CN102209550B - 含有来自包括野山参或人参的人参类形成层的植物干细胞系为有效成分的用于预防或治疗癌症的组成物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有来自包括山参或人参的人参类(Panax ginseng)形成层的细胞系、其破碎物、其提取物及其培养液为有效成分的用于预防或治疗癌症的组成物。根据本发明的细胞系、其破碎物、其提取物及其培养液为来自天然物的组成物，能使传统药物治疗剂的副作用最小化，不但对人体无害而且有效地直接作用于癌的成长，在生体内使癌细胞死灭，从而达到抑制或减轻肿瘤形成及成长的抗癌活性，因此能有效预防治疗癌症及缓和症状。

Description

含有来自包括野山参或人参的人参类形成层的植物干细胞系为有效成分的用于预防或治疗癌症的组成物
【技术领域】
本发明涉及含有来自人参类形成层的细胞系、其破碎物、其提取物或其培养液为有效成分的用于预防或治疗癌症的组成物。
【背景技术】
癌症是在现代人死亡原因中占有最大比重的疾病之一，由于多种原因正常细胞因基因突变转变成癌细胞，是指不按照正常的细胞分化和成长形态的恶性肿瘤。
到目前治疗恶性肿瘤癌症的方法主要有三种，包括外科手术、放射线治疗及化学疗法，而通过其中一种或其组合进行治疗。具体地说，外科手术用于去除大部分的疾病组织，此种外科手术在去除位于乳房、结肠及皮肤等特定部位上的肿瘤时很有效，但是不适合施行于治疗位于一部分如脊椎的部位上的肿瘤或分散性肿瘤，有时会引起需要去除脏器等的副作用以及无法防止转移的问题。
放射线治疗适用于急性炎症性疾病、阳性或恶性肿瘤、内分泌功能障碍及过敏性疾病等，一般有效使用于由急速分裂性细胞构成的恶性肿瘤上，放射线治疗可能导致正常组织的功能弱化或丧失、治疗完后在治疗部位会产生皮肤疾患，以及对于脏器发育正在进行的小儿可能引起智能发达迟延或骨发育障碍等严重的副作用，并存在治疗过程中伴随病人苦痛的问题。
化学疗法也同样，虽然广泛使用于扰乱癌细胞的复制或代谢，以治疗乳房、肺及精巢中的癌症，但是抗癌剂具有不但作用于癌细胞，而且对病人的正常细胞也会发挥其毒性的副作用。化学疗法的副作用大部分在严重时需要住院或为了治疗痛症需要投入镇痛剂。
于是，针对具有能抑制癌细胞成长并使癌细胞死灭的抗癌活性的新型药物研究及剂料开发已有诸多研究，尤其是关心集中在对于开发副作用少的天然物中的抗癌物质的研究上。
在此，本发明人为了开发能使现有抗癌剂的副作用最少化，并作用于癌症发展机制，表达优秀抗癌活性的来自天然物的抗癌组成物倾注不断的努力，其结果终于确认从包括野山参及人参的人参类形成层被诱导的同质细胞系、其破碎物、其提取物及其培养液能表达癌细胞死灭活性，于是完成了本发明。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种能使现有癌症治疗剂的副作用最少化，对癌症具有预防及治疗活性的来自天然物的组成物。
为了实现上述目的，本发明提供用于预防或治疗癌症的组成物，其含有从人参类(Panax ginseng)的形成层被诱导，并具有如下特性的细胞系、其破碎物、其提取物及其培养液中任何一种或一种以上：
(a)其固有地处于未分化状态(innately undifferentiated)；
(b)其以大量液泡(vacuole)为形态学特征。
本发明还提供一种用于预防或改善癌症的功能性食品，其含有该细胞系、其破碎物、其提取物及其培养液中任何一种或一种以上。
本发明还提供一种用于预防或改善癌症的用途，涉及到该细胞系、其破碎物、其提取物及其培养液中任何一种或一种以上。
本发明还提供一种用于预防或治疗癌症的方法，其步骤包括适用该细胞系、其破碎物、其提取物及其培养液中任何一种或一种以上。
根据本发明的其他特征及实施例从如下详细说明及附加专利申请范围更加明晰。
【附图说明】
图1是显示根据本发明的细胞系诱导步骤(a)及来自野山参形成层的细胞系((b)A)以及来自人参子叶的愈伤组织细胞系(生物资源中心，KCTC PC10224)的照片。
图2是显示来自野山参形成层的细胞系(U2)和野山参培养根提取物对于8种癌细胞系的细胞增殖抑制活性用EC50值表示的(HCC：肝细胞癌；-：未评估)。
图3是将来自野山参形成层的细胞系给淋巴癌患者投药之前(A)和投药后(B)的PET-CT摄影图片。
图4是显示给急性骨髓性白血病患者投入根据来自野山参形成层的细胞系的投药期间中的白血球及血小板数值的图表。
图5是将来自野山参形成层的细胞系给肺癌患者投药之前(A)和投药后(B)的PET-CT摄影图片。
图6是将来自野山参形成层的细胞系给直肠癌患者投药之前(A)和投药后(B)的PET-CT摄影图片。
图7是将来自野山参形成层的细胞系给胃癌患者投药之前((a))和投药后((b))的胃纤维镜(gastro-fiberscope)摄影图片。
【具体实施方式】
除非特别限定，这里使用的所有技术和科学术语与本领域普通技术人员通常所理解的具有相同含义。一般说来，这里使用的各种术语的定义在本领域是公知且常用的。
本发明的详细说明中使用的主要术语的定义如下：
本发明中，“形成层(cambium)”是指使茎和根加厚以便允许植物体积增大。据报道，当其中出现大多数活跃细胞分裂的分生组织形成层被用作植物细胞组织培养的外植体时，细胞的迅速和大量生产成为可能(韩国专利第0533120号)。
本发明中所谓“破碎物”是指利用洗涤剂(detergent)等化学性或物理性方法破碎细胞得到的细胞溶解物，至于细胞系的“提取物”是将细胞溶解于溶剂中而分离出的物质，并可利用蒸馏或蒸发使其浓缩。在本发明中细胞系包括由培养条件去分化的细胞系以及提高有用物质的生产能及/或分泌能的细胞系，细胞系的“培养液”是指培养细胞后，除细胞以外剩下来的细胞培养溶液。
