KR20180090937A - 정제뱀독을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 살모사(Agkistrodon) 속 유래 뱀독의 세포독성 제거방법 및 세포독성이 제거된 뱀독을 유효성분으로 포함하는 항산화, 항균, 항알레르기, 항염증 조성물 및 피부상태 개선용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따르면, 정제된 뱀 독을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 화장품 조성물 및 이의 제조방법을 제공함으로써, 천연소재인 뱀 독을 분리 및 정제하여 피부 주름 개선 효과가 있는 기능성 화장품의 소재로 활용할 수 있는 효과가 있다.

Description

정제뱀독을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물{Composition of Functional Cosmetic comprising Purified Snake Venom as an Active Ingredient}

본 발명은 정제된 뱀 독(venom)을 유효성분으로 포함하고 피부 주름 개선 효과 및 피부 탄력 개선 효과가 있는 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 신체의 최외각에 존재하는 기관으로 인체를 외부의 환경으로부터 보호하는 역할을 한다. 피부는 성인의 경우, 몸무게의 약 7%를 차지하며, 외부로부터 오는 물리적, 화학적 자극으로부터 인체를 보호하는 기능을 수행하고 있다. 또한 혈관을 통하여 체온 조절을 하고, 면역세포를 이용하여 면역 반응을 수행하고 있다. 이 외에도 수분의 증발 방지, 외부 자극에 대한 감각 기능, 노폐물 분비 및 배설, 대사, 흡수 등의 다양한 기능을 가지고 있으므로 피부는 인체의 정상적인 생리활성을 유지하는데 핵심적 역할을 하고 있다. 그러나 피부는 스트레스, 햇빛, 대기오염, 담배 등의 외부환경에 노출되어 활성산소종(reactive oxygen species; ROS)이 발생하여, 과산화 지질이 생성되고 콜라겐과 엘라스틴 등의 피부 구성 단백질이 변형이 된다. 또한 나이가 들어감에 따라 피부 세포의 활성이 저하되면서 콜라겐과 엘라스틴의 생성 능력이 저하되고, 그 결과로 피부의 진피층이 파괴되면서 피부 내부 구조가 약해지고 피부가 얇아지게 되면서, 지방층이 엷은 얼굴에 주름의 형성이 촉진된다. 또한 진피층 내에서 피부보습을 담당하는 점다당질(Glycosaminoglycans; GAGs)이 피부노화로 인하여 감소하게 되어 피부가 건조해지며 색소 침착, 탄력 감소 등의 노화 피부의 특징이 나타나게 된다. 피부노화에서 가장 두드러진 점은 피부 주름 생성이다. 피부 주름은 진피층과 관련이 깊으며, 특히 진피층에 존재하는 콜라겐(collagen)과 엘라스틴(elastin)이 항노화의 중요한 인자로 알려져 있다. 따라서 주름개선 문제에 가장 많이 이용되는 방법으로는 콜라겐 및 엘라스틴의 합성을 촉진 하거나 또는 이들의 분해를 억제하여 주름 및 탄력을 개선하는 연구개발이 기존에 주로 이루어져 왔다.

한편, 독이란 생체에서 물리, 화학적 반응을 통해서 생리적으로 어떤 해로운 변조(變調)를 일으키는 물질로, 이로운 효능을 나타내면 약이 되고 그 반대이면 독이 된다. 독을 이용한 연구로서 전갈, 지네 등의 독소 중 특정 성분을 마취제로 사용하는 연구가 진행되었으며, 뱀독 성분을 동맥경화증 예방을 위한 약학조성물으로 활용하기 위한 연구개발도 활발하게 진행되고 있으며, 독 개구리에서 추출한 물질인 '에피바티딘'은 모르핀보다 200배 강한 진통제로 활용되고 있다.

더불어, 독을 이용한 기능성 화장품 조성물에 관한 선행기술을 보면 대한민국 등록특허 제10-1508614호는 스파이더 실크 단백질, 거머리 추출물, 봉독 추출물 및 뱀독 유사 펩타이드 복합물로 제조된 포이즌 콤플렉스를 유효성분으로 함유하는 항노화 화장품 조성물을 개시하고 있고, 대한민국 등록특허 제10-1374327호는 장수말벌독 추출물을 이용한 기능성 화장품 조성물을 개시하고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

대한민국 등록특허 제10-1508614호 대한민국 등록특허 제10-1374327호

본 발명자들은 살모사 유래의 독을 활용한 기능성 조성물을 제조하고자 노력하였다. 그 결과, 살모사(Agkistrodon) 속 유래 독의 유해성분 및 세포독성을 제거하는 방법을 확립하고 이의 기능성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 살모사 속 유래 뱀독의 세포독성 제거 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 항산화 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 항균 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 항알레르기 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 항염증 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 피부상태 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 살모사 속 유래 뱀독의 세포독성 제거 방법을 제공한다:

(a) 살모사 속 유래 뱀독 내 5 kDa 이하의 단백질을 수득하는 단계; 및

(b) 상기 5 kDa 이하의 단백질을 변성시키는 단계.

