KR102548424B1 - 독성 성분이 불활성화된 신경독을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

독성 성분이 불활성화된 신경독을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 독성 성분이 불활성화된 신경독(neurotoxin)을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 사독으로부터 분리 및 정제하고, 독성 성분이 불활성화된 신경독이 세포 탈과립을 억제하고, 침윤성 비만세포 수를 감소시키며, COX-2(cyclooxygenase-2), TNF-α(tumour necrosis factor α), IgE(immunoglobulin E) 및 IL-4(interleukin-14) 활성을 억제하는 것을 확인함으로써, 염증성 피부질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

독성 성분이 불활성화된 신경독을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory skin disease comprising neurotoxin with inactivated toxic components as an active ingredient}
본 발명은 독성 성분이 불활성화된 신경독(neurotoxin)을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
염증성 피부질환(inflammatory skin disease)이란 피부 상피(epithelium) 내에 일련의 염증 반응을 일으키는 다양한 자극 요인들로 인해 가려움(소양증), 부종, 홍반, 벗겨짐 등과 같은 염증 반응이 동반된 피부질환을 말한다.
최근 산업화 및 서구적 식습관 등의 생활환경의 변화로 인해 과민성 또는 염증성 피부질환의 발병률이 크게 증가하고 있고, 염증성 피부질환을 겪는 사람들의 경우, 오랜 치료 기간 및 그에 따른 고비용을 감수해야 할 뿐 아니라, 상기 질환으로 인해 외적인 활동에 소극적으로 변하거나, 심할 경우, 비만, 우울증 등에 이를 수 있다. 가장 폭넓게 알려진 염증성 피부질환으로는 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염(contact dermatitis), 지루성 피부염(seborrhoic dermatitis), 여드름 등이 있다. 그 중 아토피성 피부염은 일반적으로 습진(eczema)과 같은 의미로 쓰이는데 아토피 체질인 사람에게 생기는 습진 모양의 피부병변이다.
아토피성 피부염의 원인은 현재까지 밝혀져 있지 않으며 유전적인 경향이 있는 것으로 알려져 있고, 현재는 일종의 자가면역 질환이라는 설이 설득력을 얻고 있다. 보통의 습진이나 피부염과는 달리 특이한 증세와 경과를 나타내는데 소아습진의 70∼80％가 이에 해당하며 최근 들어 성인에게서도 많이 발생한다.
여드름의 치료에는 에리스로마이신 등의 항생제를 이용하거나 여성호르몬인 에스트로젠을 이용한 피지를 조절하는 방법 등이 사용되고 있으나, 부작용이 동반되는 문제점이 있다. 여드름 치료를 위한 화장료에 비타민 A 유도체나 벤조일 퍼옥사이드, 살리실산, 트리클로산 등이 사용되고 있으나, 이러한 물질들은 어느 정도의 항균 효과는 있으나 피부발적, 피부과민, 광과민 등의 부작용을 일으키는 문제점을 지니고 있다.
사독(Snake venom)은 뱀이 지닌 독으로 신경독(neurotoxin), 세포독(cytotoxin), 혈류독(hemotoxin), 포스포리파아제(PLA2), 신경성장인자(NGF) 등의 성분을 함유한다. 뱀의 종별로 사독의 구성성분비는 다르지만 일반적으로 40~60%의 세포독과 20~30%의 포스포리파아제, 3~10%의 신경독 및 0.1~1% 남짓의 신경성장인자로 구성된다. 사독은 예로부터 한방의학에서 중풍, 구안와사와 같은 마비질환, 비증, 역절풍 등의 관절질환 및 악성 피부질환에 뛰어난 효과를 지닌 약재로 기록되어 있고, 주로 병이 깊고 오래된 난치질환에 적용되어 왔다. 최근에는 항염, 항통 및 면역조절의 작용을 기반으로 하는 버거씨병, 류마티스 관절염, 아토피 등에 효능이 있다고 보고된 바 있다.
따라서, 상기의 문제점들을 해소할 수 있는 염증성 피부질환 예방, 치료 또는 개선용 외용제 개발이 필요한 실정이다.
