CN102325538B - 含有源自包括野山参或人参的人参类形成层植物干细胞系作为活性成分的增强免疫用组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于增强免疫的组合物，该组合物含有源自包括野山参、人参在内的人参类(Panax ginseng)形成层细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液作为活性成分。由于本发明的组合物的细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液源自天然物，因此其不仅将现有的免疫增强剂的副作用降至最低，对人体安全的同时有效增强了具有先天免疫功能的NK细胞的活性。同样，当本发明的组合物的细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液在特异性免疫反应中再暴露于抗原中时，能够大大增加淋巴结细胞的增殖速度，此表明其也具有增强后天免疫反应的效果，因此其作为免疫增强剂非常有效。尤其是，其还可以有效增加骨髓细胞的数量，因此不仅作为免疫反应佐剂非常有效，而且还可用于由于造血作用所引起的贫血的预防及治疗。

Description

含有源自包括野山参或人参的人参类形成层植物干细胞系作为活性成分的增强免疫用组合物
技术领域
本发明涉及用于增强免疫的组合物，该组合物含有源自人参类形成层细胞系、其裂解物、其提取物或其培养液作为活性成分。
背景技术
免疫大体上可分为出生就具有的先天免疫(innate immunity)和适应后天生活过程等中获得的后天免疫(acquired immunity)两大类。在此，先天免疫又称为“自然免疫”，其对抗原进行非特异性反应，且不具有特定的免疫记忆。先天免疫系统包括阻断抗原入侵的皮肤、粘液组织、低pH值胃酸，承担噬菌作用去除侵入体内入侵者的巨噬细胞(macrophage)、多形核白细胞等噬菌细胞。这种先天免疫实际上防止了大部分感染。另外，后天免疫由于对第一次入侵抗原具有记忆功能，当再次发生入侵时，其具有进行特异性反应有效去除抗原的特点。
一旦上述免疫功能降低就可能发生如下多种免疫疾病：哮喘、季节性或常年性鼻炎、过敏性鼻窦炎、结膜炎、过敏性皮炎、荨麻疹、红细胞溶血、急性肾小球肾炎等。
对上述免疫疾病的预防要比治疗重要，但实际上通过服用现在市面销售的治疗剂来进行预防是比较困难的。因此需要一种无需服用可能有副作用的免疫增强剂也能预防和治疗免疫紊乱的方法。
一直以来，人们进行了大量的能够预防和治疗免疫紊乱的新药物的研究和制剂开发工作，尤其是集中关注于有关副作用小的天然物抗癌物质的开发的研究上。曾经开发出用于增强免疫的源自韩国产海藻类的用于增强免疫的提取物(韩国公开专利10-2000-00063617)，但是对优异的源自天然物的免疫增强剂的需求仍然从没有间断过。
另外，增强免疫功能的免疫增强剂的概念由罗曼(Roman)提出，随着“比起单纯的疫苗给药，如果同时进行某种增强免疫物质和疫苗的给药，疫苗效果会增强”这一观点的明确而开始被大家所了解。而且，免疫增强剂是指能够提高宿主的特异或非特异免疫反应和细胞性免疫及体液性免疫反应的所有物质，最近，随着将免疫强化应用于感染或肿瘤的治疗中，引起了人们对免疫增强剂的极大关注。
因此，发明人为了开发出一种在最小化副作用的同时，能够预防和治疗免疫紊乱的新的用于增强免疫的组合物而努力研究的结果，确认了从包括野山参和人参的人参类形成层中诱导出的同质细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液能够增强NK细胞活性，并且以抗原特异性方式提高了淋巴结细胞的增殖速度，由此完成了本发明。
发明内容
本发明目的在于提供一种使现有免疫增强剂的副作用最小化并且显示出增强免疫活性的源自天然物的组合物。
为了实现上述目的，本发明提供一种用于增强免疫的组合物，该组合物含有获自人参类(Panax ginseng)形成层且为天然未分化(innately undifferentiated)状态的细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的任意一种或一种以上。
本发明还提供一种用于增强免疫的功能性食品，该功能性食品含有上述细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的任意一种或一种以上。
本发明还提供一种增强动物免疫的方法，其特征在于，使用上述细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的任意一种或一种以上进行给药。
本发明还提供一种上述细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的任意一种或一种以上的用于增强免疫的用途。
本发明还提供一种用于预防或治疗贫血的组合物，其含有上述细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的任意一种或一种以上。
本发明还提供一种预防或治疗贫血的方法，上述方法包括应用上述细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的任意一种或一种以上的步骤。
本发明还提供一种上述细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的任意一种或一种以上用于预防或治疗贫血的用途。
通过以下详细说明及附加的权利要求书，本发明的其它特征和具体实施方式将更加清楚。
附图说明
图1为一组照片，示出了本发明细胞系的分离过程(a)和源自野山参形成层的细胞系((b)A)及源自人参子叶的愈伤组织的细胞系(韩国典型菌种保藏中心，KCTC PC10224)((b)B)。
图2为本发明细胞系的给药前及给药14天后，对照组(A)和实验组(B、C)的体重测量图。
