산물로 생성되는 활성산소는 생체 내 여러 가지 병태생리적인 반응에 관여하게 된다. 그중 Hydrogen peroxide (H2O2)는 superoxide (O2-), hydroxy radical (OH-) 등을 포함하는 활성 산소종(reactive oxygen species)의 하나로 심혈관계나 노화 등 각종 질환의 발병인자로 인식되고 있다. 칠점사로부터 획득한 peptide powder의 H2O2 소거 측정 실험 결과는 도 6과 같다. 10 μg/mL의 농도에서는 활성을 보이지 않았으며 50, 100, 500, 1000 μg/mL의 농도에서 각각 43%, 138%, 851%, 1040% 의 농도의존적으로 hydrogen peroxide 소거능이 증가하였으며, Positive control인 Ascorbic acid의 1000 μg/mL의 946%의 활성과 비교해보았을 때 유의한 활성을 보였다.(도 6 참조)
4) H2O2 scavenging assay
[실험 방법]
○ H2O2 라디칼 소거능 측정
Hydrogen peroxide는 상대적으로 반응성이 적으나 전이금속 등과 반응하여 세포의 구성성분 손상을 유발하는 반응성이 큰 hydroxyl radical 및 singlet oxygen으로 전환되기 때문에 hydrogen peroxide에 대한 소거 활성 측정은 산화방지제의 기능을 결정하기 위한 유용한 방법 중 하나이다. Hydrogen peroxide 소거 활성 측정은 시료 500 ㎕씩 처치한 후 50 mM Hydrogen peroxide 500 ㎕씩 처치하여 37℃에서 10분간 반응시킨 뒤 230 ㎚에서 측정하였다.
[실험 결과]
○ Hydrogen peroxide (H2O2) 소거 측정 결과
Hydrogen peroxide (H2O2)는 superoxide (O2-), hydroxy radical (OH-) 등을 포함하는 활성 산소종(reactive oxygen species)의 하나로 심혈관계나 노화 등 각종 질환의 발병인자로 인식되고 있다. 칠점사로부터 획득한 peptide powder의 H2O2 소거 측정 실험 결과는 도 7과 같다. 100, 500, 1000 μg/mL의 농도에서 각각 158%, 223%, 328%의 활성을 보여 농도의존적으로 hydrogen peroxide 소거능이 증가하였지만 Positive control인 Ascorbic acid의 1000 μg/mL의 1075%의 활성과 비교해보았을 때 미미한 활성을 보였다.(도 7 참조)
5. Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP) assay
[실험 방법]
○ FRAP value 측정
FRAP value의 측정에서는 추출물에 존재하는 항산화 물질이 산화제로 작용해 산화-환원 반응에 사용된다. Ferric 2,4,6-tripyridyl-S-triazine의 [Fe(Ⅲ) - (TPTZ)2]2+ 화합물은 산화-환원 반응에 의해 파란색을 띠는 ferrous complex[Fe(Ⅲ)-(TPTZ)2]3+로 변한다. 이 파란색은 593 nm에서 흡광도 측정이 가능하다. FRAP은 Benzie와 Strain의 방법에 따라 측정하였다3). FRAP reagent는 sodium acetate buffer (03 M, pH 36)와 40 mM HCl에 용해한 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ), 20mM ferric chloride (FeCl3)를 10:1:1의 비율로 섞은 후 37℃에서 10분 방치시켜 실험에 사용하기 직전 조제하여 사용하였다. 제조된 FRAP reagent 1500 ㎕ 처치한 후 시료 30 ㎕씩 처치하여 37℃에서 30분간 반응시킨 뒤 593 nm에서 측정하였다.
○ FRAP value 측정 결과
FRAP value는 환원력과 비례하며 FRAP value가 높을수록 항산화능이 높다. 칠점사로부터 획득한 peptide powder의 FRAP value 측정 실험 결과는 도 8과 같다. 10, 50, 100, 500 μg/mL에서 각각 0030%, 0046%, 0036% 0059%의 활성을 보여 500 μg/m에서 FRAP value로 가장 높았지만 동일 농도에서 Positive control인 BHA의 117%의 활성과 비교해보았을 때 미미한 활성을 나타내었다.(도 8 참조)
2. 항노화 검증
1) Elastase inhibition assay
[실험 방법]
○ Elastase 저해 활성 측정
인체 내 중성구 과립에 존재하는 elastase는 진피에 존재하는 교원섬유와 탄력섬유를 분해하는 비 특이적 가수분해효소로 주름을 생성시키는 주요 원인으로 알려져 있으며, 피부노화의 주요 원인 중 하나인 Elastase의 활성을 저하시킴으로써 피부 노화를 억제할 수 있다. Elastase 저해 활성은 다음과 같이 측정하였다. 04 M Tris-HCl buffer (pH 86)을 50 μL, 농도별 추출물을 100 μL, 50 mM Tris-HCl buffer (pH 86)에 06 units/mL이 되도록 희석한 Elastase (Sigma-Aldrich) 를 50 μL을 넣고 37 ℃에서 30 분간 반응시킨 후 substrate (N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-P-nitroanilide)를 100μL를 넣은 후 상온에서 20 분간 반응 시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. Elastase 저해활성은 시료 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.