1. 대한민국 공개특허 제10-2020-0042258호(2020.04.23. 공개)
본 발명의 목적은 신경독(neurotoxin)을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 신경독(neurotoxin)을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 신경독(neurotoxin)을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 신경독(neurotoxin)을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 사독으로부터 분리 및 정제하고, 독성 성분이 불활성화된 신경독(neurotoxin)이 세포 탈과립을 억제하고, 침윤성 비만세포 수를 감소시키며, COX-2(cyclooxygenase-2), TNF-α(tumour necrosis factor α), IgE(immunoglobulin E) 및 IL-4(interleukin-14) 활성을 억제하는 것을 확인함으로써, 염증성 피부질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물로서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 코브라독의 독성 활성 및 불활성 상태에 따른 HPLC(High-performance liquid chromatography) 성분분석 결과를 나타낸 그래프이다. 빨간색 크로마토그램은 불활성독을, 파란색 크로마토그램은 활성독을 나타낸다.
도 2는 까치살무사독의 독성 활성 및 불활성 상태에 따른 HPLC 성분분석 결과를 나타낸 그래프이다. 빨간색 크로마토그램은 불활성독을, 파란색 크로마토그램은 활성독을 나타낸다.
도 3은 살무사독의 독성 활성 및 불활성상태에 따른 HPLC 성분분석 결과를 나타낸 그래프이다. 빨간색 크로마토그램은 불활성독을, 파란색 크로마토그램은 활성독을 나타낸다.
도 4는 제2용리단계를 통해 수득한 코브로톡신의 HPLC 성분분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 사독의 독성 활성 및 불활성 상태에 따른 세포독성을 분석한 결과이다.
도 6은 사독의 독성 활성 및 불활성 상태에 따른 COX-2(cyclooxygenase-2) 및 TNF-α(tumour necrosis factor α) 발현 억제 효과를 분석한 결과이다.
도 7은 코브로톡신의 세포 탈과립 억제 효과를 분석한 결과이다.
도 8은 코브로톡신의 IL-4(interleukin-14) 억제 효과를 분석한 결과이다.
도 9는 아토피 피부염 유도 마우스 모델에서 코브로톡신의 피부 수분 함유량 증진을 통한 피부장벽 기능 개선 효과를 분석한 결과이다.
도 10은 아토피 피부염 유도 마우스 모델에서 코브로톡신 처리를 통한 마우스의 표피두께 및 조직학적 변화를 분석한 결과이다.
도 11은 아토피 피부염 유도 마우스 모델에서 코브로톡신 처리를 통한 마우스 병변 부위의 침윤성 비만세포 수 변화를 분석한 결과이다.
도 12는 아토피 피부염 유도 마우스 모델에서 코브로톡신의 마우스 혈장 내 면역글로불린 E(immunoglobulin E; IgE) 및 IL-4 억제 효과를 분석한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 신경독(neurotoxin)을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기신경독은 독성에 대해 불활성 상태일 수 있다.
또한, 상기 신경독은 살무사과(Viperidae) 또는 코브라과(Elapidae)의 사독(snake venom)으로부터 분리 또는 정제된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 신경독은 COX-2(cyclooxygenase-2), TNF-α(tumour necrosis factor α), IgE(immunoglobulin E) 및 IL-4(interleukin-14)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 억제할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 신경독은 세포의 탈과립을 억제하거나, 침윤성 비만세포의 수를 감소시킬 수 있다.
상기 염증성 피부질환은 접촉피부염, 자극 접촉피부염, 알레르기 접촉피부염, 광독성 및 광알레르기 접촉 피부염, 접촉 두드러기 증후군, 자가 감작 피부염, 울체 피부염, 여드름, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 지루성 피부염, 구진상 두드러기, 습진 및 건선으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물에 포함되는 첨가제의 함량은 특별히 한정되는 것은 아니며 통상의 제제화에 사용되는 함량 범위 내에서 적절하게 조절될 수 있다.