图3为本发明细胞系的给药前及给药14天后，对照组(A)和实验组(B、C)的脾细胞数测定结果图。
图4为本发明细胞系的给药前及给药14天后，对照组(A)和实验组(B、C)的胸腺细胞数测定结果图。
图5为本发明细胞系的给药前及给药14天后，对照组(A)和实验组(B、C)的NK细胞活性测定结果图。
图6为本发明细胞系的给药前及给药14天后，表示当E∶T比为10∶1、20∶1及40∶1的实验结果的测定对照组(A)和实验组(B、C)中的NK细胞活性图。
图7为本发明细胞系的给药前及给药26天后，对照组(野山参)和实验组(A细胞，A培养液)中的NK细胞活性测定结果图。
图8为表示本发明细胞系在给药10天后，经抗原刺激后对小鼠淋巴结增殖带来的影响的图。
图9为本发明细胞系的给药前及给药14天后，对照组(A)和实验组(B、C)的骨髓细胞数测定结果图。
图10为本发明细胞系在给药26天后，对照组(野山参)和实验组(A细胞，A培养液)的骨髓细胞数测定结果图。
图11及12示出了在给药本发明源自野山参形成层的细胞系给药前后，测定的血红蛋白、血小板、红细胞及白细胞的数值测定结果。
具体实施方式
在没有用其它方式进行定义的前提下，本发明中所使用的全部技术和科学术语都具有如本领域普通技术人员所通常理解的那样的相同含义。一般来讲，本说明书中所使用的命名法为本领域公知的并且常规适用于本领域。
本发明详细说明等中所使用的关于主要术语的定义如下。
在本申请中，“形成层(cambium)”是指使植物的茎和根变粗，能够使植物材积生长的组织。据报道，形成层作为细胞分裂最为活跃的分生组织，用作植物组织培养的外植体时，能够快速大量地生成细胞(韩国专利No.0533120)。
本申请中，“裂解物”是指通过使用去垢剂(detergent)等化学方法或物理方法等破坏细胞，从而获得的细胞溶解物。细胞系的“提取物”是指将细胞溶解于溶剂后进行分离后获得的物质，所述提取物可以通过蒸馏或蒸发进行浓缩。在本申请中，细胞系的概念包括根据培养条件进行分化的细胞系或有用物质的生产能力和/或分泌能力得到提高的细胞系。此外，术语“培养液”是指细胞培养后，除细胞之外剩余的细胞培养液。
本申请中“天然未分化状态(innately undifferentiated)”并非指经过脱分化过程并以未分化状态存在的，而是指从最初开始就维持分化之前的状态。
本发明的一个观点是：本发明涉及一种用于增强免疫的组合物，其含有源自人参类(Panax ginseng)形成层的细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的任意一种或一种以上作为活性成分。在本发明中，人参类(Panax ginseng)包括野山参或人参(Lian M.L.等.，J.PlantBiology，45：201，2002；Han J.Y.等.，J.Plant Biology，49：26，2006；Teng W.L.等，Tissue and Organ Culture，68：233，2002)。此时，本发明中的上述野山参或人参包括露天人参或组织培养的人参类(不定根和源自不定根的细胞系)。
本发明中源自人参类形成层的细胞系，其特征为天然未分化状态。此时，上述细胞系进一步进行悬浮培养时其特征在于，以单细胞水平存在。其中“悬浮培养时单细胞水平”是指与源自人参类形成层之外的组织细胞系或在脱分化的愈伤组织中诱导出的细胞等相比，在悬浮培养时，表示为以单细胞数量更多或以直径更小的细胞团块(cellaggregates)方式存在。另外，还具有如下特征：(a)其形态学特征为具有多个液泡(vacuole)；(b)同源自人参类形成层之外的组织细胞系相比，在生物反应器中对剪应力(shear stress)具有低敏感性；及(c)同源自人参类形成层以外的组织细胞系相比，生长速度快且能够稳定培养。另外，还具有上述细胞系为同质细胞系的特征。
在本发明中，上述细胞系的特征在于：根据包括如下步骤的分离方法获得：
(a)获得含有人参类形成层的贮藏根组织；
(b)在含有IAA(3-吲哚乙酸)或IBA(3-吲哚丁酸)的培养基中进行培养，诱导源自形成层的细胞系，其中，在该培养过程中或培养前期或后期向上述含有形成层的组织施加渗透胁迫；以及
(c)收集上述被诱导的源自形成层的细胞系。
此时，在上述步骤(b)中，上述渗透胁迫工序是为了形成层特异性诱导细胞系而进行的，优选在包括上述IAA或IBA的培养基中进行培养之前进行，这样，在形成层之外的一般组织，即皮层(cortex)、韧皮部(phloem)、木质部(xylem)、木髓(pith)会丧失分化潜能(differentiation potential)，从而使它们在后续的用IAA或IBA等形成层分裂特异性激素进行培养时坏死。此时将渗透剂的含量控制为0.5-2M，优选为在冷藏或常温条件下施加16至24小时的渗透胁迫处理后，去除渗透胁迫。但是由于渗透剂的浓度、处理时间和温度按照不同植物、不同组织的状态而不同，因此并不限于此。还有，在上述步骤(b)中，上述IAA或IBA的含量优选为含有0.1-5mg/L。
另外，在上述步骤(c)中，其特征在于：优选为将被诱导的源自形成层的细胞系在含有选自2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)、毒莠定(picloram)和IBA中的一种或一种以上的培养基内进行增殖，然后回收源自形成层的细胞系。此时，上述2，4-D、毒莠定及IBA中任一种含量优选为1-5mg/L，更优选为以2mg/L的含量使用。