본 발명자들은 살모사 유래의 독을 활용한 기능성 화장료 조성물을 제조하고자 노력하였다. 그 결과, 살모사 속 유래 독의 유해성분 및 세포독성을 제거하는 방법을 확립하고 이의 기능성을 확인하였다.

본 발명의 뱀독의 세포독성 제거 방법은 살모사 속의 뱀을 대상으로 실시한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 살모사 속은 쇠살모사(Agkistrodon caliginosus), 캔틸살모사(A. bilineatus), 미국살모사(A. contortrix) 및 늪살모사(A. piscivorus)를 포함하며 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 살모사 속은 쇠살모사이다.

상기 쇠살모사의 다른 학명으로 Gloydius ussuriensis이 있다.

상기 살모사 속 유래 뱀독의 세포독성 제거 방법을 단계별로 설명한다.

단계 (a): 5 kDa 이하 단백질의 수득

먼저, 살모사 속 유래 뱀독 내 5 kDa 이하의 단백질을 수득한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)는 특정 사이즈의 단백질을 분리할 수 있는 공지된 기술을 적용하여 실시할 수 있다. 예컨대, 한외여과, 투석, 단백질 일루션, 원심분리, 겔여과 크로마토그래피 등의 방법에 의해 실시될 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)는 한외여과에 의해 실시된다.

상기 한외여과는 분획분자량 5 kDa 이하이고, 시료농도 0.1-2.0 ㎎/L 및 압력 20-40 psi의 조건에서 실시한다.

상기 한외여과에 의해 뱀독 내 독성 지표물질이 제거될 수 있다. 상기 지표물질은 50 kDa, 38 kDa, 30 kDa, 20 kDa 및 15 kDa 사이즈의 단백질(도 3)로 5 kDa 이하 한외여과에 의해 제거되게 된다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 시료농도는 0.3-2.0, 0.6-2.0, 0.8-2.0, 0.8-1.7, 0.8-1.5 또는 0.8-1.2 ㎎/L이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 시료농도는 1.0 ㎎/L이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 압력은 23-40, 26-40, 28-40, 28-38, 28-35 또는 28-32 psi이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 압력은 30 psi이다.

상기 단계 (a)는 살모사 속 유래 뱀독의 5 kDa 이하 단백질을 수득한다.

상기 단계（a) 이전에 5 kDa보다 큰 분획분자량(예컨대, 30 kDa, 10 kDa)의 한외여과를 추가적으로 실시하여 결과물을 수득할 수 있다.

단계 (b): 단백질 변성

다음, 상기 5 kDa 이하 단백질을 변성시킨다.

본 명세서에서 용어, ‘변성’은 천연 단백질이 물리적인 요인(가열, 건조, 교반, 압력, X선, 초음파, 진동, 동결)이나 화학적인 요인(산, 염기, 요소, 유기용매, 중금속, 계면활성제) 혹은 효소의 작용등으로 원래의 성질을 잃어버리는 현상을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 변성은 가열, 건조, 교반, 압력, X선, 초음파, 진동, 동결, 산, 염기, 요소, 유기용매, 중금속, 계면활성제 또는 효소에 의해 실시될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 변성은 가열에 의해 실시될 수 있다.

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 가열은 80-100℃에서 1-30분 동안 실시한다. 상기 가열은 83-100℃, 85-100℃, 88-100℃, 90-100℃, 92-100℃ 또는 92-98℃에서 실시한다. 상기 가열은 5-30분, 5-25분, 5-20분 또는 5-15분 동안 실시한다.

하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 상기 단백질 변성에 의해 세포독성이 억제되었다.

본 발명의 살모사 속 유래 뱀독의 세포독성 억제방법을 통해 정제뱀독을 수득할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 정제뱀독을 유효성분으로 포함하는 항산화 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 정제뱀독을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 정제뱀독을 유효성분으로 포함하는 항알레르기 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 정제뱀독을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물을 제공한다.