在本发明中所谓“其固有地处于未分化状态(innatelyundifferentiated)”不是指经过去分化过程后以未分化状态存在的，而是指本来就维持分化前状态的。
本发明在一观点上，涉及含有来自人参类(Pananx ginseng)形成层的细胞系、其破碎物、其提取物及其培养液中任何一种或一种以上为有效成分的用于预防或治疗癌症的组成物。根据本发明，人参类(Panax ginseng)包括野山参或人参(Lian M.L.et al.，J.PlantBiology，45：201，2002；Han J.Y.et al.，J.Plant Biology，49：26，2006；Teng W.L.et al.，Tissue and Organ Culture，68：233，2002)。这里，本发明中该野山参或人参包括露地参或组织培养参类(不定根及来自不定根的细胞系)。
根据本发明的来自人参类形成层的细胞系，具有如下特征：(a)其固有地处于未分化状态；及(b)其以大量液泡为形态学特征。另外，其特征还在于：(a)其在悬浮培养过程中以单个细胞存在；(b)与来自除人参类形成层以外的其他组织的细胞系相比，在生物反应器下对剪切应力(shear stress)具有较低的敏感性；及(c)与来自人参类形成层以外的其他组织的细胞系相比，其具有较高的生长速度并被稳定培养。并且，其特征在于：该细胞系为同质细胞系(homogeneous cellline)。
在本发明中，其特征在于：该细胞系由包括如下步骤的分离方法获得：
(a)得到含有人参类形成层的储藏根组织；
(b)通过在含有IAA(吲哚-3-乙酸)或者IBA(吲哚-3-丁酸)的培养基中培养得到的含有形成层的储藏根组织而诱导来自形成层的细胞系，
其中在培养过程中、之前或之后将渗透压施加到含有形成层的储藏根组织；以及
(c)收集诱导的来自形成层的细胞系。
此时，在该步骤(b)中，进行渗透压的施加以便专一性诱导形成层中的细胞系。优选地，其在含有IAA或IBA的培养基中培养组织之前进行，使形成层以外的一般组织(即皮层、韧皮部、木质部和木髓)失去分裂能力，由此当它们受到形成层分裂专一性激素诸如IAA或IBA处理时变得坏死。这里，优选地，渗透剂以0.5～2M的量被使用，并且渗透剂以冷却状态或者在室温下使用16～24小时，然后将其除去。但是，本发明的范围不限于此，因为渗透剂的浓度、处理时间和温度可根据植物种类和组织状态而变化。而且，在该步骤(b)中，优选地，IAA或IBA以0.1～5mg/l的含量包含在培养基中。
此外，步骤(c)通过在含有2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)、毒莠定和IBA中的一种或一种以上的培养基中增殖被诱导的来自形成层的细胞，然后收集来自形成层的细胞来进行。此时，该2，4-D、毒莠定及IBA中任何一种优选地以1～5mg/L，更优选地以2mg/L的含量被使用。
在本发明中使用的培养基是用于植物组织培养的常用培养基，其例子可包括但不限于：N6培养基、SH培养基、MS培养基、AA培养基、LS培养基、B5培养基、WPM培养基、LP培养基、White培养基、GD培养基、DKW培养基及DCR培养基等等。
在本发明中，该提取物是利用蒸馏水、醇如低级醇等、丙酮、DMSO(二甲基亚砜)及由其混合溶剂构成的群体中选择的溶剂进行提取的。这里，低级醇是指甲醇、乙醇等碳数为1至5的醇。
在本发明的一实施例中确认，当使用根据本发明的来自人参类形成层的细胞系提取物处理在胰腺癌细胞系、肺癌细胞系、肝癌细胞系、大肠癌细胞系、乳房癌细胞系、子宫颈癌细胞系、皮肤癌细胞系及前列腺癌细胞系上时，对所有癌细胞系均具有死灭效果。而且，在本发明的另一实施例中确认，根据本发明的来自人参类形成层的细胞系培养液对乳房癌细胞系和胰腺癌细胞系具有死灭效果。
并且，在本发明的另一实施例中还确认，将根据本发明的来自人参类形成层的细胞系给患淋巴癌、肺癌、直肠癌及胃癌的癌患者口服投药后，拍摄PET-CT的结果，来自人参类形成层的细胞系在生体(例如患者)内使癌细胞系死灭，由此达到抑制或减轻肿瘤形成及生长的效果，又给白血病患者口服投药后测定血液数值，结果血液数值恢复到了正常值。即，根据本发明的细胞系对预防及治疗胰腺癌、肝癌、大肠癌、乳房癌、子宫颈癌、皮肤癌、前列腺癌、淋巴癌、白血病、肺癌、直肠癌及胃癌有效，但并不局限于此。
于是，在本发明中，即使没有具体实施例以提示该含有细胞系破碎物的组成物具有预防及治疗癌症的效果，但如上所述，其细胞系、其提取物及培养液对预防及治疗癌症具有活性已被确认，因此含有根据本发明的细胞系破碎物的组成物也能达到预防及治疗癌症的效果，是对所属领域的具有通常知识的人来说是很容易理解的。
含有根据本发明的细胞系、其破碎物、其提取物及其培养液中任何一种或一种以上的用于预防或治疗癌症的组成物，可以各自单独包括该细胞系、其破碎物、其提取物及其培养液中任何一种或一种以上或包括一种或一种以上的药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，以提供为药学组成物，而该细胞系、其破碎物、其提取物及其培养液可以根据疾患及其危重程度、患者年龄、体重、健康状况、性别、投药路径及治疗期间等，以药学上有效的含量适当包括在药学组成物中。
上述所谓“药学上可接受的”是指生理学上可接受，并给人投药时，通常不会引起胃肠障碍、头晕等过敏反应或与此类似反应的组成物。该载体、赋形剂及稀释剂有如乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、凝胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物类。