另外，其特征还在于，进一步包括在含有激发子的培养基中培养所述步骤(c)中收集的细胞系并收集细胞系的步骤。这样的激发子为选自如下物质组成的组：粗糖或食糖；以及茉莉铜酸甲酯(methyljasmonate)、真菌类提取物、细菌类提取物、酵母(yeast)提取物、壳聚糖、葡甘露聚糖(glucomanan)、葡聚糖(glucan)、苯基丙氨酸(phenylalanine)、苯甲酸(benzoic acid)、水杨酸(salicylic acid)、花生四烯酸(arachonic acid)，STS、甲羟戊酸(mevalonate)、N-苯甲酰基甘氨酸(N-benzoylglycine)、ABA、SNP、IPP、BHT、CCC、乙烯利(ethephon)、马尿酸(hippuic acid)、硝酸铈铵(amminoiumceric nitrate)、AgNO3、硫酸氧钒(vanadyl sulfate)、对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)、油菜素类固醇(brassinosteroids)、海藻酸钠(sodium alginate)、乙酸钠(sodium acetate)。另外，作为激发子，可进行紫外线、热、光、光周期、剪应力、乙烯、抗真菌剂、抗生素、重金属盐及高浓度盐等处理，从而施加物理、化学应力。优选使用茉莉铜酸甲酯或粗糖。此时，作为激发子而添加的粗糖或茉莉铜酸甲酯的添加浓度可优选为：粗糖按照3-5重量％(g/L)添加，茉莉铜酸甲酯按照50-150μM的浓度添加。
本发明中所使用的培养基为通常进行植物组织培养时使用的培养基，可例举N6培养基、SH培养基、MS培养基、AA培养基、LS培养基、B5培养基、WPM培养基、LP培养基、怀特培养基，GD培养基、DKW培养基、DCR培养基，但不限于此。
本发明中，上述提取物，其特征在于：其是使用蒸馏水、一元醇、丙酮、DMSO(二甲基亚砜)以及它们的混合溶剂所组成的组中选出的溶剂进行提取的。此时，上述一元醇可以使用甲醇、乙醇等碳原子数为1-5的醇。
在本发明的一个实施例中确认了如下结果：通过源自本发明人参类形成层细胞系的给药，承担先天性免疫的细胞，即NK细胞的活性大大增强。已知NK细胞在抗肿瘤免疫反应和抗病毒免疫反应中发挥非常重要的作用。尤其是在使用经过作为激发子的粗糖及茉莉铜酸甲酯处理的培养基中进一步培养后获得的源自野山参形成层的同质性细胞系时，显示为NK细胞活性增加幅度更大。此外，在本发明其它实施例中，同进行野山参培养根给药的对照组相比，可以确认进行源自本发明人参类形成层的细胞系及其培养液的给药时，NK细胞活性得以增强，由此可知源自本发明人参类形成层的细胞系及其培养液的增强免疫效果更为优异。
另外，在本发明及其它实施例中，源自本发明人参类形成层的细胞系给药结果如下：将之前暴露的抗原被重新导入时，淋巴结细胞数量更加显著地快速增加，由此可确认本发明的细胞系具有提高抗原特异性淋巴结细胞增殖速度的效果。
因此可确认，源自本发明人参类形成层的细胞系是一种能够增强先天免疫及后天免疫的优异的免疫增强剂。并且，在本发明中即使没有能够揭示含有上述细胞系裂解物、提取物或培养液的组合物显示免疫增强效果的具体实施例，但如上所述，能够确认上述细胞系具有免疫增强活性，所以含有本发明细胞系裂解物、提取物或培养液的组合物也能够显示免疫增强效果，这对具有通常知识的本领域技术人员而言是显而易见的。
含有本发明细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的一种或一种以上的用于增强免疫的组合物，可以分别单独含有上述细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的一种或一种以上，或者可以进一步含有药用的载体、赋形剂、或稀释剂中的一种以上作为药物组合物来提供。药物组合物中的上述细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液可以根据疾病及其病重程度、患者的年龄、体重、健康状态、性别、给药途径和治疗期限等以药学上有效的量适当地含有。
上述的术语药用组合物是指生理上允许并对人体给药时，通常情况下不发生胃功能障碍、眩晕等过敏反应或与之类似反应的组合物。上述载体、赋形剂及稀释剂可例举：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石粉、硬脂酸镁及矿物油等。
上述药物组合物还可以含有填充剂、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、香料、乳化剂及防腐剂等。另外，可利用本领域的公知方法将本发明中的组合物制成制剂，从而对哺乳动物给药后活性成分能够迅速、持续或延缓释放。剂型可为粉末、颗粒、片剂、乳剂、糖浆、气雾剂、软质或硬质明胶胶囊、灭菌注射液、灭菌粉末等形态。
同时，源自本发明人参类形成层的细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液能够作为食品添加剂进行使用。因此，从其它观点来讲，本发明涉及用于增强免疫的功能性食品，该功能性食品含有来自上述人参类形成层的细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的一种或一种以上。本申请中的“功能性食品”意味着通过向普通食品添加本发明中的细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液来提高食品功能性。
另外，已确认在本发明其它实施例中，经过源自本发明人参类形成层的细胞系给药能够有效增加骨髓细胞数量。同时，还可确认与普通野山参制品(野山参培养根)相比，本发明的细胞系及培养液的给药能够更有效地增加骨髓细胞数量。目前在进行癌的放疗和化疗时，由于抑制骨髓血细胞生成的副作用，必然存在免疫功能下降的问题。本发明细胞系显示能够增加骨髓细胞数量，显然本发明的细胞系、该细胞系的裂解物、提取物及培养液作为能够阻止这种免疫功能下降的免疫增强剂是非常有效的。
