CN109908350B - 钠离子通道阻断剂在制备治疗黑色素瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种钠离子通道阻断剂在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用，所述的钠离子通道阻断剂为河豚毒素和脱水河豚毒素中的任一种或两种，还提供了一种治疗黑色素瘤的药物，包括所述钠离子通道阻断剂、第二治疗剂和和药学上可接受的载体，所述的第二治疗剂为化疗剂、免疫治疗剂、基因治疗剂或放疗剂中的一种或多种。本发明表明钠离子通道阻断剂有抑制黑色素瘤癌细胞的增殖和致瘤作用，并可以与第二治疗剂联用，特别是与丝裂原活化细胞外信号调节激酶抑制剂产生协同作用，达到更好的治疗黑色素瘤的效果。

Description

钠离子通道阻断剂在制备治疗黑色素瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及医学药物研发技术领域，涉及特异性钠离子通道阻断剂在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。

背景技术

黑色素瘤恶性程度高，转移早，特别是致死率很高，在皮肤癌中占到了80％。目前，黑色素瘤的治疗主要包括放疗、化疗和手术等方法。极早期的黑色素瘤可以通过手术治愈，但由于黑色素瘤早期症状不明显，大部分患者发现时已经处于中晚期，主要依赖放疗或化疗，而其对放疗或化疗药物的敏感性差、耐药性是目前黑色素瘤治疗的瓶颈。

寻找新的治疗靶标一直是治疗黑色素瘤的研究热点。研究表明，黑色素瘤可以通过异常激活不同的促进细胞增殖的信号通路来实现其不受限制的增长。因此，亟需寻找或研发出一种可以同时抑制多种信号传导通路的药剂，通过新药剂或既有药物与新药剂的联合施用，可以增效减毒，特别是控制肿瘤的耐药性，为黑色素瘤的传统放疗和化疗方法赋予新的生机。因此，开发出针对不同分子通路的选择性药剂具有非常重要的作用。

近年来，离子通道在癌症中的作用逐渐被研究和重视。离子通道在肿瘤中经常有异常表达，导致肿瘤变异，恶性程度增加和耐药性。特别是钠离子通道在非神经细胞，如肿瘤细胞中的作用逐步被阐明。研究表明，电压门控钠离子通道介导的细胞内钠释放可调节巨噬细胞和肿瘤细胞的侵袭。

CN101450056A公开了一种钠离子通道阻断剂用于治疗抗生素对生物耐药性的新用途，该发明发现采用氨基全氢化喹唑啉类化合物和双胍基氢化嘌呤环类化合物作为钠离子通道阻断剂，发现钠离子通道阻断剂可以有效抑制“耐药病菌”或“病源微生物的残留病菌株”的化学成分，使用本发明钠离子通道阻断剂类的药品或者化学成分，能快速将人体内或动物体内残留的“耐药病菌”或“病源微生物的残留病菌株”拮抗或将其排泄出人体或生物体外，减少病源性微生物对抗生素的耐药性。

CN128453A公开了一种全身给药的镇痛方法，发现采用钠离子通道阻断剂河豚毒素的制剂可以有效地缓解多种物理化学原因造成的疼痛。

目前尚未发现钠离子通道阻断剂在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了钠离子通道阻断剂在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。本发明研究结果表明钠离子通道阻断剂具有抑制黑色素瘤癌细胞的增殖和致瘤作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了钠离子通道阻断剂在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。

优选地，所述的钠离子通道阻断剂为河豚毒素和脱水河豚毒素中的任一种或两种。

优选地，所述黑色素瘤为恶性前细胞、恶性细胞、转移性细胞或多药耐药性细胞。

本发明还提供了一种治疗黑色素瘤的药物，包括所述钠离子通道阻断剂、第二治疗剂和药学上可接受的载体。

优选地，所述钠离子通道阻断剂在药物中的质量百分含量为0.0001-0.1％。

优选地，所述钠离子阻断剂与所述第二治疗剂的质量比为50:1-1:50。

优选地，所述的第二治疗剂为化疗剂、免疫治疗剂、基因治疗剂或放疗剂中的一种或多种。

进一步优选地，所述的第二治疗剂为丝裂原活化细胞外信号调节激酶(MEK)抑制剂。

优选地，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、混悬剂、溶液剂、乳剂、散剂、颗粒剂、注射剂、冻干粉针剂、搽剂、涂剂、涂膜剂、软膏剂、洗剂、栓剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、软膏剂、硬膏剂、巴布剂和贴剂。