该药学组成物还可以包括填充剂、抗凝集剂、润滑剂、湿润剂、香料、乳化剂及防腐剂等。而且本发明的药学组成物为了给哺乳动物投药后，能使其活性成分迅速、持续或迟延放出，可以使用所属领域所公知的方法剂型化。剂型可以为粉末、颗粒、片剂、乳剂、糖浆、气溶胶、软质或硬质凝胶胶囊、灭菌注射溶液及灭菌粉末形态。
本发明在另一观点上，涉及含有该来自人参类形成层的细胞系、其破碎物、其提取物及其培养液中任何一种或一种以上的用于预防或改善癌症的功能性食品。
本发明中所谓“功能性食品”是指在一般食品中添加根据本发明的细胞系、其细胞系的破碎物或提取物，以提高食品的功能性。
【实施例】
以下，将参照实施例对本发明作更详细的说明。这些实施例仅仅用于解释的目的，而不是用于限制本发明，对所属领域的具有通常知识的人应该很容易理解的。
特别指出，如下实施例中虽然确认了来自野山参形成层的细胞系、其提取物及其培养液对预防及抑制癌症有效，但是当使用该细胞系的破碎物时也能够获得相同的效果，对所属领域的具有通常知识的人而言也是应该容易理解的。
【实施例1：制造来自人参类形成层的细胞系】
【1-1：植物材料的制备】
(1)图1中(a)的A显示本发明所使用的野山参的典型形态。先准备野山参，为了使用山参的主根部，在流动自来水下洗涤以从野山参外表面除去土壤或其他污染物质。然后，使用液体洗剂清洗主根表面后，放置在流动的自来水中。将洗涤的组织置于净化工作台中的灭菌烧瓶中，并使用70％酒精灭菌30秒到1分钟。然后用灭菌蒸馏水漂洗，使用1％～1.5％的次氯酸钠(sodium hypochlorite，Junsei，Japan)消毒5～15分钟。这里，为了使消毒液有效浸透到组织内部，将几滴TWEEN20(聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯，Junsei，Japan)加入到消毒液进行处理。然后，用灭菌蒸馏水漂洗3～5次左右。此后为了防止灭菌组织的褐变，包含有抗氧化剂的BIM(褐变抑制培养基)中置入灭菌的主根，进行摇瓶培养大约30分钟到1小时后，置于灭菌滤纸上从组织中除去湿气。
使用到的BIM的成分和使用浓度如表1所示。
<表1>BIM的成分和浓度
这里，盐浓度仅加入与1/4总浓度对应量。
然后，为了防止材料变褐，将该材料置于含有抗氧化剂的CS溶液(切削液cutting solution，表3)的灭菌盘中，将主根去掉很薄的皮后切成两片，将切割下的部分切片成0.5～0.7cm(宽)x0.5～0.7cm(长)x0.2～0.5mm(高)的尺寸，使具有活跃细胞分裂能力的形成层被包括在切割部分中。图1中，(a)的B显示通过将野山参切割成上面的特定尺寸以使在野山参主根部含有形成层的外植体。
<表2>CS(切削液)
 成分   浓度
 PVP(聚乙烯吡咯烷酮)   0.5％(w/v)
 抗坏血酸   100mg/L
 柠檬酸   150mg/L
(2)将保持在生物反应器(bioreactor)中的100年生的野山参的不定根制备并置于含有表2中的CS溶液的灭菌盘中，并以与上面相同的方式从野山参中得到含有形成层的外植体。
【1-2：使用渗透剂处理含有野山参主根部形成层的外植体】
使用渗透液处理在实施例1-1中制备的外植体以便使分化组织如韧皮部，木质部，木髓等坏死并仅仅诱导形成层(分生组织)。将含有形成层的外植体涂抹(blotting)在放置有滤纸的预接种培养基(培养基1，表3)上，并将其置于含有1M蔗糖溶液(Duchefa，Netherland)的烧瓶中并在冷却状态下使用渗透压处理16～24小时。然后，在0.05M的蔗糖溶液中将外植体处理5分钟并在0.1M的蔗糖溶液中处理5分钟以除去由高浓度蔗糖引起的应力。将已经从除去渗透压的含有形成层的外植体置于放置有滤纸的预接种培养基(培养基1)上以除去湿气。
<表3>预培养培养基(培养基1)的组分
Figure BDA0000059518620000091
【1-3：从含有野山参形成层的外植体中诱导来自形成层的同质细胞系】
为了诱导具有分裂能力的含有来自形成层的同质细胞系，将实施例1-2中使用渗透压处理的外植体转移到细胞系诱导培养基上(培养基2，表4)。使用的培养基组分在下表5中示出。将转移的外植体在22±1℃的黑暗条件下培养。
<表4>为诱导来自形成层的同质细胞系的培养基(培养基2)成分
  组分和条件  使用浓度和条件
  盐  Full strength WPM
  蔗糖  3％(w/v)
  IAA(吲哚-3-乙酸)  2mg/L
  pH  5.8
  固化剂(Gelrite)  0.3％(w/v)
  抗坏血酸  100mg/L
  柠檬酸  150mg/L
这里，如下表5中所示，在直接转移到同质细胞系诱导培养基(培养基2)上而没有进行渗透压处理步骤的外植体中，在转移后的初始阶段(2～3天)显示与形成层有关的黄色反应，然后随着时间的推移，整个外植体都变黄。将已经显示与形成层有关的黄色反应的外植体在用于分离并增殖来自形成层的具有分裂能力的同质细胞系的优化培养基(培养基3)中传代以便诱导并增殖同质细胞系，但是褐变现象变得严重，并且即便随着时间的推移，除了褐色反应之外的任何反应都不被显示。