此外，这种骨髓细胞增加意味着本发明的细胞系具有强化造血功能的作用，这种造血功能的强化起到预防和治疗贫血的作用。因此，从其它观点来讲，本发明涉及一种用于预防或治疗贫血的组合物，该组合物含有源自上述人参类形成层的细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的一种或一种以上。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行更为详细的说明。具有通常知识的本领域技术人员应该明白，这些实施例仅用于对本发明进行举例说明，不对本发明范围进行任何限制。
尤其是，在以下实施例中，虽然只确认了来自野山参形成层的细胞系及其培养液的免疫增强作用，但使用其裂解物或其提取物也能获得相同结果，这对具有通常知识的本领域技术人员来讲是显而易见的。
实施例1.制备源自人参类形成层的同质细胞系
1-1：准备植物材料
图1(a)的A显示了本发明中所使用野山参的典型外观。准备好野山参(江原道产)后，为了使用野山参的主根部分，用流水去除附在外表面的土或其它污染物，再用液体去垢剂清洗主根表面，之后放到流水中。将清洗干净的组织放入到洁净工作台上准备好的经过灭菌处理的烧瓶中，用70％的乙醇灭菌30秒至1分钟左右。之后用无菌水漂洗，用1％至1.5％次氯酸钠(sodium hypochlorite，Junsei，日本)消毒液进行5-15分钟左右的消毒处理。此时，为了使消毒液能够有效地渗透到组织内，滴入几滴TWEEN 20(聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯，Junsei，日本)该处理过程结束后，使用无菌水漂洗3至5次左右。然后，为了防止经灭菌处理后组织的褐变，将灭菌后的主根放入包含抗氧化剂的BIM(褐变抑制培养基)中进行30分钟至1小时左右的振荡培养，然后放到灭菌的滤纸上除去水分。
使用的BIM的组成与使用浓度参见表1。
表1 BIM的组成及使用浓度
此处，盐的添加量为总量的1/4。
然后，为了防止经过上述处理的材料褐变，将上述材料放到盛有含有抗氧化剂的CS溶液(切削液，表2)的灭菌培养皿中。薄薄地剥掉外表皮分成两半，使各个部分含有分化潜能旺盛的形成层部分，以横×竖×高＝0.5-0.7cm×0.5-0.7cm×0.2-0.5mm的大小切割。图1(a)中的B示出了在野山参的主根部分，按照上述大小切割后制得的含有形成层的外植体的形状。
1-2：对含有野山参主根部分形成层的外植体进行渗透剂处理
为了使上述制得的外植体中被分化的组织即韧皮部、木质部、木髓等坏死，而仅使作为分生组织的形成层能够存活，进行渗透胁迫处理。将含有上述形成层的外植体转接(blotting)到盖有滤纸的预培养基(培养基1，表3)上，然后放置到装有1M蔗糖(Duchefa，荷兰)溶液的烧瓶内，在冷藏状态进行16-24小时的渗透胁迫处理后，在0.05M蔗糖溶液中处理5分钟，在0.1M蔗糖溶液中处理5分钟，以消除高浓度蔗糖的胁迫。之后，将消除了上述渗透胁迫的含有形成层的外植体放到盖有滤纸的预培养基上(培养基1)，除去水分。
表2.CS(切削液)
  组成成分   使用浓度
  PVP(聚乙烯吡咯烷酮)   0.5％(w/v)
  抗坏血酸   100mg/L
  柠檬酸   150mg/L
表3.预培养基(培养基1)组成
1-3：用野山参的含有形成层的外植体诱导同质细胞系
为了诱导具有源自形成层的分化潜能的同质细胞系，将在上述实施例1-2中经渗透胁迫处理的外植体接种于细胞系诱导培养基(培养基2，表4)中。用于接种的培养基与下述<表4>中的记载相同。接种的外植体在22±1℃的黑暗条件下进行培养。
表4 用于诱导形成层起源的同质细胞系的培养基组成(培养基2)
  组成及条件   使用浓度与条件
  盐   全量(Full strength)WPM
  蔗糖   3％(w/v)
  IAA(3-吲哚乙酸)   2mg/L
  pH   5.8
  结冷胶(Gelrite)   0.3％(w/v)
  抗坏血酸   100mg/L
  柠檬酸   150mg/L
此时，如<表5>中的记录，没有进行渗透处理直接接种于同质性细胞系诱导培养基中的外植体，在接种初期(2-3天内)，看到快速地向形成层中心发生变黄的反应，但随着时间的推移看到外植体整体变黄，将看到了形成层中心变黄反应的外植体放入到最适合分离并增殖形成层起源的具有分化潜能的同质性细胞系的培养基(培养基3)中进行继代培养，并试图继续诱导并增殖同质性细胞系，但是褐变现象恶化，经过一段时间后仍然是除了褐变反应之外看不到其它反应。
另外，如<表5>所示，进行渗透处理后，进行解除，然后接种到同质性细胞系诱导培养基上的外植体，可观察到在其它组织中细胞没有被诱导，仅在形成层中观察到同质性细胞被特异性诱导。即，进行渗透处理，进行解除后接种的外植体中，在培养的3-7天之间，外植体形成层部分开始变为淡黄色。之后大约7-14天后，在变为淡黄色的部分可以观察到诱导出圆圆的细胞系。图1(a)中的C显示出了在含有野山参形成层的外植体中，具有形成层特异性分化潜能的同质细胞系被诱导的状态。
另外，将进行了渗透处理的外植体不是在具有形成层特异性分化潜能的同质细胞系诱导培养基中，而是在进行普通人参、野山参等人参类培养中使用的含有2，4-D的培养基中进行培养时，在7-10天之间外植体整体开始变黄，之后再过7-14天后，能够观察到在整个截面上细胞被诱导出来。
表5 进行渗透处理后的外植体和没
有进行渗透处理的外植体的反应比较
1-4：分离的源自野山参形成层的同质细胞系的增殖
使用在上述实施例1-3中被诱导的源自形成层具有分化潜能的同质性细胞系进行增殖。基于表6所示盐组成的表7所示培养基被用作增殖源自形成层的具有分化潜能的同质细胞系的最佳培养基。
表6.用于分离及增殖源自形成层的具有分化
潜能的同质细胞系的最佳培养基的基本盐组成
表7 用于分离和增殖源自形成层的具有
分化潜能的同质细胞系的最佳培养基(培养基3)
  组成与条件   使用浓度与条件
  盐   全量MS
  蔗糖   3％(w/v)
  2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)   2mg/L