상기 약학 조성물은 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 정제, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 피부 외용제 형태로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 제형화를 위해 추가로 있는 약학적으로 허용 가능한 담체 및 희석제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체 및 희석제는 전분, 당 및 만니톨과 같은 부형제, 칼슘 포스페이트 등과 같은 충전제 및 증량제, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 폴리비닐 피롤리돈 등과 같은 결합제, 활석, 스테아린산 칼슘, 수소화 피마자유 및 폴리에틸렌글리콜과 같은 윤활제, 포비돈 및 크로스포비돈과 같은 붕해제, 폴리소르베이트, 세틸알코올, 글리세롤 등과 같은 계면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체 및 희석제는 대상체에게 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 희석제의 예로는 염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산제(dispersion media)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있다. 경구 투여일 경우, 정제, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽, 엘릭시르제 등으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여일 경우, 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등으로 제형화 될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이 체질 특이성, 제제의 성질, 질병의 정도, 조성물의 투여시간, 투여방법, 투여기간 또는 간격, 배설율 및 약물 형태에 따라 그 범위가 다양할 수 있으며, 이 분야 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예컨대, 약 0.1 내지 10,000mg/kg의 범위일 수 있으나 이제 제한되지 않으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여되거나 비경구 투여(예를 들면, 정맥 내, 피하 내, 복강 내 또는 국소에 적용)될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 약학적 유효량 및 유효 투여량은 약학 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간, 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수도 있다.
또한, 본 발명은 신경독(neurotoxin)을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 통상적으로 이용되는 식품으로써 일반적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. 상기“건강기능식품”이라 함은 건강기능 식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, “기능성”이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
상기 건강기능식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 “식품 첨가물”로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다. 예를 들어, 캡슐 형태의 건강기능 식품 중 경질 캡슐제는 통상의 경질 캡슐에 본 발명에 따른 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합 및 충진 하여 제조할 수 있으며, 연질 캡슐제는 본 발명에 따른 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합하고 젤라틴 등 캡슐기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캡슐제 는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없으며, 통상적인 의미에서의 건강 기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에서 용어“예방”은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 염증성 피부질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 용어 “치료”는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 염증성 피부질환을 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 용어 “개선”은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 염증성 피부질환의 나쁜 상태를 좋게 하는 모든 행위를 말한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
[ 준비예 1] 사독 조성물 제조 및 독성 불활성화
1-1. 사독 조성물 제조
뱀(코브라, 칠점사 및 살무사)으로부터 채취하여 동결건조한 사독분말 20mg을 0.2μm 필터에 여과한 증류수 10ml에 2:1000 중량비로 혼합하여 사독 조성물을 제조하였다.
1-2. 사독 조성물 독성 불활성화
상기 제조한 사독 조성물을 100℃의 온도에서 10분간 중탕하여 사독 조성물의 독성을 불활성화시키고, 45μm 기공 사이즈의 필터를 이용하여 여과한 후, -40℃에서 동결건조하였다. 상기 정제한 사독 조성물의 독성 활성 및 불활성화 상태에 따른 HPLC(High-performance liquid chromatography) 성분분석 결과는 도 1, 2 및 3에 나타난 바와 같다.
[ 준비예 2] 코브로톡신 ( Cobrotoxin ) 분리
상기 준비예 1-1에서 제조한 사독 조성물과 상기 준비예 1-2에서 독성 불활성화 과정을 거친 사독 조성물을 같은 중량비로 혼합하여 정제 사독 수용액을 제조하였다. Prep HPLC(Preparative High-performance liquid chromatography)에 C18 수지[Agilent Prep-C18(21.2 x 150mm / 10μm) 컬럼을 연결하고 물[0.1% TFA(Trifluoroacetic acid)을 포함] : 아세토나이트릴[0.1% TFA(Trifluoroacetic acid)를 포함] 비율이 95:5(v/v)인 이동상으로 안정화시켰다. 안정화된 컬럼에 정제 사독 수용액을 자동주입하여 흡착시킨 후, 이동상의 비율(물:아세토나이트릴)을 0~2분 구간에서 80:20(v/v)로 변화, 2~4분에서 70:30(v/v)로 변화, 4~6분에서 20:80(v/v)으로 변화되도록 설정하고 유속은 20ml/min으로 하여 용리 과정을 수행하였다. 용리 과정 중 코브로톡신을 포함하는 신경독(neurotoxin)을 4분~4분 30초 구간에서 용리하였다. 분리한 신경독을 포함하는 이동상 회수액을 분리하여 60℃에서 회전진공농축기를 사용하여 농축하였다. 회수액에서 아세토나이트릴(Acetonitrile; C2H3N)을 회수한 후, 남아있는 증류수 층을 동결건조하여 신경독 분말을 수득하였다.