但是，使用渗透压进行处理并除去之后，从接种到来自形成层的细胞系诱导培养基上的外植体观察到，仅仅在形成层中专一性诱导了同质细胞系而在其他组织中没有诱导。该观察结果在下表5中示出。特别是，在已经使用渗透压处理并从其上释放渗透压的转移的外植体中，外植体的形成层在培养3～7天之后开始转为浅黄色，并且在从此时开始大约7～14天之后，在变成浅黄色的部分开始诱导圆形细胞系。此时，在含有露地山参形成层的外植体和含有野山参不定根形成层的外植体上均观察到相同的结果。图1中(a)的C显示含有野山参形成层的外植体中诱导形成层专一性分裂能力的同质细胞系。
另外，将进行渗透处理的外植体在含有2，4-D的培养基中进行培养，所述培养基不是具有形成层专一性分裂能力的同质细胞系的诱导培养基，并且已经在普通人参、野山参等的常规培养中使用。在这种情况下，观察到在培养7～10天之后整个外植体开始变黄，自此时开始大约7～14天，在整个剖面细胞都被诱导。
<表5>经渗透处理的外植体与未经渗透处理的外植体之间的反应的比较
【1-4：分离的来自野山参形成层的同质细胞系的增殖】
使用在上述实施例1-3中诱导的具有分裂能力的来自形成层的同质细胞系进行增殖。培养基以如下表6所示的基本盐类(salt)组分为基础，按照表7所示，是用于增殖来自形成层的具有分裂能力的同质细胞系的优化培养基。此时，2，4-D用于增殖从露地山参的形成层诱导的同质细胞系，而IBA用于增殖从山参不定根诱导的同质细胞系(表7)。
<表6>用于来自形成层的具有分裂能力的同质细胞系分离及增殖的优化培养基的基本盐类组分
Figure BDA0000059518620000112
<表7>用于来自形成层的具有分裂能力的同质细胞系的分离及增殖的优化培养基(培养基3)成分
 组分和条件   使用浓度和条件
 盐   全浓度MS
 蔗糖   3％(w/v)
 IBA(吲哚-3-丁酸)或2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)   2mg/L
 pH   5.8
 固化剂(Gelrite)   0.3％(w/v)
 抗坏血酸   100mg/L
 柠檬酸   150mg/L
如图1(a)的C所示，使用渗透压处理和培养基2同质细胞系仅仅在形成层中被专一性诱导之后，在表7的培养基3中传代。结果，来自形成层的具有分裂能力的同质细胞系连续分裂并增殖，由此在大约10～20天的培养后具有分裂能力的来自形成层的同质细胞系可被分离。由此分离的来自野山参形成层的同质细胞系在相同培养基中培养以再次增殖。如图1(a)的D所示，分离的形成层专一性同质细胞系在表7中所示的培养基3中进行增殖。
【1-5：被分离的细胞系特性的观察】
将该来自野山参形成层的同质细胞系置于含有表8中所示的液体培养基的烧瓶中。然后，将烧瓶中的细胞系在摇床(shaker)上100rpm在黑暗条件下在25±1℃下培养。传代间隔设置为2周，以使培养细胞可在指数生长阶段始终保持高生命力。此时，如表8所示，2，4-D用于培养从露地山参形成层诱导的同质细胞系，IBA用于培养从山参不定根诱导的同质细胞系。
另外，来自人参子叶的愈伤组织(callus)也在表8中所示的培养基4中进行培养以便于与根据本发明的来自野山参形成层的同质细胞系进行比较。
<表8>用于来自形成层的细胞系的悬浮培养基(培养基4)
 成分   使用浓度和条件
 盐   全浓度MS
 蔗糖   3％(w/v)
 IBA(吲哚-3-丁酸)或2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)   2mg/L
 pH   5.8
首先观察细胞凝集的定量(biological microscope CX31，Olympus，Japan)，如表9中所示，能观察到根据本发明的使用2，4-D处理的来自露地山参形成层的细胞系在悬浮培养过程中以95％以上的单个细胞存在，并且根据本发明使用IBA处理的来自不定根形成层的细胞系也以60％以上的单个细胞存在，于是能确认根据本发明的细胞系在悬浮培养过程中具有以单个细胞存在的特征。而且，如图1(b)的A所示，能观察到使用2，4-D处理的来自露地山参形成层的细胞系和使用IBA处理的来自不定根形成层的细胞系均具有许多液泡(vacuole)的形态学特征，并处于未分化状态。但是，与此相反，观察来自人参子叶愈伤组织(callus，生物资源中心KCTC PC10224)的观察结果显示，如图1(b)的B所示，并没观察到许多液胞，而观察到了一个较大的液泡。
<表9>长期培养过程中来自形成层的细胞系的细胞团类型
Figure BDA0000059518620000131
另一方面，为了检查大量培养的可能性，在具有3L内容积的气升式生物反应器(airlift bioreactor，Sung-Won Cytec，Korea)中培养了来自人参子叶(cotyledon)的愈伤组织和根据本发明的来自野山参形成层的同质细胞系。培养中使用的基使用为在表8中所示的液体培养基并在暗条件下维持25±1℃的温度。
其结果，如表10所示，来自人参子叶(cotyledon)的培养物倍增时间(doubling time)在烧瓶中是21天，而在反应器(reactor)中就延长到28天。换言之，当在烧瓶中培养时，可以看出，当在烧瓶中培养时，与来自其他组织的细胞系相比，根据本发明的来自形成层的细胞系显示高达约3～5倍生长速度，并且当在反应器中培养时，与来自形成层以外的其他组织的细胞系相比，根据本发明的来自形成层的细胞系显示生长速度高达约5～9倍。这被认为是因为非同质细胞系的发育能力(cell viability)由于在反应器中生长环产生、培养过程中植物细胞凝集以及坚硬的细胞壁对剪切应力的敏感性而迅速降低。