  pH   5.8
  结冷胶   0.3％(w/v)
  抗坏血酸   100mg/L
  柠檬酸   150mg/L
如图1(a)中的C所示，进行渗透胁迫处理并使用培养基2，仅在形成层特异诱导出同质细胞后，使用<表7>所示的培养基3进行继代培养。其结果为，源自形成层的具有分化潜能的同质细胞继续分裂、增殖，大约培养10～20天后，能够分离源自形成层的具有分化潜能的同质细胞系。将这样分离得到的源自野山参形成层的同质细胞系在同一培养基内进行培养，再次增殖具有分化潜能的同质细胞系。图1(a)中的D表示将分离的形成层特异性同质细胞系在<表7>所示的培养基3中进行增殖的形态。
1-5：观察分离的细胞系的特性
将上述源自野山参形成层的细胞系在含有下面<表8>所示的液体培养基的烧瓶内，在黑暗条件下，于25±1℃下，在100rpm的旋转搅拌机(shaker)中进行培养。继代培养周期固定为两周，以使得培养细胞始终维持在对数生长期状态下，能够维持高的活性。另外，将源自人参子叶的愈伤组织(callus)也在<表8>的培养基4中进行培养，并与本发明中的源自野山参形成层的细胞系进行比较。
表8 人参悬浮培养基(培养基4)
  组成及条件   使用浓度与条件
  盐   全量MS
  蔗糖   3％(w/v)
  2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)   2mg/L
  pH   5.8
首先在观察细胞凝聚程度(生物显微镜CX31，奥林巴斯，日本)时，如<表9>所示，可确认本发明中的细胞系在进行悬浮培养时，95％以上是以单细胞状态存在；如图1(b)的A所示，能观察到具有多个小液泡的形态学特征，并能够确定为未分化状态。但是，与此相反，观察源自人参子叶的愈伤组织(韩国典型菌种保藏中心，KCTCPC10224)的结果，如图1(b)中的B所示，观察不到多个小液泡，观察到了一个大液泡。
表9 人参长期培养液的细胞团类型
另外，为了考察大量培养的可能性，在内部容积为3L的气升式生物反应器(Sungwon si-tech，韩国)中对源自人参子叶的愈伤组织以及本发明中的源自野山参形成层的同质性细胞进行培养。培养基使用<表8>中的液体培养基，并在黑暗条件下维持于25±1℃进行。
其结果，如<表10>所示，源自人参子叶的培养物倍增时间(doubling time)在烧瓶中为21天，但与此相反，在反应器中延长至28天。究其原因，分析为：由于在反应器内生成生长轮、在培养过程中植物培养体具有聚生以及刚性细胞壁引起的对剪应力的敏感性，使细胞存活率急剧降低。
另外，本发明中的源自野山参形成层的细胞培养物的倍增时间为3-4天，与是否在烧瓶或反应器中进行没有什么差异，与在反应器中相比在烧瓶中的时间反而缩短了。源自形成层的同质细胞培养物在生物反应器内形成了面积非常小的生长轮，对培养器进行简单的刺激并移动培养基，其内壁上的生长轮很容易就去除了。这说明本发明的细胞系具有低聚生性，并具有很多小液泡，因而对剪应力的敏感度低，从而不会使得细胞存活率降低。
表10 在液体悬浮培养及生物反应器中培养的源自野
山参形成层的同质细胞系和源自人参子叶细胞的倍增时间
1-6：激发子处理
利用上述实施例1-5中悬浮培养14天的细胞系，分成2种处理方式进行了如下实验。
即，分别收集(1)上述进行14天悬浮培养的细胞系(生长阶段：实验组1)及(2)将上述悬浮培养14天的细胞系在无菌水中添加有3～5重量％(g/L)粗糖及100μM茉莉铜酸甲酯的培养基中黑暗条件下培养14天获得的细胞系(诱导物1：实验组2)。
实施例2.源自野山参形成层的同质细胞系的干燥及其提取物的制备
将通过实施例1中的两种处理方式制得的细胞系按照如下方法进行了干燥及提取。
(1)制备热风干燥的细胞系粉碎物
(i)将去除了培养液的细胞系在90℃下进行热风干燥。
(ii)上述干燥的细胞系是利用粉碎机粉碎得到。
(2)制备冷冻干燥细胞系粉碎物
(i)将去除培养液的细胞系在超低温(-70℃)状态下冷冻后，缓缓减压维持在常温(25℃)以上进行干燥。
(ii)上述干燥的细胞系是利用粉碎机粉碎得到。
(3)制备蒸馏水提取物
(i)分别取去除培养液的细胞系、热风干燥的细胞系冷冻干燥的细胞系500g，向其中分别加入5000ml蒸馏水，将它们进行混合，在50℃条件下搅拌6小时并进行提取。
(ii)对上述溶解后的3000g溶液进行10分钟的离心分离，通过收集上清液获得了蒸馏水可溶性物质。
(iii)利用真空旋转浓缩机对上述获得的蒸馏水可溶性物质进行减压浓缩。
(4)乙醇提取物的制备
(i)分别取去除培养液的细胞系、热风干燥的细胞系、冷冻干燥的细胞系500g，向其中分别加入5000ml乙醇，将它们进行混合，在50℃条件下，搅拌6小时并提取。
(ii)对上述溶解后的3000g溶液进行10分钟离心分离，通过收集上清夜获取乙醇可溶性物质。
(iii)利用真空旋转浓缩机对上述获得的乙醇可溶性物质进行减压浓缩。
参考事项：实验动物及统计方法
在如下的实施例中，所有实验均使用Sigmaplot 5.0(SPSS公司.，芝加哥，IL)，综合每个实验所得的结果，以平均值±标准误值来表示。采用ST检验(Student′s test)检验数据的统计学意义，当P值不超过0.05时，可确认其具有显著性。
实验中所使用的实验动物为出生6～7周的C57BL/6小鼠和Balb/c小鼠(Orient Bio公司，城南市，京畿道)，上述小鼠放在恒温恒湿装置(Dae Jong Science，韩国)内，用于试验。
实施例3.细胞毒性试验
为了确定实验中所用试样的使用浓度范围，进行了如下的细胞毒性试验。
3-1测定试样给药对体重变化的影响
首先，在试样给药之前测定对照组与实验组的体重，比较试样给药前后的体重。对照组仅给药固体饲料，而在实验组1与2中，将上述实施例2中制得的热风干燥细胞系粉碎物按照5重量％混合到粉碎的饲料中，使小鼠自由摄食。即，实验组1中给药的是上述实施例1-6中获得的经过悬浮培养14天的细胞系，再经热风干燥的干燥细胞系粉碎物；实验组2中给药的是：将上述实施例1-6中的将悬浮培养14天的细胞系在无菌水中添加了3～5重量％(g/L)粗糖和100μM茉莉铜酸甲酯的培养基中黑暗条件下培养14天后获得的细胞系进行热风干燥从而得到的干燥的细胞系粉碎物。对照组和实验组分别使用了10只小鼠。