상기 수득한 신경독 분말을 상기 정제사독 수용액을 만들 때와 같은 조건으로 수용액을 만들어 상기의 흡착, 농도구배 및 용리단계를 재수행하였다. 제2용리단계에서 코브로톡신은 4분~4분 15초 구간에서 용리하였다. 코브로톡신을 포함하는 이동상 회수액을 분리하여 60℃에서 회전진공농축기를 사용하여 농축하였다. 회수액에서 아세토나이트릴을 회수한 후, 남아있는 증류수 층을 동결건조하여 코브로톡신 분말을 수득하였다.
상기 제2용리단계를 마치고 최종적으로 저온농축 및 동결건조한 코브로톡신 분말의 HPLC(High-performance liquid chromatography) 성분분석 결과는 도 4에 나타난 바와 같다.
[ 실험예 1] 활성독 및 불활성독의 세포 독성 분석
상기 준비예 1에서 분리한 사독 조성물의 활성독 및 불활성독의 세포독성을 확인하기 위해, 멜라닌형성세포(B16F10), 대식세포(RAW264.7), 비만세포(RBL-2H3), 각질형성세포(HaCaT) 및 인간진피섬유아세포(HDF)를 사용하였다. 상기 세포들의 세포주를 배양 접시의 바닥에 접종한 후, 페니실린(100IU/mL), 스트렙토마이신(100μg/mL) 및 10% FBS(fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM(Dulbecco' Modifide Eagle' Medium) 배지를 넣고 37℃ 및 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다. 상기 세포주를 96-웰 플레이트에 1×10⁴cells/well 농도로 분주한 후, 세포배양조건에서 24시간 동안 37℃ 및 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다. 배지를 버리고 1 × PBS로 세척한 다음 새로운 배지에 일정농도(0, 0.1, 0.5, 1, 2, 4, 8 및 10μg/mL)로 시험물질인 활성독 또는 불활성독을 처리한 후 24시간 또는 48시간 동안 배양하였다. 배양 후에 MTT 용액(0.5% 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 dephenyl-2H-tetrazolium bromide)을 각 웰(well)에 100μL씩 넣고, 포마잔(formazan)이 형성될 때까지 4시간 동안 배양하였다. 4시간 후에 배양액을 제거한 다음 DMSO(dimethylsulfoxide) 용액을 200μL씩 넣고 5분간 흔들어 준 다음 microplate reader VICTOR X3(PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA)로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 효능에 대한 분석은 시료를 처리하지 않은 대조군의 비율을 100으로 설정하고, 대조군 대비 세포 생존율이 90% 이상인 경우 세포독성이 없는 것으로 판단하며, 90% 미만인 경우는 세포독성이 있는 것으로 판단하였다.
[ 실험예 2] 활성독 및 불활성독의 염증 억제 효과 분석
상기 준비예 1에서 분리한 사독 조성물의 활성독 및 불활성독의 염증 억제 효과를 확인하기 위해, 염증 발생과정에 있어서 중요한 역할을 하는 COX-2(cyclooxygenase-2) 및 TNF-α(tumour necrosis factor α)의 mRNA 발현 억제 효과를 확인하였다. 대식세포 RAW264.7(한국세포주은행, 대한민국 서울)를 6-웰 플레이트에 4 × 105 cells/well 농도로 분주하고, 세포가 부착되면 활성독 또는 불활성독을 농도별로(0.1~2μg/mL) LPS(1μg/mL)와 함께 처리하고 18시간 동안 배양하였다. 배양 후 TrizolTM(Ambion, Thermo, USA)로 total RNA를 추출하고, cDNA 합성 키트(ECDNA100, NanoHelix, Daejeon, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이후 프리미어 qPCR 키트(PQL-S500, NanoHelix, Daejeon, Korea)를 사용하여 Real-Time PCR(CFX Connect, Biorad) 기계로 하기 표 1의 프라이머 세트를 이용하여 COX-2 및 TNF-α의 mRNA 발현량을 측정하였다. COX-2 양성 대조군으로 셀레콕시브(celecoxib; CEL, 5μM), TNF-α 양성 대조군으로 덱사메타손(dexamethasone; DEX, 100μM)을 사용하였다. 효능에 대한 분석은 LPS 처리군의 비율을 1로 설정하고, 이와 비교하여 분석하였다.