优选地，所述药物可全身施用或局部施用；进一步优选地，所述的全身施用为经口施用和/或静脉施用，所述的局部施用为局部注射和/或局部敷用。

本发明的有益效果为：

本发明提供了钠离子通道阻断剂在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用，并采用钠离子通道阻断剂进行抑制和治疗黑色素瘤的体内和体外试验。本发明研究结果表明河豚毒素和/或脱水河豚毒素有抑制黑色素瘤癌细胞的增殖和致瘤作用。

同时，本发明还将已知的钠离子通道阻断剂与第二治疗剂，如化疗剂、免疫治疗剂、基因治疗剂或放疗剂联用，进行药物再定位，削减了新药物开发的费用，缩短了研制时间。同时，与目前所采用的单一的既有药物相比，其靶标特异，可以显著降低副作用和耐药性。

附图说明

图1为本发明实施例1的受试样对小鼠黑色素瘤的影响；

图2为本发明实施例3的脱水河豚毒素A、河豚毒素B和曲美替尼D对人黑色素瘤细胞株A375的影响；

图3为本发明实施例3的脱水河豚毒素A、河豚毒素B和卡比替尼E对人黑色素瘤细胞株A375的影响。

具体实施方式

名词解释：

本发明所述的恶性前细胞指的是癌前细胞，即将发展为癌症；

所述的恶性细胞是指已经发展为癌细胞；

所述的转移性细胞指的是发生转移的黑色素瘤细胞；

所述的多药耐药细胞指的是已经发生耐药的黑色素瘤细胞。

本发明公开了钠离子通道阻断剂在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的钠离子通道阻断剂在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用中所用原料药或辅料均可由市场购得。其中，所述的河豚毒素，其含量≥99％(HPLC)，所述的脱水河豚毒素为4,9-脱水河豚毒素，其含量≥98％(HPLC)，所述的粗品河豚毒素，其河豚毒素含量≥63％，上述药物可以为市售品，亦可通过本领域的常规方法制得，本发明不对药物的来源作任何限定。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

河豚毒素，脱水河豚毒素以及脱水河豚毒素和河豚毒素的组合物抑制小鼠黑色素实体瘤

(一)实验材料

(1)黑色素瘤细胞株：黑色素瘤细胞B16F10为本实验室冻存；

(2)受试药物：脱水河豚毒素、河豚毒素、粗品河豚毒素(代表脱水河豚毒素和河豚毒素的组合物)、顺铂冻干粉和生理盐水；

(3)实验动物：清洁级ICR小鼠，雌雄各半。

(二)实验方法

将B16F10黑色素瘤细胞复苏后体外培养，传代扩增后，收集对数生长期细胞，用含体积分数10％胎小牛血清的DMEM液体培养基悬浮，每只小鼠右腋下接种该细胞悬液0.2ml(1×10⁶个瘤细胞)。黑色素瘤细胞接种次日，将接种小鼠随机分为6组，模型组10只，其余每组12只，雌雄各半。

模型组给予10ml/kg生理盐水，阳性组给予2mg/kg顺铂DDP，A1组给予905μg/kg脱水河豚毒素，A2组给予1810μg/kg脱水河豚毒素，B1组给予10μg/kg河豚毒素，B2组给予5μg/kg河豚毒素，C1组给予10μg/kg粗品河豚毒素，C2组给予5μg/kg粗品河豚毒素。各组小鼠均于接种黑色素瘤次日，通过腹腔注射给药，给药体积10ml/kg体重，每天1次，连续7d。

给药期间，小鼠每日称重，观察小鼠生存状态。停药次日处死小鼠，剥瘤称重，计算抑瘤率，并进行显著性检验。考察给药组与模型组比较，有无显著性差异，是否呈量效关系。实验重复三次。

(三)实验结果

表1脱水河豚毒素、河豚毒素和粗品河豚毒素对小鼠黑色素瘤B16F10的影响

注：A1-2代表脱水河豚毒素，B1-2代表河豚毒素，C1-2代表河豚毒素粗品；*代表与模型组相比有显著性差异，p<0.05；**代表与模型组相比有显著性差异，p<0.01。