상기 항산화조성물, 항알레르기 조성물 또는 항염증 조성물은 건강기능식품 조성물로 제조될 수 있다.

상기 건강기능식품은 특별히 이에 제한되지 않으나, 건강 기능성 식품, 영양 보조제, 영양제, 파머푸드(pharmafood), 건강 식품, 뉴트라슈티칼(nutraceutical), 디자이너 푸드, 식품 첨가제 등의 모든 형태의 식품이 될 수 있는데, 바람직하게는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 유효성분으로서 정제뱀독 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토 스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 식품은 여러 가지 영양제, 비타민류, 광물(전해질), 식이성분, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분인 정제뱀독 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 각 종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

식품에 대한 용이한 접근성을 고려한다면, 본 발명의 식품은 산화, 알레르기 또는 염증의 예방 및 개선에 매우 유용하다.

상기 항산화 조성물, 항알레르기 조성물 또는 항염증 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 세포독성에 제거된 뱀독(이하, ‘정제뱀독’의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 정제뱀독의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여 방식으로 적용된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001 ㎍/kg - 100 ㎎/kg 범위 내이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어 “유효성분으로 포함하는”이란 상술한 정제뱀독의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 상술한 정제뱀독이 본 발명의 조성물에 포함된 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 정제뱀독을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 피부상태 개선은 미백, 피부 주름 개선, 피부 탄력 개선, 아토피 개선, 각질 제거, 노화 방지이다.

본 발명의 피부상태 개선용 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 본 발명의 정제뱀독 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린씩, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 나노입자 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 살모사(Agkistrodon) 속 유래 뱀독의 세포독성 제거방법 및 세포독성이 제거된 뱀독을 유효성분으로 포함하는 항산화, 항균, 항알레르기, 항염증 조성물 및 피부상태 개선용 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명에 따르면, 정제된 뱀 독을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 화장품 조성물 및 이의 제조방법을 제공함으로써, 천연소재인 뱀 독을 분리 및 정제하여 피부 주름 개선 효과가 있는 기능성 화장품의 소재로 활용할 수 있는 효과가 있다.

도 1 은 본 발명에 의한 정제된 뱀독을 유효성분으로 포함하는 화장품 조성물 제조과정을 나타낸 모식도이다. 뱀으로부터 분리한 뱀독의 분석과정을 모식도로 나타낸다.
도 2 는 본 발명에서 정제된 뱀독 제조과정 및 이를 포함하는 화장품 원료의 제조과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 국내산 및 중국산 살모사의 뱀독의 SDS-PAGE 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 의한 정제된 뱀독의 독성테스트 원리를 나타낸 모식도이다.
도 5는 열처리하지 않은 정제뱀독의 1차 세포생존능 측정 결과이다. 세로축은 ‘cell viable count’이다.
도 6은 열처리한 정제뱀독의 1차 세포생존능 측정 결과이다. 세로축은 ‘cell viable count’이다.
도 7은 열처리하지 않은 정제뱀독의 2차 세포생존능 측정 결과이다. 세로축은 ‘cell viable count’이고, ‘C’는 대조군(control)을 의미한다.
도 8은 열처리한 정제뱀독의 2차 세포생존능 측정 결과이다. 세로축은 ‘cell viable count’이고, ‘C’는 대조군(control)을 의미한다.
도 9는 정제뱀독의 세포생존능 측정 결과를 종합적으로 나타낸 그래프이다. 세로축은 ‘cell viable count’이고, ‘Con’는 대조군(control)을 의미한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 뱀 독(snake venom)의 분리 및 정제

4년생 이상, 크기 35 cm 가량의 제주산 쇠살모사(Agkistrodon caliginosus)로부터 독을 추출한 후, 종래는 신경독소와 혈액응고 장애 발생원인 성분을 원천적으로 차단하기 위해 FPLC(Fast Performance Liquid Chormatography)를 통한 분리 및 HPLC를 이용한 분석 공정을 실시하였다. FPLC를 이용한 분리는 뱀독 유효성분의 분리가 각각 가능하며 성분 분리도가 높은 장점을 가지지만 컬럼 안정화 및 패킹, 용매에 따라 분리 및 분석의 소요 시간이 길며 공정의 복잡함이 단점이다. 본 발명은 한외여과 시스템(Ultra filtration system)을 이용하여 정제된 뱀독의 알레르기 유발성분을 제거하는 동시에 분리-정제뱀독의 대량생산까지 가능하다.