[실험 결과]
○ Elastase 저해 활성 측정 결과
Elastase는 elastin을 분해하는 백혈구 과립 효소 중의 하나로 이상조직에는 그 효소 활성이 극히 높아 조직 파괴에 직접적인 원인이 되어 피부의 주름 및 탄력성 소실을 유발한다. 기능성 화장품에 적용 범위인 항노화에 대한 활성을 알아보기 위해 칠점사로부터 획득한 peptide powder의 elastase 저해 활성을 평가한 결과는 도 9와 같다. 10, 50, 100, 500 μg/mL의 농도에서는 활성을 보이지 않았으며 1000 μg/mL의 농도에서 20.2%의 활성을 보였다.(도 9 참조)
2) Collagenase inhibition assay
[실험 방법]
○ Collageanse 저해 활성 측정
Collagen은 많은 fibroblast에 의해 생성되며 ECM (Extracellular matrix)의 70~80%를 차지하고, 2~4%의 elastin, glycosaminoglycans, 당단백 등과 함께 ECM을 구성한다. collagen은 연령 및 자외선 조사에 의한 광노화에 감소하며 피부의 주름 형성과 밀접한 연관이 있다고 알려져 있다. Collagenase 저해 활성은 다음과 같이 측정하였다. 농도별 추출물을 100 μL씩 처치한 뒤 01 M Tris-HCl buffer (pH 75)에 40mM CaCls을 첨가하여 03 mg/mL 4-phenylazobenzyloxy- carbony-Pro-Leu-Fly-Pro-Arg을 녹인 기질액 250 μL 및 02 mg/mL Collage- nase 150 μL씩 처치하여 실온에 20분간 방치한 뒤 6% citric acid 500 μL를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, ethyl acetate 1500μL씩 첨가하여 320 nm에서 흡광도를 측정하였다. Collagenase 저해 활성은 시료 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.
[실험 결과]
○ Collagenase 저해 활성 측정 결과
Collagen은 세포기질 외 진피를 70% 이상 구성하여 피부를 지탱하고 탄력 및 보습 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 그러나 자연 노화에 따른 세포 활성의 감소 등의 내적인 요인에 의해 생성이 감소되고, 여러 가지 유해 환경에 의한 스트레스, 태양 광선에 의한 활성 산소종의 증가와 같이 외적요인에 의해 콜라겐 분해가 가속화되어 피부 기질이 파괴되면서 주름이 생성된다. 칠점사로부터 획득한 peptide powder의 collgenase 저해 활성 측정 결과는 도 10과 같다. 10 μg/mL의 농도에서는 활성을 보이지 않았으며 50, 100, 500, 1000 μg/mL의 농도에서 각각 648%, 1143%, 1563%, 3127%의 활성을 보였다. Positive control인 EGCG (Epigallocatechin gallate)은 500, 1000 μg/mL의 농도에서 각각 6948%, 835%의 활성과 비교해보았을 때 주목할 만한 결과는 나타나지 않았다.(도 10 참조)
3. 항염증 검증
1) Cell Nitric Oxide assay
[실험 방법]
○ Nitric oxide (NO) 저해능 측정
NO 측정은 다음과 같이 측정하였다. Mouse macrophage인 Raw 2647 세포를 6well plate에 4×105 cells/mL 의 농도로 2700 ㎕씩 분주하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24 시간 배양하였다. 다음 날 무혈청 배지를 사용하여 18 시간 배양 후 칠점사로부터 획득한 peptide powder를 625, 125, 25, 50 ㎍/mL의 농도로 처리한 뒤 2 시간 후에 LPS 1 ㎍/mL를 normal군을 제외한 모든 well에 넣어 자극시켰다. 24 시간 후에 상층액 100 ㎕와 griess reagent 100 ㎕를 15 분 동안 반응시킨 후 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 NO생성량을 확인하였다.