由图1和表1可知，河豚毒素，粗品河豚毒素在5μg/kg和10μg/kg时，对小鼠黑色素瘤B16F10具有显著抑制作用。其中，10μg/kg河豚毒素对小鼠黑色素瘤B16F10的抑制率与阳性对照药顺铂相当。脱水河豚毒素在905μg/kg和1810μg/kg时，对小鼠黑色素瘤B16F10有显著抑制作用。以上结果表明，河豚毒素、脱水河豚毒素及其组合物对小鼠黑色素实体瘤具有显著抑制作用。

实施例2

脱水河豚毒素，河豚毒素以及粗品河豚毒素抑制人黑色素瘤细胞系

(一)实验材料

(1)黑色素瘤细胞株：黑色素瘤细胞G-361购自美国ATCC；

(2)主要受试药物：脱水河豚毒素、河豚毒素、乙酸和顺铂冻干粉。

(二)实验方法

采用MTS法考察受试样品A(脱水河豚毒素)，受试样品B(河豚毒素)对人黑色素瘤细胞株G-361的细胞毒作用。

用含体积分数10％胎小牛血清的McCoy’s 5A(含2mM谷氨酰胺)液体培养基将人黑色素瘤细胞G-361制成单细胞悬液，将人黑色素瘤细胞G-361以2×10³个/孔接种于96孔板中，每孔90μl。常规培养24h后，实验A组每孔加10μl不同浓度的脱水河豚毒素溶液，使终浓度分别为125μg/ml、62.5μg/ml、31.25μg/ml、15.625μg/ml和7.8μg/ml；实验B组每孔加10μl不同浓度的河豚毒素溶液，使终浓度分别为125μg/ml、62.5μg/ml、31.25μg/ml、15.625μg/ml和7.8μg/ml；顺铂对照组每孔加入10μl顺铂工作液，使终浓度为10μg/ml；溶媒对照组每孔加入10μl乙酸工作液，使终浓度为0.0108％乙酸；另外，以单纯的培养液和未经药物作用的细胞分别作为空白组和正常组，每组设8个复孔，培养24h后，每孔加入20μl MTS/PMS，使MTS终浓度为380μg/ml，PMS终浓度为9.52μg/ml，37℃继续培养4h后，以490nm的波长测定吸光度值(OD490)。

计算：

顺铂生长抑制率＝(正常组吸光度值-顺铂组吸光度值)/(正常组吸光度值-空白组吸光度值)×100％。

试样生长抑制率＝(溶媒对照组吸光度值-给药组吸光度值)/(溶媒对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100％。

(三)实验结果

表2脱水河豚毒素和河豚毒素对黑色素瘤癌细胞株G-361增殖的影响

(n＝8)

注：A1-5代表脱水河豚毒素，B1-5代表河豚毒素；与正常组相比，^##P<0.001；与溶媒对照组相比，^*P<0.05，^**P<0.01。

由表2可知，脱水河豚毒素，河豚毒素对人黑色素细胞瘤细胞株G-361的增殖具有抑制作用。其中，当脱水河豚毒素的浓度为31.25μg/ml时，对人黑色素细胞瘤细胞株G-361的抑制率较好，达到64.4183％；当河豚毒素的浓度为62.5μg/ml时，对人黑色素细胞瘤细胞株G-361的抑制率较好，达到56.5826％。

实施例3

脱水河豚毒素、河豚毒素与曲美替尼或卡比替尼联用抑制人黑色素瘤细胞增殖

(一)实验材料

(1)黑色素瘤细胞株：黑色素瘤细胞A375(CRL1619IG-3)购自美国ATCC；

(2)主要受试药物：脱水河豚毒素(A)、河豚毒素(B)、曲美替尼(D)、卡比替尼(E)、乙酸和生理盐水。

(二)实验方法

采用CCK8法考察脱水河豚毒素，河豚毒素，曲美替尼，卡比替尼，脱水河豚毒素与曲美替尼合用，河豚毒素与曲美替尼合用，脱水河豚毒素与卡比替尼合用，以及河豚毒素与卡比替尼合用对人黑色素瘤细胞株A375的细胞毒作用。