另外，根据本发明的使用2，4-D处理的来自露地山参形成层的同质细胞培养物倍增时间为3～4天，使用IBA处理的来自山参不定根形成层的同质细胞培养物的倍增时间为5～6天，均在烧瓶和反应器之间没有差别或比烧瓶中还更缩短了倍增时间。来自形成层的细胞系在生物反应器中形成非常小的生长环区，并且当对培养箱施加简单刺激以摇动培养基时，内壁上的环(ring)被简单消除。而且，显示本发明的细胞系具有较低的凝集并且包含大量的液泡(vacuole)，因此具有对剪切应力的较低的敏感性，使细胞发育能力(cell viability)不降低。
换言之，可以看到根据本发明的来自形成层的细胞系对来自用于大量生产的生物感应器中的摇动产生的剪切应力具有较低的灵敏度，因此可在生物反应器中迅速大量生产。因此，可以看到与来自形成层以外的其他组织的细胞系相比，根据本发明的来自形成层的细胞系具有低5～9倍的敏感性。
<表10>来自形成层的细胞系和来自人参子叶的非同质细胞系在液体悬浮培养基和生物反应器中的倍增时间
Figure BDA0000059518620000141
另外，将来自人参子叶(cotyledon)的非同质愈伤组织(生物资源中心，KCTC PC10224)和来自形成层的细胞系冷藏。将悬浮培养物培养6～8天，并且低温储藏剂为含有0.5M甘油(DUCHEFA，TheNetherlands)，0.5M DMSO(DUCHEFA，The Netherlands)和1M蔗糖(DUCHEFA，The Netherlands)的培养基并被转移到5～ml冷冻瓶(cryovial，Duran，USA)中。接种到低温储藏剂的细胞量为200mg/mL。通过将它们保持在冷冻机中30分钟将使用低温储藏剂处理的悬浮细胞冷冻，将它们储藏在冰柜(deep freezer)中3小时，然后将它们浸泡在液氮中。
然后，为了融化，取出液氮中保持在20分钟或者更长时间的培养的细胞，将它们置于40℃的恒温水浴中并融化1～2分钟。为了让细胞重新生长，通过灭菌漏斗和滤纸过滤细胞悬浮液。将过滤的细胞施加到包括滤纸的固体生长培养基上，然后将它们在室温下固定30分钟，然后转移到新鲜的固体生长培养基上。
结果，来自人参子叶的非同质细胞系不重新生长，而来自形成层的细胞系在4周以后开始重新生长并增殖，并且在低温储藏之前和之后不显示生长速度的差别。
【实施例2：来自野山参形成层的细胞系的干燥及提取物的制备】
根据实施例1中的来自野山参不定根形成层的细胞系，其干燥及提取步骤包括：
(1)干燥细胞系的制备
(i)对去除培养液的细胞系进行冷冻干燥或热风干燥；
(ii)用粉碎机粉碎得到该干燥细胞系。
(2)蒸馏水提取物的制备
(i)在500g的去除培养液的细胞系及经过热风干燥、冷冻干燥的细胞系中加入5000ml蒸馏水，搅拌24小时进行提取。
(ii)溶解后，在3000g中离心10分钟，收集上清液，由此得到蒸馏水溶解的物质。
(iii)将如此得到的蒸馏水溶解的物质使用真空旋转浓缩器进行减压浓缩。
(3)乙醇提取物的制备
(i)在500g的去除培养液的细胞系及经过热风干燥、冷冻干燥的细胞系中加入5000ml蒸馏水，搅拌24小时进行提取。
(ii)溶解后，在3000g中离心10分钟，收集上清液，由此得到乙醇溶解的物质。
(iii)将如此得到的乙醇溶解的物质使用真空旋转浓缩器进行减压浓缩。
(4)甲醇提取物的制备
(i)在500g的去除培养液的细胞系及经过热风干燥、冷冻干燥的细胞系加入5000ml蒸馏水，搅拌24小时进行提取。
(ii)溶解后，在3000g中离心10分钟，收集上清液，由此得到甲醇溶解的物质。
(iii)将如此得到的甲醇溶解的物质使用真空旋转浓缩器进行减压浓缩。
【试验例1：来自人参类形成层的细胞系对体外(in vitro)细胞增殖的抑制效果】
为了检查根据本发明的来自人参类形成层的细胞系对癌细胞系增殖的抑制效果，向8种癌细胞系添加该实施例2中(4)的甲醇提取物，测定其抑制效率。
试验所使用的细胞系为由韩国细胞系银行(KCLB)提供的AsPC-1(胰腺癌)，A549(肺癌)，SK-Hep1(肝癌)，HT-29(大肠癌)，MDA-MB-231(乳房癌)，HeLa(子宫颈癌)，A375P(皮肤黑色素瘤)，DU-145(前列腺癌)，培养液为含有10％乳牛血清的RPMI1640和DMEM培养基。
首先，将每个细胞系按细胞成长速度以不同浓度分散到96孔板后，在37℃下培养16～24小时，然后将该实施例2中(4)的甲醇提取物和作为对照群的野山参培养根提取物用12种稀释剂进行连续稀释处理。野山参培养根提取物用于比较根据本发明的细胞系与通常的野山参组织的效果，冷冻干燥的野山参培养根用与该实施例2中(4)相同的方法制作甲醇提取物来使用。
经过72小时后，在每孔中分别加入15μl MTT染色溶剂(Promega)后，在37℃下放置4小时，然后每孔分别加入100μl的增容溶剂/终止液(solublization solution/stop mix)，在37℃下放置过夜。确认所生成的有色甲臜产物完全被溶化后，在570nm下测定吸光度，而所测定到的吸光度以对溶剂处理群的百分比计算，并以与溶剂处理群进行比较时，表现出50％的吸光度减少的试料浓度(EC50)表示。
结果可确认，如图2所示，当根据本发明的来自人参类形成层的细胞系提取物浓度比野山参不定根提取物显著少时，能抑制8种癌细胞系的增殖。尤其，就野山参培养根提取物而言，在高浓度下，根据本发明的来自人参类形成层的细胞系提取物对于因妨碍细胞增殖的活性微弱而无法求得EC50的大肠癌细胞系也能表达出增殖抑制活性。
于是，研究表明了根据本发明的来自人参类形成层的细胞系与野山参培养根提取物相比，具有显著高的癌细胞系抑制活性，因此其能有效作为优秀的抗癌剂。
【试验例2：来自人参类形成层的细胞系培养液对体外(in vitro)细胞增殖的抑制效果(2)】