[실험 결과]
○ Nitric oxide (NO) 저해능 활성 확인
그람음성박테리아 외벽에 존재하는 LPS (Lipopolysaccharide) 로 활성화된 대식세포(macrophage)는 TNF-α, IL-6, COX-2 등과 같은 염증을 유발하는 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 과 NO를 생성하여 여러 염증성 질환에 중요한 역할을 한다. 활성산소종의 일종인 NO는 대식세포의 항균 활성 및 세포의 신호전달에 중요한 역할을 하지만, 생체에서 생성된 superoxide radical과 반응하여 세포독성이 더욱 강한 reactive peroxynitrite와 같은 이차적인 라디칼을 생성시킨다고 보고되어 있다. 생체 내 고농도의 NO 생성은 숙주 세포의 파괴와 shock에 인한 혈관 확장, 염증 반응 유발에 의한 조직의 상해를 초래할 수 있는 이중적인 생물학적인 성질을 가진다. Raw 2647 세포에 세균유래 LPS를 처리하여 자극하였을 때, 칠점사로부터 획득한 peptide powder의 첨가로 NO 생성을 저해하는지 알아보고자 하였으며, 그 결과는 도 11과 같다. LPS 단독 처리군(Control)은 LPS 무처리군에 비하여 약 3배에 가까운 NO발현 증가를 나타내었고, powder를 처리하였을 때 농도 의존적으로 NO 생성량이 감소하였다.(도 11 참조)
2) Western Blot assay
[실험 방법]
○ Western Blot을 이용한 단백질 발현 측정
염증매개인자인 inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 cyclooxygenase-2(COX-2)의 발현을 보기 위하여 raw 2647 세포를 6well plate에 4×105cells/mL 의 농도로 2700 ㎕씩 분주하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24 시간 배양하였다. 다음 날 무혈청 배지를 사용하여 18 시간 배양 후 칠점사로부터 획득한 peptide powder를 625, 125, 25, 50 ㎍/mL의 농도로 처리한 뒤 2 시간 후에 LPS 1 ㎍/mL를 normal군을 제외한 모든 well에 넣어 자극시켰다. 24시간 후 상층액을 제거하고 phosphate buffered saline (PBS: Sigma-Aldrich)로 2회 세척한 뒤 scrapper를 이용하여 세포를 수확하였다. 수확된 세포에 lysis buffer (Sigma-Aldrich) 를 well 당 100 ㎕ 씩 첨가한 뒤 1 시간 동안 냉장하여 세포를 용해시킨 후 원심 분리하여 얻어진 단백질은 bradford assay로 정량하였고, 10 ㎕의 단백질을 10% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis를 이용해 전기 영동을 실시한 후 nitrocellulose membrane (AmerchamTM, GE Healthcare Life Sciences)에 이동시켰다. 그 후 blocking solution [5% skim milk in mixture of tris-buffered saline and tween 20(TBST) buffer] 을 이용하여 24 시간 동안 blocking 하였다. 그런 다음 1차 antibody (anti-mouse iNOS, anti-mouse COX2, anti-mouse Actin; Santa Cruz Biotechnology, USA) 를 24 시간 반응시킨 후 horseradish peroxidase (HRP)가 결합된 2차 antibody (anti-mouse IgG; Santa Cruz Biotechnology)를 1:1000으로 희석하여 3 시간 반응시켰다. TBST로 3 회 세척한 후에 enhanced chemiluminescence (ECL) kit (AmershamTM)를 사용하여, ECL 기질(AmershamTM)과 반응 후 Chemiluminescent Imaging System (LuminoGraph; ATTO, Japan)을 이용하여 단백질 발현량을 확인하였다.
[실험 결과]
○ Western Blot을 이용한 단백질 발현결과
NO는 iNOS에 의해 생성되며, 정상적인 상태에서는 방어작용과 신경전달물질 및 혈관 조절 등의 기능을 하지만 염증 과정에서 대량 생성된 NO는 급성 패혈성 쇼크를 일으킬 수 있으며, 강한 독성을 갖고 있어 다양한 세포 및 조직에 손상을 일으켜 만성염증과 자가면역질환의 원인이 된다. iNOS는 세포 내존재하지 않으나 일단 자극에 의해 유도가 되면 NO를 생성한다. COX-2는 염증과정에서 인지질을 대사시켜 생성된 arachidonic acid에서 PGE2를 생성시키는 효소임 cytokine, 자외선, 세균성 내독소 및 TNF 등과 같은 여러 종류의 pro-inflammatory agent에 의하여 과발현되어 염증 뿐만 아니라 각종 퇴행성질환의 발병과 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. iNOS와 COX-2는 LPS 처리 시 대식세포 표면에 있는 TLR-4 (toll like receptor-4)에 의해 활성화되어 발현되는 염증성 효소이므로 본 연구에서는 칠점사로부터 획득한 peptide powder가 염증 발현 인자인 iNOS와 COX-2의 단백질 발현 억제를 하는지 western blot을 통해 확인하였다. 그 결과 도 12와 같이 iNOS와 COX-2의 단백질 발현은 농도 의존적으로 억제되었으며, 50 ㎍/mL의 농도에 서 iNOS와 COX-2 각각 25%, 22%의 억제 효과를 나타내었다.(도 12 참조)
이상의 실험결과 본 발명에 따라 제공되는 화장품 조성물은 우수한 항염/항진 효과를 가진 피부용 화장품을 제공할 수 있는 것을 알 수 있었다.