Gene Primer sequences
COX-2 Forward (5´→ 3´) TGA GTA CCG CAA ACG CTT CTC
Reverse (3´→5´) TGG ACG AGG TTT TTC CAC CAG
TNF-α Forward (5´→ 3´) TCT CAA AAT TCG AGT GAC AAG CC
Reverse (3´→5´) AAA TCG GCT GAC GGT GTG G
β-actin Forward (5´→ 3´) GGC TAC AGC TTC ACC ACC A
Reverse (3´→5´) CTG GAA AAG AGC CTC AGG GC
[ 실험예 3] 코브로톡신의 탈과립 효과 분석
상기 준비예 2에서 분리한 신경독의 한 종류인 코브로톡신의 탈과립 효과를 확인하기 위해, 비만세포(RBL-2H3)를 10% FBS가 포함된 DMEM(HYCLONE, #sh30284.01)에 현탁시키고, 24-웰 플레이트에 5 × 105 cells/well 농도로 분주한 후 37℃ 및 5% CO2 조건에서 16시간 동안 배양하였다. 그 후, DNP-IgE(Sigma, #D8406)를 100ng/ml 농도로 처리하고, 37℃ 및 5% CO2 조건에서 4시간 동안 배양하였다. 그 후, siraganian buffer[119mM 염화나트륨(NaCl), 5mM 염화칼륨(KCl), 0.4mM 염화마그네슘(MgCl2), 25mM PIPES 및 40mM 수산화나트륨(NaOH)]로 2회 세척하고, siraganian buffer[119mM 염화나트륨, 5mM 염화칼륨, 0.4mM 염화마그네슘, 25mM PIPES, 40mM 수산화나트륨, 5.6mM 글루코스(glucose), 1mM 염화칼슘(CaCl2) 및 0.1% BSA]를 이용하여 시료를 농도별로 처리하고, 37℃ 및 5% CO2 조건에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후, DNP-BSA를 100ng/ml의 농도로 처리하여 1시간 동안 반응시키고, 아이스 배스(ice bath)에서 10분간 방치하여 반응을 정지시켰다. 그 후, 배지를 채취하고 2,000rpm에서 원심분리하여 상등액을 취하여 기질(substrate)(1mM 4-Nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide, sigma, #N9376)과 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 0.1M 탄산나트륨/탄산수소나트륨(Na2CO3/NaHCO3) 용액을 넣어 반응을 정지시켰다. 마이크로플레이트 분광광도계(microplate spectrophotometer, biotek)로 405nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 효능에 대한 분석은 [IgE + DNP-BSA] 처리군의 비율을 100으로 설정하고, 이와 비교하여 분석하였다.
[ 실험예 4] 코브로톡신의 IL-4( interleukin -14) 억제 효과 분석
상기 준비예 2에서 분리한 신경독의 한 종류인 코브로톡신의 염증 억제 효과를 확인하기 위해, 염증 발생과정에 있어서 중요한 역할을 하는 IL-4 억제 효과를 확인하였다. 비만세포(RBL-2H3)를 6-웰 플레이트에 5 × 105 cells/well 농도로 접종하고 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 DMEM(Dulecco' Modified Eagle Medium) 배지에서 37℃ 및 5% CO2 조건에서 16시간 동안 배양하였다. 그 후, 시클로스포린 A(cyclosporine A)(양성 대조군, 1μM) 또는 코브로톡신(50, 150 및 500ng/ml)을 각각 첨가하고 1시간 동안 배양하여 전처리하였다. 다음으로, PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate) 50ng/ml 및 이오노미신(ionomycin) 1μM을 첨가하고 동일 조건에서 9시간 동안 배양하였다. PMA 및 이오노미신은 인터페론(interferon), 퍼포린(Perforin), IL-2, IL-4 등과 같은 사이토카인의 세포내 생산을 자극하기 위하여 사용하였다.
