CN108524522A - 河豚毒素在制备阻抑肺癌细胞迁移和增殖的药物中的应用 - Google Patents

河豚毒素在制备阻抑肺癌细胞迁移和增殖的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及河豚毒素在制备阻抑肺癌细胞迁移和增殖的药物中的应用，属于医学药物研发技术领域。本发明提供的应用制备得到的阻抑肺癌细胞迁移和增殖的药物包括河豚毒素和药物载体；所述药物含有0.5～2μg/mL的河豚毒素。本发明提供的药物能够有效降低肺癌细胞的迁移与增殖能力，促进细胞凋亡发生。

Description

河豚毒素在制备阻抑肺癌细胞迁移和增殖的药物中的应用
技术领域
本发明涉及医学药物研发技术领域，具体涉及河豚毒素在制备阻抑肺癌细胞迁移和增殖的药物中的应用。
背景技术
目前在中国，癌症已成为疾病死因之首，且发病率和死亡率还在攀升，对公众健康造成了巨大威胁。2016年，中国有280多万人死于癌症，平均每天7500人。死于肺癌的患者约为57万人，肺癌患者生存率仅为16.1％。因此，肺癌以其高致死率号称“全球头号癌症杀手”。其中，肺癌作为高转移性恶性肿瘤向远处组织器官侵袭与转移是造成癌症患者致死的重要原因。因此，能否控制侵袭与转移成为恶性肿瘤患者预后康复的关键因素。细胞凋亡是各种抗癌症药物引起细胞死亡的主要方式。通过药物处理阻抑肺癌细胞迁移，减少肺癌细胞增殖，增加细胞凋亡是当前研究的热点。目前，预防肺癌细胞转移与增殖的方法，主要有中草药预防，化学合成药物预防等为主。中国的中草药取材广泛，价格相对较低，但是药物成分较为复杂，药物作用的特异性不强，很难用于针对性的治疗，只能用于术后的恢复。而化学合成的药物，虽针对性较好，但是药物的副作用较大，对正常细胞与患者的身体、饮食等具有较大的影响，药物的依耐性较强，同时，价格昂贵，普通患者难以长期服用。
发明内容
本发明的目的在于提供河豚毒素在制备阻抑肺癌细胞迁移和增殖的药物中的应用。本发明提供的药物能够有效降低肺癌细胞的迁移与增殖能力，促进细胞凋亡发生。
本发明提供了河豚毒素在制备阻抑肺癌细胞迁移和增殖的药物中的应用。
优选的是，所述药物中河豚毒素的有效剂量为0.5～2μg/mL。
本发明还提供了一种阻抑肺癌细胞迁移和增殖的药物，包括河豚毒素和药物载体；所述河豚毒素在药物中的质量含量为0.5～2μg/mL。
优选的是，每100mL所述药物载体包括2～3mL的莪术油，1～2mL的香叶油，2～3mL的甜杏仁油，2～3mL的小麦胚芽油，4～6mL的鸦胆子油和83～89mL的河豚肝油。
优选的是，所述河豚肝油的制备包括以下步骤：将河豚肝脏和水混合，熬煎2～2.5h，收集上层河豚肝油。
优选的是，所述河豚肝脏和水混合的质量比为(3～5)：1。
优选的是，所述熬煎的温度为120℃～130℃。
本发明还提供了上述技术方案所述药物的制备方法，包括以下步骤：
1)将河豚毒素溶于河豚肝油，制成河豚毒素母液；
2)将莪术油、香叶油、甜杏仁油、小麦胚芽油和鸦胆子油加入河豚肝油中，在60℃下加热搅拌后，与所述步骤1)得到的河豚毒素母液混合，60℃搅拌90min，得到阻抑肺癌细胞迁移和增殖的药物；
步骤1)和步骤2)中河豚肝油的用量比为(1～4)：(80～85)。
优选的是，所述河豚毒素母液中河豚毒素的浓度为40～80μg/mL。
优选的是，所述搅拌的速率为90～120rpm。
本发明提供了河豚毒素在制备阻抑肺癌细胞迁移和增殖的药物中的应用。本发明利用河豚毒素制备的药物能够降低肺癌细胞的迁移与增殖能力，促进细胞凋亡发生，且河豚毒素的药物依赖性低。在肺癌患者治疗过程中，服用本发明的药物可以增强患者自身的预防与治愈能力。
附图说明
图1为本发明实施例4提供的不同药物添加量处理后肺癌A549细胞的迁移结果图；
图2为本发明实施例4提供的不同药物添加量处理后肺癌细胞A549的克隆结果图；
图3为本发明实施例4提供的不同药物添加量处理后肺癌细胞A549的细胞周期比例分布图；
图4为本发明实施例4提供的流式细胞术检测不同药物添加量处理后肺癌细胞A549的细胞周期结果图；