附加地为了检查根据本发明的来自人参类形成层的细胞系培养液对癌细胞系的死灭效果，进行了如下实验。
将制造该实施例2中(4)的细胞系提取物过程中去除的培养液作为试料，癌细胞系使用了由韩国细胞系银行(KCLB)提供的MDA-MB-231(乳房癌)和AsPC-1(胰腺癌)，至于培养液使用了含有10％乳牛血清的RPMI1640和DMEM培养基。
首先，将2种癌细胞系按细胞成长速度以不同浓度分散到96孔板后，在37℃下培养16～24小时，然后将该培养液用12种稀释剂进行连续稀释处理。经过72小时后，在每孔中分别加入15μl MTT染色溶剂(Promega)后，在37℃下放置4小时，然后在每孔分别加入100μl的增容溶剂/终止液，在37℃下放置过夜。确认所生成的有色甲臜产物完全被溶化后，在570nm下测定吸光度，而所测定到的吸光度以对溶剂处理群的百分比计算，并以与溶剂处理群进行比较时，表现出50％的吸光度减少的验体浓度(EC50)表示。
其结果，对于MDA-MB-231(乳房癌)和AsPC-1(胰腺癌)分别获得了＞7.57mg/ml，＞1.0mg/ml的EC50值，由此可确认，无论是根据本发明的细胞系，根据本发明的细胞系培养液也具有对癌细胞系的死灭效果。
【试验例3：来自人参类形成层的细胞系对预防及治疗癌症的效果】
为了检查根据本发明的来自人参类形成层的细胞系对预防及治疗癌症的效果，给被诊断为癌症的患者以粉末形态投入了该实施例2中(1)制得的干燥细胞系粉碎物。服用方法按每天三次(早上、中午及晚上)1g溶于水后口服，具体投药量及期间如下。而且，投药过程中并没有产生副作用已被确认。
【3-1：对淋巴癌患者投药】
对于2004年1月9日被诊断为淋巴癌的病人(金＊＊，1957年生，女)，2个月按3g/天进行口服投药，投药期未并行抗癌治疗。为了确认在人体内使癌细胞死灭的效果，投药前和投药2个月后分别在汉阳大学医院拍摄PET-CT，进行了对比观察。
结果如图3所示，投药前的CT摄影结果，在左侧腹腔及骨盆腔发现了广泛且异常增加代谢的部分，在右侧肾脏和心膜中确认到了恶性肿瘤(malignant)(见图3A，C)，而投入2个月根据本发明的细胞系后再拍摄CT，结果可确认广泛且异常增加了代谢的部位被消失(见图3B，D)。
于是，上述实验结果表明，根据本发明的细胞系能使癌细胞死灭，具有预防及治疗癌症的效果。
另外，一般口服抗癌剂时，由于抗癌剂的毒性，导致肝功能数值和肾功能数值异常增加，于是在该投药期间按定期测定了肝功能数值和肾功能数值。在标11中T.Bil，ALP，AST，ALT，LDH为测定肝功能数值的指标，BUN，CRE为测定肾功能数值的指标，均在汉阳大学医院进行测定。此时，BUN及CRE由血清肌酸酐测定法(Folin-Wu法)进行测定，AST、ALT及LDH使用ATBA-200FR、HITACHI 7170Auto Analyze进行测定，ALP用血清(serum)测定法，T.Bil使用ASANSET胆红素测定试药进行测定。
<表11>
  正常值  投药1个月后   投药38天后   投药45天后   投药75天后  投药105天后
  BUN   7～20(mg/ml)  17   11   14   9  13
  CRE   0.6～1.8(mg/ml)  0.9   0.9   1.0   0.9  1.1
  T.Bil   0.2～1.2(mg/ml)  0.3   0.2   0.2   0.4  0.2
  ALP   30～110(U/L)  79   78   71   76  75
  AST   5～40(U/L)  10   10   18   14  17
  ALT   5～45(U/L)  15   11   23   16  13
  LDH   60～200(U/L)  127   117   139   156  144
结果如表11所示，观察到了当服用根据本发明的细胞系时，肝及肾脏功能数值能维持正常状态，于是可确认根据本发明的细胞系没有毒性。
【3-2：对急性骨髓性白血病患者投药】
对于被诊断为急性骨髓性白血病的患者(李＊＊，1995年生，女)，8个月按3g/天进行口服投药。另外，为了确认在人体内治疗癌症的效果，投药前及投药1个月后使用celldyn3000自动血液测定仪(Abbott，Wiesbaden，Germany)分别测定了白血球数值和血小板数值，测定时参考了生产厂家提供的说明书中的测定方法。
<表12>
  白血球   血小板
  正常值   (4,000～10,000/mm3)   (141,000～316,000/mm3)
  9月1号   600   73000
  9月2号   500   42000
  9月3号   400   24000
  9月4号   400   52000
  9月5号   500   36000
  9月6号   400   22000
  9月7号   500   16000
  9月8号   500   58000
  9月9号   300   40000
  9月10号   300   27000
  9月11号   400   40000
  9月12号   600   26000
  9月13号细胞系投药开始日   300   13000
  9月14号   400   51000
  9月15号   400   33000
  9月16号   400   16000
  9月17号   400   50000
  9月18号   600   30000
  9月19号   1000   23000
  9月20号   1700   18000
  9月21号   1400   57000