세포 RNA를 추출하기 위해, 세포를 RNeasy mini kit(Qiagen)를 사용하여 QIAsymphony 또는 QIAQube(Qiagen) 기기에 장착하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 Agilent 2100 BioAnalyzer(Agilent Technologies, SantaClara, CA, USA)를 사용하여 견고성(integrity)을 확인하였다. cDNA는 ImProm-II Reverse Transcription System(Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 1μg의 RNA를 cDNA로 합성하였다. PCR은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 수행하였다. PCR 반응은 0.02μl Ex taq 폴리머라제(TAKARA, Otsu, Shiga, Japan), 2μl Ex taq 폴리머라제 버퍼, 1.6μl dNTP(10mM), 2μl 정방향 프라이머(Forward primer, 20μM), 2μl 리버스 프라이머(Reverse primer, 20μM), 11.38 μl 물 및 1μl 합성 제1가닥 cDNA를 잘 섞어 총 20μl 용량의 반응 혼합물에 대하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 IL-4은 94℃에서 4분 1회(denaturation), 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초의 사이클 25회(annealing) 및 72℃에서 5분 1회(extension)로, β-actin 조건은 94℃에서 4분 1회(denaturation), 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초의 사이클 20회(annealing) 및 72℃에서 5분 1회(extension)로 설정하였다. RT-PCR 결과는 QIAxcel advanced(Qiagen) 기기를 사용하여 밴드의 강도를 측정하였다. 효능에 대한 분석은 [PMA + 이오노미신](PI) 처리군의 비율을 100으로 설정하고, 이와 비교하여 분석하였다. 사용한 프라이머의 서열은 하기 표 2와 같다.
Gene Primer sequences
IL-4 Forward(5´→ 3´) CCA CCT TGC TGT CAC CCT GTT CTG CT
Reverse (3´→5´) GTG TTG TGA GCG TGG ACT CAT TCA CG
β-actin Forward (5´→ 3´) ACC GTG AAA AGA TGA CCC AG
Reverse (3´→5´) TGT CAG CTG TGG TGG TGA AG
[ 실험예 5] 아토피 피부염 동물 모델을 이용한 코브로톡신의 아토피 피부염 개선 효과 분석
동물 모델에서 코브로톡신의 아토피 피부염 개선 효과를 확인하기 위해, 아토피 피부염 유도 무모 마우스(hairless mouse)를 사용하여 하기와 같은 방법으로 상기 효과를 분석하였다.
코브로톡신의 피부 수분 함유량 증진을 통한 피부장벽 기능 개선 효과를 확인하기 위해, 먼저, 6주령(암컷, 23~27g) 무모 마우스(hairless mouse, 오리엔트바이오)를 하기와 같이 4개의 군으로 구분하였다.