图5为本发明实施例4提供的流式细胞术检测不同药物添加量处理后肺癌细胞A549的细胞凋亡结果图；
图6为实施例5提供的50μL药物处理后肺癌A549细胞的迁移能力结果图；
图7为本发明实施例5提供的50μL药物处理后肺癌A549细胞的克隆个数结果图；
图8为本发明实施例5提供的药物作用24h后的细胞状态图；
图9为本发明实施例5提供的流式细胞术分析50μL药物处理后肺癌A549细胞的细胞周期结果图；
图10为本发明实施例5提供的流式细胞术分析50μL药物处理后肺癌A549细胞的细胞周期结果图；
图11本发明实施例5提供的50μL药物处理后肺癌A549细胞凋亡结果图；
图12为本发明实施例6提供的正常人胚肺细胞MRC-5在50μL药物处理下培养192h结果图。
具体实施方式
本发明提供了河豚毒素在制备阻抑肺癌细胞迁移和增殖的药物中的应用。在本发明中，所述药物的剂型优选为液体剂型。
在本发明中，所述药物中河豚毒素的有效剂量为0.5～2μg/mL，优选为1～2μg/mL。本发明所述药物的服用剂量优选为1～1.5mL/次，服用频率优选为3次/天。
本发明提供了一种阻抑肺癌细胞迁移和增殖的药物，包括河豚毒素和药物载体；所述河豚毒素在药物中的质量含量为0.5～2μg/mL。本发明对所述河豚毒素的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的河豚毒素的常规市售产品即可。在本发明中，所述河豚毒素的纯度优选为99％以上。在本发明中，所述药物优选含有1～1.5μg/mL的河豚毒素。
在本发明中，所述药物载体的作用为使河豚毒素更好地被肠道吸收。在本发明中，每100mL所述药物载体包括2～3mL的莪术油，1～2mL的香叶油，2～3mL的甜杏仁油，2～3mL的小麦胚芽油，4～6mL的鸦胆子油和83～89mL的河豚肝油；优选的，每100mL所述药物载体包括：3mL的莪术油，2mL的香叶油，2mL的甜杏仁油，2mL的小麦胚芽油，4mL的鸦胆子油和87mL的河豚肝油。本发明对所述莪术油、香叶油、甜杏仁油、小麦胚芽油和鸦胆子油的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的莪术油、香叶油、甜杏仁油、小麦胚芽油和鸦胆子油的常规市售产品即可。在本发明中，所述莪术油、香叶油、甜杏仁油、小麦胚芽油和鸦胆子油的纯度优选独立地在99％以上。在本发明中，所述药物载体取材较为容易，制作工艺简单，价格低廉。
在本发明中，所述河豚肝油的制备方法优选包括以下步骤：将河豚肝脏和水混合，熬煎2～2.5h，收集上层河豚肝油。在本发明中，所述熬煎时间优选为2.2h。
在本发明中，所述河豚肝脏和水混合的质量比为(3～5)：1，更优选为4：1。在本发明中，所述熬煎的温度为120℃～130℃，更优选为125℃。熬煎后，出油率为75％左右，油质呈黄色，收集上层河豚肝油后，本发明优选采用网筛去除油渣后冷藏。在本发明中，所述网筛的大小优选为40目。在本发明中，所述冷藏的温度优选为4℃。
本发明还提供了上述技术方案所述药物的制备方法，包括以下步骤：
1)将河豚毒素溶于河豚肝油，制成河豚毒素母液；
2)将莪术油、香叶油、甜杏仁油、小麦胚芽油和鸦胆子油加入河豚肝油中，在60℃下加热搅拌后，与所述步骤1)得到的河豚毒素母液混合，60℃搅拌90min，得到阻抑肺癌细胞迁移和增殖的药物。
本发明药物的制备优选先将河豚毒素制成河豚毒素母液，再与药物载体混合得到药物。本发明将河豚毒素溶于河豚肝油，制成河豚毒素母液。在本发明中，所述河豚毒素母液中河豚毒素的浓度为40～80μg/mL，更优选为50μg/mL。在本发明中，用于制备河豚毒素母液的河豚肝油与后一步骤使用的河豚肝油的用量比优选为(1～4)：(80～85)。
本发明优选将莪术油、香叶油、甜杏仁油、小麦胚芽油和鸦胆子油加入河豚肝油中，在60℃下加热搅拌后，与所述步骤1)得到的河豚毒素母液混合，60℃搅拌90min，得到阻抑肺癌细胞迁移和增殖的药物。在本发明中，所述搅拌的速率为90～120rpm，更优选为100rpm。本发明对所述搅拌的方式没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的搅拌装置进行搅拌即可，如采用加热磁力搅拌器。