试样给药前对照组(组A)的体重为20.44±0.76g，实验组1(组B)为21.76±0.94g，实验组2(组C)为20.57±0.73g。如图2所示，在给药14天试样后，对照组(组A)的体重为22.32±0.82g，实验组1(组B)为24.23±0.68g，实验组2(组C)为23.14±0.55g，各组间没有差异。
3-2试样的摄取对免疫器官的细胞数的影响
进一步地，为了确认试样给药是否对免疫器官产生影响，在试样给药后，测定对照组和实验组的免疫器官的细胞数，具体为：试样给药后，分离鼠的器官，即脾脏和胸腺组织后，通过低渗休克反应去除红细胞，分离脏器内的细胞，使用血细胞计数器(hemocytometer)在显微镜下测定细胞数。给药条件与上述实施例3-1相同。
其结果如图3所示，对照组(组A)中脾细胞数为7.68±0.46×107，实验组1(组B)为6.35±0.40×107，实验组2(组C)为5.99±0.40×107。可见对照组和实验组没有显著性差异。
另外，如图4所示，对照组的胸腺细胞数为10.10±1.44×107，实验组1(组B)为8.80±1.14×107，实验组2(组C)为9.04±0.77×107。可见，各组间没有差异。
如上所述，将源自本发明野山参形成层的同质性细胞系给药14天后，测量体重及对1次(胸腺)和2次免疫器官(脾脏)的细胞数进行测定的结果为：可确认由于免疫器官的细胞数没有显著减少，因此对免疫器官没有细胞毒性。
实施例4根据源自野山参形成层的细胞系给药的NK细胞活性测定
4-1根据源自野山参形成层的细胞系给药的NK细胞活性测定
分别给对照组、实验组1和2中的小鼠给药饲料14天，具体为：对照组仅给药饲料；而对实验组1和2中的小鼠给药的饲料为：采用与实施例3相同的方法在饲料中将本发明的干燥细胞系粉碎物作为试样添加了的饲料。然后分离脾细胞，以Yac-1细胞作为靶细胞，测定了E∶T比值为40∶1时的细胞毒性(E(效应细胞)：NK细胞；T(靶细胞)：Yac-1细胞)。
即，利用离心分离器(UNION 32R，哈尼尔，汉城)将靶细胞(YAC-1)用PBS清洗1次后，调整为1×106/ml，使其悬浮于1ml的PBS中。向该细胞悬浮液中加入10μl的亲脂性羰花青染料(DiOC)，在37℃下，在CO2培养器内放置20分钟。然后用PBS清洗2次，在1ml完全培养液中悬浮。调整效应细胞(NK细胞)浓度，使E∶T的比值为40∶1，向5ml试管中放入效应细胞、靶细胞及碘化吡啶(PI)，将1000g离心分离30秒。温育(incubation)4小时后，使用流式细胞分析仪FAC扫描；流式细胞仪(Sunyvale，CD，美国)进行分析。
第1次实验结果如图5A所示，对照组(组A)NK细胞活性为39.74±1.70％，实验组1(组B)为54.82±3.79％，实验组2(组C)为59.12±2.84％，与对照组相比，实验组B和实验组C显著增加(**，P＜0.01)。第2次实验结果如图5B所示，对照组(组A)中为6.75±0.48％，实验组1(组B)中为9.25±0.50％，实验组2(组C)中为10.44±1.13％，与对照组相比，实验组B和实验组C显著增加(*，P＜0.05，**，P＜0.01)。
另外，采用与上述相同的方法使E∶T比值为10∶1，20∶1及40∶1，实验结果如图6所示，与对照组相比，可以确认实验组1和2中Yac-1细胞数显著减少，担当先天性免疫职能的NK细胞活性大大增加。尤其显示为，用激发子处理的实验组2的活性最为优异。
4-2根据给药源自野山参形成层的细胞系、细胞系培养液及野山参对照组的NK细胞活性测定
作为实验组，采用与实施例4-1相同给药方法，分别采用将上述实施例1-6的将悬浮培养14天后的细胞系经过冷冻干燥得到的干燥细胞系粉碎物(A细胞)和上述实施例1-6得到的培养液(A培养液)作为试样添加的饲料向皮下注射了癌细胞CT-265×104细胞(韩国细胞系银行)的Balb/c小鼠给药26天。此时，对照组中仅给药饲料，而作为另外的对照组给药了野山参培养根(Modern Bio公司)的冷冻干燥粉碎物。随后，分离脾细胞，将Yac-1细胞作为靶细胞，测定细胞毒性(E(效应细胞)：NK细胞；T(靶细胞)：Yac-1细胞)。
在10％FBS/RPMI培养液中将靶细胞(YAC-1)调整为2.5x106细胞/ml后，添加51Cr 100μci。在5％CO2培养器内，于37℃条件下标记90分钟后，添加5％FBS/RPMI，清洗4次。在10％FBS/RPMI中悬浮，浓度为2.5x105细胞/ml。将标记靶细胞以每孔20μl程度添加到圆底(U型底)96孔板中后，每次加入0.2ml脾细胞的细胞悬浮液，重复实验三次，使E(效应细胞细胞，脾细胞)∶T(靶细胞)的比率为80∶1、40∶1、20∶1。为了测定自发释放量(spontaneous release；SR)，代替启动细胞悬浮液加入了等量的培养液；为了测定最大释放量(maximum release；MR)，添加1％氚核X-100溶液。
对该板以100G速度进行5分钟的离心分离，在37.5％的CO2培养器内放置4小时后，取0.1ml上清液，用伽马放射能测定仪测定释放。测定各实验组的释放量(实验释放；ER)后，采用如下公式计算细胞毒性
细胞毒性(％)＝(ER-SR/MR-SR)×100
其结果如图7所示，与对照组相比，可以确认本发明的源自野山参形成层的细胞系及其培养液的NK细胞活性增加了(按照80∶1的比率进行的数据结果)。与此相反，野山参对照组比仅给药饲料的对照组的NK细胞活性要低。这样的结果说明：本发明细胞系及其培养液与人参类相比免疫增强活性显著优异。
实施例5.测定源自野山参形成层细胞系的淋巴结细胞的抗原特异性增殖速度