1) 무처리군
2) DNCB(2,4-dinitrochlorobenzene) 유도 후 비히클(vehicle) 처리군
3) DNCB 유도 후 1.25μg/ml 코브로톡신 처리군
4) DNCB 유도 후 2.5μg/ml 코브로톡신 처리군
DNCB는 99% 아세톤 및 올리브 오일을 부피 기준으로 3:1로 섞은 용액을 용매로 사용하였다. 비히클은 프로필렌 글리콜(propylene glycol) 및 에탄올을 부피 기준으로 7:3으로 섞은 것을 사용하였다. 처리군 구분 후, 7일 동안 1일 1회 1(w/v/)% DNCB 용액을 마우스 등에 200μl 도포하였다. 마지막 도포 후, 7일간 처리하지 않고 7일 후 2일 간격으로 총 7번 0.1(w/v)% DNCB 용액을 상기와 같은 방법으로 도포하였다. 0.1(w/v)% DNCB 용액을 도포하고, 14일 동안 비히클을 용매로 한 코브로톡신(1.25 및 2.5μg/ml) 용액 및 비히클을 오전 및 오후로 나누어 1일 2회로 마우스 등에 200μl씩 각각 도포하였다. 시료가 도포된 마우스 피부에 대하여, 경피수분손실량(Trans Epidermal Water Loss; TEWL)은 AquaFlux(Biox, London, UK)를 이용해서 측정하였고, 피부 수분 함유량(hydration)은 Skin-O-Mat(COSMOMEP, Berlin, Germany)를 이용하여 측정하였다. 처음 DNCB에 의해 아토피 피부염을 유도하기 전, 유도 후 7일 후, 14일 후 및 21일 후의 경피수분손실량 및 피부 수분 함유량을 측정하였다.
또한, 코브로톡신 처리를 통한 아토피 피부염 유도 마우스의 표피두께 및 조직학적 변화를 확인하기 위해, 마우스 조직을 10% 포르말린(formalin)으로 고정한 후, 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)으로 염색하였다. 염색한 조직을 도립현미경(TE-2000U, Nikon)을 이용하여 촬영하였고, Leica application suite 프로그램을 이용하여 표피층의 두께를 측정하였다.
또한, 코브로톡신 처리를 통한 아토피 피부염 유도 마우스 병변 부위의 비만세포가 침윤된 정도를 확인하기 위해, 마우스 조직을 10% 포르말린으로 고정한 후, 톨루이딘 블루(toluidine blue)로 염색하였다. 염색한 조직을 도립현미경(TE-2000U, Nikon)을 이용하여 촬영하였고, Image J 프로그램을 이용하여 비만세포의 수를 측정하였다.
또한, 코브로톡신의 아토피 피부염 유도 마우스의 혈장에서 면역글로불린 E(immunoglobulin E; 이하 IgE라 함) 및 IL-4 억제 효과를 확인하기 위해, IgE 및 IL-4 단백질량을 ELISA 실험법을 이용하여 측정하였다. 마우스를 마취시킨 후 0.18M EDTA 30μl가 들어있는 주사기를 이용하여 복부대동맥에서 혈액을 채취하였다. 원심분리기를 이용하여 4℃ 및 8,000rpm 조건에서 15분간 원심분리한 후, 혈장 및 혈구를 분리하였다. 이 중 혈장에 대하여 마우스 IgE ELISA quantitation kit(Bethy Laboratories, Montgomery, TX, USA) 및 마우스 IL-4 ELISA quantitation kit(Bethy Laboratories, Montgomery, TX, USA)를 사용하여 IgE 및 IL-4의 단백질량을 분석하였다.
[ 실시예 1] 활성독 및 불활성독의 세포독성 분석
상기 실험예 1에 따라, 사독 조성물의 활성독 및 불활성독의 세포독성을 분석한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 활성독의 경우, B16F10 세포 24h 처리군에서 0.1μg/mL까지 세포독성이 나타나지 않았고, 48h 처리군에서는 모든 농도에서 세포독성이 나타나지 않는 것을 확인하였다. 또한, RBL-2H3, HaCaT 및 HDF 세포에서는 4μg/mL까지 세포독성이 나타나지 않았고, RAW264.7 세포에서는 10μg/mL까지 세포독성이 나타나지 않는 것을 확인하였다.
반면, 불활성독의 경우, HaCaT, HDF 및 B16F10 세포 24h 처리군에서는 모든 농도에서 세포독성이 나타나지 않았고, B16F10 세포 48h 처리군에서는 8μg/mL까지 세포독성이 나타나지 않았으며, RBL-2H3 세포에서는 4μg/mL까지 세포독성이 나타나지 않는 것을 확인하였다. 이는 사독은 활성독보다 불활성독에서 세포 안전성이 우수함을 의미한다.