本发明所述阻抑肺癌细胞迁移和增殖的药物制备方法简单，取材便利，可以较好地降低患者术后肺癌细胞迁移与增殖，同时，患者对药物无依赖性，增加其康复。
下面结合具体实施例对本发明所述的河豚毒素在制备阻抑肺癌细胞迁移和增殖的药物中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
河豚毒素母液配制：称取纯度为99％的河豚毒素50μg溶解于1mL河豚肝油中配制成药物母液。
将河豚鱼的肝脏放入锅中，按照肝重添加25％的水，用120℃直火熬煎2小时，出油率为75％左右，油质呈深黄色，收集后用40目的网筛除去油渣放入4℃冰箱中冷藏备用。
配制含河豚毒素1μg/mL的药液。首先配制98mL基础载体，称取河豚肝油85mL，再分别加入莪术油3mL，香叶油2mL，甜杏仁油2mL，小麦胚芽油2mL，鸦胆子油4mL，使用加热磁力搅拌器使基础载体加热至60℃后，添加含河豚毒素母液2mL，60℃恒温下100rpm转速下搅拌90分钟，使其充分溶解，室温下冷却后放入4℃冷藏备用。
实施例2
河豚毒素母液配制：称取纯度为99％的河豚毒素50μg溶解于1mL河豚肝油中配制成药物母液。
将河豚鱼的肝脏放入锅中，按照肝重添加25％的水，用120℃直火熬煎2小时，出油率为75％左右，油质呈深黄色，收集后用40目的网筛除去油渣放入4℃冰箱中冷藏备用。
配制含河豚毒素0.5μg/mL的药液。首先配制99mL基础载体，称取河豚肝油85mL，再分别加入莪术油2mL，香叶油2mL，甜杏仁油3mL，小麦胚芽油3mL，鸦胆子油4mL，使用加热磁力搅拌器使基础载体加热至60℃后，添加含河豚毒素母液1mL，60℃恒温下100rpm转速下搅拌90分钟，使其充分溶解，室温下冷却后放入4℃冷藏备用。
实施例3
河豚毒素母液配制：称取纯度为99％的河豚毒素50μg溶解于1mL河豚肝油中配制成药物母液。
将河豚鱼的肝脏放入锅中，按照肝重添加25％的水，用120℃直火熬煎2小时，出油率为75％左右，油质呈深黄色，收集后用40目的网筛除去油渣放入4℃冰箱中冷藏备用。
配制含河豚毒素2μg/mL的药液。首先配制96mL基础载体，称取河豚肝油85mL，再分别加入莪术油2mL，香叶油1mL，甜杏仁油2mL，小麦胚芽油2mL，鸦胆子油4mL，使用加热磁力搅拌器使基础载体加热至60℃后，添加含河豚毒素母液4mL，60℃恒温下100rpm转速下搅拌90分钟，使其充分溶解，室温下冷却后放入4℃冷藏备用。
实施例4
阻抑肺癌细胞迁移的操作方法。吸取0.5mL实施例1方法配制的药物，于二甲基亚砜中溶解，配制0.5mL药液/1mL二甲基亚砜的细胞实验药液。按照Transwell实验的基本操作方法，每500μL的反应体系中，加入实验药液12.5μL-50μL。8h后，将染色后的细胞小室放置于载玻片上，荧光倒置显微镜Olympus X71下100倍拍照计数，观察细胞迁移能力。不同药物添加量处理后肺癌A549细胞的迁移结果如图1和表1所示，图1中，图1-1为对照组(基础载体组，不添加药液)，图1-2为12.5μL药物处理组，图1-3为25μL药物处理组，图1-4为50μL药物处理组。由图1和表1可以看出，Transwell实验8h后，12.5μL-50μL药物处理组的A549细胞的迁移速率明显低于对照组(基础载体组，不添加药液)。
表1不同药物添加量处理后肺癌A549细胞的迁移个数
对照组 12.5μL处理组 25μL处理组 50μL处理组
平均值 95.75 67.63 50.25 25.13
标准差 8.89 4.89 5.80 3.18
抑制肺癌细胞增殖的操作方法。吸取0.5mL实施例1配制的药物，于二甲基亚砜中溶解，配制0.5mL药液/1mL二甲基亚砜的细胞实验药液。按照细胞克隆形成实验的基本操作方法，每500μL的反应体系中，加入实验药液12.5μL-50μL。不同药物浓度处理持续一周后，终止培养，固定克隆，染色，利用数码相机拍照，计数克隆数量。随着药液的增加，肺癌细胞A549克隆形成的个数明显下降。不同药物添加量处理后肺癌细胞A549的克隆结果如图2和表2所示。图2中，图2-1为对照组(基础载体组，不添加药液)，图2-2为12.5μL药物处理组，图2-3为25μL药物处理组，图2-4为50μL药物处理组。