混合50μg KLH抗原(钉形贝血蓝蛋白：Sigma Chemical，美国)和等量CFA(弗氏完全佐剂：Sigma Chemical，美国)，注射到小鼠的尾根部(base of tail)的皮下及足垫部后，从进行免疫的第二天，采用与实施例3相同的给药方法，分别向对照组和实验组使小鼠自由摄食10天饲料及含有试样的饲料。
10天后从对照组及实验组1和2的小鼠中取出淋巴结，向获得的细胞分别以0、0.5、5及50μg/ml的浓度添加KLH，使其浓度为，在37℃的CO2培养器内进行培养。3天后，以10μg/孔的量添加CCK-8(Dojindo，日本)后，温育4小时，使用分光光度计(Peckard spectracount TM，A堪培拉公司)测得450nm波长下的O.D.值。
其结果，如图8所示，当加入0μg/ml时，即，没有添加KLH时，对照组为0.62±0.03，实验组1(组B)O.D.为0.70±0.05，实验组2(组C)为0.83±0.05。添加0.5μg/ml的KLH时，对照组为1.11±0.04，实验组1(组B)为1.19±0.06，实验组2(组C)显示为1.38±0.06。当添加5μg/ml的KLH时，对照组为1.23±0.04，实验组1(组B)为1.34±0.05，实验组2(组C)为1.56±0.04。当添加50μg/ml的KLH时，对照组为1.45±0.05，实验组1(组B)为1.48±0.04，实验组2(组C)显示为1.61±0.05。由此可以确认，与对照组相比，实验组2(组C)显著性性增加(*：P＜0.05，**：P＜0.01)。上述实验组2(组C)给药源自野山参形成层细胞系的干燥细胞系粉碎物。该细胞系是经激发子处理而培养的。
即，给药了本发明的细胞系的情况，淋巴结细胞数更加明显快速增加，此表明本发明的细胞系具有加快抗原特异性淋巴结细胞增殖速度的作用。
实施例6.测定根据给药源自野山参形成层细胞系是否增加骨髓细胞数的测定
6-1：测定给药源自野山参形成层细胞系后的骨髓细胞数
采用与实施例3-2相同的方法向对照组及实验组1、2提供饲料，测定骨髓细胞数。测定方式与实施例3相同：给药试样后，分离右侧大腿部的骨髓，然后通过低渗休克反应去除红细胞，分离脏器内部的细胞，利用血细胞计数器在显微镜下测定细胞数。
其结果如图9所示，骨髓细胞数为：对照组(组A)6.75±0.56×106个，实验组1(组B)12.93±0.52×106个，实验组2(组C)11.91±0.39×106个。同对照组相比，实验组1和实验组2显著增加(**，P＜0.01)。
在现有的对癌症进行放疗和化疗时，由于抑制骨髓血细胞生成的副作用，必然存在降低免疫功能的问题。本发明中的细胞系由于具有增加骨髓细胞数的效果，作为抵抗这种免疫功能下降的免疫增强剂，是非常有效的。
另外，像这样骨髓细胞的增加意味着本发明细胞系具有强化造血功能的作用，这种造血功能的强化效果能够提供了贫血的预防及治疗效果。
6-2：测定根据给药源自野山参形成层细胞系、细胞系培养液及野山参对照组的骨髓细胞数
作为实验组，采用与实施例3-1相同给药方法，分别采用将上述实施例1-6的将悬浮培养14天后的细胞系经过冷冻干燥得到的干燥细胞系粉碎物(A细胞)和上述实施例1-6得到的培养液(A培养液)作为试样添加的饲料向皮下注射了癌细胞CT-26 5×104细胞(韩国细胞系银行)的Balb/c小鼠给药26天。此时，对照组中仅给药饲料，而作为另外的对照组给药了野山参培养根(Modern Bio公司)的冷冻干燥粉碎物。然后测定了骨髓细胞数。测定方式与上述实施例3相同，给药试样后，分离右侧大腿部的骨髓，通过低渗休克反应去除红细胞，分离脏器内部细胞。利用血细胞计数器，在显微镜测定细胞数。
其结果如图10所示，在给药本发明的细胞系(A细胞)及其培养液(A培养液)时，分别为1.3×107cell及1.2×107个细胞，由此可确认同对照组相比，骨髓细胞数极显著增加(*，P＜0.05)。与之相比，给药野山参的对照组虽然与对照组相比有所增加，但同给药本发明细胞系及其培养液的情况相比增加程度小。
实施例7.根据给药源自野山参形成层的细胞系的给血红蛋白、血小板、红细胞及白细胞数的测定
根据患者，用上述实施例2中的热风干燥细胞系粉碎物1日2g(早、晚各1g)或3g(早、中、晚各1g)进行给药，测定给药前后Hb(血红蛋白)数值、RBC(红细胞数值)、PLT(血小板数值)、WBC(白细胞数值)。给药历史及患者信息如图11所示。另外，采用相同方法测定上述实施例2中的冷冻干燥细胞系粉碎物(生长阶段)给药情况，结果如图12所示。
本发明的源自野山参形成层细胞系的给药结果，如图11及图12所示，血红蛋白、血小板、红细胞及白细胞数值均显示为增加。上述白细胞数值的数值表明本发明的源自自野山参形成层细胞系具有增强免疫的效果；而血红蛋白、红细胞及血小板等数值的增加表明本发明的源自野山参形成层细胞系具有调节造血功能的效果，能有效预防、治疗贫血。
制备例1：药物制剂制备例
制剂例1片剂的制备
将100mg实施例2中制备的细胞系提取物与100mg玉米淀粉，100mg乳糖以及2mg硬脂酸镁混合，利用通常的片剂制备方法制备。制剂例2胶囊剂的制备
将500mg实施例2中制备的细胞系提取物填充到软质明胶胶囊中，制备胶囊。
制剂例3糖浆剂的制备
将1g实施例1中制备的细胞系，10g果葡糖浆，5g甘露醇和适量的纯净水混合，利用通常的液体制剂的制备方法制备100ml糖浆剂。
制剂例4注射剂的制备
将200mg实施例2中制备的细胞系提取物放入到含有聚氧乙烯氢化蓖麻油的生理盐水200mg中进行加热溶解，制备含有0.1％浓度的混合提取物的注射剂。
制备例2功能性食品的制备：功能性饮料的制备
制备例1
将200mg实施例1制备的细胞系溶解到96ml的水中，作为助剂加入500mg维生素C，作为增味剂加入1g柠檬酸和1g寡糖、作为防腐剂加入0.05g苯甲酸钠，然后加入纯净水使溶液总量为100ml，从而制得功能性饮料。
制备例2.