  9月22号   6700   41000
  9月23号   3900   45000
  9月26号   3400   121000
  9月27号   4400   117000
  9月28号   3400   142000
  9月29号   3000   164000
  10月2号   3000   165000
  10月17号   4400   200000
结果可观察到，如图4及表12所示，投药前白血球数值为2,000/mm3，而投药9天后白血球数值急剧增加，投1个月药后，白血球数值和血小板数值均在正常范围内(白血球数值的正常范围：4,000～10,000/mm3；血小板数值的正常范围：141,000～316,000/mm3)。
由此可确认，投药根据本发明的细胞系具有治疗白血病以及缓和其症状的效果。
【3-3：对急性淋巴球白血病患者投药】
对于被诊断为急性淋巴球白血病的患者(崔＊＊，2001年生，男)，14个月按3g/天进行口服投药。另外，为了确认在人体内治疗癌症的效果，投药前及投药14个月后使用celldyn3000自动血液测定仪(abbott，wiesbaden，Germany)分别测定了血色素数值，测定时参考了生产厂家提供的说明书中的测定方法。
<表13>
  血色素数值
  (正常值)   (13.6～17.4gm/dl)
  投药前   3.6gm/dl
  投药后   12.8gm/dl
结果表明，如图13所示，血色素数值比投药前均增加到正常范围。
白血病是在分化过程中某一个阶段被停止无法分化，而未成熟细胞被增殖，由此具有特定免疫表型的未成熟细胞会增加(CheonYinsang，Medical postgraduates 33，2005)。急性淋巴球性白血病因未成熟细胞(白血球前体)的癌性增殖，导致正常血球减少，因此经常发生贫血、出血、感染等症状，并浸润于脏器内，引起骨痛、肝及脾脏肥大，带来脏器损伤。投药前血色素数值仅达3.6gm/dl，这表示病人处于严重的贫血状态，而投入根据本发明的细胞系后，血色素数值增加到12.8gm/dl的正常数值，于是能确认由白血病引起的症状被改善。
由此可确认，投药根据本发明的细胞系具有缓和白血病症状的效果。
另外，上述口服投药时虽然并行了抗癌治疗，但是投入根据本发明的细胞系之前，由于从最初被诊断为白血病后持续进行了抗癌治疗，因此可以判断抗癌治疗并不影响到投药前或投药后的数据比较。
【3-4：对肺癌患者投药】
(1)对于2006年7月3日被诊断为肺癌的病人(尹＊＊，1939年生，女)，大约18个月按3g/天进行口服投药，在投药期间未并行其他抗癌治疗。为了确认在人体内使癌细胞死灭的效果，投药前及投药13个月后分别在首尔大学医院拍摄PET-CT进行了对比观察。
其结果，如图5所示，对照投药前(图5A)与投药后(图5B)发现，不透明度(opacity)根据投药情况有所减少，肿瘤宽径也随着减少。
于是，该试验结果表明，根据本发明的细胞系能使癌细胞死灭，可达到预防及治疗癌症的效果。
(2)附加地，对于正在投入抗癌剂(阿瓦斯丁，Genentech)中的62岁肺癌患者(J＊＊，1946年生，男)，大约3个月按3g/天投入根据本发明的细胞系。为了观察癌细胞系的死灭效果，拍摄CT测定了肿瘤直径。
测定肿瘤直径的结果发现，投药前的肿瘤尺寸从7cm减少到5.6cm。由此可确认，根据本发明的细胞系具有使癌细胞死灭的效果。
另外，该口服投药时虽然并行投入抗癌剂阿瓦斯丁，但是在投入根据本发明的细胞系之前，单独投入阿瓦斯丁时肿瘤尺寸持续增加，于是抗癌剂并不影响到投药前或投药后的数据比较。
【3-5：对直肠癌患者投药】
对于2007年11月13日被诊断为直肠癌的病人(权＊＊，1949年生，女)，按3g/天进行口服投药，在投药期间未并行其他抗癌治疗。为了确认在人体内使癌细胞死灭的效果，在投药前及投药49天后，分别在全北大学医院拍摄PET-CT进行了对比观察。
其结果，如图6所示，对照投药前(图6A)与投药后(图6B)显示，根据投药情况，在投药前的照片上红色圈部分的不透明度(opacity)有所减少。这表示癌细胞系被死灭。
于是，该试验结果表明，根据本发明的细胞系能使癌细胞死灭，具有预防及治疗癌症的效果。
【3-6：对胃癌患者的投药】
对于2007年10月5日被诊断为胃癌的病人(李＊＊，1967年生，男)，按3g/天进行了口服投药，在投药期间未并行其他抗癌治疗。为了确认在人体内使癌细胞死灭的效果，在投药前及投药4个月后，分别在蔚山医院用胃纤维镜(gastro-fiberscope)检查，对投药前及投药后的肿瘤尺寸进行了对比观察。
其结果如图7所示，开始投药时(图7(a))肿瘤尺寸达7cm，而投药4个月后(图7(b))测定时为2cm，肿瘤尺寸大幅减少。
由此可确认，根据本发明的细胞系能使癌细胞死灭，具有预防及治疗癌症的效果。
【试验例4：确认来自人参类形成层的细胞系对预防及治疗癌症的效果(2)】
为了确认根据本发明的来自人参类形成层的细胞系对预防及治疗癌症的效果，另将该实施例2(1)所制得的冷冻干燥细胞系粉碎物用粉末形态给肺癌患者进行投药。服用方法按1天3次(早上、中午及晚上)1g溶于水中口服投药。投药并未引起任何副作用。
2008年7月1日开始投药，经过1年多后的2009年7月15日为了确认投入来自野山参形成层的细胞系带来的效果，在启明大学东山医疗院拍摄了胸部CT，其结果发现，投药前在26×20mm尺寸的LLL外基底段上被观察到的针状肿块(spiculated mass)尺寸大幅减少到14×14mm。而且，可以确认在两侧肺部的多数转移性结节(multiplemetastatic nodules)尺寸显著减少。