表2不同药物添加量处理后肺癌细胞A549的克隆个数与形成率
增加肺癌细胞凋亡的操作方法。吸取0.5mL实施例1配制的药物，于二甲基亚砜中溶解，配制0.5mL药液/1mL二甲基亚砜的细胞实验药液。按照细胞周期与细胞凋亡实验的基本操作方法，每500μL的反应体系中，加入实验药液12.5μL-50μL。不同药物浓度处理24h后，收集细胞，进行流式细胞术检测。分析不同药物处理后肺癌细胞的细胞周期与细胞凋亡，结果如图3～图5和表3所示。图4中，图4-1为对照组(基础载体组，不添加药液)，图4-2为12.5μL药物处理组，图4-3为25μL药物处理组，图4-4为50μL药物处理组。图5中，图5-1为对照组(基础载体组，不添加药液)，图5-2为12.5μL药物处理组，图5-3为25μL药物处理组，图5-4为50μL药物处理组。50μL药液处理组对肺癌细胞A549有明显的G1期阻滞作用，抑制了细胞S期发生，表明50μL药液处理对肺癌细胞A549有明显周期特异性生长抑制作用。不同药物添加量处理后不同时期肺癌细胞A549的比例结果图表4所示，50μL药液处理组可以显著增加凋亡早期细胞比例。
表3不同药物添加量处理后肺癌细胞A549的细胞周期分布
细胞周期 G1 G2 S
平均值 G1phase/％ G2phase/％ Sphase/％
对照组(基础载体添加组) 50.31 6.72 42.97
12.5μL药物添加组 51.03 5.66 43.30
25μL药物添加组 52.76 3.80 43.44
50μL药物添加组 84.60 0.00 15.40
表4不同药物添加量处理后不同时期肺癌细胞A549的比例
通过在基础载体中添加河豚毒素可以有效地阻抑肺癌细胞迁移，抑制细胞克隆，增加细胞早期凋亡的发生。同时，本发明所涉及的材料取源方便，制作工艺简单，价格相对低廉。这为后期的临床实验和推广研究提供支撑。
实施例5
阻抑肺癌A549细胞迁移的操作方法。吸取0.5mL实施例1配制的药物，溶解于二甲基亚砜中溶解，配制0.5mL药液/1mL二甲基亚砜的细胞实验药液。将处于对数生长期的A549细胞消化，重悬，计数，在六孔板每孔加入2×105个A549细胞，铺板过程中要确保每孔加入细胞数目的一致；24h后每500μL的反应体系中，加入实验药液50μL，对照组只添加相应体积的基础载体溶液；药物作用24h后弃去旧培养液，消化细胞，用适量培养液重悬细胞并计数；按实验设计取所需数量小室于一空24孔板中，加100μL无血清培养基到小室内，培养箱放置1～2h；在24孔板每孔加入600μL含30％FBS培养液；按一定比例稀释细胞，在Transwell小室膜水化后，从小室内小心移去培养基，再加无血清细胞悬液(含2×105cell/mL)100μL到每个小室中；用镊子将装有细胞的小室小心转移到含30％FBS培养液的小孔中，放置培养箱培养8h；实验结束，取出小室，倒扣于吸水纸上以去除培养液，将棉签轻抵小室内底膜，轻轻转动擦去小室内层非迁移细胞；加400μL染色液到24孔板的空孔中；用镊子夹取小室浸泡在染色液中，染色20min，将膜表面已迁移的细胞染色；将染色的小室浸泡在一个大的水杯中，漂洗数次。室温下晾干小室；将小室放置载玻片上，荧光倒置显微镜Olympus X71下100×拍照后计数。50μL药物处理组的肺癌A549细胞的迁移能力明显低于对照组(图6和表5)，图6中，图6-1为对照组，图6-2为50μL药物处理组。
表5 50μL药物处理后肺癌A549细胞的迁移个数