用含体积分数10％胎小牛血清的DMEM液体培养基将黑色素瘤细胞株A375制成单细胞悬液，将黑色素瘤细胞株A375细胞悬液以1×10⁵/mL的密度接种于96孔板中，每孔100μl，在37℃培养箱中预培养细胞24h后，实验A组，每孔加入10μl的脱水河豚毒素(终浓度：10μg/ml)；实验B组，每孔加入10μl的河豚毒素(终浓度：1μg/ml)；实验D组，每孔加入10μl的曲美替尼(终浓度：1μg/ml)；实验E组，每孔加入10μl的卡比替尼(终浓度：1μg/ml)；联合实验A+D组，每孔加入10μl的脱水河豚毒素和曲美替尼(脱水河豚毒素和曲美替尼的质量比为50:1)使其终浓度为10μg/ml；联合实验B+D组，每孔加入10μl的河豚毒素和曲美替尼(河豚毒素和曲美替尼1:1)使其终浓度为1μg/ml；联合实验A+E组，每孔加入10μl的脱水河豚毒素和卡比替尼(脱水河豚毒素和卡比替尼的质量比为20:1)使其终浓度为10μg/ml；联合实验B+E组，每孔加入10μl的河豚毒素和卡比替尼(河豚毒素和卡比替尼1:50)使其终浓度为1μg/ml；另外，以单纯的培养液和未经药物作用的细胞分别作为空白组和正常对照组，每组设8个复孔，培养24h后，每孔中再加入10μl的CCK-8试剂，继续培养2h后，利用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

细胞生长抑制率(％)＝[(A_c-A_t)/(A_c-A_b)]×100％

其中：A_t为实验组孔的吸光度；

A_c为对照组孔的吸光度；

A_b为空白组孔的吸光度。

(三)实验结果

由图2和图3可知，所有给药组与对照组相比，均体现了显著的抑制黑色素瘤细胞增殖的作用(p<0.001)。由图2可知，脱水河豚毒素与曲美替尼联合给药比单独给予脱水河豚毒素(p<0.01)或单独给予曲美替尼(p<0.01)具有更显著的抑制活性；河豚毒素与曲美替尼联合给药组比单独给予河豚毒素(p<0.01)或单独给予曲美替尼(p<0.01)具有更显著的抑制活性；由图3可知，脱水河豚毒素与卡比替尼联合给药比单独给予脱水河豚毒素(p<0.01)或单独给予卡比替尼(p<0.05)具有更显著的抑制活性；河豚毒素与卡比替尼联合给药组比单独给予河豚毒素(p<0.01)或单独给予卡比替尼(p<0.05)具有更显著的抑制活性。

可见，钠离子通道阻断剂河豚毒素或脱水河豚毒素与第二治疗剂丝裂原活化细胞外信号调节激酶(MEK)抑制剂曲美替尼，卡比替尼的组合具有协同作用，显示出更显著的抑制黑色素瘤细胞增殖的作用。

综上所述，本发明提供的钠离子通道阻断剂在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用，有抑制黑色素瘤癌细胞的增殖和致瘤作用；同时，本发明将已知的钠离子通道阻断剂与第二治疗剂，如化疗剂、免疫治疗剂、基因治疗剂或放疗剂联用，进行药物再定位，削减了新药物开发的费用，缩短了研制时间，与目前所采用的单一的既有药物相比，其靶标特异，显著增强药效，可以显著降低副作用和耐药性。

Claims (3)

1.一种治疗黑色素瘤的药物，其特征在于，包括钠离子通道阻断剂、第二治疗剂和药学上可接受的载体；

所述黑色素瘤为恶性前细胞、恶性细胞、转移性细胞或多药耐药性细胞；

所述钠离子通道阻断剂为河豚毒素和脱水河豚毒素中的任一种或两种；

所述第二治疗剂为丝裂原活化细胞外信号调节激酶抑制剂；所述丝裂原活化细胞外信号调节激酶抑制剂为曲美替尼或卡比替尼；

所述钠离子阻断剂与所述第二治疗剂的质量比为50:1-1:50。

2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、混悬剂、溶液剂、乳剂、散剂、颗粒剂、注射剂、冻干粉针剂、搽剂、涂剂、涂膜剂、软膏剂、洗剂、栓剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、软膏剂、硬膏剂、巴布剂和贴剂。

3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，所述的药物可全身施用或局部施用。

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