由此可确认，根据本发明的来自人参类形成层的同质细胞系能减少癌肿块的尺寸，进而达到预防及治疗癌症的效果。
【制造例1：药学制剂的制造例】
【制剂例1：片剂的制造】
将实施例2中制得的100mg细胞系提取物与100g玉米淀粉、100mg乳糖及2mg硬脂酸镁进行混合后，按照通常的片剂制造方法制造。
【制剂例2：胶囊剂的制造】
将实施例2中制得的500mg细胞系提取物填充于软质凝胶胶囊中以制造胶囊剂。
【制剂例3：糖浆剂的制造】
按实施例1中制得的1g细胞系、10g异性化糖、5g甘露醇和适量的精制水的含量，按照通常的液制剂制造方法制造100ml的糖浆剂。
【制剂例4：注射剂的制造】
将实施例2中制得的200g细胞系提取物在含有聚氧乙烯氢化蓖麻油的200mg生理食盐水中进行加热溶解，制造以0.1％浓度含有混合提取物的注射剂。
【制造例2：功能性食品的制造-功能性饮料的制造】
【制造例1：】
将实施例1中制得的200mg细胞系溶于96ml水中后，加入作为助剂的500mg维他命C、作为矫味剂的1g柠檬酸和1g寡糖，再加入作为保存剂的0.05g苯甲酸钠后，加入精制水，制成全量为100ml的功能性饮料。
【制造例2：】
将实施例2中制得的200mg细胞系提取物溶于96ml水中后，加入作为助剂的500mg维他命C、作为矫味剂的1g柠檬酸和1g寡糖，再加入作为保存剂的0.05g苯甲酸钠后，加入精制水，制成全量为100ml的功能性饮料。
【产业上利用性】
如上所述，根据本发明的细胞系、其破碎物、其提取物及其培养液为来自天然物质的组成物，能使现有药物治疗剂的副作用最小化，不但对人体无害而且有效地直接作用于癌的成长，在生体内使癌细胞死灭，从而达到抑制或减轻肿瘤形成及成长的抗癌活性，因此能有效预防治疗癌症及缓和症状。
虽然已经参照特定特征对本发明进行了详细描述，对本领域技术人员来说容易想到的是该描述仅仅用于优选实施方式而不是限制本发明的范围。因此，本发明的实际范围由随附的权利要求书及其等同物限定。

Claims (10)

1.从人参或野山参的形成层分离出，并具有如下特性的细胞系、其提取物及其培养液中任何一种或一种以上用于制备预防或治疗癌症的组成物的用途：
（a）其固有地处于未分化状态，且不是愈伤组织；
（b）其以大量液泡为形态学特征。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：
该细胞系还具有如下特性：
（a）其在悬浮培养过程中以单个细胞存在；
（b）与来自除人参或野山参形成层以外的其他组织的细胞系相比，在生物反应器下对剪应力具有较低的敏感性；和
（c）与来自人参或野山参形成层以外的其他组织的细胞系相比，具有较高的生长速度并可被稳定地培养。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：该细胞系由包括如下步骤的分离方法获得：
（a）得到含有人参或野山参形成层的储藏根组织；
（b）通过在含有吲哚-3-乙酸或者吲哚-3-丁酸的培养基中培养得到的含有形成层的储藏根组织而诱导来自形成层的细胞系，其中在培养过程中、之前或之后将渗透压施加到含有形成层的储藏根组织；以及
（c）收集诱导的来自形成层的细胞系。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：
所述步骤(c)通过在含有2,4-二氯苯氧乙酸、毒莠定和吲哚-3-丁酸中的一种或一种以上的培养基中增殖被诱导的来自形成层的细胞，然后收集来自形成层的细胞来进行。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：
该提取物是利用蒸馏水、低级醇等醇、丙酮、二甲基亚砜及由其混合溶剂构成的群体中被选择的溶剂进行提取的。
6.根据权利要求1至5中任何一项所述的用途，其特征在于：
该癌症为胰腺癌、肝癌、大肠癌、乳房癌、子宫颈癌、皮肤癌、前列腺癌、淋巴癌、白血病、肺癌、直肠癌及胃癌中任何一种。
7.从人参或野山参形成层被诱导，并具有如下特性的细胞系、其提取物及其培养液中任何一种或一种以上用于制备预防或改善癌症的功能性食品的用途：
（a）其固有地处于未分化状态，且不是愈伤组织；
（b）其以大量液泡为形态学特征。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：该细胞系还具有如下特性：
（a）其在悬浮培养过程中以单个细胞存在；
（b）与来自除人参或野山参形成层以外的其他组织的细胞系相比，在生物反应器下对剪应力具有较低的敏感性；和
（c）与来自人参或野山参形成层以外的其他组织的细胞系相比，具有较高的生长速度并可被稳定地培养。
9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：该细胞系由包括如下步骤的分离方法获得：
（a）得到含有人参或野山参形成层的储藏根组织；
（b）通过在含有吲哚-3-乙酸或者吲哚-3-丁酸的培养基中培养得到的含有形成层的储藏根组织而诱导来自形成层的细胞系，其中在培养过程中、之前或之后将渗透压施加到含有形成层的储藏根组织；以及
（c）收集诱导的来自形成层的细胞系。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：
所述步骤(c)通过在含有2,4-二氯苯氧乙酸、毒莠定和吲哚-3-丁酸中的一种或一种以上的培养基中增殖被诱导的来自形成层的细胞，然后收集来自形成层的细胞来进行。
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