抑制肺癌A549细胞增殖的操作方法。吸取0.5mL实施例1配制的药物，溶解于二甲基亚砜中溶解，配制0.5mL药液/1mL二甲基亚砜的细胞实验药液。将处于对数生长期的A549细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液；六孔板每孔加入300个A549细胞，铺板过程中要确保每孔加入细胞数目的一致；24h后加入实验药液50μL，对照组只添加相应体积的基础载体溶液；药物作用3d后弃去旧培养液，重新加入相同浓度的药物，对照组换新鲜培养液，添加相应体积的基础载体溶液；培养一周后观察到培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养；弃去旧培养液，PBS小心浸洗2次；每孔加入1mL 4％多聚甲醛，固定15min，灭菌的超纯水清洗2次，每次2min；每孔加入1mLCrystal Violet Staining Solution(1％结晶紫染色液)，室温下避光孵育10min，无菌的超纯水清洗2次，每次2min，空气干燥；将培养板倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，计算克隆形成率。克隆形成率＝(克隆数/接种细胞数)*100％。50μL药物处理组的肺癌A549细胞的克隆个数与克隆形成率明显低于对照组(图7和表6)，图7中，图7-1为对照组，图7-2为50μL药物处理组。
表6 50μL药物处理后肺癌A549细胞的克隆个数与形成率
对照组 50μL处理组
克隆形成数量/个 253 6
克隆形成率/％ 84.44 2.00
标准差 3.02 0.33
增加肺癌A549细胞凋亡的操作方法。吸取0.5mL实施例1配制的药物，溶解于二甲基亚砜中溶解，配制0.5mL药液/1mL二甲基亚砜的细胞实验药液。将处于对数生长期的A549细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液；六孔板每孔加入2×105A549细胞，铺板过程中要确保每孔加入细胞数目的一致；24h后加入实验药液50μL，对照组只添加相应体积的基础载体溶液；药物作用24h后消化细胞，1500rpm离心5min，吸弃离心上清；用预冷的1×PBS洗涤细胞沉淀1次，1500rpm离心5min，吸弃离心上清；80％4℃预冷的乙醇水溶液重悬沉淀，4℃固定一小时或更长时间；取出固定好的细胞，颠倒离心管摇匀，1500rpm离心5min去上清及固定液，PBS洗涤细胞一次，同步骤；细胞染色液配制：40×PI母液：100×RNAse母液：1×PBS＝25：10：1000；细胞染色：在1.5mL EP管中加入500μL细胞染色液重悬细胞，直接转移到流式管中，上机检测。50μL药物处理后的肺癌A549细胞周期明显阻滞在G1期，S期的数量显著下降(表5和图9)。药物作用24h后，细胞状态图片结果(放大倍数100倍)如图8所示，图8中，图8-1为对照组，图8-2为50μL药物处理组。图9为流式细胞术分析50μL药物处理组与对照组对肺癌A549细胞的细胞周期影响。图9中，图9-1为对照组，图9-2为50μL药物处理组。
将处于对数生长期的A549细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液；六孔板每孔加入2×105A549细胞，铺板过程中要确保每孔加入细胞数目的一致；24h后加入实验药液50μL，对照组只添加相应体积的基础载体溶液；药物作用24h后消化细胞，1500rpm离心5min，吸弃离心上清；用预冷的1×PBS洗涤细胞沉淀1次，1500rpm离心5min，吸弃离心上清；加入500μL Binding Buffer悬浮细胞；加入5μLAnnexinV-APC混匀后，加入5μL PI染色液混匀；室温下避光反应5～10min；在1h内进行流式细胞仪的观察和检测。50μL药物处理后的肺癌A549细胞早期凋亡数量明显增加(图10和11)。图10为流式细胞术分析50μL药物处理组与对照组对肺癌A549细胞的细胞凋亡影响(碘化丙锭双染法)，图10中，图10-1为对照组，图10-2为50μL药物处理组；图11为50μL药物处理后肺癌A549细胞凋亡结果图。
通过本发明的药物制剂，药物处理组可以有效地阻抑肺癌A549细胞的迁移能力，抑制肺癌细胞A549的细胞克隆形成。同时，50μL药物处理后的肺癌A549细胞周期明显阻滞在G1期，S期的数量显著下降，早期凋亡细胞数量显著增加，表明该药物处理能明显阻抑细胞生长，增加早期细胞凋亡发生。