[ 실시예 2] 활성독 및 불활성독의 염증 억제 효과 분석
상기 실험예 2에 따라, 사독 조성물의 활성독 및 불활성독의 염증 억제 효과를 분석한 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 활성독 및 불활성독 모두 LPS 자극에 의해 증가된 COX-2 및 TNF-α의 발현을 유의성 있게 억제시켜 항염증 효과가 나타났고, 동일 농도 기준 불활성독에서 더 우수한 COX-2 및 TNF-α 발현 억제 효과가 나타나는 것을 확인하였다.
[ 실시예 3] 코브로톡신의 탈과립 효과 분석
상기 실험예 3에 따라, 코브로톡신의 탈과립 효과를 분석한 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 코브로톡신은 RBL-2H3 세포에서 탈과립을 억제하는 것을 확인하였다. 이는 코브로톡신이 탈과립에 의한 급격한 알레르기 반응, 가려움증 등의 아토피 증상 완화에 도움이 될 수 있음을 의미한다.
[ 실시예 4] 코브로톡신의 IL-4 억제 효과 분석
상기 실험예 4에 따라, 코브로톡신의 IL-4 억제 효과를 분석한 결과, 도 8에 나타나 바와 같이, 코브로톡신은 RBL-2H3 세포에서 IL-4의 발현을 억제하는 것을 확인하였다. 이는 코브로톡신이 IL-4 발현 억제를 통해 아토피 증상 완화에 도움이 될 수 있음을 의미한다.
[ 실시예 5] 아토피 피부염 동물 모델을 이용한 코브로톡신의 아토피 피부염 개선 효과 분석
상기 실험예 5에 따라, 아토피 피부염 동물 모델을 이용한 코브로톡신의 아토피 피부염 개선 효과를 분석하였다. 구체적으로, 코브로톡신의 피부 수분 함유량 증진을 통한 피부장벽 기능 개선 효과를 분석한 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 코브로톡신 처리군에서 외관상으로 태선화, 부종, 홍반, 과각질화 등의 피부염 증상들이 개선된 것을 확인하였다.
또한, 코브로톡신 처리를 통한 아토피 피부염 유도 마우스의 표피두께 및 조직학적 변화를 분석한 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 코브로톡신 처리군에서 대조군인 비히클 처리군보다 표피 두께가 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 코브로톡신 처리를 통한 아토피 피부염 유도 마우스 병변 부위의 비만세포 침윤 정도를 분석한 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 코브로톡신 처리군에서 대조군인 비히클 처리군보다 병변부위로 침윤된 비만세포의 수가 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 코브로톡신의 아토피 피부염 유도 마우스 혈장에서 IgE 및 IL-4 억제 효과를 분석한 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 코브로톡신 처리군에서 대조군인 비히클 처리군보다 혈청 내 IL-4 단백질량이 감소하고, 고농도에서 IgE 단백질량이 감소하는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims (8)

  1. 코브라로부터 채취한 사독분말을 증류수와 혼합한 사독 조성물을 중탕하여 독성을 불활성화 시킨 신경독(neurotoxin)을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
    상기 염증성 피부질환은 접촉피부염, 자극 접촉피부염, 알레르기 접촉피부염, 접촉 두드러기 증후군, 자가 감작 피부염, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 지루성 피부염, 구진상 두드러기, 습진 및 건선으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 염증성 피부질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 신경독은 COX-2(cyclooxygenase-2), TNF-α(tumour necrosis factor α), IgE(immunoglobulin E) 및 IL-4(interleukin-14)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 신경독은 세포의 탈과립을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 신경독은 침윤성 비만세포의 수를 감소시키는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  7. 삭제
  8. 코브라로부터 채취한 사독분말을 증류수와 혼합한 사독 조성물을 중탕하여 독성을 불활성화 시킨 신경독(neurotoxin)을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물로서,
    상기 염증성 피부질환은 접촉피부염, 자극 접촉피부염, 알레르기 접촉피부염, 접촉 두드러기 증후군, 자가 감작 피부염, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 지루성 피부염, 구진상 두드러기, 습진 및 건선으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 염증성 피부질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20200042258A (ko) 2018-10-15 2020-04-23 문성현 정제된 코브로톡신의 검출 및 대량 생산방법

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