将200mg实施例2中制备的细胞系提取物溶解到96ml的水中，作为助剂加入500mg维生素C，作为增味剂加入1g柠檬酸和1g寡糖，作为防腐剂加入0.05g苯甲酸钠，然后加入纯净水使溶液总量为100ml，从而制得功能性饮料。
工业实用性
如上述说明，由于本发明中组合物中的细胞系、其裂解物、其提取物极其培养液源自天然物，因此其不仅将现有的免疫增强剂的副作用降至最低，对人体安全的同时有效增强具有先天性免疫功能的NK细胞活性，而且由于在特异性免疫反应中再暴露于抗原中时，能够大大增加淋巴结细胞的增殖速度，显示出了也具有增强后天免疫反应的作用，因此其作为免疫增强剂非常有效。尤其是，还具有增加骨髓细胞数的作用，因此不仅作为免疫反应助剂非常有效，而且还可用于由于造血作用所引起的贫血的预防及治疗。
如上所述，对本发明内容的特定部分已经进行了详细说明，但对于具有通常知识的本领域技术人员应该明白这种具体技术仅是优选的实施方式而非限制本发明的范围因此，本发明的实质范围将通过所附的权利要求书及其等同方式来限定。

Claims (19)

1.一种用于增强免疫的组合物，其特征在于，其含有获自人参类形成层且为天然未分化状态的细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的一种或一种以上，所述细胞系是采用包括如下步骤的分离方法获得的：
(a)获得含有人参类形成层的贮藏根组织；
(b)在含有IAA或IBA的培养基中进行培养，诱导源自形成层的细胞系，其中，在该培养过程中或培养前期或后期向上述含有形成层的组织施加渗透胁迫；以及
(c)回收上述被诱导的源自形成层的细胞系。
2.根据权利要求1所述的用于增强免疫的组合物，其特征在于，所述细胞系进行悬浮培养时以单细胞水平存在。
3.根据权利要求1所述的用于增强免疫的组合物，其特征在于，所述细胞系还具有如下特征：
(a)其形态学特征为具有多个液泡；
(b)同源自人参类形成层以外的组织的细胞系相比，在生物反应器中对剪应力具有低敏感性；及
(c)同源自人参类形成层以外的组织的细胞系相比，生长速度快且能够稳定培养。
4.根据权利要求1所述的用于增强免疫的组合物，其特征在于，所述步骤(c)中，将被诱导的源自形成层的细胞系在含有选自2,4-二氯苯氧基乙酸、毒莠定和IBA中的一种或一种以上的培养基内进行增殖，然后收集源自形成层的细胞系。
5.根据权利要求1所述的用于增强免疫的组合物，其特征在于，其进一步包括在含有激发子的培养基中培养所述步骤(c)中收集的细胞系并收集细胞系的步骤。
6.根据权利要求5所述的用于增强免疫的组合物，其特征在于，所述激发子是粗糖或茉莉铜酸甲酯。
7.根据权利要求1所述的用于增强免疫的组合物，其特征在于，所述提取物是使用选自下组的溶剂提取细胞系获得的：蒸馏水、一元醇、丙酮、二甲基亚砜及它们的混合物。
8.根据权利要求1至8中任一项所述的用于增强免疫的组合物，其通过增加NK细胞活性具有免疫增强作用。
9.根据权利要求5或6所述的用于增强免疫的组合物，其通过增加抗原特异性淋巴结细胞数具有免疫增强作用。
10.一种用于增强免疫的的功能性食品，其特征在于，其含有获自人参类形成层且为天然未分化状态的细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的一种或一种以上，所述细胞系是采用包括如下步骤的分离方法获得的：
(a)获得含有人参类形成层的贮藏根组织；
(b)在含有IAA或IBA的培养基中进行培养，诱导源自形成层的细胞系，其中，在该培养过程中或培养前期或后期向上述含有形成层的组织施加渗透胁迫；以及
(c)收集上述被诱导的源自形成层的细胞系。
11.根据权利要求10所述的用于增强免疫的功能性食品，其特征在于，所述细胞系进行悬浮培养时以单细胞水平存在。
12.根据权利要求10所述的用于增强免疫的功能性食品，其特征在于，其进一步包括在含有激发子的培养基中培养所述步骤(c)中收集的细胞系并收集细胞系的步骤。
13.获自人参类形成层并为天然未分化状态的细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的一种或一种以上在制备免疫增强用组合物中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述细胞系在悬浮培养时以单细胞水平存在。
15.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述细胞系是采用包括如下步骤的分离方法获得的：
(a)获得含有人参类形成层的贮藏根组织；
(b)在含有IAA或IBA的培养基中进行培养，诱导源自形成层的细胞系，其中，在该培养过程中或培养前期或后期向上述含有形成层的组织施加渗透胁迫；以及
(c)收集上述被诱导的源自形成层的细胞系。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，其进一步包括在含有激发子的培养基中培养所述步骤(c)中收集的细胞系并收集细胞系的步骤。
17.一种用于预防或治疗贫血的组合物，其特征在于，其含有获自人参类形成层且为天然未分化状态的细胞系、其裂解物、其提取物及其培养液中的一种或一种以上，所述细胞系是采用包括如下步骤的分离方法获得的：
(a)获得含有人参类形成层的贮藏根组织；
(b)在含有IAA或IBA的培养基中进行培养，诱导源自形成层的细胞系，其中，在该培养过程中或培养前期或后期向上述含有形成层的组织施加渗透胁迫；以及
(c)收集上述被诱导的源自形成层的细胞系。
18.根据权利要求17所述的用于预防或治疗贫血的组合物，其特征在于，所述细胞系在悬浮培养时以单细胞水平存在。
19.根据权利要求17所述的用于预防或治疗贫血的组合物，其特征在于，其进一步包括在含有激发子的培养基中培养所述步骤(c)中收集的细胞系并收集细胞系的步骤。
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