实施例6
正常人胚肺细胞MRC-5在50μL药物处理下培养192h后结果如图12所示，图12中，图12-1为对照组，图12-2为50μL药物处理组。结果表明：正常人胚肺细胞MRC-5在50μL药物处理下培养192h时，细胞状态良好，细胞密度有90％以上，说明本发明的药物制剂在治疗过程中有明显的针对性，可以有效阻抑肺癌细胞的迁移与增殖，然而对正常细胞的损伤较小，符合肺癌的治疗要求。
实施例7
肺癌患者治疗的临床观察
患者1：张女士，56岁，辽宁锦州人。2017年1月上旬咳嗽严重，到医院去检查，发现肺部有4.5*6.1的阴影，切片检查发现是肺癌肝转移，肺部的肿瘤医院及时的采取了切除手术，由于肝脏上面的肿瘤离大动脉非常静，做手术风险非常大，医生建议不切除，最后医院给患者安排了四个疗程的化疗，患者第一个疗程做了以后，副作用非常大，白细胞降低到1000多，患者卧病在床不能动弹。在医生的建议下，患者开始服用本实验药物，经过40天的治疗，患者的食欲，疼痛有明显的改善，2017年12月患者去检查发现各项癌症指标正常，未发现其他转移现象。
患者2：刘先生，63岁，安徽阜阳人。2014年9月在阜阳人民医院确诊为右肺癌，后进行有肺癌切除术，术后病理腺癌Ⅱ—Ⅲ级。术后一直未给予放化疗，也未进行复查。2016年无明显诱因出现右侧肩背部疼痛，于2016年11月就诊于阜阳人民医院进行全身MRI：右侧肩胛骨骨质破坏。考虑骨转移，后一直口服去痛片治疗。后在医院进行右侧肩胛骨伽马刀治疗后疼痛略有缓解。2017年3月刘先生化疗一次，当时由于白细胞低，不能耐受化疗。在医生的建议下开始服用本实验药物，2017年7月检查发现骨转移得到有效控制，各项癌症指标均有所降低。
患者3：赵先生，45岁，安徽铜陵人。2017年1月检查发现左侧肺癌，活检提示腺癌，克唑替尼治疗，肺部肿瘤缩小；2017年11月前开始出现右侧肢体乏力，伴有性格改变；查体：脾气暴躁，余(-)。患者磁共振上可见颅内多发脑转移病灶，共有7处转移灶，而且肿瘤有囊变。在医生的建议下开始服用本实验药物，4个月后检查发现肿瘤控制满意，颅内未出现其他转移病灶。肺部肿瘤有所减小。病情稳定，现在继续服用本药物。
患者4：桑先生，71岁，江苏泰州人。2017年1月在医院检查时发现肺部呈现不规則软组织影，大小为46mm*34mm，边缘毛糙，右肺上叶后段及右肺下叶后基底段可见结节状及索条状密度增高影，右肺中叶可见小片状淡薄影，边缘模糊。左肺下叶可见小结节状钙化影。右肺下叶背段支气管受压、移位，管腔略变窄。纵膈內可见肿大淋巴结，其内可见低密度坏死灶、主动脉可见線條状及结节状钙化。右侧胸腔可见新月形水样密度影及弧線状致密影。肝右叶可见类园形低密度灶，大小为18mm*13mm，CT值为20HU，边界清楚。患者出现明显的肺癌肝转移现象。在医生的建议下，患者开始服用本实验药物。2017年6月，在医院检查中发现，肝脏转移面积明显缩小，为14mm*11mm。肺部软组织影大小也缩小为42mm*31mm，并且未发现其他转移现象。
患者5：张先生，58岁，江苏泰兴人。因头痛、恶心、呕吐20余天于2016年10月收入院。20余天前有受凉史，出现头痛，持续性剧烈全头痛，后枕部明显。行头颅CT(-)，拟“中枢神经系统感染”给予抗生素治疗，半月无好转。头痛进行性加重，颅神经:眼底水肿明显，静脉充盈迂曲，点片状渗血，视乳头边界不清。细胞学检查:细胞数轻-中度增加以激活单核细胞为主，10数个异常细胞，胞体大，胞浆嗜碱，核浆比例大，核染色质粗糙，有多个核仁，个别双核细胞。诊断:颅内转移癌。肺部CT:发现右肺下叶软组织块影。诊断:肺癌脑转移。2017年2月，在医生建议下服用本实验药物。服用60天后，头疼明显缓解，水肿消失。头颅CT检查发现，软组织块影面积缩小。目前，长期服用本实验药物，病人情况稳定，无明显负作效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.河豚毒素在制备阻抑肺癌细胞迁移和增殖的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中河豚毒素的有效剂量为0.5～2μg/mL。