Claims (6)
- 칠점사 또는 살모사로부터 추출된 생독을 중화시켜 무독화 시킨 무독화물을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 하는 항염/항진 화장품 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 화장품 조성물은 천연물 추출물 99.99 ~ 99.85중량% 및 무독화물 0.01~ 0.15중량%를 포함하는 것을 특징으로 한다.
- 제 1 항에 있어서,
상기 천연물 추출물은 상황버섯추출물, 국화추출물, 황금추출물, 포트마리골드 추출물, 콩발효추출물, 겨우살이추출물을 1:1:1:1:1:1의 중량비로 혼합한 혼합물인 것을 특징으로 한다.
- 제 1 항에 있어서,
상기 무독화물은 하기의 방법으로 중화시켜 된 것을 특징으로 한다.
칠점사 또는 살모사로부터 생독을 추출하고, 추출 후 30분 이내에 추출된 생독을 -50~-60℃에서 냉동 보관하는 생독추출공정;
상기 냉동 보관된 생독을 상온에서 일정시간 녹인 후, 용기에 상기 생독과 주정도 15%~85%의 주정을 1~3:10의 중량비로 혼합한 다음, 그 주정혼합물을 온도 50~90℃ 범위에서 30~60분간 중탕하여 생독을 중화하는 생독중화공정;
상기 생독중화공정이 완료된 주정혼합물을 건조기에서 70~80℃ 온도조건으로 30~60분간 건조하여 중화독을 얻는 건조공정;
상기 건조공정이 완료된 중화독에 오일 및 천연물추출물을 중화독, 오일 및 천연물추출물은 1~10:1~180:3~30의 중량비로 혼합하여 피부트러블인자를 상쇄시켜 무독화하여 무독화 독을 얻는 증폭공정;
상기 증폭공정이 완료된 후, 밀랍, 개구리기름, 백목이 버섯추출물, 글리세린으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 부재료를 상기 무독화 독과 부재료의 혼합비는 1:9~400의 중량비로 혼합하여 융합시키는 융합공정; 및
상기 융합공정이 완료된 후, 수득되는 원료를 무균실에서 7~15일간 숙성시키는 숙성공정을 포함하여 이루어지며,
상기 건조공정의 오일은 식물성 오일 및/또는 동물성 오일을 사용하며, 상기 천연물추출물은 건조된 고삼, 국화, 황금, 연교, 감초, 생선 비늘, 송진, 뱀 허물, 금은화, 어성초 및 상황버섯을 일정중량비로 혼합한 혼합물을 열 추출하여 얻어지는 추출액을 농축하여 된 천연물추출물 농축물을 사용하며,
상기 천연물추출물 농축물은 건조된 고삼, 국화, 황금, 연교, 감초, 생선 비늘, 송진, 뱀 허물, 금은화, 어성초 및 상황버섯을 1:1:1:1:1:1:1:1:1:2:2의 중량비로 혼합한 천연물혼합물인 것을 특징으로 한다.
- 제 4 항에 있어서,
상기 천연물추출물 농축물은 하기의 단계로 이루어지는 제조방법에 의해 얻어지는 것을 특징으로 한다.
천연물혼합물 대비 4~6배의 중량비로 정제수를 고압용기에 담아 끓이는 단계;
상기 단계의 끓인 물에 상기 천연물혼합물을 넣고 용기의 덮게를 닫고 60~90분간 침지시켜 방치시키는 단계;
방치 후, 여과기로 여과하여 고형물을 제거하고 여과액을 수득하는 단계;
상기 수득된 여과액을 용기에 담아 열을 가하여 기화하는 수증기를 냉각시켜 증류수를 수득하는 단계; 및
상기 수득되는 증류수를 일정 온도범위에서 농축하는 단계.
- 청구항 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항 기재의 화장품 조성물을 포함하는 항염/항진 화장품.
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| KR102530034B1 (ko) * | 2022-09-22 | 2023-05-10 | 주식회사 톡시온 | 독성 성분이 불활성화된 정제사독 제조방법 |
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| KR101508614B1 (ko) | 2014-08-25 | 2015-04-08 | 한솔바이오 주식회사 | 스파이더 실크 단백질, 거머리 추출물, 봉독 추출물 및 뱀독 유사 펩타이드 복합물로 제조된 포이즌 컴플렉스를 유효성분으로 함유하는 항노화 화장료 조성물 |
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2020
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