뱀독의 주요 성분의 분자량 차이를 바탕으로 한외여과를 통해 분리하였다. 한외여과의 분리 조건[조건1: 시료농도(10, 2, 1 ㎎/L), 조건2: 분획분자량(5, 10, 30 kDa), 조건3: 압력(20, 30, 40 psi)]에 따라 PLA2(Phospholipase A2, allergen) 분리의 최적 조건을 확립하였다. 뱀독으로부터 PLA2를 분리하기 위한 최적 조건은 분획분자량(MWCO, Molecular Weight Cutoff) 5 kDa, 시료농도 1 ㎎/L 및 압력 30 psi이다.

다음, HPLC(표 1)를 통해 정제 뱀독 및 분리-정제뱀독의 주요 성분을 확인하였고(정량분석), SDS-PAGE(표 2)를 통해 정제 뱀독에서 PLA2 분리를 확인하였다(정성분석). 다음, Pre-HPLC를 이용하여 역상 크로마토그래피 방법(표 3)을 통해 PLA2를 분리 및 분석하였다.

장비	펌프	Waters 1525u binary HPLC pump
	검출기	Waters 486 detector
	자동샘플러	Waters 717 plus
	컬럼	Phenomenex Jupiter 4u proteo 90A
이동상		A: 0.2% TFA in water
		B: 0.22% TFA in acetonitrile
UV 흡광도		220 nm
컬럼 온도		25℃
주입 부피		20 uL
유량		1.0 mL/min
구배		min	A(%)	B(%)
		Ini.	100	0
		20	50	50
		50	100	0

20% 분리겔		5% 스태킹겔
DW	700 uL	DW	3.4 mL
30% acrylamide mix	6.6 mL	30% acrylamide mix	830 uL
1.5 M Tris-HCl(pH8.8)	2.5 mL	1.0 M Tris-HCl(pH8.8)	630 uL
10% SDS	100 uL	10% SDS	50 uL
10% APS	100 uL	10% APS	50 uL
TEMED	4 uL	TEMED	5 uL

장비	펌프	Waters 2525u binary HPLC pump
	검출기	Waters 996 photodiode array
	자동샘플러	Waters 717 plus
	컬럼	Waters Fraction Collector 3
이동상		A: 0.2% TFA in water
		B: 0.22% TFA in acetonitrile
UV 흡광도		220 nm
컬럼		Phenomenex Jupiter 10u Preteo 90A 250x21.20mm
주입 부피		1,000 uL (10 mg/mL)
유량		8.0 mL/min
구배		min	A(%)	B(%)
		Ini.	100	0
		25	50	50
		60	100	0

실시예 2. 정제뱀독의 세포독성 확인

정제뱀독을 멸균수로 희석하여 농도별로 준비하고 여과한 후, 95℃에서 10분 동안 열처리하였다. 정상 섬유모세포(normal fibroblast)에 준비된 정제뱀독을 농도별로 처리하고 48시간 후에 세포생존능(EZ-CUTOX 이용)을 확인하였다.

그 결과, 저농도(0.01 ㎍/㎖) 정제뱀독을 48시간 처리한 경우 무처리 대조군과 유사한 수치가 나타남을 확인하였지만, 정제뱀독의 농도가 증가함에 따라 세포생존능이 감소하였고, 10 ㎍/㎖ 농도 처리의 경우 거의 모든 세포가 사멸한 것을 확인할 수 있었다(도 5 및 7). 이러한 정제뱀독의 농도 증가에 따른 세포생존능의 감소는 정제뱀독을 열처리하는 경우에 억제되었다(도 6 및 8). 이는 세포생존능에 영향을 미치는 물질이 열에 의해 분해되거나 활성을 잃어버린 것으로 판단된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

1. 다음의 단계를 포함하는 살모사(Agkistrodon) 속 유래 뱀독의 세포독성 제거 방법:
   (a) 살모사 속 유래 뱀독 내 5 kDa 이하의 단백질을 수득하는 단계; 및
   (b) 상기 5 kDa 이하의 단백질을 변성시키는 단계.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 살모사는 쇠살모사(Agkistrodon caliginosus)인 것을 특징으로 하는 방법.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 한외여과법에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 가열에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 의해 수득한 뱀독을 유효성분으로 포함하는 항산화 조성물.
   
6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 의해 수득한 뱀독을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물.
   
7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 의해 수득한 뱀독을 유효성분으로 포함하는 항알레르기 조성물.
   
8. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 의해 수득한 뱀독을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물.
   
9. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 의해 수득한 뱀독을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물.

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