3.一种阻抑肺癌细胞迁移和增殖的药物，包括河豚毒素和药物载体；所述河豚毒素在药物中的质量含量为0.5～2μg/mL。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，每100mL所述药物载体包括2～3mL的莪术油，1～2mL的香叶油，2～3mL的甜杏仁油，2～3mL的小麦胚芽油，4～6mL的鸦胆子油和83～89mL的河豚肝油。
5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述河豚肝油的制备包括以下步骤：将河豚肝脏和水混合，熬煎2～2.5h，收集上层河豚肝油。
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述河豚肝脏和水混合的质量比为(3～5)：1。
7.根据权利要求5或6所述的药物，其特征在于，所述熬煎的温度为120℃～130℃。
8.权利要求3～7任意一项所述药物的制备方法，包括以下步骤：
1)将河豚毒素溶于河豚肝油，制成河豚毒素母液；
2)将莪术油、香叶油、甜杏仁油、小麦胚芽油和鸦胆子油加入河豚肝油中，在60℃下加热搅拌后，与所述步骤1)得到的河豚毒素母液混合，60℃搅拌90min，得到阻抑肺癌细胞迁移和增殖的药物；
步骤1)和步骤2)中河豚肝油的用量比为(1～4)：(80～85)。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述河豚毒素母液中河豚毒素的浓度为40～80μg/mL。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述搅拌的速率为90～120rpm。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109908350A (zh) * 2019-04-02 2019-06-21 自然资源部第三海洋研究所 钠离子通道阻断剂在制备治疗黑色素瘤药物中的应用
WO2021003890A1 (zh) * 2019-07-09 2021-01-14 赵继红 一种河豚毒素酯化物的制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1647800A (zh) * 2004-12-30 2005-08-03 黄致强 一种河鲀油制剂及其制备方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1647800A (zh) * 2004-12-30 2005-08-03 黄致强 一种河鲀油制剂及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
P.U. ONGANER: "Small-cell Lung Cancer (Human): Potentiation of Endocytic Membrane Activity by Voltage-gated Na+ Channel Expression in Vitro", 《THE JOURNAL OF MEMBRANE BIOLOGY》 *
黄军等: "河豚毒素的起源及其研究进展", 《生物技术通讯》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109908350A (zh) * 2019-04-02 2019-06-21 自然资源部第三海洋研究所 钠离子通道阻断剂在制备治疗黑色素瘤药物中的应用
CN109908350B (zh) * 2019-04-02 2021-04-30 自然资源部第三海洋研究所 钠离子通道阻断剂在制备治疗黑色素瘤药物中的应用
WO2021003890A1 (zh) * 2019-07-09 2021-01-14 赵继红 一种河豚毒素酯化物的制备方法

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